本發(fā)明涉及工程菌，更具體的說是涉及一種基于霧化吸入的工程菌制劑及制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前，隨著微生物腫瘤防治研究和臨床應(yīng)用的不斷突破，利用合成生物學(xué)技術(shù)改造的可預(yù)測宿主免疫反應(yīng)的工程化微生物制劑取得重要進展。已有研究報道，利用工程菌將腫瘤代謝產(chǎn)物(nh3)轉(zhuǎn)化為l-精氨酸(l-arg)，腫瘤局部高濃度l-arg可增強抗細(xì)胞程序性死亡配體1(抗pd-l1)藥物免疫治療效率，有效避免口服或靜脈注射l-arg的劑量毒性。另外，中國知易生物在研管線sk08(基于脆弱擬桿菌開發(fā)的活體生物藥)聯(lián)合抗細(xì)胞程序性死亡受體1/細(xì)胞程序性死亡配體1(抗pd-1/l1)單抗治療晚期實體瘤的微生物聯(lián)合用藥方案也在國內(nèi)開展臨床試驗。

2、利用自上而下的基因工程技術(shù)分解、設(shè)計、組裝、構(gòu)建的功能定制化工程菌活性生物藥，一方面工程菌自身攜帶脂多糖、肽聚糖等固有免疫原性分子；另一方面工程菌可通過表達(dá)細(xì)胞因子(如白介素，il-12)，細(xì)胞毒性因子(如腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，trail)，抗腫瘤蛋白(如天青蛋白，laz)，前藥物酶(如胞嘧啶脫氨酶)以及sirna(如sipd-1rna)等，靶向抗腫瘤獲得性免疫反應(yīng)的特定步驟，從而與固有免疫激活產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)并重塑腫瘤免疫微環(huán)境，提高工程菌的抗腫瘤療效。盡管工程菌協(xié)同遞送免疫檢查點抑制劑與抑炎細(xì)胞因子能夠增加抗腫瘤效果，但是工程菌經(jīng)靜脈注射給藥后，其他組織或器官的非特異性定植會引發(fā)全身性免疫治療相關(guān)不良反應(yīng)(iraes)，導(dǎo)致各器官的慢性損傷、功能受損，甚至功能喪失，影響患者預(yù)后。

3、因此，提供一種非靜脈注射給藥途徑的工程菌遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種基于霧化吸入的工程菌制劑及制備方法與應(yīng)用。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種基于霧化吸入的工程菌制劑，所述系統(tǒng)為工程菌-海藻酸鈣-殼聚糖核殼微球；

4、所述工程菌含有免疫檢查點抑制劑anti-pd-l1nanobody質(zhì)粒與抗炎細(xì)胞因子il-10質(zhì)粒，所述工程菌基因組整合同步裂解回路slic基因；

5、所述免疫檢查點抑制劑anti-pd-l1nanobody核酸序列，如seq?id?no.1所示；

6、所述抗炎細(xì)胞因子il-10核酸序列，如seq?id?no.2所示。

7、進一步的，所述核殼微球為工程菌-海藻酸鈣微球表面單包裹殼聚糖涂層；所述工程菌-海藻酸鈣微球為工程菌表面單包裹海藻酸鈣涂層。

8、進一步的，免疫檢查點抑制劑anti-pd-l1nanobody質(zhì)粒為p15a-j23119-anti-pd-l1nanobody，包括組成型啟動子j23119、免疫檢查點抑制劑anti-pd-l1nanobody基因；

9、所述抗炎細(xì)胞因子il-10質(zhì)粒為prsf-j23119-il-10，包括組成型啟動子j23119、抗炎細(xì)胞因子il-10基因。

10、進一步的，所述工程菌基因組整合同步裂解回路slic基因的方法為：

11、將ptd103luxi_sfgfp質(zhì)粒執(zhí)行裂解功能的slic基因片段整合在工程菌的caga位點上，將ptd103aiia(cm)質(zhì)粒執(zhí)行裂解功能的slic基因片段整合在工程菌的fhla位點上；

12、所述ptd103luxi_sfgfp質(zhì)粒執(zhí)行裂解功能的slic基因，核酸序列如seq?id?no.3所示；

13、所述ptd103aiia(cm)質(zhì)粒執(zhí)行裂解功能的slic基因，核酸序列如seq?id?no.4所示。

14、一種基于霧化吸入的工程菌制劑的制備方法，包括以下步驟：

15、1)將自殺質(zhì)粒pre112引入野生型大腸桿菌ecn，敲除ecn中存在的兩個隱蔽質(zhì)粒pmut1和pmut2，獲得大腸桿菌ecnδδ菌株；利用red同源重組技術(shù)，改造ecnδδ，基因組整合同步裂解回路slic基因，構(gòu)建具有同步裂解周期的底盤菌株ecn?slic；

