專利名稱：一種新的多肽制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的分離蛋白，具體涉及由哺乳動(dòng)物肝臟肝內(nèi)膽汁管或由哺乳動(dòng)物骨髓分離的純凈蛋白。更具體地講，本發(fā)明涉及一種稱之為probursin的哺乳動(dòng)物蛋白，該蛋白可用化學(xué)方法合成或重組復(fù)制。本發(fā)明還涉及含有probursin的治療組合物及使用該組合物的方法。
脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的B淋巴細(xì)胞或B細(xì)胞對(duì)引入動(dòng)物體的外源性抗原呈現(xiàn)抗體反應(yīng)。就鳥(niǎo)類而言，前體B細(xì)胞在稱作Fabricius囊的器官中發(fā)生變異。就哺乳動(dòng)物而言，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與Fabricius囊具有同等功能的器官，據(jù)認(rèn)為有相對(duì)于B細(xì)胞的造血前體存在，并且可以在骨髓中變異為成熟B細(xì)胞。
直到最近，將B細(xì)胞前體變異為B細(xì)胞的激素誘導(dǎo)物還屬未知。但是，由本發(fā)明者之一及其他人所進(jìn)行的早期研究表明在雞的Fabricius囊提取物中有特異性B細(xì)胞變異誘導(dǎo)物存在。在本文引為對(duì)比文獻(xiàn)的下列文章中報(bào)導(dǎo)了這一早期工作Brand，etal，Science，193319-321(1976年7月23日);Brand，etal，Nature，269;597-598(1977年10月13日);Goldstein，etal，ColdSpringHarborSymposiaonQuanti-tativeBiology，XLI5-8(1977);Gold-stein，“增殖和變異的分子控制”(“MolecularControlofProliferationandDifferen-tiation”)P.197-202，AcacdemicPress(1977)。
最近，本發(fā)明者和其他人簽定了一種用作B細(xì)胞變異特異性誘導(dǎo)物的稱之為bursin三肽激素，其氨基酸序列為L(zhǎng)ys-His-Gly-NH2。也稱之為bursopoietin的這一多肽對(duì)鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物均有活性，并在本文引為對(duì)比文獻(xiàn)的美國(guó)專利4，584，284中作了介紹。
在本領(lǐng)域中已公開(kāi)了其他內(nèi)分泌多肽。生長(zhǎng)激素釋放抑制因子是由下丘腦和胰島細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)狀十四肽。生長(zhǎng)激素釋放抑制因子抑制下列激素的釋放，這些激素包括生長(zhǎng)素，促甲狀腺激素，促腎上腺皮質(zhì)激素，胰島素，胰高血糖素，促胃酸激素，腸促胰液肽，血管緊張肽原酶。另一個(gè)這類調(diào)節(jié)肽是tuftsin，是由循環(huán)免疫球蛋白中產(chǎn)生的堿性四肽，該四肽刺激在多形核白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的吞噬作用?！矃⒁?jiàn)V.A.Najjaretal，Nature228672(1970);Y.Stabinskyetal，Mol.Cell.Biochem.，3071(1980);A.Constantopoulosetal，Cytobios.，697(1972)〕。
至今還未弄清這些激素(包括B細(xì)胞變異因子bursin)相互之間的關(guān)系。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在使B細(xì)胞變異并對(duì)其他組織產(chǎn)生影響的各種激素作用之間的關(guān)系極有可能成為治療人體和動(dòng)物免疫疾病和肝臟機(jī)能障礙的一種新方法。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種從哺乳動(dòng)物骨髓或肝臟獲得的純凈14氨基酸多肽。該多肽，即probursln也可按標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成技術(shù)制得。另外，通過(guò)重組技術(shù)也可制得該多肽。
Probursin尤其具有特異性誘發(fā)B細(xì)胞前體骨髓細(xì)胞變異的能力。因此，對(duì)于治療人體和動(dòng)物免疫系統(tǒng)B細(xì)胞缺陷及各種肝臟疾病而言，該多肽是十分有用的。另外，Probursin具有抑制生長(zhǎng)激素從腦垂體釋放的功能。生長(zhǎng)激素釋放加速某些惡性腫瘤的生長(zhǎng)。因此，Probursin也可用于治療某些癌癥，對(duì)腫瘤產(chǎn)生特異性抑制。
