專利名稱：防止內(nèi)臟粘連或出血的羊膜移植物或覆蓋物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明歸屬于防止或減少損傷特別是外科損傷后粘連和防止內(nèi)臟損傷后出血方面的領(lǐng)域。
粘連形成起因于很多醫(yī)學(xué)情況或外科手術(shù)，包括盆腔炎、子宮內(nèi)膜異位和其他盆腔或腹部炎癥。這種外科手術(shù)及囊腫、腫瘤等都可導(dǎo)致粘連形成。粘連引起輸卵管閉塞，干擾輸卵管、卵巢功能，抑制排卵，繼發(fā)不育癥。粘連形成從損傷發(fā)展到漿膜面，滲出纖維蛋白原，形成纖維蛋白，導(dǎo)致盆腔組織器官的稠厚或薄膜的粘連帶，互相固定。盆腔、腹腔粘連是女性不育的主要原因。
歷年來，大量天然和合成移植物被用于減少損傷表面上的粘連形成，然而，僅僅有勉強(qiáng)成效。天然物質(zhì)包括腹膜、網(wǎng)膜、脂肪和羊膜，以及羊膜加絨毛膜。過去使用合成材料，包括聚乙烯醇薄膜和鉭箔，晚近，使用由明膠薄膜和明膠泡沫糊(Upjohn Co.，Kalamazoo，Michigan)組成的屏障，Surgicel(Johnson & Johnson，NewBrunswick，New Jersey)，和硅橡膠(Dow—corning，Midland，Michigan)以及Gore結(jié)構(gòu)篩網(wǎng)((Gore—Tex，Gore，Texas)和多孔網(wǎng)眼(Johnson & Johnson，New Brunswick，New Jersey)等。較新的材料已導(dǎo)致更有希望的結(jié)果。
由于防止出血的手段和方法無效，引起肝、胰、脾、腎等內(nèi)臟出血損傷導(dǎo)致死亡。
人羊膜用作外科輔助物已有較長歷史。Trelford和Trelford—Sauder發(fā)表了一篇極好的綜述。在很多實(shí)驗(yàn)動物模型以及病人身上，羊膜曾被試用于防止盆腔和腹腔粘連而未成功，用于輸卵管手術(shù)及陰道重建術(shù)上有其廣泛的經(jīng)驗(yàn)。其他應(yīng)用包括結(jié)膜缺損的修復(fù)、膽道重建，以及穿顱術(shù)后腦膜腦粘連的預(yù)防。然而，它對于人類的主要作用停留在燒傷、潰瘍和其他皮膚損傷的領(lǐng)域及傷口愈合上。
在本發(fā)明之前，并無描述人羊膜在預(yù)防人腹腔內(nèi)粘連上有潛能重大意義的文獻(xiàn)存在，盡管通過大量合成劑的使用在這一領(lǐng)域已取得某些進(jìn)步。Badaway等最近報告了羊膜腹內(nèi)應(yīng)用在大鼠模型上防止粘連。他們很少注意到在漿膜表面抑制粘連形成的作用，但在腹膜壁層上觀察到稍好的結(jié)果。他們對不成功所作的解釋涉及手術(shù)后器管靜止和郁血的問題，這兩方面均可在人手術(shù)后粘連形成上起作用。
沒有實(shí)質(zhì)性的文獻(xiàn)描述用羊膜包裹內(nèi)臟，對受損傷的內(nèi)臟如肝、胰、脾、腎等在受傷后防止出血。
文獻(xiàn)研究揭示，制備和貯存膜的不同方法幾乎與病例或?qū)嶒?yàn)報告一樣多。用戊二醛處理的膜得到很差的結(jié)果(未發(fā)表資料)，用乙醇預(yù)處理和烘箱干燥或僅在生理鹽水中冷凍也得到同樣不滿意的經(jīng)驗(yàn)。
提供從人胎盤而來的羊膜材料薄片，如膜片，將是很有益的，它成功地防止或減少損傷后(如外科創(chuàng)傷后)的內(nèi)部粘連，促進(jìn)愈合，并且不引起免疫反應(yīng)。
用這種羊膜薄片(膜片)，提供對受傷出血內(nèi)臟的包裹或覆蓋將是很有益的，它成功地阻止出血。
本發(fā)明針對特殊制備的羊膜薄片或膜，它們的制備和使用方法，其使用成功地防止或減少因損傷(如對內(nèi)臟的外科損傷)而引起的粘連，成功地防止出血，促進(jìn)愈合，并且不引起免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的一個方面，提供適于防止或減少患者內(nèi)臟粘連的移植物，它包含滅菌羊膜材料的薄片或膜，它們不含抗原部位，避免引起免疫反應(yīng)，并且暴露基底膜，I、II、III型膠原，昆布氨酸，纖維結(jié)合素類和其他暴露的糖蛋白成分，它們促進(jìn)所接觸的受傷器官的愈合。
