本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種重組帶狀皰疹疫苗組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、水痘-帶狀皰疹病毒（vzv）是廣泛存在于全球人口中的一種病原體，感染全球90%以上的人。vzv原發(fā)感染常發(fā)于兒童時(shí)期，可發(fā)為以全身水皰性發(fā)疹為特征的水痘，并在感染后潛伏在宿主的神經(jīng)元細(xì)胞中。隨著年齡增長(zhǎng)、免疫功能減退或其他因素影響，潛伏的病毒可再次激活，沿著外周神經(jīng)擴(kuò)散，引起帶狀皰疹（hz）。隨著疫苗的普及，目前水痘的發(fā)病率基本被控制住，但是很多老年人出現(xiàn)hz的現(xiàn)象較為普遍。對(duì)于初次感染vzv且免疫力低下或vzv再激活的人群，常會(huì)伴有腦膜炎、腦卒中、hz后遺神經(jīng)痛等并發(fā)癥，降低患者的生活質(zhì)量、甚至危及生命。

2、全球范圍內(nèi)，帶狀皰疹疾病相關(guān)疫苗可分為兩種類(lèi)型：減毒帶狀皰疹疫苗和重組亞單位帶狀皰疹疫苗。前者在帶狀皰疹的預(yù)防中發(fā)揮作用，但隨著年齡的增長(zhǎng)，效果大大減弱，而后者在所有年齡段均發(fā)揮了較高的保護(hù)作用，可以維持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。目前，國(guó)際上批準(zhǔn)上市的hz疫苗為默克公司的zostavax，其預(yù)防hz的有效性為69.8％（50-59歲）和51％（60歲以上）。此外，還有葛蘭素史克（gsk）的重組亞單位帶狀皰疹疫苗shringrix，該疫苗成份為帶狀皰疹病毒ge蛋白和佐劑系統(tǒng)as01b。as01b佐劑系統(tǒng)是一種包含單磷酸酰脂質(zhì)a和皂素qs-21的脂質(zhì)體佐劑，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。臨床研究表明，shringrix疫苗可以顯著地降低50歲以上人群罹患hz的風(fēng)險(xiǎn)（91％～97％），并且能有效地降低隨后的phn風(fēng)險(xiǎn)（≥80％），研究發(fā)現(xiàn)，shringrix在老年人群形成長(zhǎng)期保護(hù)的原因可能與其能夠誘導(dǎo)較高水平的il-2、ifn-γ有關(guān)。亞單位帶狀皰疹疫苗在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)前景巨大。

3、隨著生物技術(shù)在疫苗產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的不斷發(fā)展和進(jìn)步，目前確定的vzv病毒表面糖蛋白有9種，其中g(shù)e糖蛋白是vzv表達(dá)量最高的糖蛋白，在病毒的復(fù)制和組裝過(guò)程中起到主要作用，也介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間的傳播。鑒于vzv-ge具有很強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)vzv的免疫反應(yīng)，它已成為vzv亞單位疫苗和dna疫苗的主要候選抗原之一。

4、目前，已被證實(shí)和使用的佐劑種類(lèi)已達(dá)上百種：

5、?1.無(wú)機(jī)鹽類(lèi)佐劑

6、主要是鋁及鎂的鹽類(lèi)化合物，是最早發(fā)現(xiàn)以及使用最廣泛的疫苗佐劑。大量的臨床試驗(yàn)認(rèn)為鋁佐劑能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的體液免疫，但會(huì)引起注射部位反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力較弱。鋁鹽主要包括磷酸鋁、氫氧化鋁和硫酸鋁三種。目前常用的鋁佐劑為氫氧化鋁和磷酸鋁。鋁佐劑的作用機(jī)理主要包括儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)、免疫刺激效應(yīng)，鋁佐劑還可以通過(guò)活化nlrp3炎性小體刺激先天免疫和誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌il-1β和il-18。此外，鋁佐劑可以刺激注射部位的壞死細(xì)胞釋放dna、atp和尿酸等損傷相關(guān)模式分子（damps），而釋放的damps有助于樹(shù)突狀細(xì)胞和cd4+t細(xì)胞的相互作用。目前為止，鋁佐劑仍然是疫苗中唯一廣泛使用的佐劑。然而，鋁佐劑存在極大的缺陷：它對(duì)增加血清抗體通常有效，但會(huì)引起注射部位反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力較弱，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。

7、2.油水乳劑佐劑

8、油佐劑是傳統(tǒng)佐劑類(lèi)型，其中最著名的是弗氏佐劑，目前在動(dòng)物用滅活疫苗中被廣泛使用，但毒性較大。近年來(lái)，開(kāi)發(fā)出一種與弗氏佐劑類(lèi)似的乳劑性佐劑，如角鯊烯水包油佐劑、as03和af03等。單獨(dú)使用免疫原性相對(duì)較差，需要提高用量以增加免疫原性。但是提高佐劑用量，就要面臨更大的副作用問(wèn)題。油乳劑的副作用主要包括強(qiáng)烈的疼痛感，在接種位點(diǎn)處形成的炎癥反應(yīng)、肉芽腫以及潰瘍等。