本發(fā)明的目之二是提供一種含有Probursin的治療組合物。目的之三包括利用這些治療組合物治療下述疾病的方法，這些疾病包括由于B細(xì)胞變異因子不足或缺乏而引起的B細(xì)胞變異不足，不能充分控制由生長(zhǎng)激素釋放抑制因子調(diào)節(jié)的那些激素，和/或提高免疫系統(tǒng)在循環(huán)中吞噬外源性粒子的能力。采用Probutsin的其他治療方法包括依上所述治療癌癥。
本發(fā)明的目的之四是提供用于合成或重組制備Probursin的新的中間體，包括新的多肽樹(shù)酯中間體，新的載體和新的轉(zhuǎn)移宿主細(xì)胞。
根據(jù)本文的下列優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述，可以十分清楚地看到本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)。


圖1圖解說(shuō)明由牛肝臟獲得的純凈Probursin組份的光密度。
圖2說(shuō)明Probursin的硅膠薄層層析。
圖3圖解說(shuō)明各種滴定度的抗-bursin抗體(圓點(diǎn))和兔血清(方塊)的光密度。
圖3B圖解說(shuō)明KLH-對(duì)照共軛物(方塊)，KLH-bursin(三角)和游離Probursin(圓環(huán))光密度VS.吸收濃度。
圖4圖解說(shuō)明每一降解周期PTH氨基酸的得量。
圖5A圖解說(shuō)明經(jīng)Probursin，bursin，豬胰島素(A)，馬肌紅蛋白(B)和牛生長(zhǎng)激素(C)孵育后，Daudi細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀GMP水平;
圖5B圖解說(shuō)明如上所述經(jīng)Probursin，bursin，(A)，(B)，(C)孵育后，MOPC-315細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀GMP水平、依此作為對(duì)照。
本發(fā)明提供了一種稱之為Probursin的新的哺乳動(dòng)物分離多肽，其特征在于相同或基本相同的氨基酸序列(1)(5)(10)(14)Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg在該14氨基酸Probursin序列中的前5個(gè)氨基酸殘基與生長(zhǎng)激素釋放抑制因子的活性部位相對(duì)應(yīng)。Probursin中氨基酸殘基5至8與人體多肽uftsin的活性部位相對(duì)應(yīng)。另外，Probur-sin中氨基酸殘基9至11與前述多肽bursin相對(duì)應(yīng)。存在于Probursin序列中的這些重疊生長(zhǎng)激素釋放抑制因子，fuft-sin和bursin序列與人類多肽生長(zhǎng)激素釋放抑制因子，tuftsin和bursin的活性部位序列相同。因此，盡管Probursin多肽最初是由胎牛肝臟分離而得的，但是，據(jù)認(rèn)為其序列基本上與其他哺乳動(dòng)物，尤其是與人類相同。
就其廣義而言，本發(fā)明提供了基本上無(wú)天然蛋白物質(zhì)的任何形式的哺乳動(dòng)物Probursin或其類似物，即，或者從哺乳動(dòng)物肝臟或者從骨髓分離，或者從合成或重組而得。一般認(rèn)為，下列物質(zhì)將作為Probursin同系物貫穿于本說(shuō)明書(shū)Probursin的變異物，包括各哺乳動(dòng)物物種之間和某一物種各成員之間在所述序列中自然出現(xiàn)的等位基因改變，以及在所述序列中人為引入的變化(例如，采用誘變或化學(xué)技術(shù))，或者通過(guò)各種重組宿主引起的改變(如糖基化改變)，或者通過(guò)與其他外源分子連接引起的改變(如放射性標(biāo)記等)。這些同系物屬于本發(fā)明的范疇。
所述哺乳動(dòng)物Probursin最好是人的Probursin。最初，采用直接抗bursin的抗體監(jiān)視純化，進(jìn)而從胎牛肝臟中分離Probursin。下文實(shí)施例1介紹了分離Probursin的方法。最好從肝臟中分離哺乳動(dòng)物Probursin，但是，按照類似于下文實(shí)施例1介紹的從牛肝臟分離Probursin的方法，也可從骨髓中分離Probursin。盡管如上所述，Probursin多肽序列的特征在于相同或基本相同，但從哺乳動(dòng)物源分離時(shí)，也可得到序列等位基因變異體，以及含有其他氨基酸或天然物質(zhì)的序列變異體。
另外，通過(guò)化學(xué)合成可以得到該14氨基酸序列的Probur-sin，即，得到一新的合成多肽。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例是分子式如下的合成多肽和其藥物上可以接受的酸成鹽，其分子式為Phe-Phe-Trp-Lys-ThrLys-Pro-ArgLys-His-Gly-Gly-Arg-Arg。
