專利名稱：用作間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞標(biāo)記物的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的方法，它是通過鑒別在細(xì)胞表面上有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(fibroblast growth factor receptor3，F(xiàn)GFR3)為特征的細(xì)胞而加以鑒定的。
本發(fā)明還涉及通過采用FGFR3-結(jié)合劑而獲得間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及基本上為純間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的培養(yǎng)物，以及含有該間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的藥物組合物和植人物。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒定軟骨-骨瘤(cartilage-bony tumor)的方法，以及治療軟骨-骨瘤的藥物組合物。
背景技術(shù)：
骨骼生長(zhǎng)既依賴于組織細(xì)胞組份-軟骨細(xì)胞和長(zhǎng)骨的軟骨生長(zhǎng)中心的細(xì)胞膜受體二者發(fā)揮正常的功能，還依賴于循環(huán)的和局部的激素及生長(zhǎng)因子的常態(tài)和濃度水平。因此，生長(zhǎng)失調(diào)被劃分為截然不同的兩類(a)循環(huán)因子的失調(diào)，和(b)靶軟骨組織的失調(diào)。
正常的分化過程是從間充質(zhì)干細(xì)胞開始的，這些干細(xì)胞分化成骨骼祖細(xì)胞，后者或者分化成前軟骨干細(xì)胞(它最終形成軟骨)，或者分化成前成骨干細(xì)胞(它最終形成骨頭)。
要追蹤間充質(zhì)干細(xì)胞支持的生長(zhǎng)以及它們?cè)谡Ｈ撕突忌L(zhǎng)疾病的家族中的遷移情況是有難度的，其中包括缺少用于這些特異間充質(zhì)干細(xì)胞的合適標(biāo)記物。例如，已有零星的和不完整的、關(guān)于生長(zhǎng)板干細(xì)胞的最初位置和遷移路徑的信息，它支持縱向的和橫向的生長(zhǎng)。在一百多年來長(zhǎng)期爭(zhēng)論的問題即“Ranvier對(duì)La Cro2ix之爭(zhēng)”仍然懸而未決。1889年，Ranvier聲稱“形成骨膜骨的細(xì)胞來自生長(zhǎng)板的細(xì)胞”，而1951年LaCroix宣稱“并置式(appositional)生長(zhǎng)由軟骨膜外周的細(xì)胞造成”。Ranvier的理論在70年代早期得到了 Rigal，Hert，J.(Acta Anat(Bazel)82420-436(1972))和其他學(xué)者的支持，而在90年代得到了Langenskiold等人(Acta.Orthop.Scand.，64683-687(1993))的支持，他們表明來自胚層的細(xì)胞遷移到骨溝的邊界處，作為縱向和橫向骨生長(zhǎng)的源頭。
然而，對(duì)各種類型的軟骨細(xì)胞和影響間充質(zhì)分化的因子的充分了解卻受到了阻礙，因?yàn)椴荒艽_定這些細(xì)胞的初級(jí)儲(chǔ)存體的最初位置，因而受到了體外細(xì)胞培養(yǎng)的限制。一個(gè)困難是缺少特異性的表型標(biāo)記物來跟蹤相繼的分化事件。II型膠原的分泌被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞分化主要的早期標(biāo)記，而堿性磷酸酶的合成是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)記。成熟的成骨細(xì)胞也產(chǎn)生骨橋蛋白、骨粘連蛋白和骨鈣蛋白，這3種細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白與I型膠原一起沉積在礦化的骨基質(zhì)上。不幸的是，僅鑒別出少量的分化標(biāo)記物，而且其中某些標(biāo)記物如堿性磷酸酶、骨橋蛋白和骨粘連蛋白等對(duì)于成骨分化并不特異，而且另一些標(biāo)記物如骨鈣蛋白很少在體外表達(dá)。此外，間充質(zhì)細(xì)胞系和分化的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的初級(jí)培養(yǎng)物，會(huì)表現(xiàn)出不同的表型而且常常是處于不同分化階段的各種細(xì)胞類型的混合物(Eriebacher，A.等人，細(xì)胞(Cell)80371-378，(1995)；Yamaguchi，T.P.和Rossant，J.，Currentopinion in Genetics and Development 5485-491(1995))。
因此，特別需要開發(fā)一種能夠精確地確定對(duì)縱向和橫向生長(zhǎng)以及骨修復(fù)有支持和貢獻(xiàn)的干細(xì)胞位置和來源的標(biāo)記物，以便可以更好地了解正常狀態(tài)和病理狀態(tài)下間充質(zhì)發(fā)育的機(jī)制，以及獲得有治療用途的基本純的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞培養(yǎng)物。
