專(zhuān)利名稱：協(xié)調(diào)的體內(nèi)基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明題目協(xié)調(diào)的體內(nèi)基因表達(dá)與其他申請(qǐng)相關(guān)的交叉申請(qǐng)本申請(qǐng)是未結(jié)案的美國(guó)系列號(hào)08/207526(1994年3月7日提交)的接續(xù)申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本文描述了在體內(nèi)單細(xì)胞中協(xié)調(diào)表達(dá)外源基因的方法，所述外源基因經(jīng)多順?lè)醋佣嗪塑账針?gòu)建體導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物的組織中。所述方法會(huì)產(chǎn)生抗外源基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)。在脊椎動(dòng)物中可以使用本發(fā)明方法和多核苷酸構(gòu)建體以產(chǎn)生抗由單細(xì)胞表達(dá)的抗原決定基的免疫反應(yīng)。協(xié)調(diào)表達(dá)導(dǎo)致基因產(chǎn)物的表達(dá)得到改善，而所述基因產(chǎn)物可能在此之前表達(dá)得很差。它還會(huì)因通過(guò)相同細(xì)胞表達(dá)的T-細(xì)胞抗原而提供T細(xì)胞刺激信號(hào)，從而提高細(xì)胞的免疫反應(yīng)。以編碼人免疫缺損病毒(HIV)抗原的多核苷酸構(gòu)建體作為本方法的一個(gè)實(shí)施方案。
2.發(fā)明背景研制抗病毒，特別是象HIV這樣的高突變率病毒的疫苗的主要問(wèn)題是不同病毒分離物或毒株之間病毒被膜蛋白的多樣性，需要引發(fā)抗所述病毒的中和和保護(hù)性免疫反應(yīng)。由于小鼠和人的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)均能識(shí)別來(lái)自保守內(nèi)部病毒蛋白的抗原表面決定基而且它們?cè)诳共《久庖叻磻?yīng)中是重要的，因此，已經(jīng)努力研制CTL疫苗，所述疫苗引發(fā)抗不同病毒株的異源保護(hù)作用。
當(dāng)CD8+CTL的T細(xì)胞受體識(shí)別與MHCI型分子相關(guān)的病毒肽時(shí)，它們可殺死病毒感染的細(xì)胞。這些肽是內(nèi)源合成的病毒蛋白。因此，CTL通過(guò)識(shí)別來(lái)自保守病毒蛋白的抗原表面決定基就可提供跨毒株的保護(hù)作用。與有關(guān)CTL識(shí)別的MHCI型相關(guān)的肽來(lái)源于存在于或跨過(guò)胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)。進(jìn)入核內(nèi)體加工途徑的外源蛋白質(zhì)(如MHCII型分子提供的抗原)在產(chǎn)生CD8+CTL反應(yīng)中通常沒(méi)有作用。
產(chǎn)生CTL反應(yīng)需要復(fù)制載體以便在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)抗原或?qū)㈦膶?dǎo)入到細(xì)胞溶質(zhì)中。這些方法有限制它們作為疫苗使用的不足之處。反轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)多肽的大小和結(jié)構(gòu)有限制，所述多肽可作為融合蛋白而得到表達(dá)，同時(shí)保持重組病毒復(fù)制的能力。
此外，載體如痘苗所進(jìn)行的隨后免疫的有效性可能還被抗載體自身的免疫反應(yīng)所危害。另外，病毒載體和改性的病原體本身的危險(xiǎn)性有可能妨礙其用于人[R.R.Redfield等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志316，673(1987)；L.Mascola等，國(guó)際醫(yī)學(xué)進(jìn)展149，1569(1989)]。此外，選擇所出現(xiàn)的肽抗原表面決定基取決于個(gè)體MHC抗原的結(jié)構(gòu)；因此，由于在遠(yuǎn)系繁殖種群中MHC單模標(biāo)本的多樣性，肽疫苗可能會(huì)有有限的有效性。
Benvenisty，N.，和Reshef，L.[PNAS 83，9551-9555，(1986)]表明，可以表達(dá)經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)，靜脈內(nèi)(i.v.)或肌肉內(nèi)(i.m.)導(dǎo)入小鼠中的CaCl2沉淀的DNA。將DNA表達(dá)載體經(jīng)肌肉內(nèi)注射到小鼠中會(huì)導(dǎo)致肌肉細(xì)胞攝取DNA，然后表達(dá)由所述DNA編碼的蛋白質(zhì)[J.A.Wolff等，科學(xué)，247，1465(1990)；G.Ascadi等，自然，352，815(1991)]。質(zhì)粒作為游離體保持，但并不復(fù)制。隨后在大鼠，魚(yú)和靈長(zhǎng)類(lèi)的骨骼肌中和大鼠心肌中i.m.注射后觀察到持續(xù)的表達(dá)。在WO90/11092(1990，10，4)中報(bào)告了用核酸作為治療劑的技術(shù)，其中用裸多核苷酸接種脊椎動(dòng)物。
肌肉內(nèi)免疫對(duì)于此方法不是必需的。因此，Tang等人[自然，356152-154(1992)]公開(kāi)了將用編碼牛生長(zhǎng)激素(BGH)之DNA包被的金微射彈導(dǎo)入到小鼠的皮膚內(nèi)，從而在所述小鼠中生產(chǎn)抗BGH抗體。Furth等人[生物化學(xué)年鑒205，365-368，(1992)]表明可以用噴射注射器(jet injector)轉(zhuǎn)移活動(dòng)物的皮膚，肌肉，脂肪和乳腺組織。最近由Friedman，T.，[科學(xué)，244，1275-1281(1989)]綜述了導(dǎo)入核酸的方法。Robinson等人[新疫苗(包括防治艾滋病)現(xiàn)代進(jìn)展1992年會(huì)議論文摘要，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，p92]報(bào)告了將鳥(niǎo)流感病毒DNA通過(guò)i.m.，i.p.，i.v.施用到雞中可提供抗致命攻擊的保護(hù)作用。但是，Robinson等人并未公開(kāi)使用了何種鳥(niǎo)流感病毒基因。另外，只肯定了H7特異性免疫反應(yīng)；并未討論導(dǎo)入了跨毒株的保護(hù)作用。Zhu等人[科學(xué)，261209-211(1993年7月9日)；還可參見(jiàn)WO93/24640，1993年12月9日]表明將DNA陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物經(jīng)靜脈內(nèi)注射到小鼠中會(huì)導(dǎo)致全身表達(dá)克隆的轉(zhuǎn)基因。最近，Ulmer等人[科學(xué)2591745-1749，(1993]報(bào)告了通過(guò)注射編碼流感病毒蛋白質(zhì)的DNA而產(chǎn)生的抗流感病毒感染的異源保護(hù)作用。
用本發(fā)明就可滿足能夠引發(fā)抗病原體和腫瘤抗原的所需免疫反應(yīng)的特異性治療和預(yù)防劑的需要。在所述治療方法中特別重要的是誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)可防止因病毒毒株而引起的感染或疾病，而所述病毒毒株與得到所述抗原基因所來(lái)自的毒株是異源的。由于HIV突變迅速，而且已經(jīng)鑒定了許多致病性強(qiáng)的分離物，所以這是HIV的顯著特點(diǎn)[參見(jiàn)例如，LaRosa等，科學(xué)，249932-935(1990)，鑒定了245種不同的HIV分離物]。
為了與這種多樣性相適應(yīng)，研究人員試圖用肽免疫來(lái)產(chǎn)生CTL。因此Takahash等人[科學(xué)，255333-336(1992)]報(bào)告了誘導(dǎo)有廣泛交叉反應(yīng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，所述T細(xì)胞識(shí)別一種HIV被膜(gp160)決定基。他們認(rèn)識(shí)到得到真正交叉反應(yīng)性的CTL反應(yīng)的困難，而且表明在T細(xì)胞的引發(fā)或再刺激(是很?chē)?yán)格的)和從已經(jīng)被刺激的CTL引發(fā)效應(yīng)物功能(包括細(xì)胞毒性)之間有不同。Wang等人[美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，904156-4160(1993)]報(bào)道了通過(guò)肌肉內(nèi)接種克隆的基因組(未剪接的)HIV基因而在小鼠中引發(fā)免疫反應(yīng)。所達(dá)到的免疫反應(yīng)水平很低，而且所述系統(tǒng)使用了部分小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子和部分猴病毒40(SV40)啟動(dòng)子和終止子。已知SV40可能通過(guò)整合到宿主細(xì)胞DNA中而轉(zhuǎn)化細(xì)胞。因此，與本文所描述的系統(tǒng)不同，Wang等人描述的系統(tǒng)并不適用于人。另外，Wang等人的DNA構(gòu)建體含有編碼鄰接Tat/REV-gp160-Tat/REV編碼序列的主要HIV基因組片段(

圖1)。正如在下文詳細(xì)描述一樣，為了得到高水平表達(dá)的gp160，這是一個(gè)次最佳系統(tǒng)。一個(gè)缺陷是Tat的表達(dá)對(duì)卡氏肉瘤的發(fā)展有影響[Y.N.Vaishav和F.W.WongStaal，生物化學(xué)研究年鑒(1991)]。
WO93/17706描述了給動(dòng)物接種疫苗以預(yù)防病毒的方法，其中用一基因構(gòu)建體包被載體顆粒，然后將所述包被的載體顆粒加速導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中。就HIV而言，建議主要使用完整基因組，去掉長(zhǎng)末端重復(fù)。那種方法會(huì)給受體帶來(lái)一定的危險(xiǎn)。通常HIV構(gòu)建體應(yīng)含有至少約50％的HIV基因組以確保疫苗的安全。因此，如果用基因傳遞技術(shù)導(dǎo)入有用的人HIV疫苗就會(huì)有許多問(wèn)題。
本發(fā)明使用已知方法將多核苷酸導(dǎo)入活組織中以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。本發(fā)明提供了將HIV和其他蛋白質(zhì)導(dǎo)入抗原加工途徑以有效產(chǎn)生HIV特異性CTL和抗體的免疫原。所述藥物作為疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞和體液抗HIV和HIV中和免疫反應(yīng)是有效的。本發(fā)明通過(guò)提供多核苷酸免疫原而解決了某些問(wèn)題，所述多核苷酸免疫原在其被導(dǎo)入到動(dòng)物中時(shí)，可以指導(dǎo)有效地表達(dá)HIV蛋白質(zhì)和表位，而不會(huì)帶來(lái)與那些方法相關(guān)的危險(xiǎn)。所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)在識(shí)別HIV，抑制HIV復(fù)制，鑒定并殺死HIV感染的細(xì)胞方面是有效的，而且有抗許多HIV菌株的交叉反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了抗HIV的有用的免疫原本發(fā)明還提供了多核苷酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體能夠在體內(nèi)的單個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)一種以上的基因產(chǎn)物。這點(diǎn)由HIV基因表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)明，其中第一個(gè)基因的表達(dá)依賴于第二個(gè)基因產(chǎn)物在相同細(xì)胞中的共表達(dá)。由于成功地達(dá)到了所述的體內(nèi)共表達(dá)，現(xiàn)在可預(yù)測(cè)這種類(lèi)型的多核苷酸構(gòu)建體可用于體內(nèi)共表達(dá)許多組合的基因產(chǎn)物，包括但不限于除HIV相關(guān)抗原以外的病毒抗原，癌相關(guān)的抗原和免疫調(diào)節(jié)或免疫刺激基因產(chǎn)物。
發(fā)明綜述本發(fā)明公開(kāi)了在導(dǎo)入到動(dòng)物組織中后，能夠誘導(dǎo)兩到三種順?lè)醋訁f(xié)調(diào)表達(dá)的核酸，包括DNA構(gòu)建體和RNA轉(zhuǎn)錄本。在一個(gè)實(shí)施方案中，協(xié)調(diào)表達(dá)了編碼HIV蛋白質(zhì)的兩個(gè)順?lè)醋?，并引發(fā)了抗一種以上基因產(chǎn)物的HIV特異性免疫反應(yīng)。產(chǎn)生了應(yīng)答人免疫缺損型病毒(HIV)不同毒株的病毒抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和通常為毒株特異性的抗體。所述CTL在體內(nèi)的產(chǎn)生，象病毒感染一樣，通常要求所述抗原的內(nèi)生表達(dá)。為了產(chǎn)生呈現(xiàn)于免疫系統(tǒng)的病毒抗原，而不會(huì)限制直接的肽傳遞或病毒載體的利用，將編碼HIV蛋白質(zhì)的多核苷酸直接導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物體內(nèi)組織，用所述組織內(nèi)的細(xì)胞攝取所述多核苷酸，然后被產(chǎn)生并加工編碼的蛋白質(zhì)以呈遞到免疫系統(tǒng)中。在小鼠中，這會(huì)導(dǎo)致HIV特異性CTL和抗體的產(chǎn)生。在靈長(zhǎng)類(lèi)可得到相似的結(jié)果。通過(guò)編碼并共表達(dá)HIV基因產(chǎn)物，作為T(mén)細(xì)胞共刺激元件的免疫刺激基因產(chǎn)物(包括但不限于GM-CSF，白細(xì)胞介素，干擾素和B7蛋白質(zhì))的2-或3-順?lè)醋雍怂岫嗪塑账峋涂傻玫竭@些結(jié)果。通常將本發(fā)明的方法用于協(xié)調(diào)任何兩個(gè)或三個(gè)基因的體內(nèi)表達(dá)。因此，本發(fā)明的各種實(shí)施方案包括病毒抗原和免疫刺激基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)以及腫瘤抗原和免疫刺激基因的協(xié)調(diào)表達(dá)。
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1 HIV基因組圖。圖2 本發(fā)明多核苷酸構(gòu)建體的圖，所述構(gòu)建體能夠在單個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)多達(dá)三個(gè)基因產(chǎn)物的體內(nèi)協(xié)調(diào)表達(dá)，所述基因產(chǎn)物分別由三個(gè)順?lè)醋又械囊粋€(gè)編碼(I，II和III)。片段A和B表示包括轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和啟動(dòng)子或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的對(duì)照序列。圖3 HIV被膜多核苷酸免疫原構(gòu)建體的詳細(xì)圖，所述構(gòu)建體含有CMV-intA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，5’-剪接供體，HIV gp160(表明gp120，gp41和REV反應(yīng)性元件，RRE)，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，REV順?lè)醋?，BGH轉(zhuǎn)錄終止子，和由原核轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素抗性標(biāo)記。圖4 表明了特異性調(diào)節(jié)元件的雙順?lè)醋拥腍IVenv和gag多核苷酸免疫原構(gòu)建體的詳細(xì)圖。圖5 由HIV多核苷酸免疫原誘導(dǎo)的gp160表達(dá)的Western印跡分析。該結(jié)果大致反映了在一個(gè)多核苷酸構(gòu)建體中一個(gè)以上基因產(chǎn)物在單個(gè)細(xì)胞中的共表達(dá)只編碼gp160的多核苷酸(見(jiàn)道B，從左邊數(shù)第四道)未表達(dá)可檢測(cè)的gp160，但反向加入REV(通過(guò)共轉(zhuǎn)染只編碼REV的構(gòu)建體)，就有較好的gp160表達(dá)(道A，從左邊數(shù)第四道)。無(wú)論是否反向加入REV，基因組tat/REV/env構(gòu)建體只表達(dá)低水平的gp160(道A和B，第三道)。但是，雙順?lè)醋觛p160/IRES/REV構(gòu)建體表達(dá)很多gp160(道A和B，從左邊數(shù)第五道)。用編碼gp160/IREV/REV的雙順?lè)醋訕?gòu)建體得到的表達(dá)最好，所述構(gòu)建體在gp160編碼序列的5’端有一剪接供體(SD)(道A和B，右邊道)。由于當(dāng)REV以反向(道A右邊道)提供時(shí)未增加表達(dá)，，所以被表達(dá)的REV水平不限制所述系統(tǒng)。圖6 V1J序列。圖7 V1Jneo序列。圖8 CMVintABGH序列。圖9 在應(yīng)答V1J-SIV-p28多核苷酸構(gòu)建體接種的恒河猴中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(不依賴REV)。該SIV p28等同于HIV的p24gag。因此，用編碼多核苷酸構(gòu)建體的gag可誘導(dǎo)群特異性抗原的特異性CTL。圖10 在應(yīng)答痘苗-SIVp28核酸接種中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。這表明與表達(dá)相同抗原的復(fù)制抗原(牛痘)相比，用編碼多核苷酸的(圖9) gag可誘導(dǎo)相似的CTL[見(jiàn)Shen L.等，科學(xué)252440-443，1991]。圖11 載體V1R的序列。圖12 由V1Jns-tPA-gp120，200μg/小鼠每輪，兩輪，誘導(dǎo)的抗體。圖13 用來(lái)自V1Jns-tPA-gp120(MN)DNA接種的非洲綠猴的血清中和HIV-1(MN)病毒。道A和B表示在暴露于表明稀釋度的血清后，用HIV-1(MN)感染的C8166細(xì)胞p24gag蛋白質(zhì)生產(chǎn)的降低，所述血清來(lái)自V1Jns-tPA-gp120DNA接種的猴。病毒接種(每樣品TCID50)后，在10天的組織培養(yǎng)物中得到數(shù)據(jù)。圖14 V1Jns-tPA-gp120接種的小鼠的T細(xì)胞有長(zhǎng)期的抗原特異性T淋巴細(xì)胞記憶反應(yīng)。在殺死前6個(gè)月受免疫的小鼠接受兩次1.6mcg的疫苗DNA。將脾T細(xì)胞與5mcg/ml重組gp120蛋白質(zhì)一起體外培養(yǎng)。增殖gp120特異性T細(xì)胞。刺激指數(shù)(SI；將3H-胸苷摻入gp120處理的T細(xì)胞T細(xì)胞未接受抗原)。圖15 由來(lái)自V1Jns-tPA-gp120DNA接種的小鼠的T細(xì)胞分泌1型T輔助(TH1)淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子。rgp120處理后，檢測(cè)圖13中所示樣品細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌的γ-干擾素和白細(xì)胞介素4(IL-4)。免疫小鼠分泌大量的γ-干擾素和少量的IL-4，這表明這種疫苗誘導(dǎo)TH1樣反應(yīng)。對(duì)照小鼠有很少量的干擾素分泌，而IL-4水平是背景水平。圖15 在V1Jns-tPA-gp120DNA接種的小鼠中抗gp120細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性。gp120DNA接種后，兩只小鼠(2006和2008)有對(duì)gp120肽(P18)特異性的MHCI限制的CTL活性。在沒(méi)有P18的這些小鼠或以前未接種的對(duì)照小鼠中未觀察到活性。圖16 用V1Jns-gp160/IRES/rev和V1Jns-tPA-gp120DNA疫苗接種的恒河猴中的抗-gp160CTL活性。所有四只接受這些疫苗的猴的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物表明MHCI有限地殺死已經(jīng)用痘苗-gp160處理的自體靶細(xì)胞。在用“空白”DNA疫苗(沒(méi)有基因插入的V1Jns)免疫的四只對(duì)照恒河猴中未觀察到CTL活性。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了在直接導(dǎo)入到動(dòng)物組織中后，能夠誘導(dǎo)兩個(gè)或三個(gè)順?lè)醋訁f(xié)調(diào)表達(dá)的活性，包括DNA構(gòu)建體和RNA轉(zhuǎn)錄本。在一個(gè)實(shí)施方案中，說(shuō)明了編碼HIV蛋白質(zhì)的兩個(gè)順?lè)醋拥膮f(xié)調(diào)表達(dá)，并引發(fā)了抗一種以上基因產(chǎn)物的HIV特異性免疫反應(yīng)。產(chǎn)生了應(yīng)答不同人免疫缺損型病毒(HIV)毒株的病毒抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和通常為毒株特異性的抗體。象病毒感染一樣，通常體內(nèi)產(chǎn)生所述CTL需要所述抗原的內(nèi)生表達(dá)。為了產(chǎn)生呈現(xiàn)于所述免疫系統(tǒng)的病毒抗原，不限制直接的肽傳遞或病毒載體的利用，將編碼HIV蛋白質(zhì)的多核苷酸直接導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物體內(nèi)組織中，由所述組織內(nèi)的細(xì)胞攝取所述多核苷酸，然后在所述免疫系統(tǒng)中生產(chǎn)并加工被編碼的蛋白質(zhì)。在小鼠中，這樣導(dǎo)致產(chǎn)生HIV特異性CTL和抗體。在靈長(zhǎng)類(lèi)中得到了相似的結(jié)果。用編碼并共表達(dá)HIV基因產(chǎn)物，作為T(mén)細(xì)胞共刺激元件的免疫刺激基因產(chǎn)物(包括但不限于GM-CSF，白細(xì)胞介素，和B7蛋白質(zhì))的兩-或三-順?lè)醋雍怂岫嗪塑账嵋部梢缘玫竭@些結(jié)果。本發(fā)明的方法和多核苷酸通常用于任何兩或三個(gè)基因的體內(nèi)協(xié)調(diào)表達(dá)。因此，本發(fā)明的不同實(shí)施方案包括病毒抗原和免疫刺激基因產(chǎn)物的體內(nèi)協(xié)調(diào)表達(dá)以及腫瘤抗原和免疫刺激基因的協(xié)調(diào)表達(dá)。
本發(fā)明提供多核苷酸，當(dāng)其被直接導(dǎo)入的脊椎動(dòng)物體內(nèi)，包括哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)和人中后，在所述動(dòng)物中誘導(dǎo)所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
如本文所用，多核苷酸是含有必需的調(diào)控元件的核酸，以便導(dǎo)入到活脊椎動(dòng)物細(xì)胞中后，能夠指導(dǎo)細(xì)胞機(jī)制以生產(chǎn)由含所述多核苷酸之基因編碼的翻譯產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸是含有與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子操作相連的HIV基因的多脫氧核糖核苷酸。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述多核苷酸疫苗含有編碼HIV基因的多核糖核酸，所述HIV基因適合于由真核細(xì)胞機(jī)制(核糖體，tRNA和其他翻譯因子)翻譯。由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)是除在病理?xiàng)l件下，在正常動(dòng)物中沒(méi)有的蛋白質(zhì)，(即一種異源蛋白質(zhì))如與人免疫缺損型病毒(HIV)，獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)的病因?qū)W因子相關(guān)的蛋白質(zhì)，激活所述動(dòng)物的免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生保護(hù)性的免疫反應(yīng)。由于這些外源蛋白質(zhì)是由動(dòng)物自身的組織產(chǎn)生的，所以以與相關(guān)生物的，HIV感染實(shí)際發(fā)生時(shí)相似的方式，由主要組織相容性系統(tǒng)(MHC)加工所表達(dá)的蛋白質(zhì)。正如在本說(shuō)明書(shū)中所說(shuō)明的，其結(jié)果就是誘導(dǎo)抗同源病原體的免疫反應(yīng)。
因此，本發(fā)明人制備了核酸，當(dāng)其被導(dǎo)入到生物系統(tǒng)中后，誘導(dǎo)HIV蛋白質(zhì)和表位的表達(dá)。所誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)是所表達(dá)的HIV蛋白質(zhì)特異性的，而且中和HIV。另外，誘導(dǎo)了特異性識(shí)別并破壞HIV感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明人還研制了多核苷酸，借此，在導(dǎo)入體內(nèi)后，有效地表達(dá)猴免疫缺損型病毒(SIV)基因。這一成果是顯著的，因?yàn)橹挥泻芙咏啬M人疾病，AIDS的動(dòng)物模型是使用SIV的次人靈長(zhǎng)類(lèi)模型。因此，通過(guò)比較用HIV和SIV多核苷酸免疫原體內(nèi)得到的效果，就可以表明本發(fā)明免疫原作為疫苗的效力。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員在本文的教導(dǎo)下，可得出本發(fā)明的許多實(shí)施方案。因此，以本文公開(kāi)的成功的本發(fā)明為基礎(chǔ)，可以成功地使用不同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，終止子，載體或特定的基因序列。
本發(fā)明提供了使用多核苷酸的方法，在其導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物組織中后，在體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)兩個(gè)或多個(gè)不同的，獨(dú)立的基因產(chǎn)物的共表達(dá)。由于特定HIV基因含有已知為REV反應(yīng)性元件(RRE)的序列，所以所述模型是嚴(yán)格的。除非已知為REV的另一HIV基因也在表達(dá)含HIV基因的RRE的細(xì)胞內(nèi)，否則不能有效地表達(dá)這些基因。將所述現(xiàn)象描述為REV依賴性。
Pavlakis和Felber，WO93/20212描述了消除序列的方法，所述序列可誘發(fā)轉(zhuǎn)錄本的不穩(wěn)定性，而且還得到特定HIV基因的某些REV非依賴性。該方法通常不適用于所有的所述基因，而且耗費(fèi)時(shí)間并需要多基因修飾。此外，所述基因的表達(dá)水平和免疫原性可能因REV依賴性的消除而受到損害。
本發(fā)明提供了不同的解決方法，這些方法得到REV非依賴性并不需要多步操作REV依賴性的HIV基因。另外，本發(fā)明適用于表達(dá)REV非依賴性的基因以及表達(dá)REV依賴性的基因。本文所描述的REV依賴性表達(dá)系統(tǒng)在本發(fā)明中是有用的而且還可以用作說(shuō)明在體內(nèi)單細(xì)胞中共表達(dá)一個(gè)以上所需基因產(chǎn)物的嚴(yán)格系統(tǒng)。因此，在有益于體內(nèi)給定的細(xì)胞中共表達(dá)一種以上基因產(chǎn)物的任何環(huán)境中，均可使用本文所描述的方法和多核苷酸構(gòu)建體。
本文舉證的一種情況是，共表達(dá)免疫原性的表位和T細(xì)胞識(shí)別因子家族中已知為B7的一個(gè)成員。最近，Steven Edgington[生物技術(shù)，111117-1119，1993]描述了在激活消除腫瘤的CD8+CTL過(guò)程中，B7和抗原遞呈細(xì)胞表面上表位的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)出現(xiàn)的協(xié)調(diào)作用。一旦在抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的MHC分子呈現(xiàn)了T細(xì)胞受體(TCR)表位，通過(guò)與CTLA-4或CD28結(jié)合，在相同APC表面上表達(dá)的B7即作為第二信號(hào)。其結(jié)果是迅速分裂CD4+輔助T細(xì)胞，這樣傳遞信號(hào)使CD8+增殖并殺死APC。因此，我們?cè)诒疚闹姓f(shuō)明通過(guò)協(xié)調(diào)表達(dá)REV基因而有效地表達(dá)并產(chǎn)生抗含RRE的HIV REV依賴性基因的免疫反應(yīng)，從而結(jié)論性地證明通過(guò)誘導(dǎo)編碼兩個(gè)甚至三個(gè)順?lè)醋拥亩嗪塑账?定義為攜帶有關(guān)多肽鏈信息的一段核酸)來(lái)協(xié)調(diào)表達(dá)一個(gè)以上基因。
由于本發(fā)明的許多應(yīng)用都是用于抗病毒接種，所以常常將所述多核苷酸稱為多核苷酸疫苗(PNV)。這并不是說(shuō)這些多核苷酸在免疫刺激和抗腫瘤治療上的其他應(yīng)用，就可以忽略或認(rèn)為其在本發(fā)明的范圍之外。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼HIV基因產(chǎn)物的基因插入到表達(dá)載體中。所述載體含有由真核RNA聚合酶識(shí)別的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，和在HIV基因編碼序列末端的轉(zhuǎn)錄終止子。盡管本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道許多已知的其他啟動(dòng)子，如可以使用強(qiáng)免疫球蛋白或其他真核基因啟動(dòng)子但在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是帶內(nèi)含子A序列的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV-intA)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是牛生長(zhǎng)激素終止子。CMVintA-BGH終止子的組合(圖8，SEQ ID13)是特別優(yōu)選的。另外，為了有助于在原核細(xì)胞中制備多核苷酸，還可以優(yōu)選地在所述表達(dá)載體中包括位于原核啟動(dòng)子控制下的抗生素抗性標(biāo)記以便表達(dá)在真核細(xì)胞中本沒(méi)有的抗生素?？梢允褂冒逼S青霉素抗性基因，新霉素抗性基因或任何其他藥物學(xué)可接受的抗生素抗性標(biāo)記。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗生素抗性基因編碼新霉素抗性的基因產(chǎn)物。此外，為了有助于通過(guò)在原核生物中發(fā)酵來(lái)高水平生產(chǎn)所述多核苷酸，有利的是所述載體含有原核復(fù)制起點(diǎn)并且是高拷貝量的。許多市售原核克隆載體都可以提供這些益處。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)已知為pUC的市售載體提供這些功能。但是需要除去非必需的DNA序列。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中除去了pUC的lacZ和lacI編碼序列。還要使所述載體不能在真核細(xì)胞中復(fù)制。這樣使多核苷酸疫苗序列整合到受體基因組中的危險(xiǎn)降到最低。