為制得多肽Probursin的酸成鹽，可用適量的酸處理該游離多肽。能夠與本發(fā)明多肽形成鹽的酸包括(但不限于)無(wú)機(jī)酸例如，鹽酸，氫溴酸，高氯酸，硝酸，硫氰酸，硫酸，碳酸，磷酸等等?？捎糜谠撃康牡钠渌崾怯袡C(jī)酸，例如，甲酸，乙酸，丙酸，乙醇酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，馬來(lái)酸，富馬酸，氨酸，肉桂酸，萘磺酸，磺酸，等等。
通過(guò)合成制得本發(fā)明所述多肽可按Merrifield在“J.A.C.S.，852149-2154(1963)”中介紹的固相合成法進(jìn)行。該技術(shù)是用于制備多肽的眾所周知的普通方法。另外，Bodanszky等在“PeptideSynthesis”第二版，JohnWileyandSons，1976中介紹了其他多肽合成技術(shù)。該固相合成法包括被護(hù)氨基酸逐步加成，成為增長(zhǎng)肽鏈，后者由共價(jià)鍵與固體樹(shù)脂顆粒連接。通過(guò)這一方法，經(jīng)過(guò)濾除去試劑和付產(chǎn)物，因此，不必純化中間體。這一方法的一般原理是通過(guò)共價(jià)鍵使鏈中的第一氨基酸與固體聚合物連接，然后依次逐步加入被護(hù)氨基酸，一次一個(gè)或一次一段，直到組成所希望的序列為止。最后，從固體樹(shù)脂載體中除去被護(hù)多肽，并除去保護(hù)基。
本發(fā)明還提供了用于制備本發(fā)明多肽的新的多肽-樹(shù)脂中間體。該中間體的分子式與下述分子式相同或類似R1-Phe-Phe-(R2)Trp-(R3)Lys(R4)Thr-(R5)Lys-Pro-(R6)Arg-(R7)Lys-(R8)His-Gly-Gly-(R9)Arg-(R10)Arg-樹(shù)脂，其中，R1至R10是在所標(biāo)明氨基酸適宜位置上的適宜保護(hù)基團(tuán)，樹(shù)酯是起反應(yīng)載體作用的適宜固相聚合物。根據(jù)上述引用參考文獻(xiàn)公開(kāi)的內(nèi)容，多肽合成領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠選擇適宜的氨基保護(hù)基，羥基保護(hù)基，吲哚保護(hù)基，咪唑保護(hù)基和樹(shù)酯。就制備與本發(fā)明多肽不同的多肽而言，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可制備類似的多肽-樹(shù)酯中間體。
可以將氨基酸連接在任何適宜的聚合物上。該樹(shù)酯為須含有一個(gè)第一被護(hù)氨基酸可通過(guò)共價(jià)鍵牢固地與其相連的官能團(tuán)。各種聚合物或共聚物均可用于這一目的，例如，纖維素，聚乙烯醇，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚苯乙烯二乙烯基苯?？捎糜谶@種合成及其縮略的適宜保護(hù)基參見(jiàn)前述教科書(shū)，另外還可參見(jiàn)《J.F.W.Mc Omie，“Protective Groups in Org-anic Chemistry”，Plenum Press New York 1973》，這兩本書(shū)均引為本文的對(duì)比文獻(xiàn)。本文所采用的普通保護(hù)基包括叔丁氧基羰基(BOC)，芐基(BZL)，叔戊氧基羰基(AOC)，甲苯磺?；?TOS)，鄰溴苯基甲氧基羰基(BrZ)，2，6-二氯芐基(Cl2BZL)，苯基甲氧基羰基(Z或CBZ)。
制備這一多肽的一般方法包括先將精氨酸(在其α-氨基和胍基上進(jìn)行保護(hù))連接到樹(shù)酯上。連接完成后，將樹(shù)酯過(guò)濾，洗滌，并除去精氨酸在α-氨基上的保護(hù)基。該保護(hù)基最好是叔丁氧基羰基。當(dāng)然，必須在不使精氨酸與樹(shù)酯之間的連接鍵斷裂的情況下除去保護(hù)基。然后將在其α-氨基和胍基保護(hù)的精氨酸偶聯(lián)到形成的多肽樹(shù)酯上。通過(guò)在第二精氨酸的游離羧基與連接在樹(shù)酯上的第一精氨酸氨基之間形成酰胺鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)這一偶聯(lián)。依次用氨基酸重復(fù)上述偶聯(lián)，直到將所有的氨基酸連接到樹(shù)酯上為止。最后，將被護(hù)多肽與樹(shù)酯分離，除去保護(hù)基，展現(xiàn)出所期望的多肽。從樹(shù)酯中分離多肽以及除去保護(hù)基所采用的斷裂技術(shù)是根據(jù)所選擇的樹(shù)酯和保護(hù)基而制定的，并且對(duì)于熟悉多肽合成工藝的人來(lái)說(shuō)是已知的。
采用標(biāo)準(zhǔn)的溶液多肽合成法也可以合成該多肽，所述方法包括采用化學(xué)或酶學(xué)方法形成酰胺鍵逐步或分段偶聯(lián)氨基酸或多肽片斷。這些溶液合成法是本領(lǐng)域眾所周知的。
