本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種仿生納米囊泡及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥免疫治療是近年來腫瘤學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要進(jìn)展，其中的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune?checkpoint?inhibitors，icis）為部分癌癥患者帶來了顯著生存獲益。作為一種免疫檢查點(diǎn)受體，程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed?cell?death?receptor-1，pd-1）通過與其主要配體（programmed?cell?death?receptor-ligand?1，pd-l1）結(jié)合，阻礙了t細(xì)胞效應(yīng)因子對抗癌癥的功能?；趐d-1/pd-l1的腫瘤免疫治療已被證明在黑色素瘤和三陰性乳腺癌的治療中具備有效性。然而，由于免疫激活不足，例如腫瘤細(xì)胞固有的低免疫原性、免疫細(xì)胞浸潤不足或耗盡、腫瘤免疫微環(huán)境呈現(xiàn)抑制性等原因，導(dǎo)致免疫治療的應(yīng)答率較低，僅有20%~30%的癌癥患者能從pd-1/pd-l1抑制劑中獲益，甚至部分患者會不可避免地發(fā)生快速進(jìn)展和惡化的情況。

2、研究表明，環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶合酶-干擾素基因刺激因子（cyclic?gmp-ampsynthase?-?stimulator?of?interferon?genes，cgas-sting）通路的激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有十分緊密的聯(lián)系，其通常被認(rèn)為是腫瘤免疫的有效調(diào)節(jié)器。除了腫瘤細(xì)胞中的cgas-sting通路會被激活導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡或死亡，在腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤來源的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic?acid，dna），并能夠激活cgas-sting通路，促進(jìn)腫瘤特異性抗原呈遞和細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞（cytotoxic?t?lymphocyte，ctl）活化。值得注意的是，陳志堅(jiān)教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了pd-l1阻斷劑在sting敲除小鼠中的抗腫瘤效果會有所減弱。因此認(rèn)為，sting通路的激活有望增強(qiáng)icis的治療效果。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了cgas-sting通路在腫瘤免疫中的重要作用，目前越來越多的研究集中在sting激動劑的合成和篩選上，其中最經(jīng)典的第一代sting激動劑是環(huán)二核苷酸（cyclic?dinucleotide，cdn）類似物，但是它們往往面臨血漿清除快、細(xì)胞膜通透性差、無法到達(dá)細(xì)胞質(zhì)等限制。

3、光免疫療法是光療和免疫療法相結(jié)合的新型治療方法，與單一的治療方式相比，該方法可以顯著提高治療效果，目前已有多種光敏劑用于光免疫治療。作為光敏劑，吲哚菁綠（indocyanine?green，icg）能在808?nm近紅外光照射下實(shí)現(xiàn)光動力治療（photodynamictherapy，pdt）和光熱治療（photothermal?therapy，ptt）。腫瘤免疫殺傷效應(yīng)包括腫瘤抗原釋放，抗原提呈，免疫系統(tǒng)激活，t淋巴細(xì)胞遷移，t淋巴細(xì)胞浸潤，識別腫瘤細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞這七個(gè)步驟。免疫細(xì)胞少、難以滲透的被稱為“冷腫瘤”。icg在殺傷腫瘤細(xì)胞提供腫瘤特異性抗原的同時(shí)也具有免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic?cell?death，icd）誘導(dǎo)潛能。在icd過程中，腫瘤細(xì)胞可通過釋放大量的損傷相關(guān)分子模式（damage?associatedmolecular?patterns，damps）激活樹突狀細(xì)胞從而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答，啟動級聯(lián)過程，導(dǎo)致抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答。然而，icg存在著一些缺點(diǎn)，如光穩(wěn)定性差、光熱能力弱、非特異性靶向以及在活體組織內(nèi)快速被降解和清除等，限制了其在腫瘤治療中的潛力。

4、在應(yīng)對這些挑戰(zhàn)的可能策略中，細(xì)胞膜衍生的納米囊泡（nanovesicles，nvs）提供了一種具有前景的藥物遞送方案。由于其生物物理學(xué)特性，細(xì)胞膜衍生的納米囊泡如外泌體、大囊泡和膜擠壓囊泡，在輸送藥物方面具有巨大潛力。它們具有良好的生物相容性、低毒性和低免疫原性，從而在細(xì)胞間通訊方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在不足，本發(fā)明提供一種仿生納米囊泡及其制備方法與應(yīng)用，將pd-1蛋白、sting激動劑和近紅外探針整合到仿生細(xì)胞膜囊泡中，得到最終產(chǎn)物cdn@pm-icg。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種仿生納米囊泡，所述的仿生納米囊泡由細(xì)胞膜與pd-1蛋白，sting激動劑以及光敏劑組成，其中細(xì)胞膜與pd-1蛋白為表達(dá)pd-1的細(xì)胞的細(xì)胞膜，sting激動劑為環(huán)二核苷酸（cdn）類似物。

