專利名稱：改進的病毒疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及針對流感、皰疹病毒等的改進的病毒疫苗。
背景技術：
免疫是現(xiàn)代醫(yī)學防治傳染病的最成功和最經(jīng)濟有效的手段之一。通過接種，天花已被徹底消滅；其它致死性疾病如脊髓灰質炎和白喉的發(fā)病率通過免疫計劃也被極大地降低了。然而，疫苗特別是那些基于采用滅活病毒的疫苗的效果有差異。例如，雖然據(jù)報告目前已獲準的流感疫苗對青年成人的效果超過80％，但它對65歲以上的成人的效果只有約60％，對不足2歲的幼兒的效果低于50％。據(jù)報告，最近已獲準的水痘疫苗的效果為將近70％，但目前還沒有預防許多重要疾病的有效疫苗，所述的疾病包括那些由呼吸道合胞體病毒、副流感3型病毒、輪狀病毒和人免疫缺陷病毒引起的疾病。在某些情況下，已獲準的滅活病毒疫苗可能會產(chǎn)生副作用，所述的副作用妨礙了它們以較高的劑量使用來改善效果。
滅活病毒疫苗通過刺激對游離病毒的蛋白產(chǎn)生應答而提供保護。在與病毒接觸后，抗游離病毒的成熟包膜蛋白的抗體在防止感染發(fā)生的起初階段(例如病毒與細胞受體結合、附著和進入細胞內(nèi))可能是最有效的，但一旦病毒進入到細胞內(nèi)部，該抗體則可能是次最有效的。一旦感染發(fā)生了，細胞和細胞結合的成熟病毒粒子則含有成熟包膜蛋白的前體。當身體的第一道防線——抗游離病毒的抗體沒能完全防止所有的病毒侵染細胞的時侯，這些前體蛋白能刺激防止感染進一步擴散和預防臨床疾病發(fā)生的更加有效的應答。
一般由在動物細胞(如生產(chǎn)流感病毒的雞胚)中生長的病毒來生產(chǎn)滅活病毒疫苗，通過化學試劑如福爾馬林的處理來滅活在細胞中生長的病毒。通過在細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)弱化病毒來生產(chǎn)麻疹和水痘的減毒疫苗。對病毒感染致病機理的進一步的理解和DNA重組技術，導致了用于亞單位病毒疫苗的特異病毒蛋白的鑒定和產(chǎn)生。這些在抗乙型肝炎病毒的亞單位疫苗的制備中特別成功?，F(xiàn)存的絕大多數(shù)已獲準的疫苗和正在研制中的疫苗，無論是基于滅活的病毒還是基于DNA重組技術，它們大都依賴于對成熟病毒的免疫應答；而在極少數(shù)的實驗中，基于重組DNA的疫苗依賴于對細胞結合形式的病毒抗原或被病毒侵染細胞的免疫應答。盡管滅活病毒和減毒病毒在一方面有了進展而重組DNA在另一方面有了進展，但它們有其有利的一面，也有其局限的一面。雖然細胞培養(yǎng)和雞胚法用來生長完整的病毒極其便宜，但它們并不是工業(yè)生產(chǎn)在被感染的細胞中發(fā)現(xiàn)的和細胞結合形式的病毒的病毒前體蛋白的極有效的方法。這是因為這些方法像小型裝配流水線，在任何給定的時間，雖然在細胞培養(yǎng)物中或雞胚中積有大量的成熟病毒，但實際上在裝配過程中的病毒卻是很少量的。因此，用來制備疫苗的經(jīng)純化的病毒含有極少的(如果有的話)包膜前體或其它前體蛋白。另一方面，病毒膜糖蛋白無論以其成熟形式還是以其前體形式均可通過DNA重組技術來有效地制備。當需要天然的構象結構來產(chǎn)生有功能的中性的抗體時，優(yōu)選采用運用哺乳動物細胞或昆蟲細胞的重組技術。然而，通過重組技術在昆蟲或哺乳動物細胞中制備病毒疫苗蛋白，以每毫克蛋白計通常比細胞培養(yǎng)和雞胚生產(chǎn)方法要昂貴些。
疫苗的副作用起因于不純或起因于導致保護性免疫產(chǎn)生的疫苗蛋白(抗原)的生物學特性。例如，存在于已獲準的流感疫苗中的雞胚污染蛋白可能是這些產(chǎn)品所產(chǎn)生的副作用的主要原因。采用高度純化的重組亞單位蛋白疫苗，這種副作用可被減少或消除。
存在于疫苗中的成熟病毒蛋白可能具有導致副作用的生物學特性。由血細胞凝集素介導的單核細胞和粒細胞對滅活流感病毒的內(nèi)吞作用也可能導致副作用的產(chǎn)生。某些抗HIV的實驗疫苗中的成熟HIV包膜糖蛋白(gp120)可能與T4淋巴細胞的CD4受體結合并使正常的免疫功能改變。在疫苗的制備中，人們希望通過采用各自的前體蛋白或通過其他途徑減少潛在的副作用，如在流感疫苗中采用HA0、在HIV疫苗中采用gp160。
滅活病毒疫苗中的病毒包膜蛋白是基本上被糖基化了的。雖然糖基化對于維持這些蛋白的構象結構很重要，但它也有可能使免疫原性降低。這些蛋白無論是其成熟形式還是其前體形式，均可在培養(yǎng)的昆蟲細胞中采用重組的桿狀病毒表達載體用經(jīng)修飾的糖殘基來產(chǎn)生。桿狀病毒產(chǎn)生的蛋白保留了足以刺激有功能的中和抗體產(chǎn)生的天然構象，并會提供比高度糖基化的天然蛋白更強的免疫原性。
流感病毒的感染引起世界范圍內(nèi)的多種疾病和夭折。用由滅活流感病毒制備的疫苗進行免疫是目前減少由病毒性流感引起的疾病的最有用的方法。這些滅活的疫苗已通過世界各地制定規(guī)章的機構的核準。它們通過刺激對血細胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP、M1)以及還可能對成份株系的其他蛋白產(chǎn)生免疫應答而賦予抗感染和防止疾病的保護作用(Murphy，B.R.等人，新英格蘭醫(yī)學雜志，2681329-1332(1972)和Kendal，A.P.等人，傳染病雜志，136S415-24(1986))。這些當中最重要的是抗HA的中和抗體的產(chǎn)生(Ada，G.I.和Jones，P.D.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.1281-54(1986))。然而，目前可得到的滅活疫苗有局限性，包括免疫原性不夠最好以及在65歲以上的成人和很年幼的孩童中的效果不是最佳，由于認為這些疫苗不是極為有效并且害怕副作用，這些疫苗難以被部分患者接受從而未得到充分利用(Nichol，K.L.等人，Arch.Int.Med.152106-110(1992))。效果的缺乏部分起因于一年年功效的不同并和伴隨流感的非流感呼吸道疾病有關。