在另一實(shí)施方案中，使用表達(dá)載體pnRSV，其中用勞氏肉瘤病毒(RSV)的長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)作為啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，使用V1，它是一種突變的pBR322載體，在所述載體中克隆了CMV啟動(dòng)子和BGH轉(zhuǎn)錄終止子。在本發(fā)明一個(gè)具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，將V1和pUC19組合以得到稱為V1J的表達(dá)載體(SEQ ID12)。將HIV基因，如gp120，gp41，gp160，gag pol env或任何可誘導(dǎo)抗HIV免疫反應(yīng)(抗體和/或CTL)的其他HIV基因克隆到V1J或另一適宜的表達(dá)載體中。除去由HIV基因組編碼的功能反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶功能元件可以使所述多核苷酸疫苗編碼序列整合到受體基因組中的危險(xiǎn)降到最小。在另一實(shí)施方案中，從V1J中除去氨芐青霉素抗性基因，然后用新霉素抗性基因取代以得到V1J-neo(SEQ ID14)，根據(jù)本發(fā)明可以將任何數(shù)量的不同HIV基因克隆到所得的載體中。在另一實(shí)施方案中，載體是V1Jns，它與V1Jneo相同，但除已將單個(gè)Sfi1限制位點(diǎn)插入到V1J-neo2114位置的單個(gè)Kpn1位點(diǎn)。Sfi1位點(diǎn)在人基因組DNA中的發(fā)生率很低(約每100,000個(gè)堿基1個(gè)位點(diǎn))。因此通過(guò)簡(jiǎn)單地用Sfi1消化提取的基因組DNA可以小心監(jiān)測(cè)所述表達(dá)載體是否整合到了宿主DNA。在另一方案中，載體是V1R。在該載體中，從所述載體中盡可能多地除去非必需的DNA以得到高度緊密的載體。該載體是V1Jns的衍生物并示于圖11(SEQ ID100)中。該載體允許使用更大的插入片段，而不必?fù)?dān)心會(huì)編碼不必要的序列，而且當(dāng)編碼特異性流感病毒基因的構(gòu)建體被導(dǎo)入到周?chē)M織中時(shí)，可以由細(xì)胞最恰當(dāng)?shù)財(cái)z取。在圖11中，缺失的V1Jneo部分用缺口表示，而插入序列用粗體表示，但V1Jneo標(biāo)號(hào)未變。根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法就可以完成前述的載體修飾和研制的方法。但是盡管是用常規(guī)方法得到的，所述的特定產(chǎn)物對(duì)于它們所適用的特定目的也是特別有用的。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案摻入了編碼HIVgp160，gp120，gag和來(lái)自著名實(shí)驗(yàn)室修改的HIV毒株如SF2，IIIB或MN的其他基因產(chǎn)物的基因，這是因?yàn)橐呀?jīng)得到了大量有關(guān)的資料，如表明通過(guò)第一次施用HIVIIIb V3環(huán)特異性單克隆抗體[Emini等，自然，355728-730，1992]或用重組gp120而不是gp160接種[Berman等，自然，345822-825，1990]可以使黑猩猩免于HIV IIIB病毒的致命攻擊。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以知道用與HIV-1基因功能相似的HIV-2毒株的基因可以產(chǎn)生與本文所述HIV-1構(gòu)建體的相似的免疫反應(yīng)。得到這些基因的克隆和操作方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。
最近已經(jīng)認(rèn)識(shí)到引發(fā)抗實(shí)驗(yàn)室修改的HIV毒株的免疫反應(yīng)對(duì)于中和HIV的初級(jí)野外分離物是不夠的[參見(jiàn)例如Cohen，J.，科學(xué)，262980-981，1993]。因此在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將來(lái)自強(qiáng)HIV初級(jí)野外分離物的基因插入到多核苷酸免疫原中。這可通過(guò)制備病毒基因的cDNA拷貝，然后將個(gè)體基因亞克隆到所述多核苷酸免疫原中來(lái)完成。許多HIV毒株的許多基因序列在GENBANK可公開(kāi)得到，所述HIV初級(jí)野外分離物可從國(guó)立過(guò)敏和傳染性疾病研究所(NIAID)得到，NIAID與Quality Biologica公司[17581林德堡大街，蓋斯堡，馬里蘭，20879]訂立了合同以便可得到這些毒株?，F(xiàn)在還可從世界衛(wèi)生組織(WHO)[HIV分離和表征網(wǎng)絡(luò)，疫苗發(fā)展單位，研究局，艾滋病全球規(guī)劃，CH-1211 日內(nèi)瓦27，瑞士]得到這些毒株。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員從這項(xiàng)工作可以看出本發(fā)明的實(shí)用性之一就是提供體內(nèi)以及體外的檢測(cè)和分析系統(tǒng)以便得出HIV序列多樣性與HIV中和血清學(xué)的關(guān)系以及其他參數(shù)。根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法可以完成這些不同基因的分離和克隆。因此，本發(fā)明還提供系統(tǒng)鑒定HIV毒株和疫苗序列的生產(chǎn)方法。HIV毒株初級(jí)分離物基因的摻入提供了誘導(dǎo)抗病毒臨床分離物的免疫反應(yīng)的免疫原，因此符合本領(lǐng)域尚未滿足的需要。此外，隨毒性分離物的改變，可以修飾所述免疫原以便按需要得到新序列。
為了保持術(shù)語(yǔ)的一致性，本文按下列習(xí)慣描述多核苷酸免疫原構(gòu)建體“載體名稱-HIV毒株-基因-附加元件”。因此，在MN毒株的gp160基因克隆到表達(dá)載體V11Jneo中的構(gòu)建體中，本文所給的名稱是“V11Jneo-MN-gp160”。在下文將詳細(xì)描述加到所述構(gòu)建體中的附加元件。自然，由于病毒病原毒株的變化，也可以改變用于加入到藥物中的最佳精確基因。但是，正如下文所說(shuō)明的，由于誘導(dǎo)了能夠抵御異源毒株的細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞反應(yīng)，與全病毒或以亞單位多肽為基礎(chǔ)的疫苗相比，在本發(fā)明的免疫原和疫苗中，毒株變異性就不太重要。另外，對(duì)藥物進(jìn)行簡(jiǎn)單操作就可插入一個(gè)新基因，所以這是一種用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易完成的調(diào)整。
為了完整地描述本發(fā)明，提供HIV的下列背景。人免疫缺損型病毒有核糖核酸(RNA)基因組，其結(jié)構(gòu)列在圖1中。根據(jù)本發(fā)明方法的教導(dǎo)，為了產(chǎn)生用于克隆和操作的cDNA拷貝，就必須用本領(lǐng)域熟知的方法反轉(zhuǎn)錄所述的RNA基因組。在所述基因組的兩端，各有一個(gè)作為啟動(dòng)子的長(zhǎng)末端重復(fù)序列。在這兩個(gè)末端之間，所述基因組在不同的閱讀框架中編碼gag-pol-env作為主要基因產(chǎn)物gag是群特異性抗原；pol是反轉(zhuǎn)錄酶或聚合酶；在另外的閱讀框架中該區(qū)還編碼引起翻譯后如將gp160加工成gp120和gp41的病毒蛋白酶，；env是被膜蛋白；vif是病毒粒子感染因子；REV是病毒粒子蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)基因；neg是負(fù)調(diào)節(jié)因子；vpu是病毒粒子生產(chǎn)力因子“u”；tat是轉(zhuǎn)錄的反向激活因子；vpr是病毒蛋白質(zhì)r。已經(jīng)描述了這些元件各自的功能(見(jiàn)AIDS 89，Montreal，費(fèi)城科學(xué)小組出版物，從中采用了圖1)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼HIV或SIV蛋白質(zhì)的基因直接與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子相連。env基因編碼一個(gè)大的膜結(jié)合蛋白，gp160，該蛋白翻譯后被加工成gp41和gp120。可以將gp120基因放在用于表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下。但是，gp120不與膜結(jié)合，因此表達(dá)后，可以從細(xì)胞中分泌出來(lái)。由于在感染的細(xì)胞中，HIV傾向于保持休眠，因此需要產(chǎn)生針對(duì)細(xì)胞結(jié)合的HIV表位的免疫反應(yīng)。本文通過(guò)體內(nèi)表達(dá)細(xì)胞膜相關(guān)的表位，gp160，以引發(fā)免疫系統(tǒng)就可達(dá)到該目的。然而，在沒(méi)有REV的情況下，由于不從未剪接的基因的核中排出，gp160的表達(dá)受到抑制。為了理解該系統(tǒng)，必須詳細(xì)描述HIV的生活周期。
在HIV的生活周期中，感染宿主細(xì)胞后，HIV RNA基因組反轉(zhuǎn)錄成可以作為單個(gè)轉(zhuǎn)錄單位整合到宿主基因組DNA中的原病毒DNA。LTR提供了從5’到3’(gag，pol，env)轉(zhuǎn)錄HIV基因的啟動(dòng)子以形成未剪接的全部基因組的轉(zhuǎn)錄本。未剪接的轉(zhuǎn)錄本作為可翻譯gag和pol的mRNA，而有限的剪接對(duì)于翻譯env編碼的基因是必須的。由于在基因組設(shè)置中，如圖1所示，REV和env是重疊的，因此為了調(diào)節(jié)待表達(dá)的基因產(chǎn)物REV，必須剪接一次以上。為了轉(zhuǎn)錄env，必須停止REV轉(zhuǎn)錄，反之亦然。另外，從核中排出未剪接的RNA要求存在REV。但為了使REV在該方法中發(fā)揮功能，在轉(zhuǎn)錄本上必須存在REV反應(yīng)元件(RRE)[Malim等，自然，338254-257(1989)]。
在本發(fā)明的多核苷酸疫苗中，通過(guò)提供完全剪接的基因來(lái)消除特定HIV基因的強(qiáng)制性剪接(即提供所需基因產(chǎn)物的完全開(kāi)放閱讀框架，而不需轉(zhuǎn)換閱讀框架或消除非編碼區(qū)；本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該知道，在剪接特定的基因時(shí)，在得到精確的序列方面有一定的自由度；但是，只要得到功能編碼序列，這就是可接受的)。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，剪接gp160的完整編碼序列，剪接REV序列，以便不需要各基因產(chǎn)物的間歇性表達(dá)。此外，研究了REV經(jīng)調(diào)節(jié)表達(dá)的特征以便使HIV編碼的REV依賴性的免疫原性的基因產(chǎn)物的表達(dá)最優(yōu)。
為了使REV作為在胞質(zhì)中待翻譯的來(lái)自核的轉(zhuǎn)錄本輸出物，除在被輸出的轉(zhuǎn)錄本上需要存在REV反應(yīng)元件(RRE)外，REV還需要在含RRE之基因的5’側(cè)至少有一個(gè)剪接供體位點(diǎn)[Lu等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，877598-7602，(1990年10月)，Chang和Sharp，細(xì)胞，59789-795(1989年12月1日)]。本發(fā)明人設(shè)想，在與待表達(dá)基因相同的表達(dá)載體的一個(gè)位置上，多核苷酸提供REV編碼序列以便共表達(dá)REV和REV反應(yīng)基因，而不需進(jìn)行任何剪接。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，將HIV基因緊接轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子的下游，剪接的REV編碼序列放在第一個(gè)編碼序列的3’(也稱為下游)位置。自然，可以改變這些基因的順序。但是優(yōu)選的是使免疫原性的HIV順?lè)醋又苯泳o鄰轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子以確保產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本編碼全部順?lè)醋印?br> 共表達(dá)基因的一種方法依賴于用表達(dá)不同基因的不同載體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)中的細(xì)胞。對(duì)于REV依賴性基因，以反向方式提供REV基因產(chǎn)物。但這對(duì)于本發(fā)明目的是次優(yōu)的，盡管并未在本發(fā)明范圍之外，但由于體內(nèi)共轉(zhuǎn)染給定細(xì)胞以達(dá)到REV的可獲性的可能性很低，而這種可獲性對(duì)于REV依賴性免疫原性的HIV基因產(chǎn)物的強(qiáng)表達(dá)是必需的。另一方法是在給定的載體上提供數(shù)個(gè)啟動(dòng)子，各啟動(dòng)子分別控制不同基因的表達(dá)。這等于順式提供REV基因產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明可以使用這種方法。在所述的實(shí)施方案中，它對(duì)于各種啟動(dòng)子和它們反方向控制的基因來(lái)說(shuō)是優(yōu)選的。但是，由于在這種類(lèi)型的多基因載體中啟動(dòng)子之間已知的競(jìng)爭(zhēng)性干擾，所以認(rèn)為該實(shí)施方案也是次優(yōu)的。
Ghattas等人[分子和細(xì)胞生物學(xué)，11，No.125848-5859(1991年12月)]，Kaufaman等人[核酸研究19，No.164485-4490(1991)]和Davies[病毒學(xué)雜志66，No.41924-1932(1992年4月)]已描述了腦心肌炎病毒(EMCV)前導(dǎo)序列中的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。他們報(bào)告說(shuō)可以用上游啟動(dòng)子啟動(dòng)雙順?lè)醋觤RNA轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)，在IRES位于兩個(gè)基因之間時(shí)，可以很好地表達(dá)5’和3’的開(kāi)放閱讀框架。Chen等人[病毒學(xué)雜志，672141-2145，1993]報(bào)告了一個(gè)系統(tǒng)，其中用來(lái)自豬泡囊(vesiculor)病病毒(SVDV)的5’非翻譯區(qū)(NTR)構(gòu)建雙順?lè)醋硬《?，所述雙順?lè)醋硬《居糜诠脖磉_(dá)來(lái)自一個(gè)感染病毒載體的一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的兩個(gè)基因。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)摻入?yún)f(xié)調(diào)表達(dá)含REV反應(yīng)元件(RRE)的HIV基因，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和REV編碼序列的核酸構(gòu)建體可以有效地表達(dá)REV和REV依賴性基因產(chǎn)物。參考圖2和3可以更好地理解本發(fā)明的該實(shí)施方案。圖2表示一個(gè)一般化的實(shí)施方案，而圖3表示本發(fā)明的具體實(shí)施方案，根據(jù)上述的命名系統(tǒng)，是V1Jns-gp160(RRE)-IRES-REV。免疫原性的HIV基因所來(lái)自的HIV毒株與所討論的說(shuō)明性目的無(wú)關(guān)，但是，可預(yù)測(cè)任何REV依賴性基因產(chǎn)物的表達(dá)是有效的，象引發(fā)抗REV和REV依賴性基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)是以本專(zhuān)利的公開(kāi)為基礎(chǔ)的一樣。根據(jù)圖3中所示的實(shí)施方案，載體是上述的V1Jns。因此根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，載體提供啟動(dòng)子(CMVintA)和終止子(BGH)以及原核復(fù)制原點(diǎn)以便有利于通過(guò)發(fā)酵用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)HIV多核苷酸疫苗。由于沒(méi)有真核復(fù)制原點(diǎn)，該構(gòu)建體不能在真核組織中復(fù)制。緊接在HIV基因之前提供來(lái)自天然產(chǎn)生的rev/tat剪接供體(rev/tatSD)的剪接供體位點(diǎn)。gag/pol/env編碼序列含有REV反應(yīng)元件(RRE)或在其之前，在形成新的轉(zhuǎn)錄本后，RRE提供REV結(jié)合并從核中輸出REV依賴性mRNA所必需的信號(hào)。然后在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)提供用于再啟動(dòng)反應(yīng)所需的序列以便有效地翻譯下游REV編碼序列。用該方法，在與REV依賴性基因產(chǎn)物相同的多核苷酸上順式提供REV基因產(chǎn)物。
在本發(fā)明的另一方案中，在PNV中包含了第三個(gè)順?lè)醋?。利用組織特異性轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，完成了編碼作為B7抗原遞呈細(xì)胞表面蛋白的所述免疫刺激蛋白的基因，人顆粒細(xì)胞/單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因和如白細(xì)胞介素和干擾素的細(xì)胞因子基因。通過(guò)推廣前述有關(guān)REV和REV依賴性基因，順式將IRES插入到REV之后，B7基因之前，通過(guò)在與雙順?lè)醋覴EV依賴性HIV基因相同的載體構(gòu)建體，IRES-REV構(gòu)建體上提供第二啟動(dòng)子或用不同構(gòu)建體反式提供B7或GM-CSF基因。即使反式提供可增強(qiáng)抗由本發(fā)明免疫原編碼的HIV基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)，這些基因產(chǎn)物的一般化免疫刺激效果也足夠了。特別是對(duì)于B7，優(yōu)選的是在MHC-I分子的縫隙相同細(xì)胞遞呈的HIV表位也遞呈B7?？乖砦缓虰7的共遞呈關(guān)閉了T細(xì)胞激活所需的開(kāi)關(guān)。調(diào)節(jié)是否引發(fā)顯著體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)[參見(jiàn)Afonso等，科學(xué)，263235-237，1993]的細(xì)胞因子，特別是IL-2在導(dǎo)入PNV的同時(shí)靜脈內(nèi)提供或包含在PNV中作為第三順?lè)醋?，由此確保白細(xì)胞介素的定位生產(chǎn)。這些免疫刺激和免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的基因，包括GM-CSF(見(jiàn)Shaw和Kamin，細(xì)胞，46659-667，1986)，白細(xì)胞介素-12(見(jiàn)Wolf，S.等，免疫學(xué)雜志，1463074-3081，1991)和B7(見(jiàn)Gordon等，免疫學(xué)雜志，1432714-2722，1989；有關(guān)B7蛋白質(zhì)家族新成員的克隆和序列，見(jiàn)Azuma，M.等，自然，36676-79，1993；和Freemian，G.等，科學(xué)，262909-911，1993)是已知的，而且用本領(lǐng)域已知的方法，根據(jù)本發(fā)明很容易將其克隆并摻入到PNV中。優(yōu)選的用于該目的的基因是人基因以使抗這些蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)最小，從而使被表達(dá)的蛋白質(zhì)完成它們的免疫調(diào)節(jié)和免疫刺激功能。若HIV基因已經(jīng)提供了REV獨(dú)立性，就可以完全除去REV順?lè)醋?，可以?gòu)建編碼B7基因家族成員的第二順?lè)醋雍途幋a另一基因產(chǎn)物如ZL-12的第三順?lè)醋印?br> 無(wú)論何時(shí)需要限制特定組織型多核苷酸的表達(dá)，只要使用組織特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，如肌肉肌酸激酶(MCK)增強(qiáng)子元件。例如，單核細(xì)胞是不再分裂的分化到最后的細(xì)胞。將外源DNA整合到染色體中看起來(lái)需要細(xì)胞分裂和蛋白質(zhì)合成。因此，將蛋白質(zhì)表達(dá)限制在非分裂細(xì)胞如單核細(xì)胞中是優(yōu)選的。然而，在PNV所導(dǎo)入的許多組織中，為了完成表達(dá)使用CMV啟動(dòng)子就足夠了。
在下列描述的本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，使用上述基本示例。從基本構(gòu)想的設(shè)計(jì)偏離，增加或減去作為本發(fā)明不同方面的重要部分。
本專(zhuān)利公開(kāi)舉證了以雙或三順?lè)醋親IV多核苷酸免疫原作為多核苷酸疫苗，PNVs以產(chǎn)生體液免疫以及跨毒株的細(xì)胞抗病毒免疫。當(dāng)要求在體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)所編碼的基因產(chǎn)物時(shí)，無(wú)論是否與HIV相關(guān)，所述系統(tǒng)對(duì)于任何兩或三順?lè)醋佣际怯杏玫?。但是，假如給定HIV在受感染種群和受干擾個(gè)體內(nèi)的突變傾向，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的雙體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)對(duì)于抑制HIV感染是特別有效的。為了配制用于HIV的有效保護(hù)性疫苗，需要對(duì)例如gp160(env在各種HIV-1，cladeB毒株中有約80％的保守性，所述毒株在美國(guó)人種群中是普遍毒株)(HIV上的主要中和靶)以及對(duì)gp160的保守部分和由gag編碼的內(nèi)部病毒蛋白質(zhì)有反應(yīng)性的細(xì)胞毒T細(xì)胞的多價(jià)抗體。我們已經(jīng)制備了含gp160基因的HIV疫苗，所述gp160基因選自普通實(shí)驗(yàn)室的毒株；選自在受感染種群中發(fā)現(xiàn)的顯著的初級(jí)病毒分離物；選自被設(shè)計(jì)用來(lái)暴露交叉毒株的突變gp160，中和抗體表位；選自其他有代表性的HIV基因如gag基因(在HIV分離物中有≥95％的保守性)；選自SIV，它提供檢測(cè)HIV PNV的動(dòng)物模型，在所述模型中可以免疫并攻擊非人靈長(zhǎng)類(lèi)以檢測(cè)病毒負(fù)載和疾病的進(jìn)度。
實(shí)際上未發(fā)展成免疫缺損狀態(tài)的所有血清陽(yáng)性患者均含有抗-gagCTL，而其中約60％的患者表現(xiàn)出交叉毒株，gp160特異性CTL。在已經(jīng)發(fā)展成已知為AIDS的受感染個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的HIV特異性CTL量很少，這說(shuō)明我們發(fā)現(xiàn)的成果在于我們可以誘導(dǎo)交叉毒株CTL反應(yīng)。由于HIV晚期基因表達(dá)是REV依賴性的，所以設(shè)計(jì)gp160和gag接種載體以產(chǎn)生REV(約90％保守)，從而有利于REV依賴性的基因表達(dá)。本發(fā)明的另一益處是還產(chǎn)生抗REV免疫反應(yīng)。這就是我們疫苗的另一優(yōu)點(diǎn)，由于在細(xì)胞感染后很早，而在晚期基因產(chǎn)物合成前幾小時(shí)就大量產(chǎn)生REV，由此提供了一個(gè)通過(guò)疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)，包括CTL和T輔助細(xì)胞較早進(jìn)行干擾的機(jī)會(huì)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，制備混合疫苗，其中將不同HIV REV依賴性基因構(gòu)建體混合在一起以便除產(chǎn)生抗免疫原性的HIV REV依賴性基因產(chǎn)物的抗體和CTL外，還產(chǎn)生抗REV CTL反應(yīng)。根據(jù)本實(shí)施方案，將含一個(gè)啟動(dòng)子和兩個(gè)IRES序列的三順?lè)醋訕?gòu)建體中編碼gp160，接著REV，然后B7的一個(gè)多核苷酸以另一多核苷酸混合，后者編碼gag基因產(chǎn)物，REV，和B7或另一免疫調(diào)節(jié)或免疫刺激基因產(chǎn)物，如IL-12或GM-CSF。在這種方式中，注射一個(gè)或多個(gè)核苷酸就可產(chǎn)生抗數(shù)個(gè)HIV相關(guān)免疫原的免疫反應(yīng)。另外，將含REV獨(dú)立的基因產(chǎn)物，如在WO93/20212中描述的，B7的一個(gè)多核苷酸和另一免疫調(diào)節(jié)或免疫刺激基因，如IL-12或GM-CSF與另一REV依賴性的或REV獨(dú)立性的雙或三順?lè)醋颖磉_(dá)構(gòu)建體混合在一起。此外，可以制備并混合編碼HIV或其他抗原的多雙或三順?lè)醋訕?gòu)建體以生產(chǎn)多價(jià)組合多核苷酸疫苗。
我們的env，REV和gag多核苷酸疫苗構(gòu)建體在小鼠，兔和靈長(zhǎng)類(lèi)中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。監(jiān)測(cè)小鼠中抗env的抗體生產(chǎn)可以確定，所給的構(gòu)建體是適宜致免疫的，即高比例的接種動(dòng)物表現(xiàn)出了抗體反應(yīng)。小鼠還提供了適宜檢測(cè)我們構(gòu)建體誘導(dǎo)的CTL的最易得到的動(dòng)物模型，因此用于評(píng)價(jià)特定構(gòu)建體是否能夠產(chǎn)生所述的活性。但是，已經(jīng)表明小鼠細(xì)胞系不支持有效的REV或tat功能。這種觀察是在HIV LTR驅(qū)動(dòng)的晚期基因表達(dá)中得到的，而且有限量的數(shù)據(jù)表明異源啟動(dòng)子可以使REV在小鼠細(xì)胞中發(fā)揮作用。兔和猴(非洲綠猴，恒河猴，黑猩猩)為在較大的非嚙齒動(dòng)物中評(píng)價(jià)抗體提供了包括靈長(zhǎng)類(lèi)的其他種。由于抗小鼠血清中所觀察到的反轉(zhuǎn)錄病毒的高水平內(nèi)生中和活性，這些種對(duì)于抗血清中和試驗(yàn)小鼠也是優(yōu)選的。這些數(shù)據(jù)表明用我們的疫苗產(chǎn)生了足夠的免疫原性，從而在黑猩猩/HIVIIIB攻擊模型的試驗(yàn)中得到得到作用。在科學(xué)界目前出現(xiàn)并逐漸接受的保護(hù)的定義正在離開(kāi)所謂“消毒免疫力”，這意味著完全抵御HIV感染，以防止疾病。該目的的許多相關(guān)數(shù)包括降低血液病毒滴定度，按HIV反轉(zhuǎn)錄酶活性，血清樣品的感染性，p24的ELISA檢測(cè)或血液中其他HIV抗原濃度，增加的CD4+T細(xì)胞濃度以及擴(kuò)展的存活率計(jì)[見(jiàn)例如，Cohen，J.，科學(xué)2621820-1821，1993，有關(guān)討論抗HIV疫苗效力的引伸定義]。本發(fā)明的免疫原還產(chǎn)生抗HIV感染性(臨床的初級(jí)野外)分離株的中和免疫反應(yīng)。免疫學(xué)A.對(duì)env的抗體反應(yīng)
1.gp160和gp120。用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)分泌的gp120或膜結(jié)合的gp160的疫苗載體對(duì)于生產(chǎn)env特異性抗體是否是有效的。開(kāi)始用gp160轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的免疫印跡分析體外表征我們接種載體所表達(dá)的env。用抗gp41和抗gp120單克隆抗體確認(rèn)這些數(shù)據(jù)并定量分析gp160表達(dá)以肉眼觀察轉(zhuǎn)染體細(xì)胞的gp160表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由于下列原因gp160對(duì)于gp120來(lái)說(shuō)是優(yōu)選的(1)開(kāi)始的gp120載體在小鼠中會(huì)引起不一致的免疫原性，而且在非洲綠猴中反應(yīng)性很低或沒(méi)有反應(yīng)性；(2)由于包含gp41，gp160通過(guò)增加約190個(gè)氨基酸殘基而引起附加的中和抗體和CTL表位；(3)從四聚體組裝和總的構(gòu)型來(lái)看，gp160表達(dá)與病毒env更相似；和(4)我們發(fā)現(xiàn)，象在小鼠，雪貂和非人靈長(zhǎng)類(lèi)中產(chǎn)生中和抗體肥應(yīng)的膜結(jié)合的流感病毒HA構(gòu)建體的成功一樣[參見(jiàn)Ulmer等，科學(xué)，2591745-1749，1993；Montgomery，D.等，DBA和細(xì)胞生物學(xué)，12777-783，1993]，抗gp160抗體產(chǎn)生優(yōu)于抗gp120抗體產(chǎn)生。用下列劃線的試驗(yàn)確定選擇哪一類(lèi)型env或env亞片段的混合物是否是優(yōu)選的。
