本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種重組非洲豬瘟弱毒疫苗及其制備方法和應用。

背景技術：

1、非洲豬瘟(african?swine?fever,asf)是非洲豬瘟病毒(asfv)感染引起的一種高度接觸傳染致死性傳染病，對于家豬的致死率高達100％。迄今為止，asf在世界范圍內持續(xù)發(fā)生，不僅對全球養(yǎng)豬業(yè)構成威脅，也對人類公共衛(wèi)生安全帶來重大風險。目前尚未有防治該病的有效疫苗，針對asf的防控，目前主要采取撲殺和拔牙清除等措施。

2、asfv結構復雜，是唯一的dna蟲媒病毒，非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬成員，是一種有囊膜的雙鏈dna病毒。asfv具有20面體對稱結構，直徑為175-215nm，可以編碼54種以上的結構蛋白，具有復雜的免疫逃避機制?；蚪M結構與痘病毒相似，為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈dna，大小為170-190kb，末端堿基相互連接。asfv主要感染各種組織中網(wǎng)狀內皮細胞和單核巨噬細胞。動物感染強毒力毒株后組織表現(xiàn)出廣泛性的損傷；感染低毒力毒株后，感染組織范圍和對組織的損傷較輕。研究證明影響asfv毒力的基因，也是引起細胞病變的主要因素。asfv的多個基因對家豬的致病性有關，但并不影響病毒在巨噬細胞中的復制，如dp96r和dp71l等；asfv感染也會影響并調節(jié)宿主免疫應答，病毒操縱細胞死亡途徑為自身復制提供有力條件，包括細胞凋亡、焦亡、壞死性凋亡等。細胞凋亡作為一種程序性細胞死亡機制，在清除病毒感染的細胞和維持組織穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用。大量研究表明，asfv感染顯著誘導免疫細胞凋亡，這在asf的發(fā)病機制中占有舉足輕重的地位。先前的研究表明，在病毒感染的早期階段，病毒傾向于抑制細胞凋亡，以建立有利于其復制的微環(huán)境。隨著病毒感染進入晚期，病毒誘導的細胞凋亡產(chǎn)生大量攜帶無外包膜病毒顆粒的凋亡小體；一旦被鄰近細胞吞噬，這些asfv可以以“特洛伊木馬”的方式巧妙地逃避宿主免疫監(jiān)視，引發(fā)新一輪感染。

3、p54蛋白存在于病毒粒子內層囊膜，是asfv重要的結構蛋白，由e183l基因編碼，分子質量約為25kda，含有一段跨膜區(qū)域，主要集中在衍生的內質網(wǎng)處，p54蛋白的跨膜結構在病毒蛋白經(jīng)內質網(wǎng)轉化成病毒膜前體時起到重要作用。之前的研究表明，p54蛋白的羧基末端區(qū)域含有一個動力蛋白lc8鏈的結合基序，參與細胞凋亡的誘導。然而，目前還沒有直接證據(jù)證明p54蛋白在asfv感染期間凋亡中的作用。

4、因此，本領域的技術人員致力于開發(fā)一種缺失p54蛋白促凋亡基序的重組非洲豬瘟弱毒疫苗及其制備方法和應用。

技術實現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是開發(fā)一種缺失p54蛋白促凋亡基序的重組非洲豬瘟弱毒疫苗及其制備方法和應用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種重組非洲豬瘟弱毒疫苗，包括促凋亡基序缺失的p54蛋白，由e183l基因編碼，核苷酸序列如seq?id?no.1所示；缺失的促凋亡基序為asfv?gz分離株全基因組序列162311-162355和162251-162355的核苷酸序列，缺失促凋亡基序的p54蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

3、本發(fā)明還提供了一種重組非洲豬瘟弱毒疫苗的制備方法，包括以下步驟：

4、步驟1、構建同源重組載體：利用puc19載體作為骨架載體，構建p54蛋白150-164位氨基酸和150-184位氨基酸敲除用同源重組轉移載體，獲得同源重組載體質粒p72gfp-p54△dbm(p54△150-164)和p72gfp-p54△ctm(p54△150-184)。

5、步驟2、構建重組asfv-p54△dbm和asfv-p54△ctm重組病毒：將步驟1得到的同源重組載體質粒p72gfp-p54△dbm或p72gfp-p54△ctm轉染至pam細胞，然后感染asfv?gz病毒；然后通過連續(xù)的egfp陽性單細胞純化得到asfv-p54△dbm和asfv-p54△ctm重組病毒。

6、進一步地，步驟1還包括：p54蛋白由e183l基因編碼，e183l基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，敲除的e183l基因序列為asfv?gz分離株全基因組序列162311-162355和162251-162355的核苷酸序列。

7、進一步地，步驟1還包括：將p54蛋白第150-164位氨基酸或150-184位氨基酸的基因片段上下游序列各1200bp作為同源重組同源臂、asfvp72啟動子和gfp基因的pcr片段通過融合pcr試劑盒克隆至puc19載體，其中gfp基因在asfvp72晚期啟動子的控制下進行表達。