成熟的流感病毒在其包膜蛋白中含有HA和NA兩種蛋白。每個HA單體由兩條多肽(HA1和HA2)組成，所述的兩條多肽由二硫鍵聯(lián)結。這些多肽來源于在流感病毒成熟過程中一個前體蛋白HA0的斷裂。部分因為這些分子是緊密折疊的，HA0與成熟的HA1和HA2在構象和抗原特性方面的差異很小。而且，HA0更為穩(wěn)定并且難以變性和被蛋白酶解。最近有人報導，桿狀病毒/昆蟲細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的重組HA0賦予抵抗流感的保護性免疫(Winkinson，B.，MicroGeneSysRecombinanat Influenza Vaccine，PMA/CBER病毒性流感大會，1994年12月8日)。重組HA0疫苗的一個局限是，它不能刺激對可提供更強更持久保護的非-HA抗原的免疫應答，特別是對于對免疫應答得不好的那些高危人群而言。
提供改進的病毒疫苗制劑是人們所希望的，使該制劑不再存在采用目前可得疫苗時所觀察到的許多局限和缺點。
本發(fā)明的一個目的在于提供防止病毒性傳染如流感、水痘、麻疹、呼吸道合胞體病毒、傳染性單核細胞增多癥和單純性皰疹的改進疫苗，該疫苗較目前可得的疫苗其功效和安全性均有提高。
本發(fā)明的另一目的在于提供能提供更強更持久保護(特別是對于免疫應答不好的那些高危人群而言)的病毒疫苗。
本發(fā)明的又一而更加具體的目的在于提供對游離病毒和細胞結合病毒均能產(chǎn)生最佳免疫應答的疫苗，提供更好的保護以抗傳染和疾病。
本發(fā)明的再一具體的目的在于供改進的流感疫苗。
本發(fā)明概述包含至少兩種組份滅活病毒、來源于該滅活病毒的重組包膜蛋白和佐劑的混合疫苗及其使用方法。該疫苗組合物一般包含致免疫量的滅活病毒(如流感病毒、水痘皰疹病毒、麻疹病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感3型病毒、單純性皰疹1型病毒和單純性皰疹2型病毒)和致免疫量的源自該病毒的經(jīng)純化的重組包膜蛋白或該蛋白的片段或前體。
優(yōu)選的佐劑是集落刺激生長因子。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子在某些實施方案中是特別優(yōu)選的。
改進的流感病毒疫苗一般含有滅活病毒和重組血細胞凝集素、重組神經(jīng)氨糖酸苷酶或其混合物。在一個實施方案中，人用的改進流感病毒疫苗組合物含有三株滅活病毒和源自所述的三株滅活病毒中的至少一株(優(yōu)選源自所述三株滅活病毒的各株)的重組血細胞凝集素。在另一個實施方案中，改進流感病毒疫苗含有三株滅活病毒和源自所述的三株滅活病毒中的至少一株(優(yōu)選源自所述三株滅活病毒的各株)的重組神經(jīng)氨糖酸苷酶。某些流感疫苗含有血細胞凝集素和神經(jīng)氨糖酸苷酶。在這些實施方案中，優(yōu)選含有三株病毒和至少兩種(優(yōu)選兩種到六種)相應的包膜蛋白或其片段或前體。
其他的疫苗包括滅活的pstein Barr病毒和重組病毒gp340包膜蛋白；滅活呼吸道合胞體病毒和重組病毒包膜F蛋白、G蛋白和/或FG聚蛋白；滅活的副流感3型病毒和重組病毒包膜F蛋白、HA蛋白和/或F/HA聚蛋白；滅活麻疹病毒和重組病毒包膜F蛋白、HA蛋白和/或F/HA聚蛋白；滅活的單純性皰疹1型病毒和重組病毒包膜糖蛋白D；滅活的單純性皰疹2型病毒和重組病毒包膜糖蛋白D。
改進的人用水痘疫苗含有減毒的水痘皰疹病毒和重組的水痘皰疹包膜糖蛋白D。
本發(fā)明的詳細描述疫苗組份通過混合下列組份中的至少兩種來制備疫苗源自游離病毒的抗原、源自細胞結合病毒的前體蛋白的抗原、佐劑。所述的抗原可由包括采用病毒感染的細胞(細胞培養(yǎng)或雞胚)在內(nèi)的各種方法或通過重組DNA技術來生產(chǎn)，所述的重組DNA技術包括活的重組載體(牛痘)或重組亞單位蛋白(桿狀病毒/昆蟲細胞、哺乳動物細胞、酵母或細菌)。
哺乳動物病毒疫苗組合物包括至少兩種組份致免疫量的滅活或減毒的病毒、有效量的佐劑、致免疫量的純化的重組包膜蛋白或其片段或前體?？芍苽淇共《救缌鞲胁《尽⒙檎畈《?、水痘病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感3型病毒、單純性皰疹1型病毒和單純性皰疹2型病毒的疫苗。
重組抗原的表達系統(tǒng)采用任何現(xiàn)已建立的表達系統(tǒng)如細菌、酵母、桿狀病毒和哺乳動物細胞培養(yǎng)物，可重組制備病毒包膜和包膜前體蛋白(“VEP”)。本文所用的術語“重組(的)”是指采用任何熟知的核酸操作方法產(chǎn)生的任何蛋白或核酸，這些蛋白或核酸的例子將述于下文。這里所述的由核酸操作產(chǎn)生的核酸產(chǎn)生或表達得到的任何蛋白或核酸就是重組產(chǎn)生的蛋白或核酸。
用來產(chǎn)生VEP的DNA可以是基因組DNA，在這種情況下該DNA可包含內(nèi)含子；或者是采用反轉錄酶在體外制備的含有可讀框的cDNA。分離、克隆或合成DNA和cDNA的方法是本領域的技術人員所熟知的。表達是指核酸被轉錄和轉譯成肽、多肽或蛋白質的過程。如果該核酸來自基因組DNA，表達可包括mRNA的剪接和隨后的糖基化作用，如果選擇了適當?shù)恼婧怂拗骷毎蛏锏脑?。表達載體是指重組的DNA或RNA構建體如質粒、噬菌體、重組的病毒或其他載體；當被導入適當?shù)乃拗骷毎?，所述的載體引起已被克隆進載體中的核酸分子的轉錄，然后使轉錄出的核酸轉譯成多肽。以可操作地與調(diào)控序列連接的方式，將核酸分子克隆到載體內(nèi)，所述的調(diào)控序列影響異源核酸的表達。在選定的宿主細胞或生物體內(nèi)表達后，如果有適當?shù)恼{(diào)控序列可操作地與該DNA連接或者被包含在異源DNA內(nèi)的話，表達產(chǎn)物有可能被轉運到細胞質中和/或被分泌到細胞外。