采用慣用重組技術(shù)也可生產(chǎn)該多肽。用于重組生產(chǎn)多肽的慣用技術(shù)參見(jiàn)Maniatisetal，“MolecularCloning，aLaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork(1982)”，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員可以查得到的其他已知參考文獻(xiàn)。因此，所有編碼Probursin的DNA序列均屬于本發(fā)明的部分。由于含有編碼相同氨基酸的其他密碼子，修飾或標(biāo)記過(guò)的堿基，這些DNA序列可以是不同的，或者該DNA序列可以編碼Probursin的同系物。這些序列可以形成下述DNA分子的一部分，即，在運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)與DNA序列一道含有適宜的表達(dá)控制序列，并且在轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞時(shí)能直接進(jìn)行表達(dá)。將這些DNA分子或載體稱之為細(xì)菌酵母，真菌，昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物源的載體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全有能力完成Probursin的DNA序列與已知載體成份的組裝。同樣，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)即可用慣用技術(shù)為本發(fā)明所述含Probursin的載體選擇微生物或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，并將前者轉(zhuǎn)入后者。
也可以采用用于生產(chǎn)Probursin的化學(xué)合成及重組技術(shù)修飾前述Probursin的14氨基酸序列。這種修飾包括在上述序列的14氨基酸中刪除或置換其中1個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者在上述序列中插入或加入其他氨基酸或化學(xué)基團(tuán)，借以提高所得多肽的生物或藥理活性，或者使這些活性更有方向性。例如，可以將各種化學(xué)基團(tuán)連接在該多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸上，以提供眾多的有益特征例如，對(duì)酶降解的耐受性，增加半衰期等。Probur-sin的這些修飾形式也屬于本發(fā)明的范疇。
由于Probursin混合了三種已知調(diào)節(jié)多肽的重迭活性部位，因此，可以認(rèn)為Probursin具有與生長(zhǎng)激素釋放抑制因子，fuftsin和bursin相同或類似的生物活性。由于Probur-sin能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答所涉及的B細(xì)胞變異及成熟，因此它可以用來(lái)治療人體或動(dòng)物的疾病。鑒于這些特點(diǎn)，該多肽具有多種治療用途。該多肽不僅可用于研究，而且還可用來(lái)治療人類和動(dòng)物有關(guān)成熟B細(xì)胞不足或缺乏引起的疾病。
據(jù)認(rèn)為，Probursin及其片段和同系物具有履行某些已知肝臟功能的能力(例如，刺激Kupffer細(xì)胞的吞噬作用并且抑制肝細(xì)胞的病理增殖作用)。因此，Probursin及其片段和同系物可以用來(lái)治療各種肝臟機(jī)能障礙，例如，肝硬化。
另外，據(jù)認(rèn)為可將本發(fā)明多肽用于改善機(jī)體的綜合免疫作用，即，用于增加或改善體液免疫治療刺激作用。一般認(rèn)為本發(fā)明Probursin多肽，同系物以及含有上述物質(zhì)的治療組合物可用于體液免疫為關(guān)鍵因素的任何領(lǐng)域，尤其是用于免疫缺陷。因此，由于B細(xì)胞缺乏引起抗體產(chǎn)生不足時(shí)，可采用本發(fā)明多肽刺激細(xì)胞產(chǎn)生來(lái)糾正這一情況。因此，Probursin可用來(lái)治療患有已知免疫缺陷的患者，例如，對(duì)疫苗無(wú)反應(yīng)的患者，如，對(duì)肝炎疫苗不產(chǎn)生抗體的患者和對(duì)肺炎球菌疫苗無(wú)反應(yīng)的早期患者。
例如，應(yīng)該采用Probursin治療的典型情況是X-結(jié)合的嬰兒血(內(nèi))丙種蛋白過(guò)少癥(X-linkedinfantilehypo-gammaglobulinemia)。幾乎在所有男性兒童中都會(huì)出現(xiàn)這種缺陷。據(jù)認(rèn)為這是由于出現(xiàn)這一情況的兒童骨髓及周圍血液中前體B細(xì)胞不能成熟為分泌抗體的B細(xì)胞。因此，出現(xiàn)這一情況的患者會(huì)患慢性的或復(fù)發(fā)細(xì)菌感染。
涉及免疫球蛋白產(chǎn)生缺乏或低下的其他免疫缺陷癥，根據(jù)免疫缺陷引起這一問(wèn)題的部位，也可采用本發(fā)明多肽治療。如果在前B細(xì)胞熟化為分泌抗體的成熟B細(xì)胞的過(guò)程中出現(xiàn)這一缺陷，本發(fā)明多肽是有用的。診斷出須用Probursin治療疾病的缺陷點(diǎn)，完全屬于治療免疫缺陷領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的臨床醫(yī)生的范疇。例如，參見(jiàn)“BasicandClinicalImmunology”，StitesStobo，F(xiàn)udenberg，andWells，editors4thEd(1982)，LangeMedicalPublica-tions，LosAltos，California(Chapter25)。