發(fā)明概述本發(fā)明基于一個(gè)出人意料的發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)可作為間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的標(biāo)記物。本發(fā)明還基于這樣一個(gè)出人意料的發(fā)現(xiàn)，即間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的解剖位置是在La Croix溝的軟骨膜中。
在下文中用術(shù)語“間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞”表示下列類型的細(xì)胞(a)能夠分化成骨骼祖細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞，(b)骨骼祖細(xì)胞，(c)前軟骨干細(xì)胞，和(d)前成骨干細(xì)胞，或2種或多種上述細(xì)胞類型的混合物。間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞都具有對(duì)骨和/或軟骨的生長(zhǎng)作出貢獻(xiàn)的特性，與其他類型的軟骨或骨衍生細(xì)胞相比顯示出增強(qiáng)的增殖性，而且在適當(dāng)?shù)内吇瘎┤绯衫w維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9存在下還會(huì)有遷移的傾向。
這些間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞，在胚胎和新生兒早期，支持關(guān)節(jié)軟骨和長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部生長(zhǎng)板軟骨的生長(zhǎng)。然而，在一生中很早的時(shí)候(出生后幾個(gè)月)，這些干細(xì)胞與關(guān)節(jié)區(qū)域的聯(lián)系便沒有了，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的自我損傷愈合性差。這些間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞繼續(xù)維持長(zhǎng)骨縱向和緯向(橫向)生長(zhǎng)的細(xì)胞來源，直至長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部關(guān)閉(在18-22歲時(shí))，而且繼續(xù)提供骨膜的干細(xì)胞儲(chǔ)藏庫(與整個(gè)一生的骨折骨痂有關(guān))。在成年人中，尤其是在高齡中，跟蹤未分化的、可能形成增殖的軟骨細(xì)胞的細(xì)胞源的技術(shù)早先已經(jīng)失敗，因?yàn)檫@種細(xì)胞源的稀少而且不能勝任作為這種未分化細(xì)胞的標(biāo)記物。
通過使用作為本發(fā)明基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)，即FGFR3是間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的標(biāo)記物，有可能開發(fā)出鑒定間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的方法，就是通過鑒定表面上存在FGFR3這一特征的細(xì)胞。這一方法對(duì)于追蹤間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞至關(guān)重要，比如為了更好地了解與FGFR3受體有關(guān)的生長(zhǎng)停止的病理狀況，例如導(dǎo)致遺傳性侏儒-軟骨發(fā)育不全癥、在多發(fā)性遺傳外生骨疣中持續(xù)表達(dá)，和在原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎骨贅中的再表達(dá)。
因此，本發(fā)明提供了一種鑒定間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的方法，它包括(a)在會(huì)發(fā)生配體-受體結(jié)合的條件下，將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)結(jié)合劑施用于被分析的細(xì)胞或組織上；(b)確定那些細(xì)胞與該FGFR3結(jié)合劑發(fā)生了結(jié)合，該細(xì)胞就是間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞。
FGFR3結(jié)合劑可以是抗體或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(FGF9)，它應(yīng)被標(biāo)記然后施用于被分析的組織，例如施用于關(guān)節(jié)組織。被標(biāo)記的那些區(qū)域可作為間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞來源。
較佳地，間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的來源是La Croix區(qū)域中的軟骨膜，而且該區(qū)域與滑膜和骨膜接觸。