適當?shù)谋磉_載體是本領域的技術人員所熟知的，并包括那些在真核細胞和/或原核細胞中能夠復制的載體。這樣的載體可以附加體的形式存在，也可整合到宿主細胞基因組中。
在各種情況下，所述的VEP cDNA或基因均可插入到含有表達調(diào)控元件的適當?shù)谋磉_載體中，所述的表達調(diào)控元件為(例如)轉錄起始信號、轉譯起始信號、起始密碼子、終止密碼子、轉錄終止信號、多聚腺苷酸化信號等等。合適的載體可從許多公司購得。當含有VEP-編碼DNA的重組載體轉染進宿主細胞后，該重組載體或者以染色體外DNA的形式存在，或者它們可被整合到宿主基因組中。在每一種情況下，它們都能指導重組VEP在宿主細胞中的合成。一些異源基因表達的例子被描述于《酶學的方法》第153卷、第23--34章(Wu和Grossman編輯，Academic出版社，1987)。合成VEP的宿主細胞的大規(guī)模培養(yǎng)和該蛋白的純化可形成成本有效的生產(chǎn)VEP的商業(yè)方法。大規(guī)模生產(chǎn)蛋白的方法是本領域的技術人員所熟知的。對重組表達VEP有用的許多方法和試劑被描述于The 1995 Lab Manual Source Book(冷泉港實驗室出版社，紐約，1995)。
一些可能有用的VEP表達系統(tǒng)的例子包括(但不限于)采用大腸桿菌或其他細菌作為宿主的那些系統(tǒng)。許多哺乳動物的cDNA已在大腸桿菌中表達，而且許多具有不同的啟動子、操縱基因和其他調(diào)控元件的表達載體是可商購的。Lin和Tang在J.Biol.Chem.2644482--4489(1989)中描述了一般載體的構建和表達。一些真核蛋白在大腸桿菌的胞液中的表達產(chǎn)生不溶性的內(nèi)涵體，并需要重組蛋白的再折疊。然而，引導序列如omp(由Duffaud等人描述于《酶學中的方法》153492--506(Wu和Grossman編輯，Academic出版社，1987))的使用會引導適當?shù)恼郫B，而且還會將重組的VEP運到細菌的周質腔中。
另外，酵母可用作宿主。重組的VEP在酵母中表達的原則與在大腸桿菌中的相似。由Bitter等人在《酶學中的方法》153492--506(Wu和Grossman編輯，Academic出版社，1987)中給出了這方面的例子。象大腸桿菌一樣，酵母宿主細胞可在胞液中表達外源基因或者將外源基因表達成分泌蛋白。與大腸桿菌不一樣的是，在酵母中的分泌表達不能糖基化。
真菌也可用作宿主。已有少量的真菌表達載體成功地用來表達異源基因。如Cullen等人在A Survey of Molecular Cloning Vectorsand their Uses(Butterworth出版社，Stoneham，MA1986)中指出的，現(xiàn)存的真菌表達載體在轉染后會整合到宿主的基因組中。當在表達蛋白的密碼子之前存在引導序列時，分泌的重組蛋白可被糖基化。一些成功表達的例子包括牛凝乳酶(由Cullen等人描述于Bio/Technology 5369--378(1987))和來自不同真菌的酸性蛋白酶(由Gray等人描述于基因841-53(198))。
昆蟲細胞可被用作宿主，并且在某些實施方案中是優(yōu)選的。用于在昆蟲細胞中合成外源基因的桿狀病毒表達載體已被成功地用于表達許多真核蛋白和病毒蛋白。該系統(tǒng)能夠進行糖基化，也能高水平地表達重組蛋白。該系統(tǒng)的用途已由Luckow和Summer詳細綜述于1987年9月11日的Bio/Technology，由Luckow綜述于the LaboratoryManual for Baculovirus Expression System(1994)。重組的VEP還可采用其他的表達載體如昆蟲痘(Entomopox)病毒和細胞質多角體病病毒(CPV)在昆蟲細胞中表達。
最后，哺乳動物細胞可用作宿主。許多異源基因已以商業(yè)規(guī)模在哺乳動物細胞中表達。重組的人組織血纖維蛋白溶酶源活化因子的商業(yè)化生產(chǎn)就是個例子。這些表達載體中的大多數(shù)含有1)或者為哺乳動物啟動子如金屬花青苷或生長激素啟動子，或者為病毒啟動子如SV40早期啟動子和病毒基因的長末端重復；2)多聚腺苷酸化信號；和3)包括抗生素抗性基因在內(nèi)的用于克隆大腸桿菌的適當?shù)恼{(diào)控元件。在將VEP基因插在啟動子的下游之后，可將該載體首先克隆進大腸桿菌，然后分離和轉染到哺乳動物細胞中。新霉素或類似的抗性選擇標記可用另一載體共轉染或用同一載體轉染。對于高水平的表達，基因擴增系統(tǒng)是有利的。例如，所述的表達載體可含有編碼二氫葉酸還原酶(dhfr)的基因。當使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的dhrf品系時，通過使轉化的細胞適應增高的氨甲喋呤濃度，克隆的基因可與二氫葉酸還原酶基因一起共擴增。憑借酶測定或蛋白質(Western)印跡，分泌VEP的轉化克隆可被鑒定出來。這方面成功的例子包括重組的前凝乳酶和人免疫干擾素的合成，前者由Poorman等人描述于Proteins 1139-145(1986)，后者由Scahill等人描述于Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.804654--4658(1983)。
純化重組VEP的方法是人們所熟知的，并且一般可分為色譜法如離子交換色譜、分子篩分離、高壓液相色譜、親合色譜和電泳法如瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦。這些方法中的任何一種均可用來純化VEP。
優(yōu)選的純化方法是親合色譜法。在親合色譜法中，抗VEP的抗體被固定在色譜基質上，含有VEP的混合物在允許抗體與VEP結合的條件下被施用到基質中，未結合的物質通過洗滌而被除去，采用如高或低pH的蛋白質變性劑或離液序列高的物質(chaotropes)，將結合的VEP洗脫下來。