前述事項(xiàng)可通過以下步驟來完成去除從人胎盤所獲得羊膜材料的細(xì)胞層，最好是胎兒側(cè)的細(xì)胞層，暴露基底膜和I、II、III型膠原、昆布氨酸、纖維結(jié)合素類及羊膜材料的其他糖蛋白成分；與這些成分接觸據(jù)信可促進(jìn)傷口愈合。細(xì)胞層的去除還除去了可引起免疫反應(yīng)的抗原部位。例如，按照本發(fā)明，除去細(xì)胞單層(以胰蛋白酶鈉洗滌為佳)，然后滅菌(如r—輻射)，在預(yù)防和減少粘連上是成功的。這樣制備的膜產(chǎn)生充分的新血管形成，不引起明顯的炎癥浸潤。這也支持這些膜不引起明顯免疫反應(yīng)的結(jié)論，如同Badaway的研究中觀察所見，在本發(fā)明中，可以用任何合適的方法除去細(xì)胞單層，但該法應(yīng)完全地除去細(xì)胞單層。例如，應(yīng)用胃蛋白酶等其他蛋白酶，而無花果蛋白酶是不能令人滿意的，因?yàn)樗粚Φ鞍踪|(zhì)中不經(jīng)常存在的半胱氨酸殘基有特異性，因此不完全除去該細(xì)胞單層。除去了細(xì)胞層的羊膜還可用其他方法滅菌，如用也與其膠原交聯(lián)的戊二醛進(jìn)行化學(xué)滅菌。
膜薄且有異常的順應(yīng)性，使其極利于使用。膜在盆腔和腹腔中必須單層應(yīng)用，以防止在膜本身內(nèi)部纖維化形成。這種合成移植物雖不經(jīng)縫合而被應(yīng)用，但這些薄膜還可用細(xì)微縫合定位，或用液體抗粘連藥如葡聚糖固定。與合成篩網(wǎng)相反，這些羊膜的使用還有一個技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是，它們能在不完全干的表面上應(yīng)用和縫合。
因而，本發(fā)明的一個目的是提供不含抗原部位從而避免引起免疫反應(yīng)，和具有暴露的基底膜、I、II、III型膠原、昆布氨酸、纖維結(jié)合素類和其他糖蛋白成分的滅菌羊膜材料移植物或覆蓋物，在接觸時促進(jìn)傷口愈合。
本發(fā)明的另一個目的是提供細(xì)胞層被除去，暴露膠原，其他糖蛋白和基底膜的滅菌羊膜移植物或覆蓋物，以促進(jìn)傷口愈合，并除去可引起免疫反應(yīng)的細(xì)胞層中的抗原部位。
本發(fā)明的再一個目的是為防止患者受傷后內(nèi)臟粘連或出血而提供從人胎盤而來的，其細(xì)胞層被蛋白分解處理而除去的羊膜移植物或覆蓋物。
本發(fā)明的再一個目的是提供羊膜胎兒側(cè)上細(xì)胞單層被胰蛋白酶除去的這種移植物或覆蓋物。
本發(fā)明的還有一個目的是提供這樣一種移植物或覆蓋物，其中細(xì)胞單層材料被除去的羊膜膜被r—輻射消毒與膠原交聯(lián)。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供防止患者因損傷而致內(nèi)臟粘連或出血的移植物或覆蓋物的制備方法，即除去羊膜胎兒側(cè)的細(xì)胞物質(zhì)，然后將膜滅菌。
本發(fā)明的更進(jìn)一步目的是提供防止患者損傷后內(nèi)臟粘連或出血的方法，包括將按本發(fā)明的羊膜材料的移植物施用于可能形成粘連或出血的患處表面。
其他和進(jìn)一步的目的，特征和優(yōu)點(diǎn)貫穿于說明書和權(quán)利要求書。