2.中和活性的出現(xiàn)和幅度。檢測(cè)來(lái)自兔和猴的ELISA陽(yáng)性抗血清，并且表明它們中和同源和異源的HIV毒株。
3.V3對(duì)非-V3中和抗體。env PNV的主要目的是產(chǎn)生廣泛的中和抗體。現(xiàn)在已經(jīng)表明抗V3環(huán)的抗體的毒株特異性非常高，而且用此反應(yīng)的血清學(xué)來(lái)確定毒株。
a.非-V3中和抗體似乎主要識(shí)別引起CD4結(jié)合的gp120內(nèi)的不連續(xù)的結(jié)構(gòu)表位。抗該區(qū)域的抗體是多克隆的和交叉中和更廣泛的，這可能是由于因病毒與其細(xì)胞配體結(jié)合的需要而強(qiáng)加的突變的限制。用一個(gè)體外試驗(yàn)通過(guò)受免疫動(dòng)物血清檢測(cè)gp120與固定在96孔培養(yǎng)上CD4結(jié)合的阻斷。第二個(gè)體外試驗(yàn)檢測(cè)與代表在塑料上固定的選定的V3區(qū)的合成肽結(jié)合的直接抗體。這些試驗(yàn)是抗血清兼容的而且限定了我們疫苗已產(chǎn)生的中和抗體類(lèi)型，并提供與病毒中和的體外相關(guān)性，所述抗血清來(lái)自在我們的研究中所用的任何動(dòng)物類(lèi)型。
b.gp41含至少一個(gè)主要的中和決定基，相當(dāng)于由廣泛中和的2F5單克隆抗體(可從病毒測(cè)試系統(tǒng)公司，得克薩斯貿(mào)易大樓600，塔維斯大街，休特4750，休斯頓，TX 77002-3005(美國(guó))或瓦爾得海姆Pharmazeutika GmgH，玻爾茲曼格斯11，A-1091維恩，奧地利，購(gòu)買(mǎi))識(shí)別的高度保守的線性表位，以及其他潛在位點(diǎn)，包括位于gp41 N-末端的很保守的“融合肽”區(qū)。除用上述抗gp41的抗體檢測(cè)外，將一個(gè)體外試驗(yàn)用于與合成肽結(jié)合的抗體，所述合成肽代表固定在塑料上的這些區(qū)。
4.體反應(yīng)的成熟。在HIV血清陽(yáng)性患者中，中和抗體反應(yīng)主要從抗-V3發(fā)展以包括更多的中和抗體，所述抗體含有包括gp41表位的上述gp120結(jié)構(gòu)區(qū)表位。在時(shí)間進(jìn)程和隨后的接種過(guò)程中監(jiān)測(cè)這些類(lèi)型的抗體反應(yīng)。B.抗env，REV，nef和gag的T細(xì)胞反應(yīng)性1.產(chǎn)生CTL反應(yīng)。在細(xì)胞內(nèi)合成的病毒蛋白質(zhì)引起MHCI-限制的CTL反應(yīng)。這些蛋白質(zhì)中的每個(gè)都在血清陽(yáng)性患者中引發(fā)CTL。我們的疫苗也能夠在小鼠中引發(fā)CTL。按照用流感病毒NP說(shuō)明的，小鼠品分的免疫遺傳有助于所述研究[參見(jiàn)Ulmer等，科學(xué)，2591745-1749，1993]。已經(jīng)在Balb/c小鼠中限定了HIV蛋白質(zhì)env，REV，nef和gag的數(shù)個(gè)表位。因此有利于體外CTL培養(yǎng)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)。另外，有利的是使用用這些基因轉(zhuǎn)染的同系腫瘤系，如鼠肥大細(xì)胞瘤以提供CTL以及體外抗原特異性再刺激的靶。定義能夠引發(fā)MHCI型限制性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞之免疫原的方法是已知的[參見(jiàn)CalinLaurens等，疫苗11(9)974-978，1993；特別參見(jiàn)Eriksson等，疫苗，11(8)859-865，1993，其中在靈長(zhǎng)類(lèi)中作出了在HIVgp120上T細(xì)胞激活表位的圖譜，而且發(fā)現(xiàn)，包括gp120氨基酸142-192，296-343，367-400和410-453的數(shù)個(gè)區(qū)域誘導(dǎo)淋巴增殖；此外不連續(xù)區(qū)248-269和270-295也是淋巴增殖性的。還發(fā)現(xiàn)包括氨基酸152-176的肽也誘導(dǎo)HIV中和抗體]，而且可以用這些方法鑒定在本發(fā)明PNV中所包含的致免疫表位。另外，可以使用編碼gp160，gp120蛋白酶或gag的完整基因。有關(guān)此領(lǐng)域的其他綜述參見(jiàn)例如Shirai等人，免疫學(xué)雜志1481657-1667，1992；Choppin等人，免疫學(xué)雜志，147569-574，1991；Choppin等人，免疫學(xué)雜志，147575-583，1991；Berzofsky等人，臨床研究雜志，88876-884，1991。如在本文中所用的，T細(xì)胞效應(yīng)物功能與成熟的T細(xì)胞表型有關(guān)，如細(xì)胞毒性，用于B細(xì)胞激活的細(xì)胞因子分泌和/或巨噬細(xì)胞和噬中性粒細(xì)胞的補(bǔ)充和刺激。
2.TH活性的測(cè)量。通過(guò)加入重組蛋白質(zhì)或肽表位來(lái)監(jiān)測(cè)得自接種動(dòng)物脾細(xì)胞培養(yǎng)物恢復(fù)特異性抗原的情況。伴隨脾抗原遞呈細(xì)胞(APC)的出現(xiàn)，通過(guò)增殖這些培養(yǎng)物或細(xì)胞因子生產(chǎn)來(lái)監(jiān)測(cè)所述抗原激活的T細(xì)胞。因細(xì)胞因子生產(chǎn)的方式可以將TH反應(yīng)分成1型或2型。由于在免疫受損的血清陽(yáng)性患者中，明顯的TH2反應(yīng)與細(xì)胞免疫力的除去有關(guān)，因此可以限定患者中由給定PNV產(chǎn)生的反應(yīng)類(lèi)型，從而控制所得的免疫反應(yīng)。
3.延遲型超敏反應(yīng)(DTH)。皮內(nèi)注射后對(duì)病毒抗原的DTH是細(xì)胞初級(jí)MHCII限制性免疫力的指標(biāo)。由于可以從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)已知表位的重組HIV蛋白質(zhì)和合成肽，所以在用這些試劑接種的脊椎動(dòng)物中很容易確定DTH反應(yīng)，由此提供誘導(dǎo)細(xì)胞免疫力的另一體內(nèi)相關(guān)性。保護(hù)作用以上述免疫學(xué)研究為基礎(chǔ)，可以預(yù)測(cè)我們的疫苗在脊椎動(dòng)物中，對(duì)于抗毒性HIV攻擊是有效的。用HIVIIIB/黑猩猩攻擊模型，在用PNV構(gòu)建體或PNV構(gòu)建體混合物有效接種這些動(dòng)物后，完成了這些研究，所述PNV構(gòu)建體混合物由gp160IIIB，gagIIIB，nefIIIB和REVIIIB組成。由于已經(jīng)確定了該毒株致命量的黑猩猩滴定度，所以IIIB毒株就這點(diǎn)而論是有用的。然而，還要用任何HIV毒株和給定毒株特異性的或與其異源的表位進(jìn)行研究。除黑猩猩外，第二個(gè)接種/攻擊模型是scid-hu PBL小鼠。隨后在小鼠宿主中進(jìn)行HIV攻擊，該模型可以檢測(cè)人淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)和我們的疫苗。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它很容易適用于任何HIV毒株，而且提供抗HIV初級(jí)野外分離物的多個(gè)毒株的保護(hù)作用。第三個(gè)攻擊模型使用雜交HIV/SIV病毒(SHIV)，已表明其中有些感染恒河猴，并會(huì)導(dǎo)致引起死亡的免疫缺損疾病[見(jiàn)Li，J.，等，艾滋病雜志，5639-646，1992]。用我們的多核苷酸疫苗構(gòu)建體對(duì)恒河猴的接種對(duì)于隨后用致死量SHIV攻擊有保護(hù)作用。PNV構(gòu)建體綜述將HIV和其他基因優(yōu)選的連接到對(duì)于多核苷酸接種特別優(yōu)化的表達(dá)載體中。根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)，生產(chǎn)數(shù)種所述載體的方法是可能的。基本上除去了所有的額外DNA，只剩下了必需的元件轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，致免疫表位，帶有它們自己的啟動(dòng)子或IRES的編碼免疫增強(qiáng)或免疫調(diào)節(jié)基因的其他順?lè)醋?，轉(zhuǎn)錄終止子，細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因(如前所述)(見(jiàn)圖2)。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)該理解導(dǎo)入體外轉(zhuǎn)錄的RNA以生產(chǎn)由本發(fā)明DNA對(duì)應(yīng)物編碼的多順?lè)醋觤RNA自然構(gòu)成了本發(fā)明的必要部分。為了達(dá)到該目的，需要使用轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，并用T7或SP6啟動(dòng)子這樣的強(qiáng)RNA聚合酶啟動(dòng)子，并用線性化的DNA模板進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)錄。這些方法是本領(lǐng)域熟知的。
HIV晚期基因，如env和gag的表達(dá)是REV依賴性的，而且要求REV反應(yīng)元件(RRE)存在于病毒基因轉(zhuǎn)錄本上。在缺乏REV的情況下，通過(guò)用如來(lái)自tpa(組織型纖溶酶原激活物)的異源前導(dǎo)肽，優(yōu)選用如發(fā)現(xiàn)于商度表達(dá)的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的前導(dǎo)肽，如免疫球蛋白前導(dǎo)肽來(lái)取代gp120前導(dǎo)肽即可產(chǎn)生分泌形式的gp120。我們已將tPA-gp120嵌合基因插入到在轉(zhuǎn)染細(xì)胞(RD，人橫紋肌肉瘤系)有效表達(dá)分泌的gp120的V1Jns載體中。我們還研究了以IRES(IRES＝內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))為基礎(chǔ)的雙順?lè)醋覸1Jns載體，所述載體含有g(shù)p160(含RRE)和在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系(293，人胚胎腎細(xì)胞系；和RD)中有效表達(dá)gp160的REV。在未加入REV表達(dá)載體而轉(zhuǎn)染后，單順?lè)醋觛p160不生產(chǎn)任何蛋白質(zhì)。雙順?lè)醋觛p160/REV生產(chǎn)出與共轉(zhuǎn)染gp160和REV單順?lè)醋虞d體相似量的gp160。從這些研究可以預(yù)測(cè)，相對(duì)于gp160和REV載體的混合物而言，雙順?lè)醋虞d體在經(jīng)肌肉內(nèi)導(dǎo)入體內(nèi)后，能夠更有效地表達(dá)gp160，這是由于雙順?lè)醋颖ＷC在結(jié)構(gòu)上擴(kuò)展的多核肌肉細(xì)胞內(nèi)gp160構(gòu)建體和REV接近。這種雙順?lè)醋硬呗赃€可以保證在載體轉(zhuǎn)錄本區(qū)域內(nèi)，包含RRE后表達(dá)gag。它還支持在雙或三順?lè)醋覲NV中表達(dá)無(wú)關(guān)的基因，如共表達(dá)HIV致免疫表位，流感病毒致免疫表位，癌相關(guān)的抗原和免疫調(diào)節(jié)基因如白細(xì)胞介素，B7和GM-CSF。代表性的構(gòu)建體組分包括(但不限于)(見(jiàn)圖2，順?lè)醋覫，II和III)1 tPA-gp120MN2 gp160IIIB/IRES/REVIIIB；3 gp160IIIB；4 REVIIIB；5 tat/REV/gp160(弱表達(dá)gp160的基因組IIIB克隆)；6 REV/gp160；7 gp160MN；8 夾自臨床相關(guān)的初級(jí)HIV分離物的gp160；9 nef，用來(lái)自臨床相關(guān)毒株的基因；10 gagIIIB為抗-gag CTL；11 tPA-gp120IIIB為黑猩猩研究；12 帶結(jié)構(gòu)突變的gp160來(lái)自HIV臨床相關(guān)毒株的V3環(huán)取代；在數(shù)個(gè)構(gòu)建體上的數(shù)個(gè)突變，如除去可變環(huán)，Asn突變以除去立體(steric)結(jié)構(gòu)的碳水化合物障礙，中和抗體表位；和CD4結(jié)合位點(diǎn)拆卸(knockout)突變；13 gp41特異性地引發(fā)抗-gp41中和抗體，特別是位于跨膜區(qū)之前的2F5單克隆抗體表位，它在許多毒株中有廣泛的保守性。在沒(méi)有g(shù)p120的情況下，很難表達(dá)所述肽，而且需要數(shù)種策略，如最近的報(bào)道發(fā)現(xiàn)剪接到流感病毒HA環(huán)頂?shù)?F5表位能夠引發(fā)HIV中和抗體；另外，提供適宜的前導(dǎo)序列，如在tPA信號(hào)肽中的前導(dǎo)序列就可以表達(dá)所述的基因產(chǎn)物；14 gag與上述#5的構(gòu)建體相似，用來(lái)自臨床相關(guān)毒株的基因；15 rev為gp160和gag雙順?lè)醋樱?6 B7編碼序列；17 GM-CSF序列；18 白細(xì)胞介素序列，特別是編碼IL-12的；19 腫瘤相關(guān)的抗原；20 編碼由除HIV以外的病原體表達(dá)的抗原的基因，所述抗原包括但不限于流感病毒核蛋白，血細(xì)胞凝集素，基質(zhì)，神經(jīng)氨酸酶和其他抗原蛋白質(zhì)；單純性皰疹病毒基因；人乳頭瘤病毒基因；結(jié)核病抗原；甲，乙或丙型肝炎病毒抗原；以及其組合和其他抗原以至少形成雙順?lè)醋訕?gòu)建體，所述構(gòu)建體可以與多種其他的多順?lè)醋訕?gòu)建體組合以提供能夠引起抗所有代表的病原體或腫瘤抗原之免疫反應(yīng)的混合液組合物。
在HIVenv構(gòu)建體中，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以識(shí)別表達(dá)編碼各種envV3環(huán)氨基酸序列的核酸的需要性。作為一個(gè)實(shí)例，任何或所有下列氨基酸序列或其部分均可由本發(fā)明的HIV多核苷酸免疫原編碼用于PNV構(gòu)建體的gp160V3環(huán)序列的總結(jié)北美/歐洲共有序列，SEQ.ID1CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysSerIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrGlyGluIleIleGlyAspIleArgGlnAlaHisCysMN. SEQ.ID2CysThrArgProAsnTyrAsnLysArgLysArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsnIleIleGlyThrIleArgGlnAlaHisCysIIIB(HXB2R)，SEQ.ID3CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArgIleArgIleGlnArgGlyProGlyArgAlaPheValThrIleGlyLysIleGlyAsnMetArgGlnAlaHisCys116-v. SEQ.ID4CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysGlyIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrGlyLysIleIleGlyAsnIleArgGlnAlaHisCys452-p，SEQ.ID5CysThrArgProSerAsnAsnAsnThrArgLysSerIleHisIleGlyProGlyLysAlaPheTyrAlaThrGlyAlaIleIleGlyAspIleArgGlnAlaHisCys146-v，SEQ.ID6CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgArgSerIleHisIleAlaProGlyArgAlaPheTyrAlaThrGlyAspIleIleGlyAspIleArgGlnAlaHisCys通過(guò)用本發(fā)明的非復(fù)制質(zhì)粒DNA免疫，來(lái)說(shuō)明多核苷酸HIV免疫原抗隨后的病毒攻擊的保護(hù)性效力。由于不涉及感染劑，不需要組裝病毒顆粒，允許進(jìn)行決定基選擇，所以這樣是有利的。此外，由于在不同HIV毒株中，gag和蛋白酶以及數(shù)種其他病毒基因產(chǎn)物的序列是保守的，所以能夠達(dá)到抗毒性HIV毒株攻擊的保護(hù)作用，所述HIV毒株與克隆基因所來(lái)自的毒株同源或異源。
肌肉內(nèi)注射編碼gp160的DNA表達(dá)載體產(chǎn)生抗隨后的病毒攻擊的顯著保護(hù)性免疫力。具體說(shuō)，產(chǎn)生了gp160特異性抗體和初級(jí)CTL。盡管可變被膜蛋白質(zhì)有抗原漂移，但抗保守蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)還可有效。由于不同HIV基因產(chǎn)物有一定程度的保守性，而且由于為應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和MHC加工而產(chǎn)生了CTL，所以可預(yù)測(cè)許多病毒基因會(huì)引起與gp160的相似的反應(yīng)。因此，按克隆并連接在表達(dá)載體中所表明的(見(jiàn)下文)，已經(jīng)克隆了許多這些基因以便這些構(gòu)建體是可獲得形式的致免疫劑。
本發(fā)明提供了不需自我復(fù)制劑或佐劑就可誘導(dǎo)交叉毒株保護(hù)性免疫力的方法。另外，用本發(fā)明的多核苷酸免疫有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，接種方法應(yīng)該可用于腫瘤和感染劑，原因是CD8+CTL反應(yīng)對(duì)于生理學(xué)過(guò)程都是重要的[K.Tanaka等，免疫研究年鑒，6，359(1988)]。因此，引發(fā)抗轉(zhuǎn)化過(guò)程中重要的蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)可能就是癌癥保護(hù)或免疫治療的有效方法。第二，在注射病毒蛋白質(zhì)和人生長(zhǎng)激素DNA后產(chǎn)生高滴定度抗被表達(dá)蛋白質(zhì)的抗體[見(jiàn)如，D.-cTang等，自然，356，152，1992]，這表明這是容易得到的，而且是制備分離的或與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗組合的基于抗體的疫苗的高度有效的方法，所述細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞疫苗以保守抗原為靶。
與常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法相比，DNA構(gòu)建體生產(chǎn)和純化的容易性促進(jìn)了組合疫苗的產(chǎn)生。因此，可以制備，混合并同時(shí)施用如編碼gp160，gp120，gp41或任何HIV基因的多種構(gòu)建體。最后，由于注射DNA后保持蛋白質(zhì)的表達(dá)[H.lin等，循環(huán)，82，2217(1990)；E.Hansen等，F(xiàn)EBS通訊290，73(1991)；S.Jiao等，人體基因治療，3，21(1992)；J.A.Wolff等，人體分子基因治療，1，363(1992)]，B-和T細(xì)胞記憶的保留延長(zhǎng)[D.Gray和P.Matzinger，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，174，969(1991)；s.Oehen等，出處同上，176，1273(1992)]，由此產(chǎn)生了長(zhǎng)效的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。
用制備和純化DNA構(gòu)建體的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)就能夠制備本發(fā)明的DNA免疫原。盡管標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)足以生產(chǎn)本發(fā)明的產(chǎn)物，但是本文公開(kāi)的特異性構(gòu)建體提供了產(chǎn)生跨毒株和初級(jí)HIV分離物中和的多核苷酸免疫原，這是迄今為止用標(biāo)準(zhǔn)未激活的全病毒或亞單位蛋白質(zhì)疫苗所不能得到的結(jié)果。
被導(dǎo)入到疫苗受體中的可表達(dá)DNA或被轉(zhuǎn)錄的RNA量取決于所用的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)子的強(qiáng)度和被表達(dá)基因產(chǎn)物的免疫原性。一般，將免疫或預(yù)防有效劑量的約1ng-100mg優(yōu)選約10μg-300μg直接施用到肌肉組織中。還可使用皮下注射，皮內(nèi)導(dǎo)入，通過(guò)皮膚傳遞，和其他的施用方式如腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)或吸入。還可以進(jìn)行加強(qiáng)免疫。用HIV多核苷酸免疫原接種后，還可以用HIV蛋白質(zhì)免疫原如gp160，gp120和gag基因產(chǎn)物加強(qiáng)。在不經(jīng)腸導(dǎo)入本發(fā)明PNV的同時(shí)或之后，不經(jīng)腸使用，如靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下或以其他方式施用白細(xì)胞介素-12蛋白質(zhì)是有利的。
所述多核苷酸可以是裸露的，即與任何蛋白質(zhì)，佐劑或損害受體免疫系統(tǒng)的其他試劑無(wú)關(guān)。在這種情況下，要求所述多核苷酸是在生理學(xué)可接受的溶液中，如但不限于無(wú)菌鹽水或無(wú)菌緩沖的鹽水。另外，可以將所述DNA與脂質(zhì)體如卵磷脂脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其他脂質(zhì)體相連，作為DNA-脂質(zhì)體混合物，或者所述DNA可以與本領(lǐng)域已知的佐劑相混合以加強(qiáng)免疫反應(yīng)，所述佐劑如蛋白質(zhì)或其他載體。使用有助于細(xì)胞攝取DNA的試劑，如但不限于鈣離子，也是有利的。本文提到的這些試劑是作為轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑和藥物學(xué)可接受的載體。用多核苷酸包被微射彈(microprojectiles)的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，而且與本發(fā)明有關(guān)的也是有用的。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是多核苷酸，在其導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物組織中后，可在體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)兩個(gè)或三個(gè)不同的不連續(xù)的基因產(chǎn)物的共表達(dá)，所述多核苷酸含有第一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，它位于轉(zhuǎn)錄控制的第一順?lè)醋拥纳嫌魏臀挥谄渲?，在真核?xì)胞中可有效地操作在第一順?lè)醋酉掠蔚牡诙樂(lè)醋?，它位于第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下；任選地第三順?lè)醋游挥诘诙樂(lè)醋拥南掠?，它位于第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，或第三轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下；在第一，第二和第三順?lè)醋雍蠖加修D(zhuǎn)錄終止子，除非其后緊接的是沒(méi)有其自己的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的另一順?lè)醋印?br> 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是一多核苷酸，它含有在真核細(xì)胞中不能復(fù)制，但在將多核苷酸導(dǎo)入到真核組織體內(nèi)后，能夠被表達(dá)以產(chǎn)生基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列。所編碼的基因產(chǎn)物優(yōu)選地是作為免疫刺激劑或作為能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原。因此，在本實(shí)施方案中的核酸序列編碼剪接的REV基因，人免疫缺損型病毒(HIV)致免疫表位，和可選的，細(xì)胞因子或T細(xì)胞共刺激因子如B7家族蛋白質(zhì)的成員。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是在體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)兩個(gè)或三個(gè)不同基因產(chǎn)物的方法，包括將約0.1μg-100mg的本發(fā)明多核苷酸導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物組織中。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是用REV依賴性HIV基因在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括a)分離REV依賴性HIV基因；b)將所分離的基因與調(diào)節(jié)序列相連以便借助于可操作相連的控制序列而使所述基因可表達(dá)，在所述控制序列導(dǎo)入到活組織中后，可指導(dǎo)所述基因的轉(zhuǎn)錄起始和隨后的翻譯。
c)將可表達(dá)的基因?qū)氲交罱M織中；d)將編碼HIV REV的基因反式或順式導(dǎo)入到HIV REV依賴性基因中；和e)另外，可用附加的可表達(dá)HIV基因強(qiáng)化。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞以刺激HIV抗原特異性的細(xì)胞毒T細(xì)胞增殖的方法。這包括將脊椎動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞暴露與多核苷酸，所述多核苷酸由抗原HIV表位，REV(如果抗原HIV表位依賴于REV的有效表達(dá))，和B7編碼序列組成。
下列實(shí)施例將進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不是為了將本發(fā)明限定到具體的實(shí)施例。材料描述載體，pF411和pF412從R.Gallo的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的載體pSP62亞克隆這些載體。pSP62是從生物技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)室公司得到的試劑。pSP62有一個(gè)HXB2基因組的12.5 kb xbaI片段，所述基因組是從λHXB2亞克隆的。pSP62的SalI和XbaI消化產(chǎn)生HXB2片段5’-XbaI/SalI，6.5 kb和3’-SalI/XbaI，6kb。將這些插入片段亞克隆到pUC18的SmaI和SalI位點(diǎn)，產(chǎn)生pF411(5’-XbaI/salI)和pF412(3’-XbaI/SalI)。pF411含gag/pol，而pF412含tat/rev/env/nef。
Repligen試劑重組rev(IIIB)，#RP1024-10重組gp120(IIIB)，#RP1001-10抗-rev單克隆抗體，#RP1029-10抗-gp120mAB，#1C1，#Rp1010-10AIDS研究和有關(guān)的試劑程序抗-gp41mAB雜交瘤，Chessie8，#526實(shí)施例1用于疫苗生產(chǎn)的載體A)從pCMVIE-AKI-DHFR[Y.Whang等，病毒學(xué)雜志，61，1796(1987)]構(gòu)建表達(dá)載體V1。通過(guò)用EcoRI消化所述載體而除去AKI和DHFR基因，然后自我連接。所述載體不含CMV啟動(dòng)子中的內(nèi)含子A，所以將其作為有一缺失的內(nèi)部SacI位點(diǎn)[在按B.S.Chapman等，核酸研究，19，3979(1991)計(jì)數(shù)的1855位]的PCR片段加入。用于PCR反應(yīng)的模板是pCMVint-Lux，它是通過(guò)連接來(lái)自pCMV6a120[B.S.Chapman等，出處同上]的HindIII和NheI片段而制成的，所述HindIII和NheI片段包括hCMV-IE1增強(qiáng)子/啟動(dòng)子和內(nèi)含子A，將其插入到pBL3的HindIII和XbaI位點(diǎn)而產(chǎn)生pCMVIntBL。將來(lái)自RSV-Lux[J.R.deWet等，分子細(xì)胞生物學(xué)，7，725，1987]的1881堿基對(duì)的螢光素酶基因片段(HindIII-SmaIKlenow補(bǔ)平)克隆到經(jīng)Klenow補(bǔ)平和磷酸酶處理的pCMVIntBL的SalI位點(diǎn)。覆蓋內(nèi)含子A的引物是5′引物，SEQ.ID75′-CTATATAAGCAGAG CTCGTTTAG-3′；3′引物，SEQ ID85′-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA CTGCAG-3′為除去SacI位點(diǎn)而使用的引物是有義引物，SEQ ID95-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3′和反義引物，SEQ ID10，5′-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3′用Sac I和Bgl II切割所述PCR片段，然后將其插入到已用相同酶切割過(guò)的載體中。B)V1J表達(dá)載體，SEQ ID12我們產(chǎn)生V1J的目的是從我們的載體V1中取出啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止元件以便將其放在一個(gè)更確定的位置，從而得到更緊密的載體，并提高質(zhì)粒的純化率。
V1J是從載體V1(見(jiàn)實(shí)施例1)和pUC18衍生的，后者是可以從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的質(zhì)粒。用SspI和EcoRI限制酶消化V1，產(chǎn)生兩個(gè)DNA片段。從瓊脂糖電泳凝膠中純化較小的片段，它含有控制異源基因表達(dá)的CMVintA啟動(dòng)子和牛生長(zhǎng)激素(BGH)轉(zhuǎn)錄終止元件(SEQID13)。然后用T4DNA聚合酶“平整”該DNA片段的末端以便使其易與另一“末端平整”的DNA片段相連。