本發(fā)明方法可出于各種目的，用于在不同組織中(如關(guān)節(jié)中)，鑒別和確定間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的位置，例如為了獲得間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的培養(yǎng)物，在體外使它們繼續(xù)增殖然后再返回體內(nèi)以刺激軟骨和骨頭的生長(zhǎng)?；蛘?，鑒定出這些細(xì)胞便可以將它們從組織部位中去除，以便消除這些干細(xì)胞在各種疾病和失調(diào)(這些病的特征是未分化的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞過度活躍)中的過度活躍。此外，通過確定攜帶FGFR3的細(xì)胞的區(qū)域，可以在原位對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行操作，如通過向這些細(xì)胞的精確位置處施用各種調(diào)節(jié)劑。這樣的試劑可以是穩(wěn)定FGFR3從而維持這些細(xì)胞更長(zhǎng)時(shí)間地處于未分化的增殖狀態(tài)的試劑，一個(gè)例子是FGF9?；蛘?，這樣的試劑可以是使攜帶FGFR3的細(xì)胞提早分化，一個(gè)例子是FGF9拮抗劑。
通過利用FGFR3是間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的標(biāo)記物這一事實(shí)，可以第一次從非胚胎材料獲得基本純的這些細(xì)胞的培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明方法，通過將FGFR3用作標(biāo)記物，已發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞被定位于生長(zhǎng)板外周的軟骨膜環(huán)(La Croix區(qū)域)中。在一生后期關(guān)節(jié)軟骨的自我損傷愈合性差可以下列原因?yàn)榛A(chǔ)進(jìn)行解釋在生長(zhǎng)停止時(shí)，這些關(guān)節(jié)區(qū)便與其潛在的、位于軟骨膜La Croix區(qū)域的干細(xì)胞來源失去了聯(lián)系。
因此，本發(fā)明不僅能夠確定間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的位置，而且還能第一次獲得這些細(xì)胞基本純的大量培養(yǎng)物。術(shù)語“基本純的培養(yǎng)物”指培養(yǎng)物基本上由上述定義的術(shù)語“間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞”所包括的4種細(xì)胞類型中的一種或多種細(xì)胞構(gòu)成。
因此，本發(fā)明涉及一種從不同來源獲得大量間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的方法，這在下面進(jìn)行闡述。通過使用對(duì)FGFR3特異的抗體，或使用該受體的特異配體如FGF9配體，可鑒定間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞，并將其與來源中其他細(xì)胞相分離。
一種獲得基本純的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，它包括(c)將FGFR3結(jié)合劑使用于含間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的細(xì)胞源中；和(d)從該細(xì)胞源中僅分離出與FGFR3結(jié)合的細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成基本純的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的培養(yǎng)物。
分離可以用手術(shù)進(jìn)行，如用手術(shù)刀將那些結(jié)合于標(biāo)記的FGFR3結(jié)合劑的區(qū)域取下；也可用各種細(xì)胞分離系統(tǒng)進(jìn)行，這些細(xì)胞分離系統(tǒng)能夠?qū)⒕哂刑囟?biāo)記(FGFR3結(jié)合劑)的各細(xì)胞從來源中的非標(biāo)記的細(xì)胞群分離開。
用于獲得間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的合適來源是來自關(guān)節(jié)鏡或骨髓活體檢查的自身來源?；铙w檢查來源可以是非增殖性的軟骨細(xì)胞或去分化的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。細(xì)胞來源還可從軟骨膜、滑膜或骨膜區(qū)域或這些區(qū)域接觸的位置處獲得。只有通過使用特異性的標(biāo)記物，才有可能將間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞從這些來源中分離出來，因?yàn)樵诮M織中這些細(xì)胞很少。另外，細(xì)胞來源也可以是來自胚胎。