16、2)利用pcr技術(shù)分別將載體p15a和prsf線性化，并避開原有啟動子區(qū)域；利用同源重組，將anti-pd-l1nanobody片段與p15a載體連接，構(gòu)建的質(zhì)粒p15a-j23119-anti-pd-l1nanobody；將il-10片段與prsf載體連接，構(gòu)建的質(zhì)粒prsf-j23119-il-10；

17、3)以大腸桿菌dh5α菌株為宿主進行質(zhì)粒構(gòu)建和擴增，以ecnδδslic菌株為宿主進行功能表征，獲得產(chǎn)生anti-pd-l1nanobody和il-10的工程菌ecn?slic”；

18、4)利用微流控設(shè)備批量生產(chǎn)工程菌凝膠微納顆粒：

19、以工程菌ecn?slic”與海藻酸鹽混合溶液為內(nèi)相，內(nèi)相的比例cfu：m/v為1.0·108：1％；氯化鈣溶液為外相制備凝膠單包覆工程菌顆粒，外相的氯化鈣的濃度為5％；

20、采用自制的微流控裝置合成雙組分微球，該裝置由兩個注射泵控制，分別注射外相流體與內(nèi)相流體，使外相流體剪切內(nèi)相流體；內(nèi)相注射泵流速為40μl/min，外相注射泵流速為1600μl/min，制備得工程菌-海藻酸鈣微球；

21、將工程菌-海藻酸鈣微球置于0.5％殼聚糖溶液中緩慢攪拌，所述工程菌-海藻酸鈣微球與殼聚糖溶液的比例為m：v＝1mg：4ml，制備得單包覆的工程菌-海藻酸鈣-殼聚糖核殼微球；

22、5)將工程菌-海藻酸鈣-殼聚糖核殼微球凍干至含水量為4％，分散至生理鹽水中，霧化為氣溶膠顆粒，實現(xiàn)呼吸道給藥功能。

23、6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于霧化吸入的工程菌制劑的制備方法，其特征在于，步驟5)所述凍干過程為，調(diào)整設(shè)置凍干機梯度凍干程序，梯度凍干溫度程序為0℃、-20℃、-40℃，梯度凍干時間為30min、120min、360min。

24、進一步的，所述工程菌-海藻酸鈣-殼聚糖核殼微球徑為3-6μm。

25、一種基于霧化吸入的工程菌制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

26、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

27、1、本發(fā)明基于呼吸道吸入工程菌的肺臟局部遞送系統(tǒng)為一種工程菌-海藻酸鈣-殼聚糖核殼微球，形貌均一，分散性好，可實現(xiàn)肺臟局部遞送，同時釋放工程菌藥物，利用“工程菌同步裂解”實現(xiàn)外源工程菌藥物中活性分子的精準(zhǔn)釋放，進一步實現(xiàn)對肺臟疾病的緩解與治療。

28、2、本發(fā)明系統(tǒng)有望通過工程菌-海藻酸鈣-殼聚糖核殼微球的呼吸道吸入，局部遞送、病灶部位精準(zhǔn)定植、肺臟黏膜免疫系統(tǒng)協(xié)同應(yīng)答實現(xiàn)外源工程菌藥物在宿主肺臟部位的靶向有效定植，進一步實現(xiàn)工程菌藥物發(fā)揮免疫調(diào)控的時空精準(zhǔn)性，從而最大程度實現(xiàn)對肺臟疾病的復(fù)發(fā)預(yù)防、原位治療和病程抑制。

29、3、本發(fā)明基于呼吸道吸入工程菌肺臟局部遞送系統(tǒng)通過局部定位、精準(zhǔn)裂解、肺臟黏膜免疫系統(tǒng)協(xié)同應(yīng)答實現(xiàn)外源工程菌藥物對肺臟疾病的復(fù)發(fā)預(yù)防、原位治療和病程抑制。本發(fā)明創(chuàng)新性地將“合成生物學(xué)-凝膠聚合技術(shù)”有機融合，開發(fā)了一套可實現(xiàn)外源工程菌藥物在宿主肺臟內(nèi)靶向有效定植的新策略。在此基礎(chǔ)上精準(zhǔn)調(diào)控工程菌分泌協(xié)同治療因子，激活肺臟黏膜免疫。

30、4、本發(fā)明工程菌-海藻酸鈣-殼聚糖核殼微球遞送系統(tǒng)可實現(xiàn)智能化、精準(zhǔn)化、可視化和無創(chuàng)化的外源工程菌藥物高效遞送；利用“霧化吸入技術(shù)”遞送外源工程菌，實現(xiàn)外源工程菌藥物在宿主肺臟的局部遞送，實現(xiàn)工程菌藥物的病灶靶向定植，進一步協(xié)同實現(xiàn)外源工程菌藥物發(fā)揮免疫調(diào)控的時空精準(zhǔn)性。