選擇pUC18提供所述表達(dá)載體骨架。已知它可產(chǎn)生高產(chǎn)率的質(zhì)粒，而且對(duì)其序列和功能特征都非常了解，并且是最小的。通過(guò)用HaeII限制酶部分消化，我們從該載體中除去整個(gè)lac操縱子，所述操縱子對(duì)于我們的目的沒(méi)有用處，而且還會(huì)損害質(zhì)粒產(chǎn)率和異源基因的表達(dá)。從瓊脂糖電泳凝膠中純化剩下的質(zhì)粒，用T4DNA聚合酶作成平整末端，用牛腸堿性磷酸酶處理，然后與上述CMVintA/BGH元件相連。得到在pUC骨架中，啟動(dòng)子元件有兩個(gè)可能的方向的質(zhì)粒。其中之一在大腸桿菌中有很高的DAT產(chǎn)率，將其稱為V1J(SEQ ID12)。通過(guò)連接區(qū)的序列分析來(lái)證明所述載體的結(jié)構(gòu)，并表明其異源基因的表達(dá)與V1可比或比V1高。C)V1Jneo表達(dá)載體，SEQ ID14需要除去含V1J之細(xì)菌中用于抗生素篩選的ampr基因，原因是氨芐青霉素不能用于大規(guī)模發(fā)酵罐。用Ssp I和Eaml 105I限制酶消化除去VIJpUC骨架中的ampr基因。用瓊脂糖凝膠電泳純化剩下的質(zhì)粒，用T4DAT聚合酶作成平整末端，然后用牛腸堿性磷酸酶處理。用PstI限制酶切出得自轉(zhuǎn)座子903并含在pUC4K質(zhì)粒中的市售kanr基因，用瓊脂糖凝膠電泳純化，然后用T4DNA聚合酶作成平整末端。將所述片段與V1J骨架相連，然后得到在兩個(gè)方向均可能帶kanr基因的質(zhì)粒，分別稱為V1Jneo#’s1和3。通過(guò)限制酶消化分析，連接區(qū)的DNA測(cè)序來(lái)確定每個(gè)質(zhì)粒，表明產(chǎn)生與V1J相似量的質(zhì)粒。V1Jneo載體在異源基因產(chǎn)物的表達(dá)方面也可與V1J相比。我們果斷地選擇V1Jneo#3(下文稱為V1Jneo，SEQID14)作為表達(dá)構(gòu)建體，它在與V1J中ampr基因相同的方向上含有kanr基因。D)V1Jns表達(dá)載體將一個(gè)Sfi I位點(diǎn)加到V1Jneo中以便有利于整合研究。將市售的13個(gè)堿基對(duì)的SfiI接頭(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)加在所述載體BGH序列內(nèi)的KpnI位點(diǎn)。用KpnI將V1Jneo線性化，凝膠純化，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平，然后與平整的Sfi I接頭相連。用限制酶圖譜選擇克隆分離物，用接頭的序列分析確定。將所述新載體稱為V1Jns。在V1Jns(帶Sfi I)中異源基因的表達(dá)與V1Jneo(帶KpnI)中相同基因的表達(dá)相當(dāng)。E)pGEM-3-IRES當(dāng)將腦心肌炎病毒(EMCV)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)并置在兩個(gè)基因之間時(shí)，它可以使在一個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)有效表達(dá)所述的兩個(gè)基因。我們利用所述的非編碼基因片段來(lái)產(chǎn)生用于多核苷酸疫苗的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體。將EMCVIRES片段亞克隆為來(lái)自pCITE-1質(zhì)粒(Novagen公司)的0.6kb的EcoRI/BssHII消化片段。將所述片段用瓊脂糖凝膠純化，用T4DNA聚合酶作成平整末端，然后將其連接到已經(jīng)用XbaI消化，用T4DNA聚合酶平整末端化并已磷酸化的pGEM-3(普洛麥格公司)中。得到在pGEM-3中所述DNA有兩個(gè)可能的方向的克隆并用DNA測(cè)序確定各連接位點(diǎn)。構(gòu)建雙順?lè)醋虞d體的優(yōu)選方向是位于接近pGEM-3內(nèi)BamHI位點(diǎn)的IRES內(nèi)的NcoI位點(diǎn)。將所述載體稱為pGEM-3-IRES。F)pGEM-3-IRES*制備在IRES序列內(nèi)含PCR寡聚物賦予之突變的第二個(gè)IRES載體(IRES*)，與野生型IRES相比，所述突變可使IRES驅(qū)動(dòng)的表達(dá)最優(yōu)。分別用下列有義和反義寡聚物，使用pCITE-1質(zhì)粒(Novagen公司)完成IRES*的PCR擴(kuò)增5’-GGT ACA AGA TCT ACT ATA GGGAGA CCG GAA TTC CGC-3’，SEQ.ID11，和5’-CCA CAT AGA TCTGTT CCA TGG TTG TGG CAA TAT TAT CAT CG-3’SEQ，ID15。反義密碼子中劃線的突變殘基從IRES 3’末端NcoI/Kozak序列中所含的優(yōu)選ATG中消除了一個(gè)上游ATG。G)pGEM-3-IRES/REV用合成寡聚物從pCV-1(目錄#303，NIH艾滋病研究和參考規(guī)劃)擴(kuò)增HIVIIIbREV。有義和反義寡聚物分別是5’-GGT ACA AGA TCTACC ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC AGC-3’，SEQ.ID16和5’-CCA CAT AGA TCT GAT ATC GCA CTA TTC TTT AGC TCC TGACTC C-3’，SEQ ID17。這些寡聚物在翻譯開(kāi)放閱讀框架的任一末端提供BglII位點(diǎn)，在rev3’末端的BglII位點(diǎn)正上游提供EcoRV位點(diǎn)。PCR后，用NcoI(位于Kozak序列內(nèi))和BglII限制酶處理REV基因然后與已用NcoI和BgHI限制酶處理的pGEM-3-IRES相連。用DNA測(cè)序確定各連接接口和完整的0.3 kb REV基因。H)V1Jns-tPA為了提供分泌的異源前導(dǎo)肽序列和/或膜蛋白質(zhì)，修飾V1J組織特異性纖溶酶原激活劑(tPA)前導(dǎo)序列。將兩個(gè)合成的互補(bǔ)寡聚物退火，然后連接到已用BglII消化的V1Jn中。有義和反義寡聚物是5’-GATCACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTGCTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3’，SEQ.ID18，和5’-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGCTCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CATTGC ATC CAT GGT-3’，SEQ.ID19。在有義寡聚物中劃線的是Kozak序列。這些寡聚物含用于連接BglII裂解之序列的懸垂堿基。連接后破壞了上游的BglII位點(diǎn)，但保留了下游的BglII位點(diǎn)以便進(jìn)行連接。用DNA測(cè)序確定這兩個(gè)連接位點(diǎn)和tPA前導(dǎo)序列。另外，為了與我們的共有優(yōu)化的載體V1Jns(＝帶SfiI位點(diǎn)的V1Jneo)一致，通過(guò)用T4DNA聚合酶將KpnI位點(diǎn)制成平整末端，然后與SfiI接頭(目錄#1138，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)連接，從而將SfiI限制位點(diǎn)放在V1Jn-tPA的BGH終止子區(qū)內(nèi)的KpnI位點(diǎn)。用限制酶消化和瓊脂糖凝膠電泳確定所述修飾。I)V1Jns-HIVIIIbREV按上述有關(guān)pGEM-3-IRES/REV的描述用PCR擴(kuò)增REV，用BglII限制酶消化，然后連接到已用BglII和牛腸堿性磷酸酶處理的V1Jns中。用DNA測(cè)序確定連接接口，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞和免疫印跡分析(大于1μg得到的REV/106細(xì)胞)確定REV表達(dá)。J)pGEM-3-RRE/IRES/REV為了制備由REV反應(yīng)元件(RRE)組成的盒，為了發(fā)生REV依賴性表達(dá)，所述元件就需在RNA轉(zhuǎn)錄本上，用下列合成寡聚物，經(jīng)PCR得到來(lái)自HIV毒株HXB2的RRE有義寡聚物5’-GGT ACA TGATCA GAT ATC GCCC GGG C CGA GAT CTT CAG ACT TGG AGGAGG AG-3’，SEQ.ID20；和反義寡聚物，5’-CCA CAT TGA TCA GCTT GTG TAA TTG TTA ATT TCT CTG TCC-3’，SEQ.ID21；。這些寡聚物在所述插入片段的任一末端提供了BclI限制位點(diǎn)，在插入片段的5’端提供了EcoRV和SrfI位點(diǎn)。將RRE制成平整末端，在位于IRES前的HincII限制位點(diǎn)連接到PGEM-3-/IRES/REV中。用限制酶圖譜和跨連接接口的DNA測(cè)序確定連接產(chǎn)物。
實(shí)施例2gp120疫苗按如下構(gòu)建表達(dá)為gp120的REV依賴性env基因從HIV的MN毒株中PCR克隆gp120，所述毒株攜帶天然前導(dǎo)肽序列(V1Jns-gp120)或用組織纖溶酶原激活劑(tPA)前導(dǎo)肽取代天然前導(dǎo)肽的融合序列(V1Jns-tPA-gp120)。已經(jīng)表明tPA-gp120表達(dá)是REV獨(dú)立性的[B.S.Chapman等，核酸研究，19，3979(1991)；應(yīng)注意到，在產(chǎn)生gp120基因REV獨(dú)立性方面，其他前導(dǎo)序列也可提供相似的功能]。利用上述載體，制備gp120構(gòu)建體就可達(dá)到該目的I.gp120疫苗構(gòu)建體A)V1Jns-tPA-HIVMNgp120用設(shè)計(jì)的寡聚物經(jīng)PCR擴(kuò)增HIVMNgp120基因(Medimmune公司)以除去所述肽前導(dǎo)序列中的前30個(gè)氨基酸，并且有利于克隆到V1Jns-tPA中，以產(chǎn)生由tPA前導(dǎo)肽，在30個(gè)氨基酸殘基后接剩余gp120序列的嵌合蛋白質(zhì)。所述設(shè)計(jì)使得可以進(jìn)行REV獨(dú)立性的gp120表達(dá)并從含所述質(zhì)粒的細(xì)胞中分泌可溶的gp120。所用的有義和反義PCR寡聚物是5’-CCC CGG ATC CTGATC ACA GAA AAA TTG TGGGTC ACA GTC-3’，SEQ.ID22，和5’-CCCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CACTCT TCT C-3’SEQ.ID23。劃線的是翻譯終止密碼子。這些寡聚物在翻譯開(kāi)放閱讀框架的任一末端含BamHI限制酶位點(diǎn)，所述開(kāi)放閱讀框架在有義寡聚物的BamHI的3’端含一個(gè)BclI位點(diǎn)。用BclI接著用BamHI相繼消化PCR產(chǎn)物，然后連接到已用BglII消化，接著用牛腸堿性磷酸酶處理的V1Jns-tPA中。將所得的載體測(cè)序以確定在tPA前導(dǎo)序列和gp120編碼序列之間的框內(nèi)融合，用轉(zhuǎn)染的RB細(xì)胞的免疫印跡分析確定gp120表達(dá)和分泌。因此，將編碼tPA-HIVMNgp120的載體包含在表達(dá)gag，B7或其他抗原的雙或三順?lè)醋訕?gòu)建體中是有用的。
B)V1-tPA-HIVMNgp120用我們較早的基本疫苗表達(dá)載體的版本，V1(見(jiàn)核酸藥物專(zhuān)利)制備與上述嵌合-tPA-HIVMNgp120載體有輕微不同的載體，所述V1含有與V1Jns-tPA不同的tPA前導(dǎo)肽序列。
在前述任一PNV構(gòu)建體中，在翻譯終止密碼子之后，免疫調(diào)節(jié)基因，如B7的下游克隆有一IRES序列，這樣提供根據(jù)本發(fā)明方法有用的雙或三順?lè)醋佣嗪塑账?。這些PNV有效地表達(dá)兩個(gè)基因產(chǎn)物。
C)V1Jns-tPA-HIVIIIBgp120該載體除使用HIVIIIB的gp120序列外，其余均類(lèi)似于I.A.。所使用的有義和反義PCR寡聚物分別是5’-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3’，SEQ.ID24，和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTCTCT CTG CAC CAC TCT TC-3’，SEQ.ID25。這些寡聚物在插入片段的任一末端提供了BclI位點(diǎn)，在3’末端BclI位點(diǎn)上游提供EcoRV。5’末端的BclI位點(diǎn)使得可以連接到V1Jns-tPA的BglII位點(diǎn)以得到編碼tPA前導(dǎo)序列和不帶其天然前導(dǎo)序列的gp120的嵌合tPA-gp120基因。用限制消化和DNA測(cè)序確定連接產(chǎn)物。II.體外gp120疫苗表達(dá)在轉(zhuǎn)染的人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞中檢測(cè)這些構(gòu)建體的體外表達(dá)。從RD細(xì)胞中分泌的tPA-gp120的量表明V1Jns-tPA-gp120載體生產(chǎn)分泌的gp120。。III.體內(nèi)gp120接種見(jiàn)圖12(小鼠數(shù)據(jù))由分泌的gp120引發(fā)的抗-gp120ELISA滴定度種 GMT(范圍)小鼠 5310(1.8×103-1.5×104)(2輪后，200μg/輪)兔 143(75-212)(3輪后，2mg/輪)非洲綠猴 171(＜10-420)(2輪后，2mg/輪)*用V1Jns-tPA-gp120IIIB作為接種載體，肌肉內(nèi)注射。V1Jns-tPA-gp120MNPNV誘導(dǎo)的II型MHC限制的T淋巴細(xì)胞gp120特異性抗原反應(yīng)性。殺死用200μg V1Jns-tPA-gp120MN接種了兩次的Balb/c小鼠，取出其脾臟，體外確定輔助T淋巴細(xì)胞與重組gp120的反應(yīng)性。用PBMC(外周血單核細(xì)胞)，使用5μg/ml 4×105細(xì)胞/ml的重組gp120IIIB(Repligen，目錄號(hào)#RP1016-20)完成T細(xì)胞增殖試驗(yàn)。只在培養(yǎng)基中通過(guò)培養(yǎng)所述細(xì)胞來(lái)得到由這些細(xì)胞所攝取的3H-胸苷的基本水平，而用2μg/ml ConA刺激來(lái)誘導(dǎo)最大增殖。ConA-誘導(dǎo)的反應(yīng)性峰在～3天，在那時(shí)將其與對(duì)照培養(yǎng)基樣品一起收集，而在5天收集抗原處理的樣品和另一對(duì)照培養(yǎng)基。將接種的小鼠反應(yīng)與天然的，年齡匹配的同種小鼠相比較。正如預(yù)期的，對(duì)于天然和免疫的小鼠，ConA陽(yáng)性對(duì)照均有很高的增殖。在接種的小鼠中，用gp120處理得到很強(qiáng)的輔助T細(xì)胞記憶反應(yīng)，而天然小鼠不反應(yīng)(特異反應(yīng)性閾值是一個(gè)＞3-4的刺激指數(shù)(SI)；SI是樣品cpm/培養(yǎng)基cpm的比值)。與這些小鼠分別為5643和11900的抗-gp120ELISA滴定度相比，接種小鼠的SI分別是65和14。令人驚奇地是，對(duì)這兩只小鼠而言，抗體較高的應(yīng)答者的T細(xì)胞反應(yīng)性明顯低于具有較低抗體滴定度的小鼠。該試樣表明分泌的gp120在體內(nèi)有效地激活了輔助T細(xì)胞，并產(chǎn)生了強(qiáng)抗體反應(yīng)。另外，這些免疫反應(yīng)中的每一個(gè)均可用與由接種PNV編碼抗原異源的抗原來(lái)確定(IIIB對(duì)MN)有V1Jns-tPA-gp120MN接種后脾臟T細(xì)胞對(duì)rgp120的增殖反應(yīng)Avg.CPM刺激指數(shù)小鼠 #(agp120滴度)3培養(yǎng)基1ConA1培養(yǎng)基2rgp1202#1(天然的＜10) 339(1) 185，358(546) 187(1) 574(3)#2(天然的＜10) 237(1) 229，775(969) 283(1) 511(1.8)#3(免疫；5643) 317(1) 221，003(697) 354(1)23，109(65)#4(免疫；11，900)229(1) 243，427(1063)235(1)3384(14)1在用3H-胸苷24小時(shí)后的第4天收集細(xì)胞。使用2μg/ml濃度的ConA。
2在用3H-胸苷24小時(shí)后的第5天收集細(xì)胞。使用5μg/ml濃度的重組gp120IIIB。
3.使用2輪200μgDNA/小鼠(Balb/c)后，抗-gp120IIIB互為終點(diǎn)的ELISA滴定度和完成的增殖試驗(yàn)。
前述的數(shù)據(jù)清楚地表明用多核苷酸疫苗抗原體內(nèi)有效地表達(dá)了相關(guān)HIV抗原，并引發(fā)了對(duì)所表達(dá)基因產(chǎn)物的特異性免疫反應(yīng)。通過(guò)在gp120翻譯終止密碼子下游包含一個(gè)編碼REV，B7，gag或其他與HIV無(wú)關(guān)的抗原(如流感病毒核蛋白或血細(xì)胞凝集素編碼基因)的第二或第三順?lè)醋樱苋菀仔揎椝鰳?gòu)建體以形成雙順?lè)醋覲NV。
實(shí)施例3gp160疫苗除分泌的gp120構(gòu)建體外，我們還制備了全長(zhǎng)膜結(jié)合的gp160的表達(dá)構(gòu)建體。除gp120的外，gp160構(gòu)建體的基本原理是(1)對(duì)于CTL刺激和生產(chǎn)包括gp41的中和抗體可得到更多的表位，直接抗它的是潛在HIV中和單克隆抗體(2F5，見(jiàn)上文)；(2)相對(duì)于病毒產(chǎn)生的gp160，可以得到更接近于天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；和(3)用于免疫原性的膜結(jié)合流感病毒HA構(gòu)建體的成功[Ulmer等，科學(xué)，2591745-1749，1993；Montgomery，D.等，DNA和細(xì)胞生物學(xué)，12777-783，1993]。
gp160保留了基本的REV依賴性，甚至還帶有異源前導(dǎo)肽序列。因此，開(kāi)發(fā)了兩種不同與用于gp120表達(dá)的策略，以制備gp160表達(dá)載體(1)將一基因組HIV DNA片段亞克隆到V1Jns中，報(bào)告認(rèn)為所述片段對(duì)于含tat，REV和整個(gè)gp160的異源gp160表達(dá)(V1Jns-tat/REV/env)是有效的，[Wang等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，904156-4160(1993年5月)；在那項(xiàng)研究中的所有數(shù)據(jù)是在核酸注射前24小時(shí)，使用丁哌卡因注射而得到的。由于已知丁哌卡因引起肌肉損壞，顯然，這是一種不能用于免疫人的方法]，和(2)將最小gp160ORF經(jīng)PCR克隆到EMCV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)前的雙順?lè)醋虞d體中以有效地在gp160翻譯后再引發(fā)編碼REV之第二順?lè)醋拥姆g。所述構(gòu)建體可以確保同時(shí)有效地生產(chǎn)gp160和REV蛋白質(zhì)(V1Jns-gp160/IRES/rev)。除單順?lè)醋虞d體V1Jns-gp160和V1Jns-REV外，還逐個(gè)制備出了這些載體。由于在文獻(xiàn)和我們自己的試驗(yàn)中，有跡象表明在異源表達(dá)系統(tǒng)中，env mRNA需要有穩(wěn)定作用的tat/REV剪接供體(SD)位點(diǎn)，因此，通過(guò)將所述SD插入到env ORF的上游，還制備了V1Jns-gp160和V1Jns-gp160/IRES/REV。按如下制備這些疫苗構(gòu)建體。I.gp160疫苗構(gòu)建體將tat/rev剪接供體(SD)在V1Jns內(nèi)的PstI位點(diǎn)(這是這兩種載體內(nèi)唯一的PstI位點(diǎn))插入到gp160的緊鄰的上游，從而制備兩種gp160表達(dá)載體，V1Jns-gp160和V1Jns-gp160/IRES/REV(見(jiàn)下文A和B)。設(shè)計(jì)編碼SD的合成互補(bǔ)寡聚物以連接到PstI位點(diǎn)，連接后，保留在插入片段5’末端的原位點(diǎn)，但是破壞3’末端的位點(diǎn)。所用的寡聚物序列是5’-GTC ACC GTC CTC TAT CAA AGC AGT AAG TAGTAC ATG CA-3’，SEQ.ID26和5’-TGT CAT ACT TAC TGC TTT GATAGA GGA CGG TGA CTG CA-3’，SEQ.ID27。通過(guò)限制酶消化圖譜和跨整個(gè)SD/PstI區(qū)的DNA測(cè)序來(lái)確定所得的質(zhì)粒。A).V1Jns-HIVIIIbgp160用PCR從，pF412質(zhì)粒擴(kuò)增HIVIIIbgp160，所述pF412含得自HIVIIIb克隆HXB2之基因組HIVIIIb的一半3’末端。PCR有義和反義寡聚物分別是5’-GGT ACA TGA TCA ACC ATGAGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-3’，SEQ.ID28，和5’-CCA CATTGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3’，SWQ.ID29。劃線部分是Kozak序列和翻譯終止密碼子。這些寡聚物在env基因的兩個(gè)末端的翻譯開(kāi)放閱讀框架外均提供了BclI限制酶位點(diǎn)。(BclI-消化位點(diǎn)可與BglII消化位點(diǎn)的連接相容，消化后，對(duì)這兩種酶均喪失了敏感性。選擇BclI用于PCR克隆gp160，是由于該基因含有內(nèi)BglII和BamHI位點(diǎn))。如上所述，這些寡聚物還在BclI位點(diǎn)前緊接著插入一EcoRV位點(diǎn)以用于PCR衍生的其他基因。將擴(kuò)增的gp160基因經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，用BclI消化，然后連接到已經(jīng)用BglII消化和牛腸堿性磷酸酶處理的V1Jns中。所克隆的基因?yàn)榧s2.6 kb，用DNA測(cè)序確定gp160與V1Jns的連接。B).V1Jns-HIVIIIbgp160/IRES/REV用HinDII和SmaI限制酶(在pGEM-3多接頭區(qū)中所含的)消化pGEM-3-IRES/REV，以取出整個(gè)IRES/REV序列(～0.9 kb)，然后與已用EcoRV消化并用磷酸酶處理的V1Jns-HIVIIIbgp160相連。該過(guò)程產(chǎn)生了一個(gè)8.3 kb的雙順?lè)醋覸1Jns，所述V1Jns含gp160，接著是IRES和指導(dǎo)這兩種HIV基因產(chǎn)物表達(dá)的REV。用DNA測(cè)序證明所有的連接區(qū)。C).V1Jns-tPA-HIVIIIbgp160該載體與上述實(shí)施例2(C)中的相似，區(qū)別是用PCR得到了不含天然前導(dǎo)序列的全長(zhǎng)gp160。有義寡聚物與在I.C.中所用的相同，而反義寡聚物是5’-CCA CAT TGA TCA GATATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3；，SEQ ID30。這些寡聚物在插入片段的任一末端提供了BclI位點(diǎn)，在3’末端Bcli位點(diǎn)的緊上游提供了一個(gè)EcoRV。5’末端的BclI位點(diǎn)使得可以連接到V1Jns-tPA的BglII位點(diǎn)以得到一嵌合tPA-gp160基因，所述嵌合基因編碼tPA前導(dǎo)序列和不含其天然前導(dǎo)序列的gp160。用限制酶消化和DNA測(cè)序確定連接產(chǎn)物。D).V1Jns-tat/rev/envIIIB該表達(dá)載體是在D.Rekosh等人[美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，85，334(1988)]描述一種載體后組合成的，使用了包含整個(gè)未剪接tat，rev和env的HIV-1IIIB克隆(HXB2)的“基因組”片段。用BgIII消化V1Jns，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平，然后用牛腸堿性磷酸酶處理。用限制酶消化得到在pF412中所含的IIIB基因組的SalI/XhoI片段，然后用T4DNA聚合酶補(bǔ)平。用限制酶消化和DNA測(cè)序確定連接產(chǎn)物。E).V1Jns-rev/envIIIB該載體是上述D節(jié)中所描述的載體的一種變種，區(qū)別是缺失了在外顯子I中的整個(gè)tat編碼區(qū)直到REV開(kāi)放閱讀框架的開(kāi)始。用PstI和KpnI限制酶消化V1Jns-gp160IIIB(見(jiàn)上述A節(jié))以除去gp160基因的5’區(qū)。用PCR擴(kuò)增從HXB2基因組克隆中得到編碼第一REV外顯子到gp160的KpnI位點(diǎn)的DNA片段。有義和反義PCR寡聚物分別是5’-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATGGCA GGA AGA AGC GGA GAC-3’，SEQ.ID31和5’-CCA CAT CAGGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC-3’，SEQ，ID32。這些寡聚物在所述DNA片段的5’和3’末端提供了PstI和KpnI限制酶位點(diǎn)。用PstI和KpnI消化所得的DNA，從瓊脂糖電泳凝膠中純化，然后與V1Jns-gp160(PstI/KpnI)連接。用限制酶消化確定所得的質(zhì)粒。II.gp160疫苗的體外表達(dá)用gp160和REV表達(dá)構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RD和293細(xì)胞。圖5中用抗gp41單克隆抗體的Western印跡分析(Chessie 8，NIH艾滋病研究和參考規(guī)劃#526)表明，V1Jns-gp160(SD)表達(dá)gp160需要加入V1Jns-REV(在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中該載體產(chǎn)生＞1μgREV/106個(gè)細(xì)胞)。V1Jns-gp160/IRES/REV有效表達(dá)gp160，而不需反式加入REV，這確定了所述雙順?lè)醋拥墓δ?。用抗gp120單克隆抗體(1C1，Repligen，#RP1010-10)進(jìn)行的免疫印跡觀察發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。對(duì)每個(gè)載體都觀察到gp160到gp120和gp41的蛋白水解加工。將REV反式加入到雙順?lè)醋觛p160/REV載體中并不會(huì)導(dǎo)致成熟更多的gp160表達(dá)，這表明在該載體中REV表達(dá)并不限制gp160表達(dá)。如果在雙順?lè)醋觛p160/REV構(gòu)建體中包含tat/REVSD，則gp160的表達(dá)會(huì)提高，這表明了該位點(diǎn)對(duì)于最佳REV-依賴性gp160表達(dá)是重要的。我們還驚奇地發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，雙順?lè)醋觛p160/REV比基因組tat/REV/env構(gòu)建體表達(dá)的gp160多10倍，這再次表明該載體對(duì)于gp160表達(dá)是高效的。
這些載體提供了用于gp160質(zhì)粒接種的核酸構(gòu)建體，所述gp160質(zhì)粒含有g(shù)p160和REV基因，這兩個(gè)基因或在不同的質(zhì)粒上或在相同的質(zhì)粒上。在tpa-gp160構(gòu)建體的情況下，不需要順式或反式提供REV以有效表達(dá)gp160，因此，可以讓其他基因插入到雙順?lè)醋訕?gòu)建體中。
對(duì)于REV依賴性構(gòu)建體，重要的是檢測(cè)接種后有效gp160表達(dá)是否需要使REV存在于相同質(zhì)粒上，原因是在肌肉內(nèi)注射后，肌肉細(xì)胞只攝取了少量的DNA，而個(gè)體肌肉細(xì)胞(每個(gè)有數(shù)百個(gè)核)在細(xì)胞內(nèi)的接近位置不可能接受不同質(zhì)粒的拷貝。III.用gp160疫苗體內(nèi)接種用編碼gp160的PNV比較三種不同載體策略在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中誘導(dǎo)抗-gp120抗體反應(yīng)的能力接種使用(1)用V1Jns-gp160IIIB/IRES/REV(SD)的雙順?lè)醋觛p160/REV；(2)基因組gp160構(gòu)建體V1Jns/tat/rev/envIIIB；和(3)單順?lè)醋虞d體，V1Jns-gp160IIIB(SD)和V1Jns-REV的混合物。用2mg/動(dòng)物的接種劑量以一個(gè)月的間隔接種三次，同時(shí)抽血。列出了用每種載體接種猴子后，用重組gp120IIIB得到的抗-gp120ELISA滴定度。在恒河猴和非洲綠猴中雙順?lè)醋觛p160/REV均引發(fā)了抗體反應(yīng)，而在接種兩次后(即一個(gè)月后進(jìn)行第二接種)，基因組gp160和混合的單順?lè)醋虞d體沒(méi)有引發(fā)可檢測(cè)的抗體。通過(guò)使用重組gp41(ABT)作為固定底物的BIAcore測(cè)定法來(lái)進(jìn)行測(cè)量，接受了雙順?lè)醋觛p160/REV的所有四種猴還產(chǎn)生了特異性的抗-gp41反應(yīng)性(數(shù)據(jù)為列出)。從這些猴中得到的血清還表明抗V3IIIB ELISA反應(yīng)性的滴定度為～50-100。這些結(jié)果證明，用多順?lè)醋覲NV誘導(dǎo)的體內(nèi)表達(dá)與用體外轉(zhuǎn)染方法得到的結(jié)果不同，在所述體外轉(zhuǎn)染方法中是用共三種載體策略表明gp160表達(dá)。特別注意到，與雙順?lè)醋觛p160/REV相比，體外轉(zhuǎn)染導(dǎo)致與混合單順?lè)醋觛p160和REV載體等量的表達(dá)(見(jiàn)圖5)。這些試驗(yàn)證明，我們的雙順?lè)醋覲NV在體內(nèi)接種后產(chǎn)生了有效的協(xié)調(diào)表達(dá)，而用多順?lè)醋咏臃N的其他方法則做不到這點(diǎn)。見(jiàn)圖9，表明了兩只非洲綠猴和兩只恒河猴和一只兔的免疫反應(yīng)。