從這些來源中獲得的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞可被誘導(dǎo)，從而在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子和肝素存在下在活體外進(jìn)行增殖，然后再輸送回體內(nèi)?；蛘呤且赃m合維持軟骨細(xì)胞活力的介質(zhì)中的藥物組合物形式；或者是以植入物的形式被引入到所需的部位，其中間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞處于允許生長(zhǎng)的膠質(zhì)環(huán)境中。較佳地，藥物組合物和植人物都含有合適的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，尤其是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9，以便刺激這些間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞上的FGFR3的活性。
本發(fā)明的藥物組合物或植人物可用于有缺陷的關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和再生，用于治療軟骨發(fā)育不全癥病人，用于治療患其他生長(zhǎng)障礙疾病的病人和用于治療預(yù)計(jì)軟骨和骨生長(zhǎng)速率差的物理性損傷(physical injuries)。本發(fā)明的藥物組合物或植人物可用作調(diào)控生長(zhǎng)板內(nèi)生長(zhǎng)速度的調(diào)控手段，以便提高生長(zhǎng)速度和/或防止過早的分化；或者用于直接注射到細(xì)脊椎的髓核中，以便改善脊椎受傷的愈合情況。如果需要，可在活體外通過分子工程方法對(duì)自身的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞進(jìn)行改變，以便在引入所需部位之前具有所需的表達(dá)特性。遺傳操作的例子有，對(duì)野生型FGFR3的過度表達(dá)進(jìn)行操作以便替換突變的缺陷受體；或者對(duì)顯性負(fù)突變型FGFR3的表達(dá)進(jìn)行操作，以便抑制野生型受體的活性(例如在各種類型的腫瘤病例中)，以及類似的操作。
事實(shí)上，本發(fā)明方法包括將間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞包埋在粘滯的、允許生長(zhǎng)的環(huán)境中，通常以透明質(zhì)酸為基礎(chǔ)，從而形成復(fù)合的半固態(tài)的植入物。將植人物轉(zhuǎn)移至靶定的生長(zhǎng)部位例如關(guān)節(jié)受損傷的部位?；蛘咄ㄟ^打開關(guān)節(jié)手術(shù)，或者通過關(guān)節(jié)鏡設(shè)備，將植人物注入受傷的管腔直至關(guān)節(jié)表面。然后通過噴射設(shè)備形成薄的滲透膜，從而封閉缺陷并保證固定和維持植人物處于可靠位置。
另一方面，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即FGFR3也存在于軟骨-骨瘤上，例如良性瘤(如外生骨疣和骨贅)，因此FGFR3既可以作為存在這種腫瘤的指示物，還可以作為精確定位這些腫瘤的標(biāo)記物。因此，本發(fā)明還包括在組織或樣品中檢測(cè)軟骨-骨瘤的方法，它包括(i)將測(cè)試組織或樣品與FGFR3結(jié)合劑接觸；(ii)檢測(cè)是否存在與FGFR3結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞，陽性檢測(cè)結(jié)果表明在測(cè)試的組織或樣品中存在軟骨-骨瘤。
檢測(cè)可用合適的針對(duì)FGFR3的標(biāo)記抗體，或用對(duì)FGFR3特異的標(biāo)記配體如FGF9。將該標(biāo)記的FGFR3結(jié)合劑在體內(nèi)施用于組織，不僅能夠確定在該組織中是否存在腫瘤，而且還可精確地確定腫瘤的位置，這對(duì)于手術(shù)切除是有幫助的。
FGFR3存在于軟骨-骨瘤細(xì)胞這一事實(shí)，還可用于將細(xì)胞毒性劑特異性地導(dǎo)向腫瘤部位，即通過將合適的細(xì)胞毒性分子連于對(duì)FGFR3特異的受體如FGF9或?qū)GF9特異的抗體上。因此，本發(fā)明還涉及治療軟骨-骨瘤的藥物組合物，它包括連于細(xì)胞毒性分子的FGFR3結(jié)合劑；還涉及治療這種腫瘤的方法，即通過將治療有效量的連于細(xì)胞毒性分子的FGFR3施用于治療對(duì)象。
細(xì)胞毒試劑在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且該術(shù)語在本發(fā)明的上下文中指任何能夠摧毀軟骨衍生或骨衍生腫瘤細(xì)胞的試劑。這種試劑的例子有例如氨甲蝶呤、阿霉素(doxombicin)、環(huán)磷酰胺等。
還可以通過誘導(dǎo)攜帶FGFR3的細(xì)胞發(fā)生分化而治療腫瘤。這可通過向被FGFR3結(jié)合劑標(biāo)記的區(qū)域，引入FGFR3分化誘導(dǎo)劑而進(jìn)行治療。分化誘導(dǎo)劑的例子是FGF9拮抗劑或針對(duì)FGF9的抗體。
還可以將可削弱野生型FGFR3活性的顯性負(fù)探測(cè)劑(detective)FGFR3(如通過遺傳工程)引入腫瘤而進(jìn)行治療。