例如，采用如下文描述的與瓊脂糖珠共價結合的固定抗體或通過羊-抗鼠IgM抗體與金黃色釀膿葡萄球菌G蛋白珠非共價結合的固定抗體中的一種或其組合，通過親合色譜可純化VEP。例如，通過將細胞提取物與抗-VEP的抗體溫育，還可實現(xiàn)VEP的分離，所述的抗-VEP抗體如下文所述附著于固相上，如與瓊脂糖珠化學軛合連接。溫育后，洗滌該瓊脂糖珠，將蛋白質變性并在聚丙烯酰胺凝膠上分離之。
為了制備疫苗，將VEP或致免疫的VEP片段和各自的滅活病毒配合，如上所述，所述的VEP來源于所述的滅活病毒。采用疫苗領域的技術人員已知的方法和材料，可配制和包裝滅活病毒和VEP組合的制劑，這方面的例子將述于下文。如本文所用，蛋白質的致免疫片段是指在動物或人體中產(chǎn)生免疫應答的具有至少5-8個氨基酸的蛋白質片段，一般少于100個氨基酸，通常少于25-40個氨基酸。
佐劑可任意地使用佐劑，在某些實施方案中佐劑是優(yōu)選的。上述的組合疫苗可以和有效量的佐劑配合使用，以增強免疫應答。在人中廣泛使用的常見佐劑是明礬、磷酸鋁或氫氧化鋁。皂苷及其純化的組份QuilA、弗洛因德完全佐劑和其他在研究和獸醫(yī)應用方面使用的佐劑具有毒性，限制了他們在人疫苗中的可能應用。也可使用化學限定的制劑如胞壁?；?、單磷?；愔珹和磷脂共軛物如Goodman-Snitkoff等人在J.Immunol.147410-415(1995)(該文獻引入本文做參考)描述的那些。
關于口服施用，人們知道痕量的霍亂毒素(CT)或者霍亂毒素亞單位A或霍亂毒素亞單位B或者其二者以及第二抗原的混合物刺激粘膜對共同施給的抗原產(chǎn)生免疫。而且，對第二抗原有極強的體液免疫應答，而沒有單獨口服該抗原時產(chǎn)生的免疫耐受。因此，粘膜傳遞的CT起到了粘膜和體液免疫強有力的免疫刺激劑或佐劑的作用。因此，優(yōu)選將CT包括在疫苗中來增強口服施給抗原的免疫原性。
關于胃腸外施用，佐劑包括胞壁?；?、胞壁?；?、細胞因子、白喉類毒素和外毒素A?？勺允惺圪彽玫淖魟┌蓮腃ambridgeBiosciences(Worcester，WA) 購得的QS-21和可從RibiImmunochem.購得的單磷脂酰類脂A(MPLA)。
一組被稱為集落刺激因子的生長因子也可用作佐劑，所述的集落刺激因子支持造血干細胞的存活、集落擴增和分化。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是這組的成員，并誘導部分的原母(progenitor)細胞分裂并按粒細胞-巨噬細胞的途徑分化。GM-CSF還能活化成熟的粒細胞和巨噬細胞。各種細胞的應答(即分裂、成熟、活化)是通過GM-CSF與在靶細胞表面表達的特異性受體的結合來誘導的。重組形式的GM-CSF可從Immunex公司(Seattle，WA)購得，它以LEUKINE為商品名出售。LEUKINE是127個氨基酸的糖蛋白，其特征在于有3個主要的分子，分子量分別為19500、15800和15500道爾頓。LEUKINE的氨基酸序列不同于天然的人GM-CSF，它在第23位為一亮氨酸的取代，而且其糖基部分也可能不同于天然的蛋白質(LEUKINE Product Insert，Immunex公司，1992)。
GM-CSF過去一直用來使患有非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴細胞白血病(ALL)和何杰金氏病進行了自體骨髓移植(BMT)的患者加快髓樣組織的恢復?；加蠳HL、ALL或何杰金氏病的患者進行了自體骨髓移植后，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GM-CSF可安全有效地加速骨髓移入物的恢復、縮短施給抗生素的持續(xù)時間、減少感染發(fā)作的持續(xù)時間以及縮短住院的時間。最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當GM-CSF和重組癌胚(carcinoembyonic)抗原(rCEA)一起施給癌癥患者時，對rCEA的免疫應答明顯強于患者只接受rCEA時的免疫應答。在科技文獻中已經(jīng)報道過，腫瘤細胞可被轉化為表達GM-CSF。實驗動物對這些轉化細胞的免疫應答強于對非-GM-CSF轉化細胞的應答。
可從Immunex公司購得的GM-CSF是無菌的白色的不含防腐劑的凍干粉，在用注射用的1ml的無菌水(美國藥典)對其重建后，該GM-CSF用于靜脈內(nèi)的輸注。該重建的等滲溶液的pH為7.4±0.3。在常規(guī)的人骨髓集落測驗中，LEUKINE的特異性活性為約5×107集落形成單位/毫克。當用作佐劑時，LEUKINE可用無菌水或疫苗制劑重建。如果是用水重建，則通過在疫苗免疫的同一部位肌內(nèi)注射施給LEUKINE；或者先與疫苗制劑混合。然后，用疫苗制劑直接重建GM-CSF或者通過將用水重建的GM-CSF和疫苗混合得到的疫苗/GM-CSF混合物，通過肌內(nèi)、皮下或真皮內(nèi)注射施給。一次使用的每一小瓶LEUKINE含有250微克或500微克的源自酵母的重組人GM-CSF。
在以前的組合病毒疫苗的各實施例中，疫苗的配方通過加入有效量的GM-CSF而得到進一步的改進，以提高免疫原性。這是通過用1毫升上述的組合疫苗制劑對一瓶500微克的GM-CSF的重建來實現(xiàn)的?；蛘?，一瓶500微克的GM-CSF可用1毫升的無菌水重建，并將0.5ml該重建的GM-CSF和0.5ml的組合疫苗制劑混合。