在2mgDNA/輪接種的非人靈長(zhǎng)類(lèi)中，由gp160PNV引發(fā)的抗-gp120ELISA滴定度滴度載體/種 第二輪后第三輪后V1Jns-tat/rev/envIIIB非洲綠猴(#1)＜20 ND1(#2)＜20 ND(#3)＜20 NDV1Jns-gp160IIIB+V1Jns-rev2非洲綠猴(#1)＜20 ND(#2)＜20 ND(#3)＜20 NDV1Jns-gp160IIB/IRES/rev非洲綠猴(#1) 85 90(#2) 75 60恒河猴 (#1) 165175(#2) 2902601ND＝未確定2該P(yáng)NV表示兩種單順?lè)醋虞d體的等摩爾混合物在2mgDNA/輪接種的非人靈長(zhǎng)類(lèi)中，由gp160/rev雙順?lè)醋右l(fā)的抗-V3IIIBELISA滴定度種 動(dòng)物#滴定度(第三輪接種后)非洲綠猴 (#1)70(#2)45恒河猴 (#1)55(#2) 100用V1Jns-gp160IIIB/IRES/rev作為接種載體實(shí)施例4SIV疫苗從SIVMBC251病毒分離物的基因組克隆中經(jīng)PCR克隆構(gòu)建SIVenv構(gòu)建體，V1Jn-SIV gp152，通過(guò)DNA測(cè)序確定與載體的兩個(gè)連接。所述毒株與在新英格蘭地區(qū)靈長(zhǎng)動(dòng)物中心(NRPC)用于對(duì)恒河猴的感染性SIV攻擊的病毒同源。制備相似的構(gòu)建體，其中編碼前導(dǎo)肽區(qū)的DNA使用其他密碼子，但仍保留天然氨基酸序列。這樣降低了所述構(gòu)建體的REV依賴性，并得到更穩(wěn)定的mRNA轉(zhuǎn)錄本。按如下制備這些疫苗構(gòu)建體。I.SIV疫苗構(gòu)建體A).V1J-SIV MAC251P28GAG選擇被稱為p28gag的SIVgag的中心肽用于檢測(cè)在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中產(chǎn)生CTL的多核苷酸疫苗。gag的該區(qū)編碼macaque猴的已知CTL表位，其MHC I型單元型為Mamu-A01。因此，在用適當(dāng)?shù)膅ag質(zhì)粒接種后，攜帶該單元型的猴應(yīng)當(dāng)對(duì)該gag表位有CTL反應(yīng)性。盡管SIV和HIVgag基因均含有REV依賴性調(diào)節(jié)序列，但p28 gag表達(dá)對(duì)REV的依賴性似乎較小，以致在沒(méi)有REV的情況下，至少可得到一些表達(dá)。
用常規(guī)合成寡脫氧核糖核苷酸從質(zhì)粒p239SpSp5’(從NIH艾滋病研究和參考規(guī)劃，目錄#829得到的)經(jīng)PCR擴(kuò)增后，用BglII限制酶位點(diǎn)將SIVp28gag克隆到表達(dá)載體V1中。該質(zhì)粒編碼SIVMAC239基因組的5’那一半。SIVMAC239是SIVMAC251體外傳代的結(jié)果，SIVMAC251與親本病毒相比有一些突變。在這些病毒p28gag的氨基酸序列是相同的。PCR有義和反義寡聚物是5’-GGT ACA GAG TCTACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGT GGT AAC-3’，SEQ.ID33，和5’-CCA CAT AGA TCT TTA CAT TAA TCT AGCCTT CTG TCC C-3’，SEQ ID34。這些寡核苷酸在翻譯開(kāi)放框架外提供了BglII限制酶，共有Kozak翻譯起始密碼子(劃線的)和翻譯終止密碼子(劃線的)。瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)生的p28gag，用BglII消化，然后連接到BglII處理的，磷酸酶處理的V1中。隨后用BglII限制酶位點(diǎn)，將該基因亞克隆到我們的優(yōu)化表達(dá)載體，V1J中，稱為V1J-SIVp28gag。克隆的基因約0.7kb長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)各構(gòu)建體的DNA序列分析，確定V1JCMV啟動(dòng)子和p28gag5’末端的連接位點(diǎn)。用SIV感染的macaque猴的血漿，進(jìn)行Western印跡分析，來(lái)比較V1J和V1構(gòu)建體的SIVp28蛋白質(zhì)的體外表達(dá)以檢測(cè)gap蛋白質(zhì)。V1J-SIVp28gag構(gòu)建體始終產(chǎn)生最多適當(dāng)分子量的產(chǎn)物。用更優(yōu)化的V1Jneo，V1Jns和V1R載體得到了相似的結(jié)果，甚至改善的結(jié)果。
B).V1J-SIVMAC251 nef從編碼整個(gè)SIVMAC251基因組(Dr.Vanessa Hirsch，NIAID.NIH.Rockville，MD；現(xiàn)在目錄為#133，NIH艾滋病研究和參考規(guī)劃)的質(zhì)粒pBK28，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，克隆SIV nef。PCR有義和反義寡聚物是5’-GGT CAC ACC AGT GGT GGAGCT ATT TCC ATG AGG-3’，SEQID35和5’-CCT AGG TTA GCC TTCTTC TAA CCT CTT CC-3’SEQ ID36。劃線的是Koza位點(diǎn)和翻譯終止密碼子。將擴(kuò)增的nef基因經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，用T4DNA聚合酶作成平整末端，用T4 DNA激酶使5’末端磷酸化，然后克隆到已用牛腸堿性磷酸酶磷酸酶化的V1J的純端BglII限制酶位點(diǎn)?？寺〉幕蚣s0.76 kb。用DNA測(cè)序確定V1JCMV啟動(dòng)子和nef的5’末端的連接位點(diǎn)。用Western印跡分析和HIV nef抗血清(目錄號(hào)#331，NIH艾滋病研究和參考規(guī)劃)顯示體外表達(dá)。
C).V1Jn-SIVMAC251gp152從質(zhì)粒pBK28 PCR擴(kuò)增后，將稱為gp152的SIVenv克隆到V1Jneo中(見(jiàn)核酸藥物專(zhuān)利)。PCR有義和反義寡聚物是5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GGA TGT CTT GGGAAT CAG C-3’，SEQ ID37和5’-CCA CAT AGA TCT GAT ATC GTATGA GTC TAC TGG AAA TAA GAG G-3’，SEQ ID38。劃線的是Kozak位點(diǎn)和琥珀翻譯終止密碼子。PCR產(chǎn)物在兩個(gè)末端的翻譯開(kāi)放閱讀框架外均有BglII限制酶位點(diǎn)，在3’-末端的BglII前，琥珀終止密碼子后還有一個(gè)EcoRV位點(diǎn)。這對(duì)于隨后的克隆步驟提供了方便的限制酶位點(diǎn)。將擴(kuò)增的gp152基因經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，BglII消化，然后與已用BglII消化并用磷酸酶處理的V1Jn相連?？寺〉幕虻臑?.2Kb用DNA測(cè)序確定gp152的各末端與V1JnCMV啟動(dòng)子和BGH終止子區(qū)的連接。II 帶SIV疫苗的體內(nèi)疫苗已經(jīng)用兩個(gè)SIV基因構(gòu)建體接種恒河猴，并且在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中已經(jīng)產(chǎn)生了特異性的CTL反應(yīng)(見(jiàn)圖4)。
將V1J-SIVp28 gag和V1J-SIVnef以3 mg/接種的量肌肉內(nèi)注射到Macaca mulatta猴中，相隔一個(gè)月注射3次，所述V1J-SIV p28gag表達(dá)相當(dāng)REV獨(dú)立性的gag中心肽。帶Mamu-A01 MHCI單元型的恒河猴的gag特異性CTL反應(yīng)主要受p28 gag內(nèi)單肽表位的限制。接受V1J-SIVp28 gag的Mamu-A01+猴在第二次注射后一個(gè)月的開(kāi)始有g(shù)ag特異性的CTL活性，而接受該DNA的Mamu-A01-猴和接受V1J對(duì)照DNA的猴沒(méi)有CTL反應(yīng)。在體外，分別在第二和第三輪接種后，檢測(cè)到gag肽再刺激的CTL和初級(jí)CTL。這些CTL活性水平可以與用痘苗-gag接種而產(chǎn)生的水平相比。隨后，在產(chǎn)生反應(yīng)的動(dòng)物中的CTL水平降低。V1J-SIV nef-接種的動(dòng)物沒(méi)有特異性CTL反應(yīng)，盡管更精確的檢測(cè)，如在gag CTL檢測(cè)中所用的(即未給恒河猴定義顯著的MHCI單元型/nef肽關(guān)系，以致用未知效力的肽進(jìn)行刺激，并沒(méi)有陽(yáng)性對(duì)照)可以提供不同的結(jié)果。
實(shí)施例5其他疫苗構(gòu)建體A.V1Jns-HIVIIIBgag/pol-RRE/IRES/REV通過(guò)PCR擴(kuò)增帶數(shù)個(gè)改變的HIVIIIBgag-pol序列來(lái)制備編碼帶有或不帶有pol蛋白酶區(qū)的gag的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體。包含pol的蛋白酶(prt)片段可以將gag蛋白水解加工成含成熟衣殼顆粒的不同肽(如p17，p24，p15等)，而刪去該酶會(huì)導(dǎo)致以不成熟的衣殼顆粒形式合成p55。不能包含更多的pol序列以避免可能與pol反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶活性相關(guān)的潛在安全問(wèn)題。不論是否加工成成熟形式，對(duì)于從細(xì)胞中排出的gag衣殼顆粒，在開(kāi)始Met兩個(gè)位置后，Gly氨基酸的豆蔻?；潜仨毜?。該Gly殘基的誘變消除了豆蔻酰化，而且不會(huì)再?gòu)募?xì)胞中排出gag顆粒。gag的這些修飾使得我們可以確定在用所述gag載體接種后，抗gag CTL的產(chǎn)生是否受蛋白水解加工和/或從細(xì)胞中衣殼排出的影響。下文所列的有些載體含有位于gag開(kāi)放閱讀框架上游的剪接供體(SD)位點(diǎn)。這些載體使得我們可以確定所述SD對(duì)于優(yōu)化gag的rev-依賴性表達(dá)與含tat/revSD可使gp160表達(dá)最佳一樣，是否是必需的。
1).V1Jns-HIVIIIBgag-prt/RRE/IRES/REV分別用下列有義和反義寡聚物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到gag-prt編碼DNA片段5’-GGT ACA GGATCC ACC ATG GGT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3’，SEQ ID39和5’-CCA CAG GGA TCC GC CCG GGC TTA CAT CTCTGT ACA AAT TTC TAC TAA TGA-3’，SEQ ID40。這些寡聚物在所述片段的任一末端提供了BamHI限制酶位點(diǎn)，包含NcoI位點(diǎn)的Kozak翻譯起始序列，和在3’末端BamHI上游的SrfI位點(diǎn)。用SrfI位點(diǎn)將來(lái)自經(jīng)用ECORV限制性酶切割的pGEM-3-RRE/IRES/REV的RRE/IRES/REV盒克隆到gag-prt的緊下游。經(jīng)DNA測(cè)序確定所有的連接接口，然后再用限制酶圖譜確定所述構(gòu)建體。
2).V1Jns-HIVIIIBgag-prt/RRE/IRES/REV(SD)按上述載體1制備所述載體，不同之處僅在于使用的PCR有義寡聚物是5’-GGTACA GGA TCC CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG-3’，SEQ ID41。這樣可以包含在gag序列開(kāi)始的上游SD位點(diǎn)。用限制酶圖譜和連接接口的DNA測(cè)序確定所述該構(gòu)建體。
3).V1Jns-HIVIIIBgag-prt/RRE/IRES/REV(w/o豆蔻?；?按上述載體1制備所述載體，不同之處僅在于使用的PCR有義寡聚物是5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GCT GCG AGA GCG TCA GTATTA AGC-3’，SEQ ID42。
4).V1Jns-HIVIIIBgag/RRE/IRES/REV按上述載體1制備所述載體，不同之處僅在于使用的PCR反義寡聚物是5’-CCA CAT GGA TCCGCC CGG GCC TTT ATT GTA ACG AGG GGT CGT TGC-3’，SEQID43。
5).V1Jns-HIVIIIBgag/RRE/IRES/REV(SD)按上述載體4制備所述載體，不同之處僅在于所用的PCR有義寡聚物是5’-GGT ACAGGA TCC CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG-3’，SEQ ID44。
6).V1Jns-HIVIIIBgag/RRE/IRES/REV(w/o豆蔻?；?按上述載體5制備所述載體，除所用的PCR有義寡聚物是5’-GGT ACA GGA TCCACC ATG GCT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3’，SEQ ID45。
B.V1Jns-HIV nef所述載體使用一個(gè)nef基因，所述基因來(lái)自用與于SIV nef類(lèi)似的有義和反義PCR寡聚物感染的群體中的代表性毒株。
C.pGEM-3-X-IRES-B7(其中X＝任何抗原基因)作為雙順?lè)醋右呙鐦?gòu)建體的實(shí)例，所述構(gòu)建體可協(xié)調(diào)表達(dá)編碼免疫原的基因和編碼免疫刺激蛋白質(zhì)的基因，從B淋巴瘤細(xì)胞系CH1(從ATCC得到的)PCR擴(kuò)增鼠B7基因。B7是一蛋白質(zhì)家族的成員，所述蛋白質(zhì)通過(guò)在主要組織相容性復(fù)合物I和II中的抗原，提供T細(xì)胞激活所必需的共刺激。CH1細(xì)胞是B7 mRNA的良好來(lái)源，原因是它們有組成型激活的表型，而B(niǎo)7主要由激活的抗原遞呈細(xì)胞，如B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)。再用cAMP或IL-4和用標(biāo)準(zhǔn)硫氰酸胍方法制備的mRNA體外刺激這些細(xì)胞。使用用GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin-Elmer cetus)和寡聚物引物(5’-GTA CCT CAT GAG CCA CAT AAT ACC ATG-3’，SEQ ID46)的mRNA完成cDNA合成，所述寡聚物是位于B7翻譯開(kāi)放閱讀框架下游的B7特異性的。分別用下列有義和反義PCR寡聚物，經(jīng)PCR擴(kuò)增B75’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCT TGCAAT TGT CAG TTG ATG C-3’，SEQ ID47，和5’-CCA CAT AGA TCTCCA TGG GAA CTA AAT GAA GAC GGT CTG TTC-3’，SEQ ID48。這些寡聚物在所述插入片段的末端提供了BglII限制酶位點(diǎn)，和含NcoI限制位點(diǎn)的Kozak翻譯起始序列，以及正好位于3’-末端的BglII位點(diǎn)前的另一NcoI限制性位點(diǎn)。NcoI消化產(chǎn)生了適于克隆到已被NcoI有化的PGEM-3-IRES中的片段。所得載體，pGEM-3-IRES-B7含很容易轉(zhuǎn)移到V1Jns-X(其中X代表抗原編碼基因)中的IRES-B7盒。
D.pGEM-3-X-IRES-GM-CSF(其中X＝任何抗原基因)該載體含有類(lèi)似于在上述C部分中描述的那些的盒，除使用免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，GM-CSF而不是B7外。GM-CSF是巨噬細(xì)胞分化和刺激細(xì)胞因子，已經(jīng)表明它可在體內(nèi)引發(fā)潛在的抗腫瘤T細(xì)胞活性[G.Dranoff等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，90，3539，91993)]。
E.pGEM-3-X-IRES-IL-12(其中X＝任何抗原基因)該載體含有類(lèi)似于在上述C部分中描述的那些的盒，除使用免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，IL-12而不是B7外。已經(jīng)表明IL-12對(duì)于改變對(duì)細(xì)胞，T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)的途徑的免疫反應(yīng)有影響，所述的免疫反應(yīng)與體液應(yīng)答相反[L.Alfonso等，科學(xué)，263，235，1994]。
F.V1Jns-HIVxgp160/IRESrevIIIB(SD)該載體類(lèi)似于在上述I.B.中描述的載體，除使用得自各種臨床毒株的gp160基因，而不是得自實(shí)驗(yàn)室毒株IIIB的gp160外。
G.V1Jns-PR8/34/HA-IRES-SIVp28 gag就經(jīng)IRES元件的協(xié)調(diào)表達(dá)而言，該構(gòu)建體提供了與SIVp28gag基因一致的流感病毒血細(xì)胞凝集作用基因(HA)。分別用下列有義和反義寡聚物，經(jīng)PCR擴(kuò)增PR8/34/HA基因5’-GGT ACA AGA TCTACC ATG AAG GCA AAC CTA CTG TGC CTG-3’，SEQ.ID49，和5’-CCA CAT AGA TCT GAT ATC CTA ATC TCA GAT GCA TAT TCTGCA CTG C-3’，SEQ.ID50。所得的DNA片段在任一末端含有BglII限制酶位點(diǎn)，在3’-末端有EcoRV位點(diǎn)。BglII消化后，將該基因克隆到先用BglII消化，然后用堿性磷酸酶處理過(guò)的V1Jns中。通過(guò)NcoI和BglII消化，從V1J-SIVp28gag中切出SIVp28gag。用NcoI和BamHI消化pGEM-IRES，然后直接與p28gag/NcoI/BglII連接。通過(guò)用SmaI和HindII限制消化取出IRES-p28gag盒，然后連接到V1Jns-A/PR8/34/HA的EcoRV位點(diǎn)。通過(guò)PNV接種(HA)，這些基因的體內(nèi)協(xié)調(diào)表達(dá)可以產(chǎn)生潛在的抗體反應(yīng)，同時(shí)必需T細(xì)胞輔助，在局部環(huán)境中提供所述的輔助以促進(jìn)第二基因產(chǎn)物(SIVp28gag)的CTL反應(yīng)。該構(gòu)建體還表明了利用本發(fā)明PNV和方法以產(chǎn)生抗多抗原的免疫反應(yīng)的能力，不論所述抗原是否與HIV有關(guān)。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)該理解，所述類(lèi)型的構(gòu)建體可以與其他，雙或三順?lè)醋訕?gòu)建體混合以生產(chǎn)多價(jià)組合的多核苷酸疫苗。
H.V1Jns-tPA-gp160IIIB/IRES/SIVp28gag用EcoRV消化V1Jns-tPA-gp160IIIB，然后用牛腸堿性磷酸酶處理，再與通過(guò)限制酶SmaI和HindII消化已經(jīng)從pGEM-3-IRES-SIVp28中取出的IRES-SIVp28gag相連。這些基因的體內(nèi)協(xié)調(diào)表達(dá)可以將產(chǎn)生強(qiáng)輔助T細(xì)胞反應(yīng)的蛋白質(zhì)(gp160)與提供I型MHC-相關(guān)的CTL表位(SIVp28gag)的蛋白質(zhì)偶聯(lián)。設(shè)計(jì)該疫苗，以用來(lái)免疫恒河猴，使其產(chǎn)生抗env中和抗體和CTL以及抗SIVgagCTL。隨后用適當(dāng)?shù)腟HIV病毒攻擊物攻擊這些猴[見(jiàn)J.li.et.al.，J.A.I.D.S.5，639-646(1992)]。
I.V1Jns-tPA-gp120IIIB/IRES/SIVp28gag按V1Jns-tPA-gp160IIIB/IRES/SIVp28gag構(gòu)建所述載體，除用V1Jns-tPA-gp120IIIB代替gp160基因外。按上述完成接種和SHIV攻擊。
J.V1Jns-tPA-gp120IIIB/IRES/HIVgag/IRES/rev該載體與上述的相似，除三順?lè)醋硬坏峁┝薵p120，還提供了gag和rev表達(dá)。
K.V1Jns-tPA-gp160IIIB/IRES/HIVgag/IRES/rev該載體與上述的相似，除三順?lè)醋硬坏峁┝薵p160，還提供了gag和rev表達(dá)。
實(shí)施例6HIV細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)象用于接種小鼠的一樣，說(shuō)明本節(jié)描述的方法。靈長(zhǎng)類(lèi)可以使用基本相似的檢測(cè)方法，除必須建立作為各動(dòng)物靶細(xì)胞的自體B細(xì)胞系外。人可以使用E-B病毒，恒河猴可以使用皰疹B病毒來(lái)完成。為了將紅細(xì)胞與白細(xì)胞分開(kāi)，使用Ficoll-Hypaque離心，從新鮮抽出的血液或脾中得到外周血單核細(xì)胞(PBMC)。對(duì)于小鼠，使用淋巴結(jié)也可以。從PBMC中通過(guò)在IL-2(20U/ml)和伴刀豆蛋白A(2μg/ml)中體外培養(yǎng)6-12天或通過(guò)使用等量輻射的抗原遞呈細(xì)胞的特異性抗原制備效應(yīng)物CTL。特異性抗原可以由合成肽(通常9-15個(gè)氨基酸)或經(jīng)工程加工后表達(dá)適當(dāng)抗原的痘苗病毒構(gòu)建體組成，所述合成肽是所用動(dòng)物MHC元型體CTL識(shí)別的已知表位。靶細(xì)胞可以是同種的或MHC單元型匹配的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系已經(jīng)處理遞呈與CTL體外刺激所述一樣的適當(dāng)抗原。對(duì)于Balb/c小鼠，可以使用10μM濃度的p18肽(ArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn，SEQ ID51，HIV MN毒株)以便用輻射的同種脾細(xì)胞體外再刺激CTL，在細(xì)胞毒性試驗(yàn)前，以1-10μM的濃度于37℃保溫約2小時(shí)，在所述試驗(yàn)中而用所述肽使靶細(xì)胞敏感。對(duì)于H-2dMHC單元型小鼠，鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞系p815提供了良好的靶細(xì)胞。通過(guò)于37℃將靶保溫1-2小時(shí)(0.2m Ci～5×106細(xì)胞)，然后將所述靶細(xì)胞洗滌數(shù)次，用Na51CrO4負(fù)載抗原敏感化的靶細(xì)胞，所述Na51CrO4是在用CTL殺死靶細(xì)胞后，從所述靶細(xì)胞內(nèi)釋放的。以不同比例的效應(yīng)物靶，如100∶1，50∶1，25∶1等將CTL群體與靶細(xì)胞混合，一起沉淀，在收集上清液前在37℃保溫4-6小時(shí)，然后用γ計(jì)數(shù)器檢測(cè)上清液中釋放的放射性。將細(xì)胞毒性計(jì)算為從靶細(xì)胞中可釋放的總計(jì)數(shù)的百分比(用0.2％Triton X-100處理得到的)，已經(jīng)從總計(jì)數(shù)中減去了從靶細(xì)胞中的自發(fā)釋放。
實(shí)施例7HIV特異性抗體的檢測(cè)用特異性重組蛋白質(zhì)或合成肽為底物抗原，設(shè)計(jì)ELISA以檢測(cè)抗HIV的抗體。在搖晃平臺(tái)上，用在50μl/孔PBS(磷酸緩沖鹽水)溶液中，2μg/ml的重組抗原于4℃覆蓋96孔微滴定板?？乖芍亟M蛋白質(zhì)(gp120，revRepligen公司；gp160，gp41美國(guó)生物技術(shù)公司)或合成肽(對(duì)應(yīng)于來(lái)自IIIB等病毒分離物序列的V3肽美國(guó)生物技術(shù)公司，單克隆抗2F5的gp41表位)組成。用洗滌緩沖液(PBS/0.05％吐溫20)將培養(yǎng)板漂洗4次，然后在室溫加入200μl/孔的阻斷緩沖液(在PBS/0.05％吐溫20中的1％Carnation milk溶液)阻斷1小時(shí)同時(shí)振蕩。以所需的稀釋范圍，用阻斷緩沖液稀釋前血清和免疫血清并以每孔100μl加入。將培養(yǎng)板在室溫保溫1小時(shí)，同時(shí)振蕩，然后用洗滌緩沖液洗滌4次。然后將與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的第二抗體(抗恒河猴Ig，南方生物技術(shù)聯(lián)合公司；抗小鼠和抗兔Ig，Jackxon免疫研究公司)(用阻斷緩沖液以1∶2000稀釋)以100μl/孔加到各樣品中，在室溫保溫1小時(shí)，同時(shí)振蕩。用洗滌緩沖液將培養(yǎng)板洗滌4次，然后通過(guò)加入100μl/孔鄰苯二胺(o-PD，Calbiochem公司)來(lái)顯色，所述鄰苯二胺溶液在pH4.5的100 mM檸檬酸緩沖液中，濃度為1mg/ml。在450nm讀培養(yǎng)板的吸收值，包括動(dòng)力學(xué)的(反應(yīng)的前10分鐘)和10和30分鐘終點(diǎn)的(Thermomax microplate reader，分子器件公司)。
實(shí)施例8HIV中和抗體的檢測(cè)按如下完成使用得自被接種動(dòng)物血清的HIV分離物試驗(yàn)的體外中和作用。在使用前將試驗(yàn)血清和免疫前血清在56℃加熱失活60分鐘。將滴定量的HIV-1加到1∶2系列稀釋的試驗(yàn)血清中，在加入到96孔微滴定板中的105MT-4人淋巴樣細(xì)胞中之前，在室溫保溫60分鐘。在37℃將病毒/細(xì)胞混合物保溫7天，然后通過(guò)用四唑嗡染料將培養(yǎng)物染色來(lái)檢測(cè)病毒介導(dǎo)的細(xì)胞殺死作用。通過(guò)防止病毒介導(dǎo)的細(xì)胞死亡來(lái)觀察病毒的中和作用。
實(shí)施例9在用有毒性的HIV-1攻擊后對(duì)黑猩猩的保護(hù)作用迄今為止，唯一的動(dòng)物HIV攻擊模型是使用黑猩猩。盡管黑猩猩中不發(fā)生與HIV相關(guān)的免疫缺損疾病，但可以用某些HIV病毒分離物感染它們。雖然正在研究其他分離物的攻擊原種，如SF2的，但是到目前為止在該模型中最常用的毒株是IIIB毒株(BH10)。我們?cè)O(shè)想用類(lèi)似于接種其他非人靈長(zhǎng)類(lèi)的方法，用來(lái)自本文所述的HIV-1IIIB毒株(HXB2克隆)滴定的HIVenv和gag-pol構(gòu)建體接種黑猩猩，以得到抗-HIV體液和細(xì)胞應(yīng)答。盡管象我們的接種構(gòu)建體基因一樣，用于黑猩猩的BH10攻擊病毒是IIIB衍生的，但是，在該種病毒內(nèi)有不均勻性，以致HXB2只是病毒接種物中至少三種IIIB變異體中的僅有一種。因此，用HXB2基因接種的猴的IIIB攻擊試驗(yàn)不完全是同源的。
我們用0.1-3mg質(zhì)粒/輪的劑量，用多核苷酸HIV基因疫苗給黑猩猩接種3-5輪。在表征了疫苗誘導(dǎo)的體液和CTL抗-HIV反應(yīng)后，通過(guò)靜脈內(nèi)施用在使用前用生理鹽水稀釋1∶25的HIV-1IIIB接種物，用10-140CID50(50％的黑猩猩感染劑量)攻擊這些猴子。通過(guò)用從試驗(yàn)黑猩猩的PBMC中得到的DNA，檢測(cè)HIV-1病毒特異性的DNA序列來(lái)監(jiān)測(cè)黑猩猩的感染。(參見(jiàn)實(shí)施例10的詳細(xì)描述)。可以將疫苗介導(dǎo)的保護(hù)作用描述為對(duì)攻擊病毒的反應(yīng)范圍，所述范圍從完全摧毀免疫力(在感染后不能檢測(cè)到病毒)到由攻擊原種誘導(dǎo)的病毒血癥顯著減弱和/或延遲。盡管顯然，摧毀免疫力是接種最優(yōu)選的反應(yīng)，但是使用人疫苗而減弱或延遲的病毒血癥會(huì)顯著地影響免疫缺損疾病的發(fā)生。
實(shí)施例10臨床HIV分離物基因的分離從感染的用ConA處理激活的PBMC中克隆HIV病毒基因。得到病毒基因的優(yōu)選方法是使用位于所需基因側(cè)的特異性寡聚物，從感染的細(xì)胞基因組中用PCR擴(kuò)增。得到病毒基因的第二種方法是從感染細(xì)胞的上清液中純化病毒RNA，然后用PCR從所述RNA制備cDNA。該方法非常類(lèi)似于上述克隆鼠B7基因的方法，除所用的PCR寡聚物和使用的隨機(jī)六聚體產(chǎn)生cDNA而不是特異性的引物寡聚物。
通過(guò)將感染細(xì)胞沉淀溶解在STE溶液(10 mMNaCl，10mMEDTA，10mM Tris-HCl，pH8.0)中來(lái)純化基因組DNA，所述STE溶液中已分別加入終濃度為0.1mg/ml和5％的蛋白酶K和SDS。在56℃將所述混合物保溫過(guò)夜，然后用0.5體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提。通過(guò)加入終濃度為0.3M的乙酸鈉和兩體積的冰冷乙醇來(lái)沉淀水相。從溶液中沉淀出DNA后，將所述DNA重懸在0.1×TE溶液(1×TE＝10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。此時(shí)加入SDS達(dá)到0.1％，和2U的RNAse A，在37℃保溫30分鐘。用酚/氯仿/異戊醇抽提所述溶液，然后按前述用乙醇沉淀。將DNA懸浮在0.1XTE中，通過(guò)其在260 nm的紫外線吸收值來(lái)測(cè)量定量。將樣品貯存在-20℃，直到用于PCR。
用Perkin-Elmer Cetus試劑盒，和分別使用下列g(shù)p160有義和反義寡聚物的方法完成PCR5’-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAATGA-3’，SEQ ID52和5’-GGG CTT GTC TAA ATG GGT GGC AAGTGG CCC GGG C ATG TGG-3’，SEQ ID53。這些寡聚物在所得DNA片段的3’末端加入了一個(gè)SrfI位點(diǎn)。將PCR衍生的片段克隆到V1Jns或V1R接種載體中，通過(guò)DNA測(cè)序確定V3區(qū)和連接接口位點(diǎn)。
實(shí)施例11跨疫苗構(gòu)建體接口的序列克隆實(shí)施例10中的基因。在每種情況下，用下列引物確定從5’啟動(dòng)子區(qū)(CMVintA)到克隆基因的接口序列CMVinta引物5’-CTAACA GAC TGT TCC TTT CCA TG -3’，SEQ ID54，它產(chǎn)生了編碼序列的序列。這與終止子/編碼序列鄰接，還列出了其接口。用下列引物產(chǎn)生該序列BGH引物5’-GGA GTG GCA CCT TCC AGG-3’，SEQID55，它產(chǎn)生了非編碼鏈的序列。在各種情況下，根據(jù)來(lái)自GENBANK的已知序列檢索所述序列以便克隆并確定來(lái)自這些或其他HIV分離物的基因的序列。接口的位置用“/”表示，這不代表序列中的任何不連續(xù)。在各序列中的第一個(gè)“ATG”是各克隆基因的翻譯起始密碼子。所提供的各序列代表有關(guān)設(shè)計(jì)的HIV基因的完全的，可得到的且可表達(dá)的DNA構(gòu)建體。所述命名延用慣例“載體名稱-HIV毒株-基因”。每個(gè)構(gòu)建體的生物效力按前文實(shí)施例用相同的方法列出跨CMVintA和HIV基因5’接口和跨HIV基因和BGH終止子表達(dá)構(gòu)建體的序列，使用不同的HIV毒株和蛋白質(zhì)1.V1Jns-revIIIBSEQ ID565’GGA GAC AGC GACGAA GAC CTC CTC AAG GCA GTC AGA CTCATC AAG-3’rev….