3、所述的環(huán)二核苷酸（cdn）類似物為sting激動劑2',3'-cgamp。

4、所述的光敏劑為光敏劑吲哚菁綠（icg）。

5、所述的表達(dá)pd-1的細(xì)胞為表達(dá)pd-1的hek?293t細(xì)胞。

6、所述的仿生納米囊泡為表達(dá)pd-1的hek?293t細(xì)胞的細(xì)胞膜負(fù)載光敏劑吲哚菁綠（icg）和sting激動劑2',3'-cgamp得到。

7、一種仿生納米囊泡的制備方法，包括以下步驟：

8、s1、構(gòu)建包含pd-1基因的慢病毒，使用該慢病毒轉(zhuǎn)染hek?293t細(xì)胞，培養(yǎng)后，篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，獲得pd-1蛋白的穩(wěn)定表達(dá)系，將穩(wěn)定表達(dá)pd-1蛋白的hek?293t細(xì)胞培養(yǎng)，收集這些細(xì)胞；

9、s2、用hepes-naoh、edta、蔗糖和蛋白酶抑制劑，且ph?7.4的均質(zhì)培養(yǎng)基（hm）重懸細(xì)胞，之后，冰上超聲波破碎，離心獲得細(xì)胞膜片段后和sting激動劑多次過濾；0.8?μm過濾器至少10次，然后0.22?μm過濾至少10次；

10、s3、將icg和s2得到的細(xì)胞膜片段和sting激動劑泡攪拌過夜并再次通過多次過濾后共擠壓得到仿生膜納米囊泡。

11、所述的步驟s2中多次過濾為先0.8?μm過濾器至少10次，然后0.22?μm過濾至少10次。

12、所述的步驟s3中多次過濾后共擠壓為通過0.8?μm及0.22?μm過濾后共擠壓。

13、一種仿生納米囊泡在制備腫瘤的光免疫治療藥物上的應(yīng)用。

14、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種仿生納米囊泡及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明將pd-1蛋白、sting激動劑和近紅外探針整合到仿生細(xì)胞膜囊泡中，制得最終產(chǎn)物cdn@pm-icg，尾靜脈注射該仿生納米囊泡，其被動靶向到腫瘤組織后，給予的激光照射會使之產(chǎn)生光熱和光動力效應(yīng)，并且破壞囊泡結(jié)構(gòu)，釋放出cdn，其中pd-1蛋白可以有效破壞pd-1/pd-l1免疫抑制軸，icg介導(dǎo)的光療可以破壞腫瘤細(xì)胞，釋放出的cdn會激活胞內(nèi)的sting信號通路并協(xié)同光療介導(dǎo)的icd，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向m1極化，激活cd8+t細(xì)胞，從而達(dá)到提高tnbc療效的目的。

技術(shù)特征：

1.一種仿生納米囊泡，其特征在于，所述的仿生納米囊泡由細(xì)胞膜與pd-1蛋白，sting激動劑以及光敏劑組成，其中細(xì)胞膜與pd-1蛋白為表達(dá)pd-1的細(xì)胞的細(xì)胞膜，sting激動劑為環(huán)二核苷酸（cdn）類似物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種仿生納米囊泡，其特征在于，所述的環(huán)二核苷酸（cdn）類似物為sting激動劑2',3'-cgamp。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種仿生納米囊泡，其特征在于，所述的光敏劑為光敏劑吲哚菁綠（icg）。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種仿生納米囊泡，其特征在于，所述的表達(dá)pd-1的細(xì)胞為表達(dá)pd-1的hek?293t細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種仿生納米囊泡，其特征在于，所述的仿生納米囊泡為表達(dá)pd-1的hek?293t細(xì)胞的細(xì)胞膜負(fù)載光敏劑吲哚菁綠（icg）和sting激動劑2',3'-cgamp得到。

6.一種權(quán)利要求1所述的仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟s2中多次過濾為先0.8?μm過濾器至少10次，然后0.22?μm過濾至少10次。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟s3中多次過濾后共擠壓為通過0.8?μm及0.22?μm過濾后共擠壓。

9.一種權(quán)利要求1所述的仿生納米囊泡在制備腫瘤的光免疫治療藥物上的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
一種仿生納米囊泡及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明將PD?1蛋白、STING激動劑和近紅外探針整合到仿生細(xì)胞膜囊泡中，制得最終產(chǎn)物CDN@PM?ICG，尾靜脈注射該仿生納米囊泡，其被動靶向到腫瘤組織后，給予的激光照射會使之產(chǎn)生光熱和光動力效應(yīng)，并且破壞囊泡結(jié)構(gòu)，釋放出CDN，其中PD?1蛋白可以有效破壞PD?1/PD?L1免疫抑制軸，ICG介導(dǎo)的光療可以破壞腫瘤細(xì)胞，釋放出的CDN會激活胞內(nèi)的STING信號通路并協(xié)同光療介導(dǎo)的ICD，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，激活CD8<supgt;+</supgt;T細(xì)胞，從而達(dá)到提高TNBC療效的目的。

技術(shù)研發(fā)人員：李智銘,王文文,李春穎,萬藝林,邵君宜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5