GM-CSF還可用作滅活病毒疫苗和不含VEP的減毒病毒疫苗的佐劑?？蓪⒂行Я康腉M-CSF如上文加入到可自市售購得的用于預防病毒性流感的滅活疫苗中，以提高免疫原性。這對于幼童和65歲或更老的成人而言尤其重要。有效量的GM-CSF可加入到可自市售購得的用于預防水痘皰疹的疫苗中，以改善功效。這對于患有白血病的兒童而言特別重要，這種感染對于該兒童是致命的。一瓶500微克的GM-CSF可用1毫升市售的流感病毒疫苗或者1毫升市售的水痘皰疹疫苗來重建?；蛘?，一瓶500微克的GM-CSF可用1毫升的無菌水重建，并將0.5ml該重建的GM-CSF和0.5ml市售的流感病毒疫苗或者0.5毫升市售的水痘皰疹疫苗混合。
GM-CSF還可用作已獲準的乙型肝炎疫苗(包括重組的和非重組形式的疫苗)的佐劑。這對于50歲以上的成人特別重要，因為該已獲準的乙型肝炎疫苗在年長的成人中的功效較低。以GM-CSF作為佐劑的乙型肝炎疫苗還可用于治療被乙型肝炎病毒感染的個體。
GM-CSF也可與重組的病毒膜蛋白如流感HA0抗原一起用作佐劑。如下文的實施例所述，有效量的重組HA0可通過直接重建或者通過與用水重建的GM-CSF混合(如上文所述)而加入到GM-CSF中。對于大多數(shù)人，含有10微克HA0和100微克GM-CSF的疫苗提供了改進的保護。對于幼童和65歲以上的成人，含有50微克HA0和250微克GM-CSF的疫苗提供了改進的保護。
GM-CSF也可與來源于各種病毒的重組的VEP一起用作佐劑，以產(chǎn)生日前還不能自市售購得的疫苗。這些包括用有效量的GM-CSF配合有效量的HIV gp160和/或gp120蛋白產(chǎn)生AIDS疫苗，用有效量的GM-CSF配合有效量的呼吸道合胞體病毒F蛋白和/或G蛋白，用有效量的GM-CSF配合有效量的副流感3型病毒F蛋白和/或HA蛋白，用有效量的GM-CSF配合有效量的麻疹病毒F蛋白和/或HA蛋白，以及用有效量的GM-CSF配合有效量的麻疹病毒的糖蛋白D。在有關麻疹病毒的情況下，GM-CSF佐劑在預防和治療疫苗中均可使用。
GM-CSF還可與自身抗原配合使用。人絨毛膜促性腺素(HCG)的α亞單位其本身和在各種配方(包括與白喉類毒素共軛連接的HCGα亞單位和用佐劑MDP微膠囊包裝的HCG的α亞單位)作為潛在的避孕劑苗(vaccine)已被廣泛地測試過。然而，在人中還需要更高的免疫原性。這一點通過采用有效量的GM-CSF與有效量的與白喉類毒素載體共軛連接的HCGα亞單位的配合或者與有效量的含有HCGα亞單位和白喉類毒素的聚蛋白的配合來實現(xiàn)。其他的作為避孕劑苗來研究過的自身抗原是HP-20和HP-30分子。要使該方法有效需要大量的抗體。這一點通過采用有效量的GM-CSF和有效量的HP-20和HP-30蛋白的配合來實現(xiàn)。
GM-CSF一般用來改善許多疫苗的效果和可靠性，所述的疫苗包括可自市售購得的預防流感嗜血桿菌的多糖和共軛連接的多糖疫苗。這對于兩歲以下的對可自市售購得的疫苗不能產(chǎn)生可靠應答的幼童而言特別重要。
GM-CSF還可用來改善對源自傳染源的抗原的免疫應答，所述的傳染源引起慢性寄生蟲性疾病包括瘧疾、梅毒、鉤蟲病和血吸蟲病。因為這些寄生蟲必須在宿主內(nèi)停留一段時間，它們進化的途徑使它們對宿主的免疫原性降低。例如，重組的惡性瘧原蟲circumsporozooite抗原在實驗動物中具有很高的免疫原性，但在人中不致免疫。有效量的GM-CSF和有效量的惡性瘧原蟲circumsporozooite抗原的配合改善了在人中的免疫原性。
GM-CSF的優(yōu)選的量為從單劑使用的一瓶500微克的LEUKINE中獲得的500微克的GM-CSF，所述的KEUKINE可自Immunex公司購得。除非另有說明，包括在疫苗制劑中的各抗原的量優(yōu)選為100微克。
載體施給疫苗組合物所用的許多載體是已知的。這些載體包括(但不限于)簡單的液體載體、聚合的和類脂組合物。簡單的液體載體如水和緩沖鹽水可單獨使用或與其他載體配合使用。
所述的載體還可是聚合的遲延-釋放系統(tǒng)。在配制使抗原得到有控制釋放的疫苗方面，合成的聚合物特別有用。這方面的例子由Kreuter描述于Microcapsules and Nanoparticles in Medicine andPharmacology，125-148頁(M.Donbrow編輯，CRC出版社出版)。其他顆粒的采用已經(jīng)證明這些聚合物的佐劑效果取決于顆粒的大小和疏水性。
微膠囊包裝已用于微膠囊包裝的藥物的注射，以得到藥物的有控制的釋放。用于微膠囊包裝的特定聚合物的選擇與許多因素有關。聚合物合成和微膠囊包裝過程的可再現(xiàn)性、微膠囊包裝材料和方法的成本、其毒理學特征、可變釋放動力學的要求以及該聚合物和抗原的生理化學相容性都是必須考慮的因素。有用的聚合物的例子是多糖、聚酯、聚氨基甲酸乙酯、聚原酸酯和酰胺，那些可生物降解的聚合物特別有用。
經(jīng)常用作藥物的載體和最近用作抗原的載體的載體是聚(d，l-丙交酯-乙交酯)(PLGA)。它是可生物降解的聚酯，在可蝕縫合、骨夾板和其他臨時的修復術中已有很長的藥用歷史，在這些修復術中它沒有毒性。各種各樣的藥物包括肽和抗原已被配制到PLGA微膠囊中。關于使PLGA適于抗原的有控制的釋放大量數(shù)據(jù)已經(jīng)積累起來，例如，如Eldridge 等人在Current Topics in Microbiology andImmunology 14659-66(1989)中所作的綜述。該PLGA微膠囊包裝方法采用水-油乳化相分離原理。在該方法中，組合疫苗中的滅活病毒和各VEP以水溶液的形式制備，而將PLGA溶解于適當?shù)挠袡C溶劑如二氯甲烷和乙酸乙酯中。通過高速攪拌使這兩種不能相互混合的溶液共乳化。然后加入聚合物的非-溶劑，在含水液滴的周圍引起聚合物的沉淀，形成微膠囊的雛形。收集該微膠囊，并用分配劑聚乙烯醇(PVA)、明膠、藻酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或甲基纖維素中的一種穩(wěn)定之，通過真空干燥或通過溶劑萃取而將溶劑除去。