(序列在PCR寡聚物的5’末端開(kāi)始，。見(jiàn)下文#7有關(guān)完全的rev5’末端序列)SEQ ID575’-GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT CT/GAT ATCGCA CTABGH rev...TTC TTT AGC TCC TGA CTC CAA TAT TGT-3’2. V1Jns-gp160IIIBSEQ ID 585’-CTT AGA TC/A ACC ATG AGA GTG AAG GA GAA ATA TCAGCA CTT GTGCMVinta gp 160GAG ATG GGG GTG GAG ATG GGG CAC CA T GCT CCT TGGGAT GTT GAT GAT CTG TAG TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT-3’SEQ.ID595′-CTG GCA ACT AGA AGG CAC AGC AGA TC/A GAT AGT GTC CCC ATC TTABGH gp160TAG CAA AAT CCT TTC CAA GCC CTG TCT TAT TCT-3′3.pGEM-3-IRES[使用SP6(5′-GAT TTA GGT GAC ACTATA G-3′，SEQ.ID60)和T7(5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3′.SEQ.ID61)引物測(cè)序，Promega Biotech]SEQ.ID625′-CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA/AAT TCC G…pGEM-3(SP6) IRESSEQ.ID635′-A CCC GGG GAT CCT CT/A GCG CGC TTG TCT CTT GTT CCA…pGEM-3 (T7) IRES4.pGEM-3-IRES/revIIIB[rev 3′末端使用T7測(cè)序引物(Promega)，IRES/rev接口使用IRES 3′-寡聚物(5′-GG GAC GTG GTT TTCC-3′，SEQ.ID64)]SEQ.ID655′-TAT GGC CAC AAC C/AT GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGAIRES revCCT CCT CAA GGC AGT CAG ACT-3′SEQ.ID665′-CTC GAG CCA TGG GCC CCT/AGA CTA TAG CGT GAT AAG AAA TCG AGGpGEM-3 revACT GAG GTT ATA ACA TCC TCT AAG GTG GTT ATA AAC TCC CGA AGG-3′5.pGEM-3-RRE/IRES/revIIIB[使用SP6測(cè)序寡聚物(Promega)和IRES 5′-寡聚物，5′-G CTT CGG CCA GTA ACG-3′，SEQ.ID67]SEQ.ID685′-TTG CAT GCC TGC AGG T/GGT ACA TGA TCA GAT ATC G CCC GGG/C
pGEM-3RRECGA GAT CTT CAG ACT TGG AGG AGG AGA TAT GAG GGA CAA TTG GAG-3′IRES-5′SEQ.ID695′-GGG GCG GAA TT/T AGA GTC A/ATT GAT CAG CTT GTG TAA TTG TTARRE-3′ATT TCT CTG TCC CAC TCC ATC CAG GTC GTG TGA TTC…-3′6.V1Jns-(tat/rev SD)[供V1Jns-gp160IIIB/IRES/revIIIB(SD)和V1Jns-gp160IIIB(SD)使用；使用與gp160互補(bǔ)的寡聚物，朝gp1605末端方向讀并讀至CMVintA以測(cè)序5-CCA TCT CCA CAA GTG CTG-3，SEQ.ID70]SEQ.ID715′-AGA TCT A AGG ACG GTG ACT GCA/TGT ACT ACT TAC TGC TTT GATCMVintA tat/rev SDAGA GGA CGG TGA/CTG CAG AAA AGA CCC ATG GAA A-3′CMVintA7.V1Jns-gp160IIIB/IRES/revIIIB(SD)[使用IRES 5-寡聚物測(cè)定gP160/IRES接口的序列，5′-G CTT CGG CCA GTA ACG-3′’SEQ.ID735′-GGC ACA GCA GAT C/AG ATG GGG ATC TGA TA TCG CAC TAT TCT TTABGH revGCT CCT GAC TCC TGA CTC-3′SEQ.ID745′-GGA ATT/TGA GTC ATC/CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC CAA-3′IRES gp1608.V1Jns-gag-prtIIIB(SD)SEQ.ID755′-CTT AGA TC/C CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG GCG GCG ACT GGT-3′CMVintA gag(SD)SEQ.ID765′-GGC ACA GCA GAT C/CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TACBGH prtTAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC…-3′9.V1Jns-gag-prtIIIBSEQ.ID775′-CTT AGA TC/CAC CAT GGG TGC GAG AGC GTC AGT ATT AA GCG GGGCMVintA gagGGA GAA TTA GAT CGA TGG GAA AAA ATT…-3′SEQ.ID785′-GGC ACA GCA GAT C/CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TACBGH prtTAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC…-3′10.V1Jns-tPASEQ.ID795′-TCA CCG TCC TTA GAT C/ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGCCMVintA tPA前導(dǎo)序列TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA/G ATCBGHTGC TGT GCC TTC TAG TTG CCA GCC-3′11.V1Jns-tPA-gp120MNSEQ.ID805′-TTC GTT TCG CCC AGC GA/TCA CAG AAA AAT TGT GGG TCA CAG TC-3′tPA gp120MNSEQ.ID815′-GGC ACA GCA GAT C/CAC GTG TTA GCG CTT TTC TCT CTC CAC CAC-3′BGH gp120MN12.V1J-SIV.MAC251 p28 gagSEQ.ID825′-TCA CCG TCC TTA GAT CT/ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGTCMVintA p28 gag...GGT AAC TAT GTC CAC CTG CCA TTA AGC CCG AGA ACA-3′SEQ.ID835′-GGC ACA GCA GAT CT/TTA CAT TAA TCT AGC CTT CTG TCC CGG TCC-3′BGH p28 gag13.V1J-SIV. MAC251nefSEQ.ID845′-TCA CCG TCC TTA GAT C/GGT ACA ACC ATG GGT GGA GCT ATT TCC ATGCMVintA nef.....AGG CAA TCC AAG CCG GCT GGA GAT CTG ACA GAA A-3′SEQ.ID855′-GGC ACA GCA GAT CA/C CTA GGT TAG CCT TCT TCT AAC CTC TTC CTCBGH nef....TGA CAG GCC TGA CTT GCT TCC AAC TCT TCT GGG TAT CTA G-3′14.V1Jns-tat/rev/envSEQ.ID865′-ACC GTC CTT AGA T/TC GAC ATA GCA GAA TAG GCG TTA CTC GAC AGACM VintA tat/rev/envGGA GAG CAA GAA ATG GAG CCA GTA GAT CCT AGA CTA GAG CCC TGG-3′SEQ.ID875′-GGC ACA GCA GAT C/C GAG ATG CTG CTC CCA CCC CAT CTG CTG-3′BGH tat/rev/env
實(shí)施例12T細(xì)胞增殖試驗(yàn)可以從上文按實(shí)施例6所述得到PBMC，并按PBMC種群內(nèi)的增殖確定的，檢測(cè)對(duì)特異性抗原的記憶反應(yīng)。用在收集前，加到培養(yǎng)的最后18-24小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)物中的3H-胸苷來(lái)監(jiān)測(cè)增殖。如果已經(jīng)發(fā)生了增殖，細(xì)胞收集器將含同位素的DNA留在濾器上，而靜止細(xì)胞未摻入同位素，就不能以游離形式留在濾器上。對(duì)于嚙齒類(lèi)或靈長(zhǎng)類(lèi)，4×105的細(xì)胞鋪在共200μl的完全培養(yǎng)基(RPMI/10％胎牛血清)的96孔微滴定板上。僅用PBMC和培養(yǎng)基確定背景增殖反應(yīng)，而用1-5μg/ml的凝集素，如植物血細(xì)胞凝集素(PHA)或伴刀豆蛋白A(ConA)產(chǎn)生的非特導(dǎo)性反應(yīng)作為陽(yáng)性對(duì)照。特異性抗原由已知的肽表位，純化的蛋白質(zhì)或滅活的病毒組成。肽的抗原濃度為1-10μM，而蛋白質(zhì)的為1-10μg/ml。凝集素誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)峰在3-5天的細(xì)胞培養(yǎng)中，而抗原特異性峰在5-7天。若得到超過(guò)培養(yǎng)基背景至少3倍的放射性計(jì)數(shù)，而且常常作為與背景的比率或刺激指數(shù)(SI)給出，則表明發(fā)生了特異性增殖。已知HIVgp160含數(shù)種已知引起gp160/gp120免疫的或HIV感染的個(gè)體之T細(xì)胞增殖的肽。其中最常用的是T1(LysGlnIleIleAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla，SEQ.ID88)；T2(HisGluAspIleIleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys，SEQ.ID89)；和，TH4(AspArgValIleGluValValGlnGlyAalTyrArgAlaIleArg，SEQ.ID90).已經(jīng)表明這些肽刺激用抗原致敏感化的小鼠，非人靈長(zhǎng)類(lèi)和人的PBMC的增殖。參考文獻(xiàn)L.亞瑟等，病毒學(xué)雜志，63，5046(1989).[chimp/HIV攻擊模式/病毒中和測(cè)試]T.曼尼阿蒂斯等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，P280，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1982)[基因組DNA純化]E.艾米尼等，病毒學(xué)雜志，64，3674(1990)[chimp攻擊，中和測(cè)試]
實(shí)施例13載體V1R的制備在持續(xù)優(yōu)化我們的基本接種載體的努力中，我們制備了V1Jns的衍生物，稱為V1R。構(gòu)建該載體的目的是得到最小的疫苗載體，即沒(méi)有不必需的DNA序列，但它仍保留了全部V1J和V1Jns提供的優(yōu)化的異源基因表達(dá)特征和高質(zhì)粒產(chǎn)率。我們從文獻(xiàn)和試驗(yàn)中確定了(1)在pUC骨架內(nèi)的區(qū)含可除去但不會(huì)影響細(xì)菌的質(zhì)粒產(chǎn)率的大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；(2)如果插入細(xì)菌終止子代替，就可以除去卡那霉素開(kāi)放閱讀框架后的kanr基因3’區(qū)；和(3)可以從BGH終止子的3’端那一半除去～300bp，而不會(huì)影響其調(diào)節(jié)功能(在BGH元件內(nèi)的原KpnI限制酶位點(diǎn)后)。
用PCR從分別代表CMVintA啟動(dòng)子/BGH終止子，復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性元件的V1Jns合成三個(gè)DNA片段以構(gòu)建V1R。用PCR寡聚物將各片段的特有限制酶加到各片段末端CMVintA/BGH終止子加SspI和XhoI；kanr基因加EcoRV和BamHI；和orir加BclI和SalI。選擇這些酶位點(diǎn)是因?yàn)樗鼈兛梢詫⒏鱌CR衍生的DNA片段與各位點(diǎn)丟失后的產(chǎn)物直接相連EcoRV和SspI剩下可互相連接的平整末端DNA，而B(niǎo)amHI和BclI與SalI和XhoI一樣剩下互補(bǔ)的懸垂末端。用PCR得到這些片段后，用上述表明的適當(dāng)限制酶消化各片段，然后在含所有三種DNA片段的一種反應(yīng)混合物中連接在一起。設(shè)計(jì)ori的d5’末端以包括在該區(qū)中正常發(fā)現(xiàn)的T2rho獨(dú)立性的終止子序列，以便它能夠提供卡那霉素抗性基因的終止信息。通過(guò)限制酶消化(＞8種酶)和連接接口的DNA測(cè)序確定連接的產(chǎn)物。在V1R內(nèi)使用病毒基因的DNA質(zhì)粒產(chǎn)率和異源表達(dá)與V1Jns的相似。載體大小的凈減小為1346bp(V1Jns＝4.86 kb；V1R＝3.52 kb)，見(jiàn)圖11，SEQ ID45。
用于合成V1R的PCR寡聚物序列(在下列序列的括號(hào)中，劃線并鑒定的是限制酶位點(diǎn))(1)5′-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3′[Sspl]，SEQ.ID91，(2)5′-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3′[Xhol]，SEQ.ID92(用于CMVintA/BGH片段)(3)5′-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3′[EcoRV]，SEQ.ID93(4)5′-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3′[BamHI]，SEQ.ID94(用于卡那霉素抗性基因片段)(5)5′-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3′[Bcll]，SEQ.ID95，(6)5′-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3′[Sall]SEQ.ID96(用于大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn))使用下列寡聚物測(cè)定V1R連接接口的序列5′-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3′，SEQ.ID97[CMVintA/kanr接口]5′-CAA TAG CAG GCA TGC-3′，SEQ.ID98[BGH/ori接口]5′-G CAA GCA GCA GAT TAC-3′，SEQ.ID99[ori/kanr]實(shí)施例14PNV研制最重要的HIV基因是env和gag。env和gag對(duì)于病毒或異源表達(dá)均需要HIV調(diào)節(jié)rev蛋白質(zhì)。因?yàn)檫@些基因產(chǎn)物的有效表達(dá)對(duì)于PNV功能是必需的，所以為了接種目的試驗(yàn)兩種類(lèi)型的載體，即rev依賴性和rev獨(dú)立性載體。除非特別說(shuō)明，所有基因均來(lái)自HIV-1(IIIB)實(shí)驗(yàn)室分離物。
A.env根據(jù)所使用的基因片段的大小，通過(guò)用來(lái)自組織特異性纖溶酶原激活劑(tPA)基因的前導(dǎo)肽取代env的天然前導(dǎo)肽，然后在含有CMV內(nèi)含子A的CMV啟動(dòng)子后表達(dá)所得的嵌合基因，可以得到不同效力的rev獨(dú)立性載體env表達(dá)。V1Jns-tPA-gp120是用該方式構(gòu)建的分泌gp120載體的實(shí)例，所述載體的功能是在接種的小鼠和猴中產(chǎn)生抗gp120免疫反應(yīng)。
公開(kāi)的報(bào)道表明，膜固定的蛋白質(zhì)與分泌蛋白質(zhì)相比可誘導(dǎo)更實(shí)質(zhì)性的抗體反應(yīng)。膜固定的蛋白質(zhì)還可誘導(dǎo)對(duì)其他免疫表位的抗體反應(yīng)。為了檢測(cè)該假設(shè)，制備V1Jns-tPA-gp160和V1Jns-rev/env。按用體外轉(zhuǎn)染的RD細(xì)胞的免疫印跡分析所表明的，tPA-gp160載體產(chǎn)生可檢測(cè)量gp160和gp120，而不用加入rev，盡管表達(dá)比rev/env，rev依賴性的gp160表達(dá)質(zhì)粒得到的更低。這可能是由于抑制區(qū)的存在，在包括在gp41的COOH-末端的gp160內(nèi)的多位點(diǎn)得到gp160轉(zhuǎn)錄本后，可賦予rev依賴性。
制備經(jīng)設(shè)計(jì)含截?cái)嘈问降膖PA-gp160，tPA-gp143和tPA-gp150的載體以便通過(guò)消除這些抑制序列來(lái)提高env的總表達(dá)。截?cái)嗟膅p160載體沒(méi)有含肽基元(如Leu-Leu)的細(xì)胞內(nèi)gp41區(qū)，已知所述肽基元使膜蛋白轉(zhuǎn)化成溶酶體而不是細(xì)胞表面。因此，認(rèn)為與全長(zhǎng)gp160相比，p143和gp150可增加蛋白質(zhì)到細(xì)胞表面的運(yùn)輸，而這些蛋白質(zhì)在DNA接種后，能夠更好地引發(fā)抗gp160抗體。
研究在轉(zhuǎn)染體細(xì)胞中g(shù)p160/gp120表達(dá)的定量ELISA以確定這些載體以及其他載體(載體rev/tPA-gp160)的相對(duì)表達(dá)能力，所述其他載體構(gòu)成了tPA-gp160和rev/env特征。體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，然后定量分析細(xì)胞相關(guān)的對(duì)分泌的/釋放的gp120產(chǎn)生了下列結(jié)果(1)對(duì)于類(lèi)似的質(zhì)粒對(duì)rev/env和rev/tPA-gp160，用tPA前導(dǎo)序列取代gp160的天然前導(dǎo)肽不會(huì)增加gp160的表達(dá)或釋放的gp120量。這表明在這些細(xì)胞中，前導(dǎo)肽不會(huì)導(dǎo)致使gp160不能充分地到達(dá)細(xì)胞表面。
(2)與細(xì)胞內(nèi)保持的對(duì)到達(dá)細(xì)胞表面的相似比例的rev/env相比，tPA-gp160表達(dá)少5-10X的gp160。
(3)與只有低水平的細(xì)胞相關(guān)的gp143之rev/env相比，tPA-gp143分泌3-6X多的gp120，從而證實(shí)gp160的胞質(zhì)尾會(huì)使gp160在細(xì)胞內(nèi)滯留，但通過(guò)部分缺失該序列可以克服這一問(wèn)題。
(4)在細(xì)胞和培養(yǎng)基中，tPA-gp150只有很低水平的gp160，這表明了該構(gòu)建體的一個(gè)問(wèn)題或所述截?cái)嗟鞍踪|(zhì)的內(nèi)在不穩(wěn)定性。
用轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞，從初級(jí)HIV分離物(含North American共有序列V3肽環(huán)；巨噬細(xì)胞向性和非合胞體誘導(dǎo)的表型)的tPA-gp120有高表達(dá)/分泌的gp120，表明已經(jīng)以功能形式將其克隆。
實(shí)施例15血清學(xué)試驗(yàn)A.抗體反應(yīng)1.gp120PNVs用V1Jns-tPA-gp120(100，10，1μg3X)完成小鼠的ID對(duì)IM接種試驗(yàn)。ID接種在開(kāi)始的時(shí)候在低劑量似乎是有利的，但在三輪后，所有劑量均是等價(jià)的。
用V1Jns-tPA-gp120(MN)PNV接種恒河猴(RHM)和非洲綠猴(AGM)。在這兩種靈長(zhǎng)類(lèi)中，gp120抗體的峰GMT有5倍以上的不同1780(AGM)和310(RHM)。這些結(jié)果表明，與RHM相比，在AGM中可引發(fā)實(shí)際上較大的抗體滴定度，并說(shuō)明通過(guò)AGM接種可以得到較高的HIV中和滴定度。
2.gp160PNVs在三次注射前，小鼠的V1Jnx-rev/env接種(IM)不會(huì)產(chǎn)生gp160抗體，但在一輪后，ID接種就產(chǎn)生反應(yīng)，而且比在總IM試驗(yàn)中產(chǎn)生的都高(GMTs＝2115(ID)和95(IM)；200μg/小鼠)。這表明rev依賴性構(gòu)建體通過(guò)ID途徑作為免疫原更好。
用V1Jns-rev/envID或IM接種的RHM有峰(在4-5次接種(2mg/輪)后分別為，GMTs＝790和140)。這些結(jié)果與用小鼠發(fā)現(xiàn)的一致，表明rev依賴性PNV對(duì)于通過(guò)ID接種產(chǎn)生的抗體有較大的效力，盡管rev獨(dú)立性構(gòu)建體V1Jns-tPA-gp120沒(méi)有這樣的作用。接受tPA-gp160DNA(IM)的RHM比接受rev/env的RHM有較低的可變性更大的抗體反應(yīng)，從而證實(shí)了我們的結(jié)論，該載體比rev/env有效表達(dá)少4-7X的gp160。
B.體外病毒中和作用由Qualty Biologicals，Inc.(QBI)，用HIV(MN)作為病毒來(lái)源完成感染性降低中和試驗(yàn)(讀出p24 gag產(chǎn)量)。在低病毒供給時(shí)(100TCID50)，與匹配的prebleed血清相比，在所有抗血清的1/10稀釋的血清中觀察到完全中和，在高達(dá)1/80稀釋的所有樣品中，病毒的生產(chǎn)降低了至少80-90％。但在高病毒供給(1000 TCID50)時(shí)，在任何樣品中均未觀察到中和作用。
供給100 TCID50病毒，然后用tPA-gp120(IIIB)DNA接種，從而檢測(cè)RHM的HIV(IIIB)中和作用(QBI)。在兩個(gè)不同的試驗(yàn)中，在10倍稀釋的血清中觀察到最好的中和結(jié)果(p24 gag降低40-99％)，在稀釋達(dá)80倍的某些樣品中觀察到gag降低。在該試驗(yàn)中最一致的樣品的抗-gp120抗體ELISA終點(diǎn)滴定度至少為2000-3000。
類(lèi)似地，用rev/env DNA接種后，檢測(cè)RHM的HIV(IIIB)中和作用(QBI)?？偟膩?lái)說(shuō)，觀察到低水平的中和作用以10倍稀釋的血清中，三分之二的RHM有84％的中和作用，在隨后稀釋20或40倍時(shí)，觀察到p24 gag降低，而一個(gè)樣品沒(méi)有任何中和的跡象。這些樣品的抗-gp120抗體ELISA滴定度為700-800，表明在中和試驗(yàn)中，這是檢測(cè)得自gp160 DNA疫苗試驗(yàn)血清的最小有用滴定度范圍。
C.增強(qiáng)免疫力的促進(jìn)劑完成數(shù)個(gè)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)質(zhì)粒DNA形成，已經(jīng)報(bào)告了所述質(zhì)粒DNA的形成在接種后可增加DNA的攝取，并提高在小鼠和猴接種中報(bào)道基因的表達(dá)或免疫反應(yīng)。根據(jù)報(bào)道基因表達(dá)的跡象，高滲蔗糖(高達(dá)20-25％，w/v)DNA溶液可以使DNA攝取的分布更均一，并在試驗(yàn)中使用，其中在用rev/gp160質(zhì)粒接種嚙齒類(lèi)和非人靈長(zhǎng)類(lèi)中引發(fā)實(shí)質(zhì)性的gp160特異性抗體。還報(bào)告了麻醉劑丁哌卡因(0.24-0.75％，w/v)當(dāng)用作IM注射預(yù)處理或與等滲鹽溶液中的DNA共注射時(shí)，在小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)中顯著增強(qiáng)DNA疫苗介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
用丁哌卡因的結(jié)果表明，用0.5％溶液IM處理會(huì)導(dǎo)致實(shí)質(zhì)的死亡率。死亡率隨所用溶液的體積和小鼠是否在麻醉下(≥0.1 mL w/o麻醉得到最高的死亡率)注射而變化。我們?cè)囼?yàn)用0.25％溶液，但由于預(yù)處理或共處理并使用gp120或rev/env PNVs而沒(méi)有顯著的死亡率。使用丁哌卡因預(yù)處理三個(gè)接種輪次的預(yù)備試驗(yàn)相對(duì)于對(duì)照小鼠而言，免疫反應(yīng)沒(méi)有任何增強(qiáng)，而試驗(yàn)ID和IM位點(diǎn)預(yù)處理或共處理的大規(guī)模試驗(yàn)在注射一次后抗體水平?jīng)]有任何提高，而在有些組中抗體反應(yīng)似乎有所降低。在目前的研究種計(jì)劃了三中接種。
所述蔗糖形成試驗(yàn)檢測(cè)在文獻(xiàn)中描述的不同條件。在含0.1mg/mLtPA-gp120質(zhì)粒的鹽或PBS溶液中，檢測(cè)10，15，20和25％的蔗糖濃度。用IM或ID途徑共注射，檢測(cè)所有樣品，除25％蔗糖/PBS組在IM DNA/PBS注射前15-30分鐘接受該溶液外。在第一次接種后的，來(lái)自血液的血清數(shù)據(jù)的抗體反應(yīng)沒(méi)有任何提高。
實(shí)施例16T淋巴細(xì)胞反應(yīng)A.增殖和細(xì)胞因子分泌用抗原體內(nèi)引發(fā)的T淋巴細(xì)胞在外源加入引發(fā)抗原后，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中可以增殖并分泌細(xì)胞因子。反應(yīng)T細(xì)胞通常有MHCII型限制的CD4+(輔助細(xì)胞)表型。根據(jù)抗原刺激后它們分泌的細(xì)胞因子的類(lèi)型，可將輔助T細(xì)胞按功能分組TH1細(xì)胞主要分泌IL-2和g-干擾素，而TH2細(xì)胞與IL-4，IL-5和IL-10分泌有關(guān)。TH1淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞免疫力，包括CTL和DTH反應(yīng)，而TH2細(xì)胞和細(xì)胞因子促進(jìn)體液免疫力的B細(xì)胞激活。以前我們用rgp120IIIB為體外抗原，用HIVtPA-gp120PNVs接種后，在小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)(AGM和RHM)中試驗(yàn)這些反應(yīng)，并表明在小鼠中來(lái)自兩個(gè)種接種的T細(xì)胞體外對(duì)gp120有增殖反應(yīng)，而且這些反應(yīng)是TH1樣的和長(zhǎng)期的(＞6個(gè)月)用revPNV繼續(xù)這些研究。
1.小鼠研究檢測(cè)用200μg V1Jns-rev3X或1X接種的小鼠對(duì)重組rev(r-rev)蛋白質(zhì)的體外增殖。3X接種的小鼠的刺激指數(shù)(SI帶和不帶免疫抗原的免疫細(xì)胞的增殖比率)為9-12，而接受1X的小鼠與背景相同(SI＝2-3)。來(lái)自所有rev疫苗的脾T細(xì)胞，但不是對(duì)照小鼠，分泌g-干擾素來(lái)應(yīng)答r-rev抗原(2.4-2.8 ng/ml，3X；0.4-0.7ng/ml，1X)，而在培養(yǎng)上清液中未檢測(cè)到IL-4(對(duì)g-干擾素和IL-4的檢測(cè)敏感度分別為47和15 pg/ml)，表明這些T細(xì)胞反應(yīng)是TH1樣的，與我們發(fā)現(xiàn)gp120 DNA疫苗的一樣。細(xì)胞因子分泌可能是比用于確定T細(xì)胞記憶反應(yīng)的特異性抗原更敏感的檢測(cè)。在接種后至少6個(gè)月的試驗(yàn)小鼠中發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。在任何疫苗血清中都未象對(duì)該細(xì)胞內(nèi)預(yù)期蛋白質(zhì)的那樣檢測(cè)到rev抗體。
2.猴子研究在用V1Jnx-rev接種兩次后，三只RHM對(duì)r-rev有強(qiáng)的體外T細(xì)胞增殖(SI＝9-30)。在任何猴子中均未檢測(cè)到抗-rev抗體。這些結(jié)果與上述小鼠/rev試驗(yàn)相符，證實(shí)了用rev PNVs可以誘導(dǎo)強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)而不會(huì)同時(shí)誘導(dǎo)抗體反應(yīng)。
用tPA-gp120 DNA接種RHM的其他試驗(yàn)表明(i)接種一次后得到對(duì)rgp120的體外T細(xì)胞增殖；(ii)第二次接種后，初級(jí)反應(yīng)得到加強(qiáng)；和(iii)用與SHIV-感染的RHM一樣的這些疫苗得到了相似的增殖(分別為SI＝5-70和5-35)。
B.抗-env細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞在一次接種后的六星期，用tPA-gp120(IM)和gp160/IRES/rev(ID)PNV接種的四只RHM猴中的兩只有顯著的抗同源靶細(xì)胞CTL活性(以10∶1 E/T，＞20％裂解)。第二次接種后兩星期，所有四只猴子的細(xì)胞毒性為在20∶1E/T20-35％裂解。在該試驗(yàn)中所有CTL活性均是MHCI型限制的在所有四只猴子中，CD8＋T細(xì)胞的去除完全除去了細(xì)胞毒性。CTL反應(yīng)在數(shù)個(gè)月內(nèi)消弱，而再接種后，加強(qiáng)到≥原水平。將這些CTL活性表征為在RHM中觀察到的疫苗介導(dǎo)的反應(yīng)的最大潛力。序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Shiver，John WLiu，Margaret APerry，Helen C(ii)發(fā)明題目協(xié)調(diào)的體內(nèi)基因表達(dá)(iii)序列數(shù)目100(iv)相關(guān)地址(A)收件人Christine E.Carty(B)街道126 Lincoln Avenue，P.O.Box 2000(C)城市Rahway(D)州New Jersey(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼 07065(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容的(C)操作系統(tǒng)PC-COS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)當(dāng)前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(lèi)號(hào)(viii)代理/代理人資料；(A)姓名Carty，Christine E.