9、3.靶向于模式識(shí)別受體的佐劑

10、細(xì)菌、真菌、病毒以及植物中的一些成分能通過(guò)靶向模式識(shí)別受體，激活先天免疫，從而成為潛在的疫苗佐劑。如單磷酰脂質(zhì)a（mpla）、cpg基序等。單獨(dú)使用免疫原性相對(duì)較差，增加用量則會(huì)增加副作用風(fēng)險(xiǎn)，包括注射位點(diǎn)疼痛、腫脹、硬結(jié)、紅疹等局部反應(yīng)以及流感樣癥狀等系統(tǒng)癥狀。

11、4.細(xì)胞因子類(lèi)佐劑

12、細(xì)胞因子佐劑主要調(diào)控th1/th2細(xì)胞免疫過(guò)程中的反應(yīng)類(lèi)型，同時(shí)影響各細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和刺激信號(hào)。最早用作佐劑的細(xì)胞因子il-1可增強(qiáng)對(duì)抗原的初次和二次反應(yīng)，誘導(dǎo)抗原特異性t細(xì)胞活性增強(qiáng)和b細(xì)胞增殖。細(xì)胞因子可被分為白細(xì)胞介素（il）、干擾素（ifn）、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明重點(diǎn)在于提供一種新一代的重組帶狀皰疹預(yù)防性疫苗，該疫苗中含有水痘帶狀皰疹病毒（vzv）抗原?，F(xiàn)有的vzv-ge蛋白的研究可知，野生型vzv-ge的蛋白分子包括有四個(gè)區(qū)域，即信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，而vzv-ge的3個(gè)抗原決定簇均分布在胞外區(qū)?？紤]到疏水性跨膜區(qū)域?qū)ν庠吹鞍踪|(zhì)表達(dá)的影響等因素，可通過(guò)去除跨膜區(qū)（疏水區(qū)）和胞內(nèi)區(qū)（例如專(zhuān)利cn102517302a）實(shí)現(xiàn)提高蛋白的表達(dá)水平。

2、另外本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步增強(qiáng)預(yù)防效果、提高免疫記憶能力、減少并發(fā)癥和后遺癥，選擇性地增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，同時(shí)避免了減毒活疫苗存在的風(fēng)險(xiǎn)，提供一種帶狀皰疹重組蛋白疫苗佐劑配方。

3、本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：

4、一種重組帶狀皰疹疫苗組合物，包含ge蛋白和佐劑，所述佐劑為角鯊烯水包油佐劑，所述角鯊烯水包油佐劑包括以下濃度組分：角鯊烯：4-5wt%；吐溫80：0.2-0.8wt%；司盤(pán)85：0.2-0.8wt%。

5、所述ge蛋白的序列號(hào)如下：

6、svlryddfhtdedkldtnsvyepyyhsdhaesswvnrgessrkaydhnspyiwprndydgflenahehhgvynqgrgidsgerlmqptqmsaqedlgddtgihviptlngddrhkivnvdqrqygdvfkgdlnpkpqgqrmievsveenhpftlrapiqriygvrytetwsflpsltctgdaapaiqhiclkhttcfqdvvvdvdcaentkedqlaeisyrfqgkkeadqpwivvntstlfdeleldppeiepgvlkvlrtekqylgvyiwnmrgsdgtstyatflvtwkgdektrnptpavtpqprgaefhmwnyhshvfsvgdtfslamhlqykiheapfdlllewlyvpidptcqpmrlystclyhpnapqclshmnsgctftsphlaqrvastvyqncehadnytayclgishmepsfglilhdggttlkfvdtpeslsglyvfvvyfnghveavaytvvstvdhfvnaieergfpptagqppattkpkeitpvnpgtspllry。

7、在實(shí)施例中，所述角鯊烯水包油佐劑包括以下濃度組分：角鯊烯：4.3wt%；吐溫80：0.5wt%；司盤(pán)85：0.5wt%，添加檸檬酸緩沖液用于調(diào)節(jié)ph值為6.5。

8、優(yōu)選的，所述ge蛋白的含量為20-100μg/ml。

9、優(yōu)選的，所述ge蛋白的制備方法如下：

10、構(gòu)建plk002-22p20-a2：以plk002作為空載體，在抗原dna序列信號(hào)肽前端添加hind?iii酶切位點(diǎn)和kozak序列，后端添加終止密碼子和not?i酶切位點(diǎn)；分別回收載體和目的片段后進(jìn)行連接，通過(guò)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒dna進(jìn)行測(cè)序及酶切鑒定，成功構(gòu)建plk002-22p20-a表達(dá)載體；在抗原dna序列信號(hào)肽前端添加kozak序列，后端添加終止密碼子，通過(guò)同源重組方法將22p20-a2替換掉plk002載體上hindiii到not?i的dna序列，通過(guò)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序及酶切鑒定，最終成功構(gòu)建plk002-22p20-a2；