本發(fā)明的移植物包含人羊膜材料單層例如膜，它無抗原部位，避免免疫反應(yīng)，并有暴露的基底膜、I、II、III型膠原，昆布氨酸、纖維結(jié)合素類及其他糖蛋白成分，它們促進(jìn)接觸到的損傷器官的愈合。較佳地是這樣完成的將細(xì)胞層從膜上除去，暴露其促進(jìn)傷口愈合的膠原和基底膜成分，并除去可引起免疫反應(yīng)的抗原部位。較佳地，用有效除去細(xì)胞物質(zhì)的蛋白酶來除去它，較佳地用胰蛋白酶，它作用于蛋白質(zhì)的多部位(賴氨酸和精氨酸)，幾乎所有蛋白質(zhì)對胰蛋白酶的蛋白水解作用敏感。另一方面，無花果蛋白酶對較少出現(xiàn)在蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基有特異性。其他蛋白酶對除去細(xì)胞層有效，如糜蛋白酶和胃蛋白酶。這樣一種人體單層羊膜成功地防止或減少損傷(如外科損傷)后的粘連和出血。應(yīng)用這些經(jīng)處理的單層移植物已獲得極好的結(jié)果。
制備這些按本發(fā)明所述的羊膜移植物的方法建議如下收取新鮮接生的人體胎盤，最好在剖腹產(chǎn)術(shù)時取下胎盤，用手工從絨毛膜上分離羊膜，從羊膜的胎兒側(cè)除去細(xì)胞物質(zhì)，例如將它們浸泡在胰蛋白酶溶液中，然后將羊膜的膠原滅菌，例如用r—輻射或化學(xué)品戊二醛來滅菌。
按本發(fā)明的防止內(nèi)臟粘連和出血的方法包括將移植物單層薄片經(jīng)縫合或不經(jīng)縫合或通過使用液體抗粘連輔助物如葡聚糖而施用于創(chuàng)傷表面。有利的是，這些羊膜移植物和覆蓋物可在不完全干燥的表面上施用和縫合。
實(shí)施例1材料和方法羊膜取自剖腹產(chǎn)術(shù)時取出的新鮮的人胎盤。將羊膜用手工從絨毛膜上分離，用蒸餾水洗滌。將干凈的膜先在10％胰蛋白酶溶液中浸泡處理3小時。接著，按下面的方法用r—輻射將它們照射滅菌。首先，將整個膜以60,000拉德/小時輻射8小時20分鐘，總劑量500,000拉德。然后將膜切成約2×2cm的小方塊，以60,000拉德/小時輻射共33小時20分鐘，相當(dāng)于2,000,000拉德劑量。將這樣制得的小方塊在-70℃蒸餾水中冷凍，保存到使用(四周內(nèi))。在使用前，將膜于22℃融化。在此方法中不使用抗生素。
手術(shù)過程研究動物為經(jīng)產(chǎn)雌性新西蘭家兔，每只至少重3.5kg，以保證盆腔器官的大小合適。A組至C組每組分配6只家兔，D組為18只。手術(shù)時，用氯胺酮、丙嗪和二甲苯嗪組成的混合物按1cc/kg體重的劑量麻醉家兔。將腹部剃毛，作消毒準(zhǔn)備并蓋上手術(shù)巾。如前Badaway等所述，在手術(shù)顯微鏡下施用無菌顯微外科技術(shù)。實(shí)驗(yàn)性損傷由從子宮角的漿膜層和肌層延伸到子宮內(nèi)膜腔的一系列切割和粘膜的多處撕裂所組成。用微型剪刀造成1cm長、間隔5mm的切口。用每距7—Omaxon多針間斷縫合，將大小約1×2cm的膜移植物以單層縫合到損傷部位上。將膜的母體側(cè)對著傷口放置，胎兒側(cè)面向腹腔。手術(shù)后，將腹腔作三層閉合，滅菌敷料保留在位72小時。全部動物手術(shù)后接受普魯卡因青霉素，劑量50ml/kg，IM QOD×5，并喂養(yǎng)在27℃，濕度40—70％的與自然條件相似的環(huán)境下，給以Purina RabbitChow塊料，任意飲水。
實(shí)驗(yàn)組的描述將動物隨機(jī)分成3組，每組6只，第4組18只動物。每只家兔經(jīng)受兩次外科手術(shù)，首次剖腹術(shù)包括指定的手術(shù)過程，第二次探視剖腹術(shù)用于評估實(shí)驗(yàn)介入的效果。各組情況如下A組(n＝6)是背景對照組，該組腹部打開受到非特異性的損傷或處理，再關(guān)閉。B組(n＝6)是模型對照組，其中，如上所述的對照性損傷在每只動物的一個子宮角上進(jìn)行，對照側(cè)子宮角不受損傷，兩側(cè)子宮角上均不作治療介入。C組(n＝6)是第一治療組，其中，如B組一樣在一側(cè)子宮角上進(jìn)行損傷，然后損傷和未損傷的子宮角上均用細(xì)縫線固定覆蓋膜移植物。D組(n＝18)形成第二治療組，其中兩側(cè)子宮角均以類似方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性損傷。然后一側(cè)子宮角縫上膜，對照側(cè)子宮角用間斷的、能止血的7—0maxon間隔的細(xì)縫線處理。