(B)登記號(hào)36,090
(C)參考資料/文檔號(hào)19188Y(ix)通訊資料(A)電話(908)594-6734(B)電傳(908)594-4720(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO1Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro1 5 10 15Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln20 25 30Ala His Cys35(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO2Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro1 5 10 15Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Thr Ile Arg Gln20 25 30Ala His Cys35(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO3Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile Gln Arg1 510 15Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg20 25 30Gln Ala His Cys35(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO4Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Gly Ile His Ile Gly Pro1 510 15Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Lys Ile Ile Gly Asn Ile Arg Gln20 25 30Ala His Cys35(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO5Cys Thr Arg Pro Ser Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly1 510 15Pro Gly Lys Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ala Ile Ile Gly Asp Ile Arg20 25 30Gln Ala His Cys35(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO6Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Arg Ser Ile His Ile Ala Pro1 510 15Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln20 25 30Ala His Cys35(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO7CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO8GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)
(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO9GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO10GTTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO11GGTACAAGAT CTACTATAGG GAGACCGGAA TTCCGC(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4432個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO12TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 120TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGATTGG 240CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG 300TCCAACATTA CCGCCATGTT 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GACCATTATT GACCACTCCC 1200CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC ACAACTCTCT 1260TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA CACGGACTCT GTATTTTTAC 1320AGGATGGGGT CTCATTTATT ATTTACAAAT TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC 1380CCGCAGTTTT TATTAAACAT AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG 1440ACATGGGCTC TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC 1500CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA GACTTAGGCA 1560CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC GTGGCGGTAG GGTATGTGTC 1620TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC 1680GGCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC 1740CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC 1800GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT 1860CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCTGCTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGTTTGCC 1920CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA 1980ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG 2040GGCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG 2100GCTCTATGGG TACCCAGGTG CTGAAGAATT GACCCGGTTC CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC 2160AGGCACATCC CCTTCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTCTTA GTTCCAGCCC 2220CACTCATAGG ACACTCATAG CTCAGGAGGG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTAAAGTAC 2280TTGGAGCGGT CTCTCCCTCC CTCATCAGCC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAAGAGTGG 2340GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGCTATTAAG TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG 2400TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA TCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 2460CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 2520TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 2580AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG 2640CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 2700CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 2760GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT 2820AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 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CTATACACCC CCGCTTCCTC 900ATGTTATAGG TGATGGTATA GCTTAGCCTA TAGGTGTGGG TTATTGACCA TTATTGACCA 960CTCCCCTATT GGTGACGATA CTTTCCATTA CTAATCCATA ACATGGCTCT TTGCCACAAC 1020TCTCTTTATT GGCTATATGC CAATACACTG TCCTTCAGAG ACTGACACGG ACTCTGTATT 1080TTTACAGGAT GGGGTCTCAT TTATTATTTA CAAATTCACA TATACAACAC CACCGTCCCC 1140AGTGCCCGCA GTTTTTATTA AACATAACGT GGGATCTCCA CGCGAATCTC GGGTACGTGT 1200TCCGGACATG GGCTCTTCTC CGGTAGCGGC GGAGCTTCTA CATCCGAGCC CTGCTCCCAT 1260GCCTCCAGCG ACTCATGGTC GCTCGGCAGC TCCTTGCTCC TAACAGTGGA GGCCAGACTT 1320AGGCACAGCA CGATGCCCAC CACCACCAGT GTGCCGCACA AGGCCGTGGC GGTAGGGTAT 1380GTGTCTGAAA ATGAGCTCGG GGAGCGGGCT TGCACCGCTG ACGCATTTGG AAGACTTAAG 1440GCAGCGGCAG AAGAAGATGC AGGCAGCTGA GTTGTTGTGT TCTGATAAGA GTCAGAGGTA 1500ACTCCCGTTG CGGTGCTGTT AACGGTGGAG GGCAGTGTAG TCTGAGCAGT ACTCGTTGCT 1560GCCGCGCGCG CCACCAGACA TAATAGCTGA CAGACTAACA GACTGTTCCT TTCCATGGGT 1620CTTTTCTGCA GTCACCGTCC TTAGATCTGC TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC CATCTGTTGT 1680TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG TCCTTTCCTA 1740ATAAAATGAG GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT CATTCTATTC TGGGGGGTGG 1800GGTGGGGCAG CACAGCAAGG GGGAGGATTG GGAAGACAAT AGCAGGCATG CTGGGGATGC1860GGTGGGCTCT ATGGGTACCC AGGTGCTGAA GAATTGACCC GGTTCCTCCT GGGCCAGAAA1920GAAGCAGGCA CATCCCCTTC TCTGTGACAC ACCCTGTCCA CGCCCCTGGT TCTTAGTTCC1980AGCCCCACTC ATAGGACACT CATAGCTCAG GAGGGCTCCG CCTTCAATCC CACCCGCTAA2040AGTACTTGGA GCGGTCTCTC CCTCCCTCAT CAGCCCACCA AACCAAACCT AGCCTCCAAG2100AGTGGGAAGAAATTAAAGCA AGATAGGCTA TTAAGTGCAG AGGGAGAGAA AATGCCTCCA2160ACATGTGAGG AAGTAATGAG AGAAATCATA GAATTC 2196(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4864個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO14TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG120TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC180ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGATTGG240CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG300TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT AATCAATTAC360GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT ACATAACTTA CGGTAAATGG420CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC480CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC540TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA600TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC660TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA720CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA 780CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA 840CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG 900AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA 960TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA CGGTGCATTG GAACGCGGAT 1020TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC CTATAGAGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGC 1080TTCTTATGCA TGCTATACTG TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT 1140ATAGGTGATG GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTATT GACCATTATT GACCACTCCC 1200CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC ACAACTCTCT 1260TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA CACGGACTCT GTATTTTTAC 1320AGGATGGGGT CTCATTTATT ATTTACAAAT TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC 1380CCGCAGTTTT TATTAAACAT AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG 1440ACATGGGCTC TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC 1500CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA GACTTAGGCA 1560CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC GTGGCGGTAG GGTATGTGTC 1620TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC 1680GGCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC 1740CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC 1800GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT 1860CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCTGCTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGTTTGCC 1920CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA 1980ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG 2040GGCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG 2100GCTCTATGGG TACCCAGGTG CTGAAGAATT GACCCGGTTC CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC 2160AGGCACATCC CCTTCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTCTTA GTTCCAGCCC 2220CACTCATAGG ACACTCATAG CTCAGGAGGG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTAAAGTAC 2280TTGGAGCGGT CTCTCCCTCC CTCATCAGCC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAAGAGTGG 2340GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGCTATTAAG TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG 2400TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA TCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 2460CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 2520TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 2580AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG 2640CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 2700CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 2760GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT 2820AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 2880GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA 2940CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 3000GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 3060TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA 3120TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG 3180CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG 3240TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 3300TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 3360TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT 3420CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCGGGGG GGGGGGGCGC TGAGGTCTGC CTCGTGAAGA 3480AGGTGTTGCT GACTCATACC AGGCCTGAAT CGCCCCATCA TCCAGCCAGA AAGTGAGGGA 3540GCCACGGTTG ATGAGAGCTT TGTTGTAGGT GGACCAGTTG GTGATTTTGA ACTTTTGCTT 3600TGCCACGGAA CGGTCTGCGT TGTCGGGAAG ATGCGTGATC TGATCCTTCA ACTCAGCAAA 3660AGTTCGATTT ATTCAACAAA GCCGCCGTCC CGTCAAGTCA GCGTAATGCT CTGCCAGTGT 3720TACAACCAAT TAACCAATTC TGATTAGAAA AACTCATCGA GCATCAAATG AAACTGCAAT 3780TTATTCATAT CAGGATTATC AATACCATAT TTTTGAAAAA GCCGTTTCTG TAATGAAGGA 3840GAAAACTCAC CGAGGCAGTT CCATAGGATG GCAAGATCCT GGTATCGGTC TGCGATTCCG 3900ACTCGTCCAA CATCAATACA ACCTATTAAT TTCCCCTCGT CAAAAATAAG GTTATCAAGT 3960GAGAAATCAC CATGAGTGAC GACTGAATCC GGTGAGAATG GCAAAAGCTT ATGCATTTCT 4020TTCCAGACTT GTTCAACAGG CCAGCCATTA CGCTCGTCAT CAAAATCACT CGCATCAACC 4080AAACCGTTAT TCATTCGTGA TTGCGCCTGA GCGAGACGAA ATACGCGATC GCTGTTAAAA 4140GGACAATTAC AAACAGGAAT CGAATGCAAC CGGCGCAGGA ACACTGCCAG CGCATCAACA 4200ATATTTTCAC CTGAATCAGG ATATTCTTCT AATACCTGGA ATGCTGTTTT CCCGGGGATC 4260GCAGTGGTGA GTAACCATGC ATCATCAGGA GTACGGATAA AATGCTTGAT GGTCGGAAGA 4320GGCATAAATT CCGTCAGCCA GTTTAGTCTG ACCATCTCAT CTGTAACATC ATTGGCAACG 4380CTACCTTTGC CATGTTTCAG AAACAACTCT GGCGCATCGG GCTTCCCATA CAATCGATAG 4440ATTGTCGCAC CTGATTGCCC GACATTATCG CGAGCCCATT TATACCCATA TAAATCAGCA 4500TCCATGTTGG AATTTAATCG CGGCCTCGAG CAAGACGTTT CCCGTTGAAT ATGGCTCATA 4560ACACCCCTTG TATTACTGTT TATGTAAGCA GACAGTTTTA TTGTTCATGA TGATATATTT 4620TTATCTTGTG CAATGTAACA TCAGAGATTT TGAGACACAA CGTGGCTTTC CCCCCCCCCC 4680CATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT 4740TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC 4800TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC GAGGCCCTTT 4860CGTC 4864(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO15CCACATAGAT CTGTTCCATG GTTGTGGCAA TATTATCATC G 41(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO16GGTACAAGAT CTACCATGGC AGGAAGAAGC GGAGACAGC39(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO17CCACATAGAT CTGATATCGC ACTATTCTTT AGCTCCTGAC TCC 43(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO18GATCACCATG GATGCAATGA AGAGAGGGCT CTGCTGTGTG CTGCTGCTGT GTGGAGCAGT60CTTCGTTTCG CCCAGCGA 78(2)SEQ ID NO19的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO19GATCTCGCTG GGCGAAACGA AGACTGCTCC ACACAGCAGC AGCACACAGC AGAGCCCTCT60CTTCATTGCA TCCATGGT 78(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度52個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO20GGTACATGAT CAGATATCGC CCGGGCCGAG ATCTTCAGAC TTGGAGGAGG AG52(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO21CCACATTGAT CAGCTTGTGT AATTGTTAAT TTCTCTGTCC 40(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO22CCCCGGATCC TGATCACAGA AAAATTGTGG GTCACAGTC39(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO23CCCCAGGAAT CCACCTGTTA GCGCTTTTCT CTCTGCACCA CTCTTCTC 48(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO24GGTACATGAT CACAGAAAAA TTGTGGGTCA CAGTC 35(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度47個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO25CCACATTGAT CAGATATCTT ATCTTTTTTC TCTCTGCACC ACTCTTC 47(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO26GTCACCGTCC TCTATCAAAG CAGTAAGTAG TACATGCA 38(2)SEQ ID NO27的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO27TGTACTACTT ACTGCTTTGA TAGAGGACGG TGACTGCA38(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO28GGTACATGAT CAACCATGAG AGTGAAGGAG AAATATCAGC 40(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO29CCACATTGAT CAGATATCCC CATCTTATAG CAAAATCCTT TCC 43(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO30CCACATTGAT CAGATATCCC CATCTTATAG CAAAATCCTT TCC 43(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO31GGTACACTGC AGTCACCGTC CTATGGCAGG AAGAAGCGGA GAC 43(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO32CCACATCAGG TACCCCATAA TAGACTGTGA CC 32(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO33GGTACAAGAT CTACCATGGG ACCAGTACAA CAAATAGGTG GTAAC 45(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO34CCACATAGAT CTTTACATTA ATCTAGCCTT CTGTCCC 37(2)SEQ ID NO35的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO35GGTACAACCA TGGGTGGAGC TATTTCCATG AGG 33(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) 線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO36CCTAGGTTAG CCTTCTTCTA ACCTCTTCC 29(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO37GGTACAAGAT CTACCATGGG ATGTCTTGGG AATCAGC 37(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO38CCACATAGAT CTGATATCGT ATGAGTCTAC TGGAAATAAG AGG 43(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO39GGTACAGGAT CCACCATGGG TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GC 42(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO40CCACATGGAT CCGCCCGGGC TTACATCTCT GTACAAATTT CTACTAATGC50(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO41GGTACAGGAT CCCCGCACGG CAAGAGGCGA GGG 33(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) 線性(ii)分子類(lèi)型 cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO42GGTACAGGAT CCACCATGGC TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GC42(2)SEQ ID NO43的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO43CCACATGGAT CCGCCCGGGC CTTTATTGTG ACGAGGGGTC GTTGC 45(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO44GGTACAGGAT CCCCGCACGG CAAGAGGCGA GGG 33(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO45GGTACAGGAT CCACCATGGC TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GC42(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO46GTACCTCATG AGCCACATAA TACCATG 27(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO47GGTACAAGAT CTACCATGGC TTGCAATTGT CAGTTGATGC 40(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO 48CCACATAGAT CTCCATGGGA ACTAAAGGAA GACGGTCTGTTC 42(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO49GGTACAAGAT CTACCATGAA GGCAAACCTA CTGGTCCTG 39(2)SEQ ID NO50的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO50CCACATAGAT CTGATATCCT AATCTCAGAT GCATATTCTG CACTGC46(2)SEQ ID NO51的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO51Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn1 5 10 15(2)SEQ ID NO52的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO52GAAAGAGCAG AAGACAGTGG CAATGA 26(2)SEQ ID NO53的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA
(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO53GGGCTTTGCT AAATGGGTGG CAAGTGGCCC GGGCATGTGG40(2)SEQ ID NO54的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO54CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG23(2)SEQ ID NO55的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO55GGAGTGGCAC CTTCCAGG 18(2)SEQ ID NO56的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO56GGAGACAGCG ACGAAGACCT CCTCAAGGCA GTCAGACTCA TCAAG45(2)SEQ ID NO57的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度71個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO57GATGGCTGGC AACTAGAAGG CACAGCAGAT CTGATATCGC ACTATTCTTT AGCTCCTGAC60TCCAATATTG T 71(2)SEQ ID NO58的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度119個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO58CTTAGATCAA CCATGAGAGT GAAGGAGAAA TATCAGCACT TGTGGAGATG GGGGTGGAGA60TGGGGCACCA TGCTCCTTGG GATGTTGATG ATCTGTAGTG CTACAGAAAA ATTGTGGGT119(2)SEQ ID NO59的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO59CTGGCAACTA GAAGGCACAG CAGATCAGAT AGTGTCCCCA TCTTATAGCA AAATCCTTTC60CAAGCCCTGT CTTATTCT 78(2)SEQ ID NO60的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO60GATTTAGGTG ACACTATTAG 19(2)SEQ ID NO61的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO6120TAATACGACT CACTATAGGG(2)SEQ ID NO62的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO62CATGCCTGCA GGTCGACTCT AAATTCCG28(2)SEQ ID NO63的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO63ACCCGGGGAT CCTCTAGCGC GCTTGTCTCT TGTTCCA 37(2)SEQ ID NO64的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO6415GGGACGTGGT TTTCC(2)SEQ ID NO65的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度66個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO65TATGGCCACA ACCATGGCAG GAAGAAGCGG AGACAGCGAC GAAGACCTCC TCAAGGCAGT60CAGACT 66(2)SEQ ID NO66的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度90個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA
(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO66CTCGAGCCAT GGGCCCCTAG ACTATAGCGT GATAAGAAAT CGAGGACTGA GGTTATAACA60TCCTCTAAGG TGGTTATAAA CTCCCGAAGG 90(2)SEQ ID NO67的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO67GCTTCGGCCA GTAACG 16(2)SEQ ID NO68的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度87個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO68TTGCATGCCT GCAGGTGGTA CATGATCAGA TATCGCCCGG GCCGAGATCT TCAGACTTGG 60AGGAGGAGAT ATGAGGGACA ATTGGAG 87(2)SEQ ID NO69的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度79個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO69GGGGCGGAAT TTAGAGTCAA TTGATCAGCT TGTGTAATTTG TTAATTTCTC TGTCCCACTC60CATCCAGGTC GTGTGATTC 79(2)SEQ ID NO70的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO70CCATCTCCAC AAGTGCTG18(2)SEQ ID NO71的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度77個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)