另外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Probursin抑制生長(zhǎng)激素的釋放(見(jiàn)實(shí)施例6)。已知抑制生長(zhǎng)激素與抑制某些惡性腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)〔見(jiàn)R.S.Hilletal，Diabetes34115(1985)andM.J.BerridgeetalBiochem.J.，212473(1983)〕。因此，Probursin和/或其同系物或其修飾變種可用于治療某些癌癥，其中，通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素抑制腫瘤生長(zhǎng)。
當(dāng)與放射活性或其他可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合使用時(shí)，Probursin和其同系物也可用作診斷試劑。另外，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如，Kohler-Milsteim雜交方法，將Probursin及其同系物用于抗原物質(zhì)，借以產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。
因此，本發(fā)明包括對(duì)于需要進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的患者進(jìn)行免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的方法，該方法包括給所述患者服用有效量的本發(fā)明化合物之一。
本發(fā)明還提供了一種治療由于患者相對(duì)或絕對(duì)肝功能缺陷而引起疾病的方法，該方法包括給所述患者服用治療有效量的Probursin或其同系物。
本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)B細(xì)胞變異并成熟的方法，該方法包括患者服用誘導(dǎo)治療有效量的Probursin或其同系物。
本發(fā)明還提供了一種通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)治療癌癥的方法，即，給患者服用抑制生長(zhǎng)激素治療有效量的Probursin或其同系物。
本文所采用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指治療上述免疫系統(tǒng)或肝臟各種疾病或缺陷有效的量。
本發(fā)明還提供了實(shí)施上述治療方法的藥用組合物。就采用藥用組合物而言，本發(fā)明多肽的有效劑量范圍是約1ug/kg至10mg/Kg。Probursin在約100ug/kg出現(xiàn)最大活性。在免疫缺陷治療領(lǐng)域中普通技術(shù)人員根據(jù)本文結(jié)果無(wú)須大量試驗(yàn)即可以很容易推斷并選擇適于臨床應(yīng)用的本發(fā)明多肽的適宜劑量。例如，經(jīng)治醫(yī)生根據(jù)以下傳統(tǒng)的臨床參數(shù)可以確定劑量年齡，體重，性別，患者的整體生理狀況。
本發(fā)明多肽并不限定于某一特定的給藥模式。但是，由于胃酶可以使氨基酸序列降解，因此，最好采用胃腸道外涂藥的方式。盡管皮下是最理想的胃腸道外給藥方式，但本發(fā)明多肽也可以采用下述方式給藥經(jīng)皮，肌肉，鼻內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈，向頰或通過(guò)栓劑給藥。
為制備本發(fā)明所述藥用組合物，按照慣用的制藥混合技術(shù)，可以將Probursin作為活性成份與藥物載體和/或賦形劑混合。根據(jù)給藥所要求的制劑形式(其中包括混懸液，酏劑，溶液)，可采用各種形式的載體。就胃腸道外給藥產(chǎn)品而言，該載體通常包括無(wú)菌水或生理鹽水溶液。為了給藥品增加有益特性，例如，增加溶解度或便于保存，還可加入其他成份。采用適宜的液體載體(如懸浮劑等)還可制得注射用混懸液。胃腸道外給藥制劑領(lǐng)域中普通工作人員很容易掌握制備這類組合物的方法。
下列實(shí)施例說(shuō)明了從胎肝中分離牛Probursin的方法，提供合成Probursin的方法和測(cè)定該多肽活性的方法。這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1粗提Bursin和Probursin用含有1mM聚甲基磺酸(PMSF)，1mM乙二胺三乙酸(EDTA)，1.0mMβ-巰基乙醇的碳酸氫銨緩沖液(25%W/V，50mM，PH8.0)提取胎牛肝臟(500g)。在搗碎器中，于4℃，將組織均漿3分鐘，在9000rpm離心(4℃)45分鐘。上清液經(jīng)沙布過(guò)濾，澄清液于-60℃保存。將25ml等份液凍干，并懸浮于10ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。