蛋白體(蛋白質和脂質體的結合體)也可用作組合疫苗的載體，所述的組合疫苗采用滅活病毒和各自的VEP作為蛋白質組份。使用蛋白體的步驟和材料如Lowell等人在Science(科學)240800(1988)、Lowell等人在New Generation Vaccines(新一代的疫苗)(Woodrow和Levine編輯，Marcel Dekker，NY，1990)第12章141--160頁和Orr等人在In fect.iMMUN.612390(1993)中所描述的一樣，這些文獻的內(nèi)容引入本文作參考。
本領域的技術人員應明白的是，該致免疫的疫苗組合物還可包含生理上可接受的其它成分如水、鹽水、或礦物油(如DrakeolTM、MarkolTM)、鯊烯以形成乳液，或者與含水緩沖液配合使用，或者將該疫苗組合物包在膠囊或腸溶衣中以防止蛋白質在途經(jīng)胃時被降解掉。
在優(yōu)選的實施方案中，該疫苗以用于胃腸外途徑免疫的單一劑量包裝，所述的胃腸外途徑是肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)或皮下施給，或者通過鼻咽部即鼻內(nèi)施給。采用標準的技術如抗體效價測定來確定有效劑量?？蓪⒖乖瓋龈?，而在施給時重懸在液體中或溶于溶液中。如果施給佐劑，該佐劑可與疫苗一起施給或者在施給疫苗的附近施給。
致免疫應答的測定采用檢測和定量與VEP結合的抗體的檢驗來測量免疫。細胞免疫采用測量特異的T-細胞應答如遲發(fā)型過敏反應(DTH)和淋巴細胞增殖的檢驗來測量。通過抗原的負載和用來確定劑量的標準技術和各抗原施用的方案，基于施給抗原所產(chǎn)生抗體的滴定度，來確定劑量。本文所用的術語“導致免疫應答的有效劑量”是指，采用任何已知的測抗體效價的方法，與未經(jīng)處理的動物和人相比引起抗體效價增高的劑量。
采用重組的VEP作為抗原，通過酶免疫測定來檢測循環(huán)中的抗重組VEP的抗體。這種測定描述于下文。簡言之，可用每孔1微克的重組VEP包被測定板。采用1∶1000稀釋的與馬辣根過氧化物酶(HRP)共軛連接的羊抗狗IgG抗體。還可通過免疫熒光法(IFA)、雙向瓊脂糖擴散法和Western/免疫印跡法(由LiuShu-Xian等人描述于SE AsianJ.Trop.Med.Pub.Health 2461--65(1993))進行免疫應答的測量。
在一個實施方案中制備了改進的流感疫苗。致免疫量的滅活流感病毒和致免疫量的重組流感病毒包膜蛋白或包膜蛋白的片段或前體配合。術語“致免疫”是指能夠導致抗體產(chǎn)生。
任何流感病毒的包膜蛋白或蛋白片段或前體均可采用。在優(yōu)選的實施方案中，采用了血細胞凝集素、神經(jīng)氨糖酸苷酶或者血細胞凝集素和神經(jīng)氨糖酸苷酶的混合物。如上文所述采用標準的方式，采用桿狀病毒載體在昆蟲細胞培養(yǎng)物(如Powers，D.C.等人描述的鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)物)中進行生產(chǎn)，制備該重組蛋白。另外，該蛋白質的制備還可采用哺乳動物表達系統(tǒng)，如那些采用COS細胞或CHO細胞表達載體的表達系統(tǒng)(如由Ausubel，F(xiàn).M.等人描述于Short Proctocols in MolecularBiology，第二版，John Wiley，New York，1992，16--53至16--62頁)。在一個實施方案中采用了桿狀病毒/鱗翅目昆蟲細胞方法。
對于流感，優(yōu)選的組合疫苗含有一定的流行季節(jié)的三株滅活的流感病毒，如可自市售購得的和在下文的實施例中描述的那些病毒。由FDA和CDC選出的代表流行季節(jié)的病毒株列于下表中。病毒株1992/93 1993/94 1994/95HINIA/德克薩斯/36/91A/德克薩斯/36/91A/德克薩斯/36/91H3N2A/北京/353/89 A/北京/32/92A/山東/9/93B B/巴拿馬/45/90 B/巴拿馬/45/90 B/巴拿馬/45/90抗FDA和CDC選出的代表流行季節(jié)的H1N1、H3N2和B株的已獲準疫苗是優(yōu)選的。在這些實施方案中，在組合疫苗中采用了致免疫量的重組包膜蛋白如HA0或NA中的至少一種，優(yōu)選對于每一選出的病毒株采用一種蛋白(或片段或前體)。當在重組蛋白組份中采用蛋白質片段或前體時，該疫苗可含有蛋白質和片段或前體的混合物。
在另一實施方案中，該組合疫苗含有兩種包膜蛋白如血細胞凝集素和神經(jīng)氨糖酸苷酶。當疫苗中含有三株病毒時，該組合疫苗含有至少一種血細胞凝集素和至少一種神經(jīng)氨糖酸苷酶。優(yōu)選的組合疫苗含有對應于各病毒株的血細胞凝集素和對應于各病毒株的神經(jīng)氨糖酸苷酶。
將存在于組合疫苗中的各株滅活病毒的量加以調(diào)節(jié)，使疫苗中一般含有約12-18微克的各病毒株包膜蛋白；在一個實施方案中，滅活病毒的量被調(diào)節(jié)到每劑該疫苗中含有15微克的各株病毒HA(HA1+HA2)。在另一實施方案中，各病毒株的重組HA0均采用了15微克。
雖然可能存在單體形式的和其它多聚體形式的HA0以及可能存在單體形式的和其它形式的NA，優(yōu)選所用的HA0主要是三聚體形式的，所用的NA主要是四聚體形式的；所用的HA0或NA或其兩者是采用重組桿狀病毒載體在鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生、提取并在非-變性條件下純化到至少90％的純度。
滅活的/重組組合流感疫苗的益處在于與其中的任一產(chǎn)物相比，預期它的成本較低、更安全和更有效；與HAO疫苗本身相比，它能更快地獲得批準。該組合疫苗將最適于刺激對游離病毒抗原(如HA1、HA2)的免疫和對細胞結合病毒抗原以及病毒感染的細胞(如HA0)產(chǎn)生免疫，該組合疫苗進一步還最適于刺激通過天然糖基化的(滅活的流感病毒)和修飾糖基化的(桿狀病毒/昆蟲細胞產(chǎn)生的HA0)抗原的免疫。