首次剖腹術(shù)及外科干預(yù)后30天，每只動物再施行剖腹檢查，將粘連照相，對它們的存在與否、包括的面積百分比及粘連性質(zhì)的分級(薄、厚、薄膜狀、稠密)進(jìn)行評估。用Fisher’s Exact Test進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，p＜0.05時認(rèn)為有意義。
結(jié)果全部結(jié)果概括于表1。
表1實(shí)驗(yàn)性損傷后膜處理與未處理子宮角的結(jié)果對比組子宮角外科手術(shù)有粘連的粘連類型 受累表面動物數(shù)(％) 的百分比AR無 0n＝6 L無 0BR切割6(100)a 稠密·厚 75n＝6 L無 0CR切割＋膜0n＝6 L只用膜 1(17) 薄膜狀·薄 10DR切割＋膜3(17)a薄膜狀、薄 10n＝18L切割＋縫合 18(100) 稠密、厚 80a左右子宮角均為P＜0.05背景對照組A＋模型對照組B證實(shí)了模型的可靠性，即證明單單剖腹術(shù)無背景粘連，而實(shí)驗(yàn)性損傷若不處理則在100％的情況下引起稠密粘連。這些粘連包括表面粘連及導(dǎo)致受累子宮角嚴(yán)重彎曲的環(huán)—環(huán)(loop—to—loop)粘連。進(jìn)一步觀察到，這些粘連不跨越到受損的對側(cè)子宮角(P＝0.002)。
實(shí)驗(yàn)組C顯示損傷的子宮角與未損傷子宮角上均放置膜移植物部位的粘連形成無顯著性差異(p＝0.5)。僅在未損傷子宮角上發(fā)現(xiàn)一例薄的膜狀粘連，在損傷側(cè)未見粘連。最后，在實(shí)驗(yàn)組D，與止血微細(xì)縫合部位所發(fā)現(xiàn)的相比，膜移植物顯著地減少粘連的形成。在100％情況下，用縫合處理的子宮角上，觀察到在損傷部位平均80％的表面積上有稠密的厚的粘連。相反，覆蓋著膜移植物的受損子宮角僅17％(p＝0.0000003)顯示有些粘連，這些粘連是薄的膜狀的，并且僅覆蓋損傷/移植區(qū)域的約10％。組織學(xué)研究表明，膜已與漿膜層整合，在移植物部位顯示新生血管形成。漿膜表面存在最低限度的多形核白細(xì)胞浸潤，提示無明顯的免疫反應(yīng)。
單層膜之薄及其異常的順應(yīng)性使其特別有利于使用。在盆腔和腹腔中單層應(yīng)用是必須做到的，以防止在膜內(nèi)部纖維化形成。而且，合成移植物不經(jīng)縫合而使用，在上述實(shí)施例中，用細(xì)縫線將膜固定在位。在人體，這增加了伴隨使用液體抗粘連輔助物如葡聚糖的可能性。使用這些羊膜還有一個顯然與合成篩網(wǎng)相反的附加的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，即它們可在不完全干的表面施用和縫合。
實(shí)施例2在本實(shí)施例中，用按實(shí)施例1所制備的和使用的這些膜預(yù)防腹膜粘連和改善廣泛子宮內(nèi)膜異位或附件盆腔粘連。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，除了分別用糜蛋白酶和胃蛋白酶代替胰蛋白酶外，羊膜膜的處理與實(shí)施例1中相同，取得滿意的結(jié)果。
實(shí)施例4在本實(shí)施例中，除了在除去細(xì)胞層后用戊二醛處理來進(jìn)行羊膜膜的滅菌外，羊膜膜的處理與實(shí)施例1和3相同，取得滿意的結(jié)果。
實(shí)施例5在本實(shí)施例中，將羊膜膜薄片包裹或復(fù)蓋在內(nèi)臟(肝、胰、脾、腎)受傷和出血部位，最好是羊膜的暴露成分對著受傷部位，成功地防止了出血。如前面的實(shí)施例那樣，將羊膜膜施用到位。如前所述，這些羊膜膜移植物和覆蓋物可被施用和覆蓋在濕的表面及干的表面上。
上述動物研究是防止或減少人類內(nèi)臟粘連和出血的極好模型。此處所用的術(shù)語“患者”包括人和動物患者。
因此，本發(fā)明很適合于達(dá)到其目的，并且有上述特征和優(yōu)點(diǎn)以及其他固有的特征和優(yōu)點(diǎn)。