在下面，結(jié)合一些不起限定作用的附圖和實(shí)施例來闡述本發(fā)明。
附圖的詳細(xì)描述

圖1-用針對(duì)FGFR3的抗體對(duì)豚鼠骨骺切片的組織染色結(jié)果。顯微照片1-5為通過年輕豚鼠骨骺的切片。
1.用Masson′s三色組織染色劑染色的前后向切片(放大6倍)，該染色劑是對(duì)結(jié)締組織成分如膠原和原聚糖(protoglycan)的特異染色劑。
2.用針對(duì)FGFR3的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的前后向切片(放大400倍)。3，4&5，軸向切片。
3.對(duì)抗體劑FGFR3進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色(放大100倍)；4.Masson′s三色染劑(放大25倍)；和5.對(duì)抗體劑FGFR3進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色(放大400倍)。
圖2由顯微照片6-11構(gòu)成，它們是17天大的雞胚胎長(zhǎng)骨骨骺的前后向切片。
顯微照片6、10&11是采用針對(duì)FGFR3的抗體的免疫組織化學(xué)染色法染色，而顯微照片8是用對(duì)原聚糖特異的Alcian藍(lán)pH 2.5染色的(注意在某些區(qū)域沒有被染色)。
這些顯微照片的放大倍數(shù)如下6(25倍)；7(40倍)；9(100倍)；10(40倍)；和11(100倍)。
7和9用Masson′s三色染劑染色。
圖3顯示了年輕大鼠的股骨生長(zhǎng)情況，其中在長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部周圍的軟骨膜(prechondrian)環(huán)被去除(STRIP)；在軟骨膜被暴露但是沒有去除的大鼠中股骨的生長(zhǎng)情況；以及在沒有經(jīng)過任何手術(shù)的大鼠(CNTL)中股骨的生長(zhǎng)情況。
圖4顯示了從關(guān)節(jié)軟骨、骨骺、長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部和軟骨膜獲得的細(xì)胞，在體外生長(zhǎng)至形成細(xì)胞集落時(shí)的天數(shù)。
發(fā)明詳述材料和方法(a)初級(jí)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物從11天大的小雞胚胎中獲得長(zhǎng)骨(股骨和脛骨)的骨骺。在解剖之后，組織塊在Tyrod′s溶液中用胰蛋白酶進(jìn)行處理，然后進(jìn)行機(jī)械打碎，直至獲得游離細(xì)胞的懸浮液。然后細(xì)胞被高濃度(5×106)地進(jìn)行平板培養(yǎng)。
(b)初級(jí)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物的PCR篩選當(dāng)達(dá)到匯合時(shí)，收集細(xì)胞并用RNA純化試劑盒(三試劑)(Molecular ResearchCenter，Cincinnati，Ohio)進(jìn)行裂解。細(xì)胞的RNA用苯酚進(jìn)行抽提，用異丙醇進(jìn)行沉淀，然后再懸浮于水中，通過測(cè)量光密度進(jìn)行定量分析。在獲得純凈的RNA(O.D.260/280nm＞1.5)后，用反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)制備cDNA，然后篩選是否有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，采用針對(duì)FGFR3和FGF9的寡核苷酸引物對(duì)。變性是在94℃，退火是在52-65℃，延伸是在72℃進(jìn)行，重復(fù)35個(gè)循環(huán)。
(c)FGF9的放射標(biāo)記如前制備重組的小鼠FGF9(Hecht，D.等人,Growth factors 12，223-233(1995))，通過氯胺T法用Na125I(0.5mCi)進(jìn)行標(biāo)記，然后在肝素-瓊脂糖凝膠柱與游離的碘分開。比活性的范圍為0,5-2×105cpm/ng。
(d)免疫組織化學(xué)法脫鈣的骨頭在用福爾馬林和苦味酸固定之后，將其包埋在液態(tài)石蠟中。對(duì)石蠟塊進(jìn)行切割和制備，以用于采用標(biāo)準(zhǔn)方案的免疫組織化學(xué)分析。對(duì)載玻片進(jìn)行染色，其中抗-FGFR3抗體的效價(jià)逐漸上升。
(e)原位雜交用35S標(biāo)記的尿苷，從重組的含有FGF9和FGFR3的質(zhì)粒(Bluescript-Stratagen)中制得T7(反義探針)和T3(有義探針)。大小為懷孕后10.5天至18.5天的小鼠胚胎，在聚甲醛中固定，在濃度逐漸上升的乙醇中脫水，然后包埋在液態(tài)石蠟中。切割和制備切片，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法與適當(dāng)?shù)腞NA探針進(jìn)行雜交。
實(shí)施例1用針對(duì)FGFR3的抗體進(jìn)行的組織化學(xué)染色如圖1所示，被針對(duì)FGFR3的抗體染色的區(qū)域并不對(duì)應(yīng)于被Masson′s三色染劑(它是公認(rèn)的軟骨染色劑)所染色的區(qū)域。這些發(fā)現(xiàn)表明，具有FGFR3的細(xì)胞并不位于軟骨本身，而是在名為L(zhǎng)a Croix溝的這一區(qū)域的軟骨膜中。