將該溶液離心，分成2.5ml等份，加到PD-10〔Pharmacia〕層析枉上，將含有低分子量的組份凍干，并溶解在1ml碳酸氫銨緩沖液(50mM，PH8.0)中，該溶液用于下文實(shí)施例2所述的酶連接免疫吸收劑測(cè)定(ELISA)。
通過(guò)下列步驟從胎牛肝臟進(jìn)一步純化Probursin(A)在SephadexG-75分子篩柱〔Pharmacia〕上進(jìn)行膠體過(guò)濾。接著(B)上CMSephadex離子交換柱〔Phar-macia〕然后(C)進(jìn)行薄層層析純化，在此期間，除去具有免疫反應(yīng)的組份-Bursin。(D)所得組份在SephadexG-75上再次過(guò)濾。(E)將所得濾液在Mono-Q柱〔Pharma-cia〕上進(jìn)行離子交換快速蛋白液相層析。(F)最后一步純化為反相FPLC。下列表1列出了各純化步驟的收率和次序。
還測(cè)定了各步純化組份在254nm處的光密度。圖1示出了步驟A.B.E和F中的各組份。圖2示出了由薄層層析步驟(C)所得的膠體。
實(shí)施例2ELISAA.兔抗血清就兔免疫而言，按照Tamura等在Cell，34587(1983)中介紹的方法，通過(guò)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(ECDI)將Probursin偶聯(lián)于鑰孔 血蘭蛋白(KLH)。簡(jiǎn)言之，將5mg bursin溶解在400ul用鹽酸酸化至PH3.0的水中，然后在冰浴中冷卻。加入20ul體積的10mgECDI，在冰浴中將所得混合物保溫15分鐘。將溶有15mgKLH的0.5ml，PH3.0酸化水加到該混合物中。將0.5ml飽和碳酸銨溶液加到該溶液中，加入少量無(wú)水碳酸銨以保持該溶液飽和。在冰浴中攪拌下將該混合物保溫3小時(shí)，然后用水透析3次，每次2升水，時(shí)間為40-48小時(shí)，繼之PBS過(guò)夜。用PBS將結(jié)合物稀釋至1mg/mlbursin。
將200ul體積的200ugKLH-bursin與400ul全Freund佐劑相混合。給5只免子中每只的皮下多點(diǎn)注射500ul上述混懸液以使之免疫。以4-6周為間隔，給免子注射含不完全Freund佐劑的類似懸浮液。
B.ELISA程序以下列ELISA程序檢驗(yàn)各抗血清的活性。按照Voller等在Bull.WHO，5355(1976)中介紹的方法進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)言之，用100ul/井濃度為10ug/ml的由四體Probursin與0.1M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)制得的溶液涂敷聚乙烯氯微滴定板(FisherScientiflc，Springfield，NJ)，并使之過(guò)夜。洗滌上述板，并在室溫下，用150ul/井濃度為0.5%小牛血清清蛋白PBS液(PH7.2)再涂敷1小時(shí)。洗滌該板，于37℃干燥6-24小時(shí)，并密封于干燥包裝袋中，于4℃下保存。
在含0.05%吐溫-20的PBS中稀釋待測(cè)定的抗血清。在每個(gè)井中加入100ul稀釋后的血清，一式三份。將正常的免或鼠血清用作陰性對(duì)照。在室溫下保溫60分鐘后，用PBS吐溫-20將該板洗滌3次。將結(jié)合在親和-純化山羊抗-兔IgG(重和輕鏈)上的100ul堿性磷酸酶在PBS吐溫-20中以1∶2000的比例稀釋，并將該稀釋液加到每一支井中。將該板在室溫下保溫60分鐘，洗滌該板，將100ul濃度為1mg/ml對(duì)硝基苯基磷酸酯與二乙醇胺緩沖液制得的溶液加到每一支井中。于室溫下保溫30分鐘后，在每井中加入50ul5N的氫化鈉使該反應(yīng)終止，在410mm處讀數(shù)光密度。
C.結(jié)果5只兔子中有2只在5個(gè)月后產(chǎn)生對(duì)Probursin的抗體，滴定度約為1∶800(圖3A)。通過(guò)KLH-bursin以及游離Probursin(但不用KLH-對(duì)照結(jié)合物)封鎖抗-bursin抗血清鍵合(圖3A)。
實(shí)施例3自動(dòng)N-末端蛋白編序采用氣相編序法對(duì)完整Probursin及胰蛋白酶和溴化氰片段Probursin進(jìn)行自動(dòng)序列分析，所使用的儀器是470A型AppliedBiosystems氣相編序器，用Polybrene作為載體，并采用標(biāo)準(zhǔn)的單一偶聯(lián)單一斷裂程序。用1084BHew-lettPackard高壓液相色譜鑒定所得的由苯基海硫因酸衍生的氨基酸。圖4示出了收率。