另一益處在于通過對滅活病毒組份和包膜蛋白組份的操作，可提供健康成人所需的幾種劑量水平的、以及老年成人和年幼兒童使用的高劑量水平的預防流感的改進疫苗。
例如，預防水痘的病毒疫苗，可通過混合減毒的水痘皰疹病毒和重組的水痘皰疹病毒包膜糖蛋白D(或片段或前體)來制備。
通過將滅活的麻疹病毒和重組的麻疹病毒包膜F蛋白、病毒包膜HA蛋白、病毒包膜F/HA聚蛋白或這些包膜蛋白(或其片段或前體)的混合物加以混合來制備麻疹疫苗。
其它的疫苗包括(但不限于)滅活的Epstein Barr病毒和重組的病毒gp 340包膜蛋白(或其片段或前體)的組合；滅活的呼吸道合胞體病毒和病毒包膜F蛋白、病毒包膜G蛋白、病毒包膜FG聚蛋白或這些蛋白質(其片段或前體)的混合物的組合；滅活的副流感3型病毒和病毒包膜HA蛋白、病毒包膜HA蛋白、病毒包膜F/HA聚蛋白或這些蛋白質(其片段或前體)的混合物的組合；滅活的單純性皰疹1型病毒和重組的病毒包膜糖蛋白D(或其片段或前體)的組合；以及滅活的單純性皰疹2型病毒和重組的病毒包膜糖蛋白D(或其片段或前體)的組合。
在改進流感疫苗的情況下，通過簡單的等價測驗即可滿足FDA許可對組合疫苗的要求，而不需進行完全規(guī)模的III期群體試驗。在高危人群中的測驗將被簡化，因為該組合疫苗包含已獲準的疫苗組份，預計在年輕和年老個體中的功效將有提高。與不含其它組份的重組蛋白疫苗如HA0疫苗所需的抗原相比，(組合疫苗)需要較少的抗原，因此大規(guī)模的生產(chǎn)需求不大。佐劑如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的摻入極大地增加了疫苗的功效。
實施例下面的實施例進一步對本發(fā)明作了解釋和說明，在任何意義上不應將之看成對本發(fā)明的限制。除非另有說明，所有的份數(shù)和百分數(shù)均為重量份和重量百分數(shù)，并以所在加工階段的組合物的重量為基礎給出。實施例1組合流感疫苗該實施例描述了組合流感疫苗的配方，該組合疫苗采用了可自市售購得的三種滅活流感病毒疫苗中的任何一種，所述的滅活流感病毒疫苗是采用標準的方法自雞胚分離得到的。
三種流感疫苗是來自Connaught Laboratories(Swiftwater，PA)的Fluzone、來自Parke Davis(Morris Plains，NJ)的Fluagen和來自Wyeth Ayerst Laboratories(Philadelphia，PA)的Flushield。這些產(chǎn)品的說明包括劑量、藥方信息、副作用、服用方法和生產(chǎn)方法均公開于Physicians Desk Reference，第49版，Medical Economics Data Production Company，Montvale，NY，1995(908、2660、2740頁)和隨市售產(chǎn)品附送的產(chǎn)品介紹插頁中。(產(chǎn)品的其它信息還可根據(jù)信息自由法案，從Food and DrugAdiministration(食品和藥品管理局)得到，包括各獲準流感疫苗得到批準的綱要。)
向標準成人劑量的上述已獲準的任一流感疫苗中加入0.5ml HA0三價抗原的磷酸鹽緩沖液溶液(PH＝7，該溶液的制備如Powers，D.C.等人(1995)所述)，來制備滅活病毒/重組HA0組合流感疫苗。簡言之，在用含有編碼HA基因的cDNA的桿狀病毒載體感染后，用鱗翅目昆蟲細胞的培養(yǎng)物來生產(chǎn)重組的HA0。在非變性的條件下，純化該表達的蛋白，使純度達到95％以上，用定量掃描光密度測定法測量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳的大量抗原的純度。肽的一致性由氨基酸分析、N-末端測序和采用抗-流感病毒血清的Western印跡分析來確實。三聚體形式的HA0抗原是優(yōu)選的(雖然可采用單體形式的HA0或其他寡聚形式的HA0抗原)。
該HA0三價抗原含有三株流感病毒的各株的HA0，所述的流感病毒存在于市售疫苗中，可用來制備一定流行性季節(jié)的組合疫苗A/北京/353/89、A/德克薩斯/36/91和B/巴拿馬/45/90；A/北京/32/92、A/德克薩斯/36/91和B/巴拿馬/45/90；或者A/山東/9/93、A/德克薩斯/36/91和B/巴拿馬/45/90。將各HA0在所述抗原制劑中的量調(diào)整到終濃度為30微克每毫升，以便在將所述的三價抗原加入到滅活病毒疫苗中后，該組合物疫苗含有15微克的各重組HA0。
以一劑1毫升的劑量將該組合疫苗注射進三角肌中，以此方式來施用該疫苗。在如果注射是在秋季在流行性流感爆發(fā)之前，則效果最好。實施例2組合水痘皰疹疫苗預防水痘皰疹(水痘)的組合疫苗在該實施例中是優(yōu)選的。
在配方中采用的疫苗是由Merckand Co.(West Point，PA)制造最近被食品藥品管理局批準的減毒水痘(水痘皰疹)疫苗，據(jù)報道該疫苗的有效性為70％。該產(chǎn)品的說明包括劑量、藥方信息、副作用、施用方法、生產(chǎn)方法均公開于隨該市售產(chǎn)品附送的產(chǎn)品介紹插頁中。(產(chǎn)品的其它信息還可根據(jù)信息自由法案，從Food and DrugAdiministration(食品和藥品管理局)得到，包括該疫苗得到批準的綱要。)向標準劑量的上述已獲準的水痘疫苗中加入重組水痘皰疹抗原的磷酸鹽緩沖液溶液(PH＝7)0.5ml，來制備減毒病毒/重組包膜蛋白的水痘皰疹組合疫苗。該抗原含有重組的水痘皰疹病毒包膜糖蛋白D，其濃度為100微克每毫升。
該糖蛋白D抗原的制備是采用重組的桿狀病毒載體在鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生相應前體蛋白，從純化的細胞膜中提取并在非變性條件下純化到至少90％的純度。如此獲得的存在于水痘皰疹抗原中的包膜糖蛋白D優(yōu)選為四聚體形式的(雖然也可采用單體、二聚體或其他寡聚形式的包膜糖蛋白D)。