前面的較佳實(shí)施方案是為公開的目的而給出的，其中可進(jìn)行改變，這些改變落在所附權(quán)利要求范圍所定義的本發(fā)明的精神內(nèi)。
權(quán)利要求
1.適于減少患者的受傷內(nèi)臟粘連的移植物，其特征在于包含無抗原部位，具有暴露的基底膜和I、II、III型膠原、昆布氨酸、纖維結(jié)合素類和羊膜材料的其他糖蛋白成分，在接觸時促進(jìn)受傷器官愈合的從人胎盤而來的羊膜材料的滅菌薄片。
2.按權(quán)利要求1所述的移植物，其中羊膜材料薄片除去了細(xì)胞層，除去了抗原部位，暴露了羊膜材料的成分。
3.按權(quán)利要求2所述的移植物，其中已通過用胰蛋白酶處理除去細(xì)胞層。
4.按權(quán)利要求1所述的移植物，其中膠原是交聯(lián)的。
5.按權(quán)利要求2所述的移植物，其中膠原是交聯(lián)的。
6.按權(quán)利要求3所述的移植物，其中膠原是交聯(lián)的。
7.按權(quán)利要求1所述的移植物，其中膠原是用0.25M—2.5M拉德的r—輻射交聯(lián)的。
8.按權(quán)利要求2所述的移植物，其中膠原是用0.25M—2.5M拉德的r—輻射交聯(lián)的。
9.按權(quán)利要求1所述的移植物，其中羊膜材料薄片是單層薄片。
10.按權(quán)利要求2所述的移植物，其中羊膜材料薄片是單層薄片。
11.按權(quán)利要求3所述的移植物，其中羊膜材料薄片是單層薄片。
12.按權(quán)利要求4所述的移植物，其中羊膜材料薄片是單層薄片。
13.按權(quán)利要求5所述的移植物，其中羊膜材料薄片是單層薄片。
14.按權(quán)利要求6所述的移植物，其中羊膜材料薄片是單層薄片。
15.適于減少受傷內(nèi)臟粘連的移植物的制備方法，其特征在于從人胎盤羊膜除去細(xì)胞物質(zhì)，從而暴露基底膜、I、II、III型膠原、昆布氨酸、纖維結(jié)合素類和羊膜材料的其他糖蛋白成份，它們在施用于受傷器官時促進(jìn)愈合，還從而除去細(xì)胞物質(zhì)上的抗原部位，以及將羊膜滅菌。
16.按權(quán)利要求15所述的方法，其中通過用胰蛋白酶處理除去細(xì)胞物質(zhì)。
17.按權(quán)利要求15所述的方法，還包括將羊膜材料交聯(lián)。
18.按權(quán)利要求16所述的方法，還包括將羊膜材料交聯(lián)。
19.按權(quán)利要求16所述的方法，還包括用0.25M—2.5M拉德的r—輻射將羊膜材料滅菌和交聯(lián)。
20.減少患者內(nèi)臟損傷后粘連的方法，其特征在于將權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14的移植物施用于易受粘連形成的內(nèi)臟表面。
21.減少患者內(nèi)臟出血的方法，其特征在于用權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14的移植物至少復(fù)蓋內(nèi)臟的出血部位。
全文摘要
揭示一種特殊處理的羊膜薄片，如羊膜膜，它防止損傷(如外科損傷)后粘連及防止損傷引起的內(nèi)臟出血。羊膜薄片已除去細(xì)胞單層，暴露基底膜、I、Ⅱ、Ⅲ型膠原、昆布氨酸、纖維結(jié)合素類和其他糖蛋白成分，它們促進(jìn)傷口愈合，羊膜薄片也除去了細(xì)胞單層上的可引起免疫反應(yīng)的抗原部位。該羊膜材料是滅菌的，并可交聯(lián)。它以單層施用于粘連的創(chuàng)傷表面或包裹在出血內(nèi)臟上，可縫合或輔以液體抗粘連輔助物。該移植物可施用于濕的及干的表面。
文檔編號A61L33/00GK1115673SQ9510081
公開日1996年1月31日 申請日期1995年2月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月24日
發(fā)明者R·L·揚(yáng) 申請人:研究發(fā)展基金會