實(shí)施例4制備本發(fā)明的合成多肽按照用于BOC-氨基酸衍生物的標(biāo)準(zhǔn)程序，在ABI430多肽合成儀上，采用固相合成本發(fā)明所述多肽。用0.5mmolsBOC-(Tos)Arg-PAM樹(shù)酯開(kāi)始該合成。完整的多肽樹(shù)酯重量為1.87g。用20mlHF及2g對(duì)甲苯酚在0℃將樹(shù)酯處理1小時(shí)。減壓下除去HF，并將乙酸乙酯加入殘余物中。將該混合物過(guò)濾，用乙酸乙酯洗滌。在該固體中加入三氟乙酸，將該混合物過(guò)濾。將濾液蒸發(fā)至小體積，然后加入醚。濾出沉淀，用醚充分洗滌，得到1.04g白色固體。將440mg該產(chǎn)物加到50ml1M的PH為9.0的碳酸氫銨中，以使Trp去甲?；?。用氮?dú)鉀_洗，以除去溶液中的氧氣，然后在密閉燒瓶中放置16小時(shí)。最后用水稀釋該溶液，凍干。
在Partisil-ODSM-20柱上，用20%乙腈/0.1%TFA洗脫，即通過(guò)制備HPLC純化該多肽。加入稀TFA使PH約為3，進(jìn)而使多肽溶解，并分5次注入。合并含主峰的各主要組份，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，將殘留物凍干。使之通過(guò)AmberliteIR-68陰離子交換樹(shù)酯，進(jìn)而使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為乙酸鹽，經(jīng)凍干的產(chǎn)物具有如下序列，重量為102mg，其序列為Phe-Phe-Try-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Ghy-Arg-Arg。
TLC(硅膠60)Rf0.10 n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr4∶2∶3∶1Rf0.04 EtOAc∶Pyr∶HOAc∶H2O5∶5∶1∶3氨基酸分析Thr-0.88，Pro-1.04，Gly-2.01，Phe-2.00，His-1.02，Lys-2.91，Trp-0.81，Arg-3.14;73%肽。
實(shí)施例5生物活性-環(huán)GMP分析按照T.Audhya等在“Arch.Biochem Bio-phys.，234167-177(1984)”中介紹采集方法，新鮮接種Daudi細(xì)胞，并使其繁殖生長(zhǎng)2天。該細(xì)胞用PBS洗滌3次，并使之以1.0×107細(xì)胞/ml的濃度再懸浮于RPMI1640中，使之在37℃平衡30分鐘，然后加入受試化合物(25ul)bursin和Probursin，以及對(duì)照用多肽-豬胰島素(A)，馬肌紅蛋白(B)，牛生長(zhǎng)激素(C)。在振蕩水浴中保溫4-5分鐘，然后加入1ml冰冷卻TCA(10%)使反應(yīng)終止。
將在TCA中的細(xì)胞均漿，并通過(guò)超聲波粉碎使之釋放出環(huán)核苷酸。在4℃，以3000×g使該混懸液離心20分鐘。為側(cè)定蛋白成份，將所得沉淀溶解在0.1N的NaOH中。用5ml水飽和二乙醚提取4次，借以從上清液中除去TCA。在最后一次提取后，在50℃水浴中加熱10分鐘除去殘留的跡量醚。經(jīng)冷凍干燥后，在50MM的乙酸鹽緩沖液(PH6.2)中重新制備樣品，用于環(huán)GMP的放射免疫測(cè)定。
確定bursin，probursin和對(duì)照物從0至100微克/ml的劑量-反應(yīng)曲線。圖5示出了在Daudi細(xì)胞(圖5A)和在MOPC-315細(xì)胞(圖5B)中活性bursin和Proour-sin，及無(wú)活性化合物的典型劑量-反應(yīng)曲線。測(cè)定了每個(gè)受試多肽的臨界活性，即為與對(duì)照物相比，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)GMP水平標(biāo)準(zhǔn)差大于2的受試多肽的最低濃度(1ug/ml)。對(duì)照物細(xì)胞內(nèi)環(huán)GMP值小于0.1微微摩爾/ml(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。如果環(huán)GMP水平比平行陰性對(duì)照物高1.52倍(2標(biāo)準(zhǔn)差)，則認(rèn)為該試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。
實(shí)施例6生物活性-生長(zhǎng)激素抑制進(jìn)行這一測(cè)定的目的是研究Probursin與生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)結(jié)合的影響，這一結(jié)合影響在SV40轉(zhuǎn)化倉(cāng)鼠β細(xì)胞(HIT)中3H肌醇磷酸酯(IP)的釋放和生長(zhǎng)激素(GH)積累。按照上述M.J.Berridge等所介紹的方法進(jìn)行該試驗(yàn)。
簡(jiǎn)言之，將市場(chǎng)上購(gòu)得的HIT細(xì)胞在含5%胎牛血清(FCS)的代謝RPMI介質(zhì)中于37℃，保溫1小時(shí)。將下文表中所標(biāo)明的不同濃度的GRF加到細(xì)胞培養(yǎng)物中，于37℃保溫15分鐘。然后將該細(xì)胞在800rpm離心，收集上清液。仍按Berri-dge等所介紹的方法，通過(guò)放射免疫測(cè)定法(RIA)測(cè)定上清液中的GH和IP水平。這些測(cè)定即為GRF對(duì)照。