實(shí)施例2年輕大鼠的La Croix環(huán)的剝離在3個(gè)組中每個(gè)組有10只大鼠。組1作為對(duì)照組(CNTL)。大鼠被麻醉但是不進(jìn)行任何手術(shù)。組2(SHAM)作為假手術(shù)組，它們被麻醉并切開軟組織暴露出軟骨膜。組3(STRIP)在環(huán)放大(loop magnification)條件下(這樣可僅切割軟組織而不對(duì)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部本身造成損傷)，剝離了長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部周圍的軟骨膜環(huán)。在4周后，測(cè)量大鼠的平均股骨長(zhǎng)度，結(jié)果示于圖3。手術(shù)的反側(cè)肢體的長(zhǎng)度與對(duì)照肢體的長(zhǎng)度相當(dāng)(數(shù)據(jù)未標(biāo)出)。假手術(shù)的肢體表現(xiàn)出肢體長(zhǎng)度增加的趨勢(shì)，這種趨勢(shì)還未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著狀態(tài)。被剝離后的肢體顯示出肢體生長(zhǎng)的停止。這些結(jié)果表明，將被FGFR3-抗體染色的區(qū)域去除后會(huì)導(dǎo)致肢體長(zhǎng)度的停滯，這表明這些區(qū)域與正常的生長(zhǎng)有關(guān)。
實(shí)施例3從La Croix環(huán)獲得的細(xì)胞在體外生長(zhǎng)從上述大鼠中取出的La Croix區(qū)域的軟骨膜組織，被置于培養(yǎng)皿中合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并測(cè)定形成集落所需的時(shí)間。與之對(duì)比，將從遠(yuǎn)端股骨的不同部位(關(guān)節(jié)軟骨、骨骺(骨)、長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部)獲得的組織在相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，也測(cè)定形成集落所需的時(shí)間。
如圖4所示，從軟骨膜取出的組織能快速地形成細(xì)胞集落(在培養(yǎng)約3天后)，而從其他區(qū)域取出的組織僅在植入起10多天后才形成培養(yǎng)物。這些結(jié)果再次表明，從被FGFR3-抗體染色的區(qū)域獲得的細(xì)胞，比從沒有FGFR3特征的骨頭其他區(qū)域獲得的細(xì)胞生長(zhǎng)得更快。
實(shí)施例4在外生骨疣中存在FGFR3將針對(duì)FGFR3的抗體施用于從外生骨疣良性瘤獲得的組織上?？贵w染色了纖維變性組織的細(xì)胞，而基本上沒有染色軟骨細(xì)胞(數(shù)據(jù)未給出)。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)GFR3存在于軟骨-骨衍生的良性瘤(外生骨疣)上，從而可以使用FGFR3結(jié)合劑(如抗體)來鑒定這些腫瘤以及將細(xì)胞毒試劑導(dǎo)向這些腫瘤。該發(fā)現(xiàn)還導(dǎo)致可用造成FGFR3消失并因而導(dǎo)致分化的試劑(如FGF9拮抗劑)來治療這些腫瘤。
權(quán)利要求
1.一種鑒定間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的方法，其特征在于，它包括(a)在會(huì)發(fā)生配體-受體結(jié)合的條件下，將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)結(jié)合劑施用于被分析的細(xì)胞或組織上；(b)確定那些細(xì)胞與該FGFR3結(jié)合劑發(fā)生了結(jié)合，這些細(xì)胞就是間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該FGFR3-結(jié)合劑是對(duì)FGFR3特異的抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該FGFR3-結(jié)合劑是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(FGF9)。
4.一種獲得基本純的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其特征在于，它包括(a)將FGFR3結(jié)合劑使用于含間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的細(xì)胞源中；和(b)從該細(xì)胞源中分離出與FGFR3結(jié)合的細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成基本純的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的培養(yǎng)物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，該細(xì)胞源是自身非增殖的軟骨細(xì)胞，去分化的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，從軟骨膜、滑膜或骨膜獲得的細(xì)胞，或者該細(xì)胞源來自胚胎。