11、以cho?k1bn懸浮細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，將上述構(gòu)建plk002-22p20-a2的表達(dá)載體通過(guò)電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞通過(guò)加壓篩選、逐級(jí)擴(kuò)增、elisa和sec-hplc篩選出高表達(dá)單克隆株，連續(xù)傳代培養(yǎng)，離心過(guò)濾收獲培養(yǎng)上清，收集的上清液通過(guò)澄清過(guò)濾、第一次陰離子層析、低ph孵育+深層過(guò)濾、疏水層析、第一次超濾換液、第二次深層過(guò)濾、第二次陰離子層析、第二次超濾換液、納濾、稀配及原液除菌過(guò)濾，得到最終樣品，即ge蛋白。

12、優(yōu)選的，所述角鯊烯水包油佐劑液滴直徑為150-180nm；優(yōu)選的，所述角鯊烯水包油佐劑液滴直徑為160nm。

13、優(yōu)選的，所述角鯊烯水包油佐劑體積為25-50%。

14、優(yōu)選的，還包含緩沖液，所述緩沖液為pbs緩沖液、tris-hcl緩沖液和檸檬酸鹽緩沖液中的至少一種。

15、優(yōu)選的，還包括化學(xué)趨化因子；所述化學(xué)趨化因子加入量為5-15μg/ml。

16、進(jìn)一步的，所述化學(xué)趨化因子為ccl3/mip-1α和cxcl10/ip-10中的至少一種，更進(jìn)一步的，所述化學(xué)趨化因子為30-70wt%的ccl3/mip-1α和30-70wt%的cxcl10/ip-10組合而成。

17、化學(xué)趨化因子ccl3/mip-1α和/或cxcl10/ip-10的添加有助于吸引更多的免疫細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞、t細(xì)胞）遷移到疫苗接種部位和局部淋巴結(jié)，增強(qiáng)抗原遞呈和特異性免疫應(yīng)答。通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的趨化和活化狀態(tài)，促進(jìn)th1型免疫應(yīng)答，有利于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御，同時(shí)保持一定程度的th2應(yīng)答，以促進(jìn)抗體產(chǎn)生。強(qiáng)化的免疫細(xì)胞激活和優(yōu)化的th1/th2平衡有助于形成強(qiáng)大的免疫記憶，為長(zhǎng)期保護(hù)提供基礎(chǔ)。

18、所述的重組帶狀皰疹疫苗組合物的制備方法，將角鯊烯水包油佐劑與ge蛋白混合，再加入緩沖液，在避光條件下，吹打吸附，得到重組帶狀皰疹疫苗組合物。

19、有益技術(shù)效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：

20、1、本發(fā)明的重組帶狀皰疹疫苗組合物，經(jīng)過(guò)二次免疫后ge抗原特異性igg表達(dá)水平均有所提升，在體液免疫應(yīng)答水平，ge蛋白、角鯊烯水包油佐劑的組合物可以有效促進(jìn)b淋巴細(xì)胞反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)特異性igg抗體的產(chǎn)生，有效預(yù)防帶狀皰疹再次發(fā)生，在預(yù)防帶狀皰疹方面發(fā)揮重要作用。

21、2、本發(fā)明的重組帶狀皰疹疫苗組合物，在細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，ge、角鯊烯水包油佐劑佐劑可以有效促進(jìn)th1細(xì)胞反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞因子ifn-γ和il-2的分泌，il-2可以有效激活cd4+和cd8+t細(xì)胞及形成記憶表型，促進(jìn)cd4+t細(xì)胞向th1和th2細(xì)胞的分化，ifn-γ對(duì)殺滅帶狀皰疹病毒起促進(jìn)作用，二者協(xié)調(diào)作用阻止病毒再激活，控制病毒的細(xì)胞內(nèi)感染、維持病毒的潛伏狀態(tài)。

22、3、本發(fā)明的重組帶狀皰疹疫苗組合物，使用了vzv-ge蛋白，配合角鯊烯水包油佐劑，顯示出在免疫原性、細(xì)胞因子表達(dá)方面的明顯提升，比單獨(dú)使用氫氧化鋁佐劑、cpg佐劑的免疫效果好。

23、4、本發(fā)明的重組帶狀皰疹疫苗組合物，還包括了化學(xué)趨向因子ccl3/mip-1α和/或cxcl10/ip-10，cxcl10/ip-10通過(guò)其特定的受體cxcr3，特別是促進(jìn)th1細(xì)胞的遷移和活化，這對(duì)于形成針對(duì)病原體的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。當(dāng)這兩種趨化因子共同作用時(shí)，它們不僅招募了一個(gè)更廣泛和多樣化的免疫細(xì)胞群體，而且還特別增強(qiáng)了針對(duì)特定病原體的免疫防御能力。因此，ccl3/mip-1α和cxcl10/ip-10的組合實(shí)現(xiàn)了對(duì)免疫系統(tǒng)的全面激活，包括強(qiáng)化了體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是通過(guò)促進(jìn)ifn-γ、tnf-α和il-2的產(chǎn)生，這些因子對(duì)抵御感染和疾病至關(guān)重要。

24、5、本發(fā)明充分運(yùn)用現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)，可以高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的反應(yīng)免疫應(yīng)答水平，為佐劑配方篩選提供良好的支持。