(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO71AGATCTAAGG ACGGTGACTG CATGTACTAC TTACTGCTTT GATAGAGGAC GGTGACTGCA60GAAAAGACCC ATGGAAA 77(2)SEQ ID NO72的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO72GCTTCGGCCA GTAACG 16(2)SEQ ID NO73的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度62個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO73GGCACAGCAG ATCAGATGGG GATCTGATAT CGCACTATTC TTTAGCTCCT GACTCCTGAC60TC 62(2)SEQ ID NO74的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO74GGAATTTGAG TCATCCCCAT CTTATAGCAA AATCCTTTCC AA 42(2)SEQ ID NO75的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型 核酸(C)鏈型 兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO75CTTTAAGATCCC CGCACGGCAA GAGGCGAGGG GCGGCGACTG GT 42(2)SEQ ID NO76的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度70個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO76GGCACAGCAG ATCCGCCCGG GCTTACATCT CTGTACAAAT TTCTACTAAT GCTTTTATTT60TTCTTCTGTC 70(2)SEQ ID NO77的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度70個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO77CTTAGATCCA CCATGGGTGC GAGAGCGTCA GTATTAAGCG GGGGGAGAAT TAGATCGATG 60GGAAAAAATT 70(2)SEQ ID NO78的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度70個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO78GGCACAGCAG ATCCGCCCGG GCTTACATCT CTGTACAAAT TTCTACTAAT GCTTTTATTT60TTCTTCTGTC 70(2)SEQ ID NO79的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO79TCACCGTCCT TAGATCACCA TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT60GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCAGCGA GATCTGCTGT GCCTTCTAGT TGCCAGCC 118(2)SEQ ID NO80的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO80TTCGTTTCGC CCAGCGATCA CAGAAAAATT GTGGGTCACA GTC 43(2)SEQ ID NO81的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO81GGCACAGCAG ATCCACGTGT TAGCGCTTTT CTCTCTCCAC CAC43(2)SEQ ID NO82的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度80個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO82TCACCGTCCT TAGATCTACC ATGGGACCAG TACAACAAAT AGGTGGTAAC TATGTCCACC60TGCCATTAAG CCCGAGAACA80(2)SEQ ID NO83的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度44個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO83GGCACAGCAG ATCTTTACAT TAATCTAGCC TTCTGTCCCG GTCC 44(2)SEQ ID NO84的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度80個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO84TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGGG TGGAGCTATT TCCATGAGGC AATCCAAGCC 60GGCTGGAGAT CTGACAGAAA 80(2)SEQ ID NO85的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度85個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO85GGCACAGCAG ATCACCTAGG TTAGCCTTCT TCTAACCTCT TCCTCTGACA GGCCTGACTT60GCTTCCAACT CTTCTGGGTA TCTAG 85(2)SEQ ID NO86的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度90個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO86ACCGTCCTTA GATTCGACAT AGCAGAATAG GCGTTACTCG ACAGAGGAGA GCAAGAAATG60GAGCCAGTAG ATCCTAGACT AGAGCCCTGG 90(2)SEQ ID NO87的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO87GGCACAGCAG ATCCGAGATG CTGCTCCCAC CCCATCTGCT G41(2)SEQ ID NO88的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO88Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO89的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO89His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys1 510(2)SEQ ID NO90的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO90Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln Gly Xaa Tyr Arg Ala Ile Arg1 51015(2)SEQ ID NO91的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO91GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACG 33(2)SEQ ID NO92的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO92CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC 36(2)SEQ ID NO93的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO93GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC38(2)SEQ ID NO94的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO94CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC 37(2)SEQ ID NO95的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO95GGTACATGAT CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG 39(2)SEQ ID NO96的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO96CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGG 35(2)SEQ ID NO97的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO97GAGCCAATAT AAATGTAC 18(2)SEQ ID NO98的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO98CAATAGCAGG CATGC15(2)SEQ ID NO99的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO99GCAAGCAGCA GATTAC 16(2)SEQ ID NO100的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3547個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO100(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO100GATATTGGCT ATTGGCCATT GCATACGTTG TATCCATATC ATAATATGTA CATTTATATT60GGCTCATGTC CAACATTACC GCCATGTTGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA 120TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT TCCGCGTTAC ATAACTTACG 180GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC GACCCCCGCC CATTGACGTC AATAATGACG 240TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC GTCAATGGGT GGAGTATTTA 300CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATCATA TGCCAAGTAC GCCCCCTATT 360GACGTCAATG ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CATTATGCCC AGTACATGAC CTTATGGGAC 420TTTCCTACTT GGCAGTACAT CTACGTATTA GTCATCGCTA TTACCATGGT GATGCGGTTT 480TGGCAGTACA TCAATGGGCG TGGATAGCGG TTTGACTCAC GGGGATTTCC AAGTCTCCAC 540CCCATTGACG TCAATGGGAG TTTGTTTTGG CACCAAAATC AACGGGACTT TCCAAAATGT 600CGTAACAACT CCGCCCCATT GACGCAAATG GGCGGTAGGC GTGTACGGTG GGAGGTCTAT 660ATAAGCAGAG CTCGTTTAGT GAACCGTCAG ATCGCCTGGA GACGCCATCC ACGCTGTTTT 720GACCTCCATA GAAGACACCG GGACCGATCC AGCCTCCGCG GCCGGGAACG GTGCATTGGA 780ACGCGGATTC CCCGTGCCAA GAGTGACGTA AGTACCGCCT ATAGAGTCTA TAGGCCCACC 840CCCTTGGCTT CTTATGCATG CTATACTGTT TTTGGCTTGG GGTCTATACA CCCCCGCTTC 900CTCATGTTAT AGGTGATGGT ATAGCTTAGC CTATAGGTGT GGGTTATTGA CCATTATTGA 960CCACTCCCCT ATTGGTGACG ATACTTTCCA TTACTAATCC ATAACATGGC TCTTTGCCAC1020AACTCTCTTT ATTGGCTATA TGCCAATACA CTGTCCTTCA GAGACTGACA CGGACTCTGT1080ATTTTTACAG GATGGGGTCT CATTTATTAT TTACAAATTC ACATATACAA CACCACCGTC1140CCCAGTGCCC GCAGTTTTTA TTAAACATAA CGTGGGATCT CCACGCGAAT CTCGGGTACG1200TGTTCCGGAC ATGGGCTCTT CTCCGGTAGC GGCGGAGCTT CTACATCCGA GCCCTGCTCC1260CATGCCTCCA GCGACTCATG GTCGCTCGGC AGCTCCTTGC TCCTAACAGT GGAGGCCAGA1320CTTAGGCACA GCACGATGCC CACCACCACC AGTGTGCCGC ACAAGGCCGT GGCGGTAGGG1380TATGTGTCTG AAAATGAGCT CGGGGAGCGG GCTTGCACCG CTGACGCATT TGGAAGACTT1440AAGGCAGCGG CAGAAGAAGA TGCAGGCAGC TGAGTTGTTG TGTTCTGATA AGAGTCAGAG1500GTAACTCCCG TTGCGGTGCT GTTAACGGTG GAGGGCAGTG TAGTCTGAGC AGTACTCGTT1560GCTGCCGCGC GCGCCACCAG ACATAATAGC TGACAGACTA ACAGACTGTT CCTTTCCATG1620GGTCTTTTCT GCAGTCACCG TCCTTAGATC TGCTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT1680TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC1740CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG1800TGGGGTGGGG CAGCACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA1860TGCGGTGGGC TCTATGGGTA CGGCCGCAGC GGCCGTACCC AGGTGCTGAA GAATTGACCC1920GGTTCCTCGA CCCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT TCCATAGGCT CCGCCCCCCT1980GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA2040AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG2100CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCAATGCTCA2160CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA2220CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG2280GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG2340TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG2400ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC 2460TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG 2520ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GTGATCCCGT 2580AATGCTCTGC CAGTGTTACA ACCAATTAAC CAATTCTGAT TAGAAAAACT CATCGAGCAT 2640CAAATGAAAC TGCAATTTAT TCATATCAGG ATTATCAATA CCATATTTTT GAAAAAGCCG 2700TTTCTGTAAT GAAGGAGAAA ACTCACCGAG GCAGTTCCAT AGGATGGCAA GATCCTGGTA 2760TCGGTCTGCG ATTCCGACTC GTCCAACATC AATACAACCT ATTAATTTCC CCTCGTCAAA 2820AATAAGGTTA TCAAGTGAGA AATCACCATG AGTGACGACT GAATCCGGTG AGAATGGCAA 2880AAGCTTATGC ATTTCTTTCC AGACTTGTTC AACAGGCCAG CCATTACGCT CGTCATCAAA 2940ATCACTCGCA TCAACCAAAC CGTTATTCAT TCGTGATTGC GCCTGAGCGA GACGAAATAC 3000GCGATCGCTG TTAAAAGGAC AATTACAAAC AGGAATCGAA TGCAACCGGC GCAGGAACAC 3060TGCCAGCGCA TCAACAATAT TTTCACCTGA ATCAGGATAT TCTTCTAATA CCTGGAATGC 3120TGTTTTCCCG GGGATCGCAG TGGTGAGTAA CCATGCATCA TCAGGAGTAC GGATAAAATG 3180CTTGATGGTC GGAAGAGGCA TAAATTCCGT CAGCCAGTTT AGTCTGACCA TCTCATCTGT 3240AACATCATTG GCAACGCTAC CTTTGCCATG TTTCAGAAAC AACTCTGGCG CATCGGGCTT 3300CCCATACAAT CGATAGATTG TCGCACCTGA TTGCCCGACA TTATCGCGAG CCCATTTATA 3360CCCATATAAA TCAGCATCCA TGTTGGAATT TAATCGCGGC CTCGAGCAAG ACGTTTCCCG 3420TTGAATATGG CTCATAACAC CCCTTGTATT ACTGTTTATG TAAGCAGACA GTTTTATTGT 3480TCATGATGAT ATATTTTTAT CTTGTGCAAT GTAACATCAG AGATTTTGAG ACACAACGTG 3540GCTTTCC 354權(quán)利要求
1.在導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中至少兩個(gè)基因產(chǎn)物的共表達(dá)的多核苷酸，其含有在真核細(xì)胞中第一順?lè)醋由嫌尾⒃诘谝豁樂(lè)醋愚D(zhuǎn)錄控制下操作的第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；在第一順?lè)醋酉掠蔚牡诙樂(lè)醋樱湮挥诘谝晦D(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下；可任選的在第二順?lè)醋酉掠蔚牡谌樂(lè)醋?，其位于第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或第三轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下；和在第一，第二和第三順?lè)醋用恳粋€(gè)之后的轉(zhuǎn)錄終止子。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述第一順?lè)醋泳幋a病原體或癌相關(guān)抗原的至少一個(gè)致免疫表位。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述病原體是病毒。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，其中所述病毒是人免疫缺損病毒(HIV)。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述第一順?lè)醋泳幋a選自env，gag，gag/pol，gag/蛋白酶，不編碼功能性聚合酶的gag和部分pol，以及pol的人免疫缺損病毒(HIV)基因。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中如果所述第一順?lè)醋泳幋aHIV基因，所述第二順?lè)醋泳途幋a人免疫缺損病毒(HIV)REV基因，其有效表達(dá)依賴于表達(dá)HIV基因的細(xì)胞內(nèi)REV基因產(chǎn)物的存在。
7.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述第一順?lè)醋泳幋a選自env，gag和pol的HIV晚期基因。
8.權(quán)利要求7的多核苷酸，其中所述第一順?lè)醋泳幋aHIV gp160，HIV gp120，HIV gp41，沒(méi)有CD4結(jié)合位點(diǎn)的HIV gp120和帶有免疫學(xué)改變的V3的HIVenv，改變的V3具有改變的糖基化模式或取代的V3環(huán)頂。
9.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述第三順?lè)醋泳幋a細(xì)胞因子或T細(xì)胞共刺激元件。
10.權(quán)利要求9的多核苷酸，其中所述細(xì)胞因子是干擾素，GM-CSF或白細(xì)胞介素。
11.權(quán)利要求9的多核苷酸，其中所述T細(xì)胞共刺激元件是編碼B7蛋白質(zhì)的基因。
12.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述第一順?lè)醋泳幋aREV非依賴性的人免疫缺損(HIV)表位，所述第二順?lè)醋泳幋a細(xì)胞因子，所述第三順?lè)醋泳幋aT細(xì)胞共刺激元件，其中所述各順?lè)醋右部梢砸圆煌捻樞虼嬖凇?br> 13.權(quán)利要求12的多核苷酸，其中所述第二順?lè)醋泳幋a白細(xì)胞介素，干擾素或GM-CSF，而第三順?lè)醋泳幋aB7蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中第二順?lè)醋雍偷谌樂(lè)醋佣咧皇芪挥诘谝豁樂(lè)醋由嫌蔚霓D(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制，在第二和第三順?lè)醋用恳粋€(gè)的上游提供具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)功能的序列，以有效地完成第二和第三順?lè)醋釉陔p或三順?lè)醋有攀筊NA上的翻譯，所述信使RNA是從第一順?lè)醋拥拈_(kāi)始，經(jīng)過(guò)第二和第三順?lè)醋拥拿恳粋€(gè)，直到第二和第三順?lè)醋又蟮霓D(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄的。
15.權(quán)利要求14的多核苷酸，其中所述IRES選自腦心肌炎病毒(EMCV)IRES，豬水痘病毒IRES和脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES。
16.權(quán)利要求14的多核苷酸，其中所述第一順?lè)醋泳幋a人免疫缺損病毒(HIV)REV依賴性基因，所述第二順?lè)醋泳幋aREV，所述第三順?lè)醋泳幋aT細(xì)胞共刺激元件或細(xì)胞因子，此外，其中所述第一順?lè)醋又坝幸晦D(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，所述第二和第三順?lè)醋又熬幸籌RES，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
17.權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述第一順?lè)醋泳幋aHIVgp160，第一順?lè)醋又坝幸患?xì)胞肥大病毒的速發(fā)早期啟動(dòng)子，所述第二順?lè)醋泳幋aHIV REV，可選用的第三順?lè)醋泳幋a干擾素，GM-CSF，白細(xì)胞介素或B7蛋白質(zhì)。
18.一種多核苷酸，其含有不能在真核細(xì)胞中復(fù)制，但在將所述多核苷酸導(dǎo)入到真核組織后，能夠體內(nèi)表達(dá)以生產(chǎn)基因產(chǎn)物的相鄰核酸序列，其中所述基因產(chǎn)物作為一種免疫刺激劑或作為能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原，其中所述核酸序列編碼剪接的REV基因；剪接的人免疫缺損病毒(HIV)致免疫表位；和可選的細(xì)胞因子或T細(xì)胞識(shí)別元件。
19.權(quán)利要求18的多核苷酸，其中所述HIV致免疫表位選自gag，gag-蛋白酶或env或其致免疫亞單位；所述細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素-12，而T細(xì)胞共刺激元件是B7蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求19的多核苷酸，其中所述env致免疫表位選自HIVgp160，HIVgp120和HIVgp41。
21.權(quán)利要求19的多核苷酸，其中所述gag致免疫表位是p17，p24或p15。
22.一種多核苷酸，其含有編碼HIVgag，gag-蛋白酶或env致免疫表位的第一基因，含REV應(yīng)答元件(RRE)或已經(jīng)被修飾而含一RRE的基因，與適于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可操作相連的基因，與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)相連的基因和與編碼REV基因產(chǎn)物的基因相連的IRES。
23.多核苷酸構(gòu)建體a)V1Jns-revIIIB，它具有接口序列 SEQ.ID565′-GGA GAC AGC GACGAA GAC CTC CTC AAG GCA GTC AGA CTC ATC AAG-3′， 和SEQ.ID575′-GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT CT/GAT ATC GCA CTABGHrev...TTC TTT AGC TCC TGA CTC CAA TAT TGT-3′b)V1Jns-gp160IIIB，它具有接口序列 SEQ.ID585′-CTT AGA TC/A ACC ATG AGA GTG AAG GA GAA ATA TCA GCA CTT GTGCMVinta gp160GAG ATG GGG GTG GAG ATG GGG CAC CAT GCT CCT TGG GAT GTT GAT GATCTG TAG TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT-3′，和SEQ.ID595′-CTG GCA ACT AGA AGG CAC AGC AGA TC/A GAT AGT GTC CCC ATC TTABGH gp160TAG CAA AAT CCT TTC CAA GCC CTG TCT TAT TCT-3′c)pGEM-3-IRES，它具有接口序列 SEQ.ID625′-CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA/AAT TCC G…pGEM-3(SP6) IRES和SEQ.ID635′-A CCC GGG GAT CCT CT/A GCG CGC TTG TCT CTT GTT CCA…pGEM-3(T7) IRESd)pGEM-3-IRES/revIIIB，它具有接口序列 SEQ.ID655′-TAT GGC CAC AAC C/AT GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGAIRES revCCT CCT CAA GGC AGT CAG ACT-3′和SEQ.ID665′-CTC GAG CCA TGG GCC CCT/AGA CTA TAG CGT GAT AAG AAA TCG AGGpGEM-3 revACT GAG GTT ATA ACA TCC TCT AAG GTG GTT ATA AAC TCC CGA AGG-3′e)pGEM-3-RRE/IRES/revIIIB，它具有接口序列 SEQ.ID685′-TTG CAT GCC TGC AGG T/GGT ACA TGA TCA GAT ATC G CCC GGG/CpGEM-3 RRECGA GAT CTT CAG ACT TGG AGG AGG AGA TAT GAG GGA CAA TTG GAG-3′IRES-5′和SEQ.ID695′-GGG GCG GAA TT/T AGA GTC A/ATT GAT CAG CTT GTG TAA TTG TTARRE-3′ATT TCT CTG TCC CAC TCC ATC CAG GTC GTG TGA TTC...-3′f)V1Jns-(tat/rev SD)，它具有接口序列 SEQ.ID715′-AGA TCT A AGG ACG GTG ACT GCA/TGT ACT ACT TAC TGC TTT GATCMVintA tat/rev SDAGA GGA CGG TGA/CTG CAG AAA AGA CCC ATG GAA A-3′CMVintAg)V1Jns-gp160IIIB/IRES/revIIIB(SD)，它具有接口序列SEQ.ID735′-GGC ACA GCA GAT C/AG ATG GGG ATC TGA TA TCG CAC TAT TCT TTABGH revGCT CCT GAC TCC TGA CTC-3′和SEQ.ID745′-GGA ATT/TGA GTC ATC/CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC CAA-3′IRESgp160h)V1Jns-gag-prtIIIB(SD)，它具有接口序列 SEQ.ID755′-CTT AGA TC/C CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG GCG GCG ACT GGT-3′CMVintA gag(SD)和SEQ.ID765′-GGC ACA GCA GAT C/CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TACBGH prtTAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC…-3′1)V1Jns-gag-prtIIIB，它具有接口序列 SEQ.ID775′-CTT AGA TC/CAC CAT GGG TGC GAG AGC GTC AGT ATT AA GCG GGGCMVintA gagGGA GAA TTA GAT CGA TGG GAA AAA ATT…-3′和SEQ.ID785′-GGC ACA GCA GAT C/CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TACBGH prtTAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC…-3′j)V1Jns-tPA，它具有接口序列 SEQ.ID795′-TCA CCG TCC TTA GAT C/ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGCCMVintA tPA leaderTGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA/G ATCBGHTGC TGT GCC TTC TAG TTG CCA GCC-3′k)V1Jns-tPA-gp120MN，它具有接口序列 SEQ.ID805′-TTC GTT TCG CCC AGC GA/TCA CAG AAA AAT TGT GGG TCA CAG TC-3′tPAgp120MN和SEQ.ID815′-GGC ACA GCA GAT C/CAC GTG TTA GCG CTT TTC TCT CTC CAC CAC-3′BGH gp120MNl)V1J-SIVMAC251p28gag，它具有接口序列 SEQ.ID825′-TCA CCG TCC TTA GAT CT/ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGTCMVintA p28gag…GGT AAC TAT GTC CAC CTG CCA TTA AGC CCG AGA ACA-3′和SEQ.ID835′-GGC ACA GCA GAT CT/TTA CAT TAA TCT AGC CTT CTG TCC CGG TCC-3′BGH p28gagm)V1J-SIVMAC251nef，它具有接口序列 SEQ.ID845′-TCA CCG TCC TTA GAT C/GGT ACA ACC ATG GGT GGA GCT ATT TCC ATGCMVintA nef…AGG CAA TCC AAG CCG GCT GGA GAT CTG ACA GAA A-3′和SEQ.ID855′-GGC ACA GCA GAT CA/C CTA GGT TAG CCT TCT TCT AAC CTC TTC CTCBGH nef…TGA CAG GCC TGA CTT GCT TCC AAC TCT TCT GGG TAT CTA G-3′n)V1Jns-tat/rev/env它具有接口序列 SEQ.ID865′-ACC GTC CTT AGA T/TC GAC ATA GCA GAA TAG GCG TTA CTC GAC AGACMVintA tat/rev/envGGA GAG CAA GAA ATG GAG CCA GTA GAT CCT AGA CTA GAG CCC TGG-3′和SEQ.ID875′-GGC ACA GCA GAT C/C GAG ATG CTG CTC CCA CCC CAT CTG CTG-3′.BGH tat/rev/env
24.一種多核苷酸，在將其導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物組織，包括人組織后，它誘導(dǎo)體內(nèi)抗HIV中和抗體，HIV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，或保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中，所述多核苷酸含有編碼選自HIVgag，HIVgag-蛋白酶和HIV env之基因產(chǎn)物的基因，含REV反應(yīng)元件(RRE)的基因，與適于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可操作相連的基因，與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)相連的基因和與第二基因相連的IRES，編碼REV基因產(chǎn)物的第二基因。
25.在單細(xì)胞中共表達(dá)至少兩個(gè)基因產(chǎn)物的體內(nèi)方法，其包括將約1ng-100mg權(quán)利要求1的多核苷酸導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物組織中。
26.在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)抗HIV表位的免疫應(yīng)答的方法，其包括將約1ng-100mg權(quán)利要求6的多核苷酸導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物組織中。
27.在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)抗HIV表位的免疫應(yīng)答的方法，其包括將約1ng-100mg權(quán)利要求14的多核苷酸導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物組織中。
28.用REV依賴性HIV基因誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，其包括a)分離REV依賴性的HIV基因；b)將分離的基因與調(diào)節(jié)序列相連以便在導(dǎo)入到活組織中后，依靠與控制序列有效地相連而使所述基因可被表達(dá)，所述控制序列指導(dǎo)所述基因的轉(zhuǎn)錄起始和隨后的翻譯；c)將可表達(dá)的基因?qū)氲交罱M織中；和d)將編碼HIV REV的基因以反式或順式導(dǎo)入到HIV REV依賴性基因。
29.權(quán)利要求28的方法，其還包括用另外的可表達(dá)HIV基因加強(qiáng)或用重組純化的HIV基因產(chǎn)物加強(qiáng)。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述REV依賴性HIV基因編碼gag或env基因產(chǎn)物。
31.用HIV毒株誘導(dǎo)抗感染或疾病的免疫反應(yīng)的方法，其包括將來(lái)自第一HIV毒株的HIV基因?qū)氲郊棺祫?dòng)物組織中，以便所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中和第一HIV毒株感染，而且中和由與第一毒株異源的毒株引起的感染，其中所述HIV基因編碼保守的REV依賴性HIV表位，以順式或反式提供功能性REV。
32.誘導(dǎo)抗HIV感染的免疫應(yīng)答的疫苗，其含有權(quán)利要求1的多核苷酸和藥物學(xué)可接受的載體。
33.在靈長(zhǎng)類(lèi)中誘導(dǎo)抗HIV免疫應(yīng)答的方法，包括將權(quán)利要求1中的多核苷酸導(dǎo)入到靈長(zhǎng)類(lèi)的組織中，同時(shí)不經(jīng)腸施用白細(xì)胞介素12。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述多核苷酸的第一順?lè)醋泳幋aHIVgp160，所述多核苷酸的第二順?lè)醋泳幋aHIV REV，所述多核苷酸的第三順?lè)醋泳幋aB7。
35.一種多核苷酸，其含有a)真核轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；b)接在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子3’方向的編碼致免疫HIV表位的開(kāi)放閱讀框架，其中所述開(kāi)放閱讀框架在開(kāi)放閱讀框架5’側(cè)有一剪接供體序列，在開(kāi)放閱讀框架的任何位置的REV反應(yīng)元件和編碼開(kāi)放閱讀框架翻譯終止的終止密碼子；c)在所述開(kāi)放閱讀框架翻譯終止密碼子3’方向的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)；d)編碼剪接的HIV REV基因的開(kāi)放閱讀框架，其3’端是翻譯終止密碼子；e)可選的，在REV翻譯終止密碼子的3’方向，有一第二IRES，其后有編碼免疫調(diào)節(jié)或免疫刺激基因的開(kāi)放閱讀框架，所述基因選自GM-CSF，IL-12，干擾素和B7蛋白質(zhì)的基因；f)在最后的開(kāi)放閱讀框架后有一轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
36.誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞以刺激細(xì)胞毒和T輔助細(xì)胞增殖效應(yīng)物功能的方法，所述功能包括分泌HIV抗原特異性的淋巴因子，所述方法包括a)在體內(nèi)將脊椎動(dòng)物細(xì)胞暴露于多核苷酸，所述多核苷酸含有編碼抗原性HIV表位的序列，可選地為HIV REV的序列，和編碼B7蛋白質(zhì)的序列。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述HIV表位選自env，gag和pol。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述多核苷酸編碼在各HIV表位，REV和B7蛋白質(zhì)之間的IRES。
39.一種多核苷酸，其含有編碼如下元件的序列a)真核轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)；b)HIV基因開(kāi)放閱讀框架(ORF)，其前有一異源前導(dǎo)序列以使所述HIV基因ORF的表達(dá)不依賴于HIV REV基因產(chǎn)物的存在；c)在HIV ORF翻譯終止密碼子3’方向，作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的序列；d)在IRES的3’方向編碼T細(xì)胞共刺激元件的ORF序列；和e)在T細(xì)胞共刺激元件翻譯終止密碼子3’方向的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
40.權(quán)利要求39的多核苷酸，其中在(b)中的所述HIV基因ORF是tPAgp120或tPAgp160。
41.一種多核苷酸，其含有編碼如下元件的序列a)真核轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)；b)HIV基因開(kāi)放閱讀框架(ORF)，其前有一異源前導(dǎo)序列以使所述HIV基因ORF的表達(dá)不依賴于HIV REV基因產(chǎn)物的存在；c)在HIV ORF翻譯終止密碼子3’方向，作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的序列；d)HIV基因開(kāi)放閱讀框架(ORF)，其前有一異源前導(dǎo)序列以使所述HIV基因ORF的表達(dá)不依賴于HIV REV基因產(chǎn)物的存在；和e)在HIV基因ORF翻譯終止密碼子3’方向的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
42.含有多表達(dá)構(gòu)建體的組合物，所述多表達(dá)構(gòu)建體分別均能夠在哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)一個(gè)以上順?lè)醋拥谋磉_(dá)，所述順?lè)醋泳幋a與致病的病原體或腫瘤相關(guān)的抗原。
43.免疫宿主脊椎動(dòng)物的方法，其包括以下步驟將編碼至少第一和第二肽或多肽的非感染的、非整合的多核苷酸與宿主組織直接接觸而導(dǎo)入，當(dāng)所述第一和第二肽或多肽在所述宿主中作為翻譯產(chǎn)物而生產(chǎn)時(shí)，它們之中每一個(gè)都是致免疫或免疫調(diào)節(jié)的，其中所述第一肽或多肽由位于第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的操縱控制下的多核苷酸的片段編碼，而第二肽或多肽由位于第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子操縱控制下的多核苷酸的片段編碼，在編碼第一肽或多肽的多核苷酸片段與編碼第二肽或多肽的多核苷酸片段之間未提供轉(zhuǎn)錄終止子，或第二肽或多肽由位于第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子操縱控制下的多核苷酸片段編碼，此時(shí)在編碼第一肽或多肽的多核苷酸片段與編碼第二肽或多肽的多核苷酸片段之間提供轉(zhuǎn)錄終止子，由此，第一和第二肽或多肽均在所述宿主的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，從而導(dǎo)致免疫作用。
44.含有附圖2所示元件的多核苷酸構(gòu)建體，其中在圖中所示的第一，第二和第三順?lè)醋泳幋a下列物質(zhì)任何兩個(gè)或三個(gè)的組合1)tPA-gp120MN；2)gp160IIIB/IRES/REVIIIB；3)gp160IIIB；4)REVIIIB；5)tat/REV/gp160；6)REV/gp160；7)gp160MN；8)來(lái)自臨床相關(guān)的初級(jí)HIV分離物的gp160；9)nef，用來(lái)自臨床相關(guān)毒株的基因；10)gagIIIB；11)tPA-gp120IIIB；12)gp160，其帶有以下結(jié)構(gòu)突變來(lái)自臨床相關(guān)HIV毒株的V3環(huán)取代；在數(shù)個(gè)構(gòu)建體上進(jìn)行數(shù)個(gè)突變，如可變環(huán)的除去，Asn突變以除去立體碳水化合物結(jié)構(gòu)位阻，中和抗體表位；CD4結(jié)合位點(diǎn)分離(knockout)突變；13)帶有適當(dāng)前導(dǎo)序列的gp41，象tPA信號(hào)肽中的前導(dǎo)序列一樣；14)gag與上述#5構(gòu)建體相似，用來(lái)自臨床相關(guān)毒株的基因；15)rev用于gp160和gag雙順?lè)醋樱?6)B7編碼序列；17)GM-CSF序列；18)白細(xì)胞介素序列；19)腫瘤相關(guān)的抗原；20)編碼除HIV以外的病原體表達(dá)的抗原的基因，所述基因如，但不限于，流感病毒核蛋白，血細(xì)胞凝集素，基質(zhì)，神經(jīng)氨酸酶和其他抗原蛋白質(zhì)的基因；單純性皰疹病毒基因；人乳頭瘤病毒基因；結(jié)核病抗原基因；甲，乙或丙型肝炎病毒基因；和這些以及其他抗原的基因的組合以至少形成雙順?lè)醋訕?gòu)建體，所述雙順?lè)醋訕?gòu)建體可與多種其他多順?lè)醋訕?gòu)建體組合以提供能夠產(chǎn)生抗所有遞呈的病原體或腫瘤抗原的免疫反應(yīng)的混合液組合物；其中附圖2中的A和B是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或終止上游順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列和啟始下游順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列的組合。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了包括DNA構(gòu)建體和RNA轉(zhuǎn)錄本的核酸，在導(dǎo)入到動(dòng)物組織中后，它們能夠誘導(dǎo)兩到三個(gè)順?lè)醋拥膮f(xié)調(diào)表達(dá)。本發(fā)明的2-或3-順?lè)醋佣嗪塑账岚ň幋a并共表達(dá)HIV基因產(chǎn)物的多核苷酸，編碼與HIV無(wú)關(guān)的抗原的基因免疫刺激基因產(chǎn)物，所述免疫刺激基因產(chǎn)物包括但不限于GM-CSF，白細(xì)胞介素，干擾素和作為T(mén)-細(xì)胞共刺激因子的蛋白質(zhì)B7族的成員。本發(fā)明方法和多核苷酸通常可用于在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)任何兩個(gè)或多個(gè)基因的體內(nèi)表達(dá)。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1147834SQ95192953
公開(kāi)日1997年4月16日 申請(qǐng)日期1995年3月3日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月7日
發(fā)明者M·A·劉, J·W·西弗, H·C·佩里 申請(qǐng)人:麥克公司