8、進一步地，同源重組同源臂包括左臂和右臂，左臂核苷酸序列如seq?id?no.2所示；右臂核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

9、進一步地，步驟2還包括：

10、將2μg的p72gfp-p54△dbm或p72gfp-p54△ctm轉染至pam細胞，然后在轉染后6h，以1moi的劑量感染asfv?gz病毒；感染后24h，從單層pam細胞中挑選表達egfp的細胞并用無菌pbs沖洗，然后接種至新的pam細胞中，然后通過連續(xù)的egfp陽性單細胞純化得到asfv-p54△dbm和asfv-p54△ctm重組病毒。

11、進一步地，轉染使用的試劑盒為-macrophage。

12、進一步地，步驟2還包括通過常規(guī)pcr程序對重組病毒的純度進行評估和鑒定，使用的引物為p54-check-f和p54-check-r；p54-check-f序列為：5'-gttttgatgcatttagatacca-3'；p54-check-r序列為:5'-caacatactgttgtatattataag-3'。

13、進一步地，asfv?gz病毒全長序列見genbank登錄號：mt496893.1。

14、本發(fā)明還提供了重組非洲豬瘟弱毒疫苗在預防非洲豬瘟的應用。

15、在本發(fā)明的較佳實施方式1中，詳細說明了重組非洲豬瘟弱毒疫苗的制備過程；

16、在本發(fā)明的另一較佳實施方式2中，詳細說明了asfv?p54蛋白與宿主因子相互作用鑒定過程；

17、在本發(fā)明的另一較佳實施方式3中，詳細說明了asfv?p54與scamp3相互作用對細胞凋亡的影響；

18、在本發(fā)明的另一較佳實施方式4中，詳細說明了asfvp54誘導細胞凋亡的關鍵基序鑒定過程；

19、在本發(fā)明的另一較佳實施方式5中，詳細說明了asfv?p54促凋亡基序缺失顯著降低asfv通過凋亡體途徑的胞間傳播；

20、在本發(fā)明的另一較佳實施方式6中，詳細說明了asfv-p54△dbm和asfv-p54△ctm重組病毒的生物活性分析過程。

21、本發(fā)明有益的技術效果如下：

22、本發(fā)明通過免疫沉淀—質譜分析，篩選出了asfv感染過程中與p54蛋白發(fā)生相互作用的宿主因子scamp3；并發(fā)現(xiàn)p54蛋白發(fā)揮促凋亡功能的關鍵基序，參與asfv誘導的出芽性凋亡體的產(chǎn)生，從而促進asfv的胞間傳播；通過在asfv?gz分離株中缺失了p54蛋白的促凋亡基序，構建獲得了一種p54蛋白促凋亡基序敲除的重組asfv，asfv重組病毒促凋亡能力顯著減弱；并且缺失p54蛋白促凋亡基序的重組asfv與scamp3互作削弱導致病毒通過凋亡體傳播受阻；動物實驗結果顯示，本發(fā)明構建的p54蛋白促凋亡基序敲除的重組asfv對家豬的致病力顯著降低，可作為重組疫苗株，能夠促進宿主免疫反應，誘導高水平抗體，并有效抵抗野生型強毒的致死劑量攻擊，具備良好的應用前景。

23、本發(fā)明篩選鑒定asfv編碼的與致病性相關的毒力靶點，通過基因工程手段構建相關毒力基因缺失的重組病毒，使其喪失致病力并保留免疫原性。制備了一種基于p54蛋白促凋亡基序缺失的重組非洲豬瘟弱毒疫苗。

24、本發(fā)明鑒定了p54蛋白促凋亡基序，通過基因編輯技術成功得到p54蛋白促凋亡基序缺失的重組asfv。通過部分缺失p54蛋白發(fā)揮促凋亡作用的關鍵基序，使其喪失促凋亡功能，但不影響其參與病毒粒子的組裝。突破了asfv膜蛋白p54無法人工缺失的問題，獲得一株缺失p54蛋白促凋亡基序的重組asfv。

25、本發(fā)明通過免疫沉淀—質譜分析，篩選出了p54蛋白通過與scamp3相互作用發(fā)揮促凋亡功能。證明了宿主因子scamp3在細胞凋亡體釋放中發(fā)揮重要作用。解析了p54蛋白發(fā)揮促凋亡功能的分子機制，豐富了我們對asfv感染與致病的理論認知。

26、通過缺失p54蛋白與宿主因子scamp3發(fā)生相互作用的關鍵氨基酸區(qū)段，削弱凋亡體途徑的胞間傳播。削弱凋亡體途徑的胞間傳播能力的重組asfv對家豬的致病性顯著降低，可作為重組疫苗株，能夠促進宿主免疫反應，誘導高水平抗體，并有效抵抗野生型強毒的致死劑量攻擊。發(fā)現(xiàn)p54蛋白通過胞外域150-184aa基序與宿主細胞中scamp3蛋白發(fā)生相互作用，參與asfv誘導的出芽性凋亡體的產(chǎn)生，從而促進asfv的胞間傳播。

27、以下將結合附圖對本發(fā)明的構思、具體結構及產(chǎn)生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。