6.一種基本純的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞培養(yǎng)物。
7.用權(quán)利要求5所述方法獲得的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞。
8.一種用于修復(fù)骨和軟骨的藥物組合物，其特征在于，它含有適用于維持軟骨細(xì)胞活力的介質(zhì)和權(quán)利要求6或7所述的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，它還含有FGF家族的成員。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，它含有FGF9。
11.一種適用于骨或軟骨植入的植人物，其特征在于，它包括允許生長(zhǎng)的膠質(zhì)環(huán)境和權(quán)利要求6或7所述的間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求9所述的植人物，其特征在于，還含有FGF家族的成員。
13.如權(quán)利要求12所述的植入物，其特征在于，含有FGF9。
14.一種治療軟骨發(fā)育不全癥病人、患其他生長(zhǎng)障礙疾病的病人和預(yù)計(jì)軟骨和骨生長(zhǎng)前景差的長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部損傷(physeal injuries)的方法，其特征在于，在需要生長(zhǎng)或修復(fù)的部位分別施用或植人權(quán)利要求6-8所述的藥物組合物或權(quán)利要求9或10所述的植人物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，被施用的細(xì)胞是自身的。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，這些細(xì)胞是異體的。
17.一種在組織或樣品中檢測(cè)軟骨-骨瘤的方法，其特征在于，它包括(i)將受檢組織或樣品與FGFR3結(jié)合劑接觸；(ii)檢測(cè)是否存在與FGFR3結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞，陽性檢測(cè)結(jié)果表明在受檢組織或樣品中存在軟骨-骨瘤。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，該軟骨-骨瘤是選自下組的良性腫瘤外生骨疣和骨贅。
19.一種治療軟骨-骨瘤的藥物組合物，其特征在于，它包含藥學(xué)上可接受的載體和作為活性成分的連于細(xì)胞毒性分子的FGFR3結(jié)合劑。
20.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，該FGFR3結(jié)合劑是FGF9。
21.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，該FGFR3結(jié)合劑是針對(duì)FGFR3的抗體。
22.一種特異性地摧毀軟骨-骨瘤的方法，其特征在于，它包括給需要這種治療的對(duì)象施用治療有效量的偶聯(lián)于細(xì)胞毒性分子的FGFR結(jié)合劑。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，該FGFR3結(jié)合劑是FGF9。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，該FGFR3結(jié)合劑是針對(duì)FGFR3的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的新標(biāo)記物的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)。通過使用該新標(biāo)記物,可以在組織中鑒定間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞并加以定位,還可獲得這些細(xì)胞基本純的培養(yǎng)物?？梢栽谒幬锝M合物或植入物中將間充質(zhì)骨骼祖細(xì)胞的純培養(yǎng)物(可任選地在活體外進(jìn)行各種操作)用作活性成分,以用于骨和/或軟骨的修復(fù)。FGFR3還可用作鑒定和定位軟骨衍生和骨衍生腫瘤的標(biāo)記物。能夠與FGFR3結(jié)合的試劑還可用于將細(xì)胞毒試劑導(dǎo)向軟骨衍生和骨衍生的腫瘤。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1195982SQ96194719
公開日1998年10月14日 申請(qǐng)日期1996年6月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月12日
發(fā)明者A·雅因, Z·內(nèi)佛 申請(qǐng)人:依達(dá)研究發(fā)展有限公司, 拉莫特大學(xué)應(yīng)用研究及工業(yè)發(fā)展有限公司