重復(fù)相同的方法，但不加GRF，并在下文中作為對(duì)照物。
同樣，為了弄清Probursin對(duì)GRF的影響，重復(fù)上述方法，所不同的是按下表表明的適宜濃度將GRF和Probursin一道加到細(xì)胞中，然后孵育15分鐘，并離心。按上述RIA法測(cè)定上清液，所測(cè)得的IP和GH濃度列于下表中。
下表列出的數(shù)據(jù)說(shuō)明Probursin對(duì)生長(zhǎng)激素釋放因子呈現(xiàn)明顯的抑制作用，其結(jié)果與上述Hill等介紹的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子的作用類似。
表[IP](cpm)[GH](ng/ml)對(duì)照15±414±2GRF(0.1nM)489±19162±4GRF(0.1nM)+Probursin(.1μM)239±1335±4GRF(1nM)2810±290648±26GRF(1nM)+Probursin(0.1μM)1911±310480±31GRF(1nM)+Probursin(1.0μM)444±2277±6GRF(10nM)8962±8211162±84GRF(10nM)+Probursin(10.0μM)382±1629±3本文所引用的某些優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了描述，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明作出各種各樣的改變和改進(jìn)，這些改變和改進(jìn)均應(yīng)包括在下文的權(quán)利要求書(shū)中。

權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于包括與下式氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，其同系物和其藥物上可以接受的酸成鹽，該氨基酸序列為Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg。
2.通過(guò)固相或溶液相化學(xué)合成法制備權(quán)利要求1所述的多肽。
3.從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中純化權(quán)利要求1所述的多肽，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自人類肝細(xì)胞或人類骨髓細(xì)胞。
4.按重組技術(shù)制備權(quán)利要求1所述多肽。
5.權(quán)利要求1所述多肽，其特征在于該多肽在Daudi或MOPC-315細(xì)胞中誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)cGMP升高的臨界活性濃度約為1μg/ml。
6.一種多肽和其藥物上可以接受的酸成鹽，其氨基酸序列為Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg。
7.一種DNA分子，該DNA分子包括編碼一種多肽的序列和運(yùn)轉(zhuǎn)上與之相聯(lián)系的適宜表達(dá)控制序列，所述多肽包括與下式相同或基本相同的氨基酸序列，即為Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg。
8.一種藥用組合物，該組合物包括在藥物上可以接受劑型中的權(quán)利要求1所述治療有效量多肽。
9.權(quán)利要求1所述多肽或其鹽用于制備適用于調(diào)節(jié)患者免疫系統(tǒng)的藥用組合物。
10.權(quán)利要求1所述多肽或其鹽用于制備藥用組合物，該組合物適用于以足以抑制腫瘤生長(zhǎng)的量抑制生長(zhǎng)激素釋放。
11.一種下式所示的多肽-樹(shù)脂中間體，即為R1-Phe-Phe-(R2)Trp-(R3)Lys-(R4)Thr-(R5)Lys-Pro-(R6)Arg-(R7)Lys-(R8)His-Gly-Gly-(R9)Arg-(R10)Arg-樹(shù)酯，式中R1至R10各自分別選自適宜的保護(hù)基團(tuán)，并且，樹(shù)酯是適宜的固相聚合物。
12.一種診斷試劑，包括權(quán)利要求1所述多肽或?qū)λ龆嚯牡目贵w。
全文摘要
一種以純凈形式分離的，或者以合成方法或重組技術(shù)產(chǎn)生的多功能哺乳動(dòng)物多肽-Probursin，該多肽可用于治療免疫疾病及抑制腫瘤。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1037902SQ8910202
公開(kāi)日1989年12月13日 申請(qǐng)日期1989年2月24日 優(yōu)先權(quán)日1988年2月24日
發(fā)明者塔彭·奧德雅, 吉迪安·戈?duì)柎奶? 喬治·希夫納 申請(qǐng)人:免疫生物學(xué)研究所有限公司