組合疫苗的優(yōu)選劑量為一劑1ml對三角肌肌注。在初始免疫一個月后，進行第二劑加強注射。實施例3其他組合病毒疫苗的制備該實施例描述了本發(fā)明的其他幾種組合疫苗的制備，包括麻疹組合疫苗、Epstein Barr病毒組合疫苗、呼吸道合胞體病毒組合疫苗、副流感3型病毒組合疫苗、單純性皰疹1型病毒組合疫苗和單純性皰疹2型病毒組合疫苗的制備。將高度純化的重組病毒包膜蛋白(成熟形式或前體形式的)與相應的滅活病毒疫苗混合來制備所述的組合疫苗。
用由Merk and Co.生產(chǎn)的市售減毒麻疹病毒疫苗制備麻疹組合疫苗。按本領域技術人員已知的方式制備其它病毒的滅活制劑。總的說來，這些病毒都易于在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生長。收獲病毒并以切線流(tangential flow)過濾濃縮之。利用離心和基于分子排阻或植物凝集素親合的柱層析法對病毒進一步純化。通過各種方法對純化的病毒進行滅活，優(yōu)選在用補骨脂(psoralin)處理以使病毒DNA交聯(lián)后采用光滅活，這樣外層的包膜蛋白不會變性。
已經(jīng)描述了導致細胞結合和細胞融合的上述各病毒的病毒包膜蛋白及其各自的前體蛋白。采用一種或多種包括桿狀病毒/昆蟲細胞培養(yǎng)和哺乳動物表達系統(tǒng)在內(nèi)的重組方法生產(chǎn)這些蛋白質也已經(jīng)描述過了。收獲這些蛋白質的優(yōu)選方法是，先純化含該重組蛋白的細胞膜，然后在非變性的條件下從所述的膜中提取該蛋白質。該純化的蛋白質通常形成較高級的結構(二聚體、三聚體或四聚體)，就如同它們在病毒中存在的時候一樣。雖然單體形式也可采用，但在組合疫苗中優(yōu)選采用這些寡聚形式的蛋白質。重組抗原的純度為至少約90％(雖然較低或更高純度的抗原也可采用)。
優(yōu)選的其他病毒的重組包膜抗原如下病毒 包膜抗原Epstein Barr病毒 gp340呼吸道合胞體病毒F蛋白、G蛋白、FG聚蛋白副流感3型病毒F蛋白、HA蛋白、F/HA聚蛋白麻疹病毒 F蛋白、HA蛋白、F/HA聚蛋白水痘皰疹病毒 包膜糖蛋白D單純性皰疹1型病毒包膜糖蛋白D單純性皰疹2型病毒包膜糖蛋白D將溶在磷酸鹽緩沖液(PH＝7)中的重組抗原和各自的滅活病毒(也在PH＝7的磷酸鹽緩沖液中)混合。調(diào)整在組合疫苗中含有的抗原的量和滅活病毒的量，使1毫升的疫苗中含有各50微克的存在于抗原制劑中的各包膜蛋白，計算病毒的量，使疫苗中含有50微克導致與細胞受體結合的成熟包膜蛋白。
各組合疫苗的優(yōu)選劑量為一劑1ml在三角肌內(nèi)肌注，在一個月后，對所述的三角肌進行肌內(nèi)第二劑加強注射。實施例4高劑量的流感組合疫苗該實施例描述了高劑量的流感組合疫苗。對于65歲以上的成人和2歲以下的兒童，優(yōu)選實施例1所述的滅活病毒/重組HA0流感組合疫苗的配方包含各150微克的每種重組HA0或各100微克的每種重組HA0，而不是如實施例1所述的15微克的量。
將各HA0在所述抗原制劑中的量調(diào)整到每毫升300微克或200微克的終濃度，以便在將所述的三價抗原加入到滅活病毒疫苗中后，該組合疫苗含有各150微克或100微克的各重組HA0。
為了使重組HA0的濃度達到200微克或以上的濃度，通過將層析柱的大小和裝填的樹脂床體積減小50-75％，以及適當?shù)某杀壤販p小洗脫緩沖液的體積，通過重復最后一步洗脫步驟而進一步濃縮從層析柱上洗脫下來的洗脫物?；蛘?，通過在攪拌池中加壓透析來濃縮各重組的HA0。
高劑量組合疫苗的優(yōu)選劑量為一劑1ml在三角肌肌內(nèi)注射該組合疫苗。優(yōu)選在秋季在流行性流感爆發(fā)之前進行該注射。實施例5組合流感疫苗該實施例描述了含有rHA0和rNA的流感組合疫苗。
滅活流感疫苗中神經(jīng)氨糖酸苷酶的含量傾向于可變，這部分是因為對終產(chǎn)物中的滅活病毒的濃度進行了調(diào)整，以產(chǎn)生所需的血細胞凝集素濃度。雖然在美國FDA對批準的疫苗沒有關于神經(jīng)氨糖酸苷酶最低含量的要求，但在歐洲要求在批準的疫苗中包含神經(jīng)氨糖酸苷酶。將規(guī)定量的重組NA加入到現(xiàn)已獲準的疫苗中或加入到實施例1所描述的組合疫苗中或加入到實施例4所描述的高劑量組合疫苗中，提供了抵抗源自病毒性流感的疾病的額外的保護作用。
用重組桿狀病毒表達載體和鱗翅目昆蟲細胞的培養(yǎng)物來生產(chǎn)、提取和在非變性的條件下純化重組的NA，使純度達到90％以上(雖然純度較低或更高的NA也可采用)。該NA抗原為四聚體形式的(雖然也可采用寡聚形式或單體形式的NA)。
向標準成人劑量的市售流感疫苗(如實施例1所述)中加入重組NA三價抗原的磷酸鹽緩沖液溶液(PH＝7)0.5ml，來制備滅活病毒/重組NA流感疫苗的組合疫苗。該NA三價抗原制劑含有在用來制備該組合疫苗的市售疫苗中存在的三株流感病毒的各自的NA。將該抗原制劑中的各重組NA調(diào)整到每毫升10微克的終濃度，以便在將該三價抗原加入到滅活病毒疫苗中后，所述的組合疫苗含有各5微克的各重組NA。
按照實施例1所述的滅活病毒/重組HA0組合疫苗和實施例4所述的高劑量組合疫苗，通過將重組的NA三價抗原的磷酸鹽緩沖液溶液(PH＝7)加入到上述實施例所述的HA0三價抗原中，來制備滅活病毒/重組HA0/重組NA流感疫苗的組合疫苗。如上文所述，將所得的HA0/NA三價抗原制劑加入到已獲準的滅活疫苗中。在用按照實施例1所述的組合疫苗制備疫苗的情況下，將HA0/NA三價抗原制劑中的各NA調(diào)整到每毫升10微克的濃度，以便在該三價抗原加入到滅活病毒疫苗中后，該組合疫苗含有各5微克的各重組NA和各15微克的各重組HA0。
在用按照實施例4所述的組合疫苗制備疫苗的情況下，分別將HA0/NA三價抗原制劑中的各NA調(diào)整到每毫升100微克或67微克的濃度，以便在該三價抗原加入到滅活病毒疫苗中后，該組合疫苗或含有50微克的每種重組NA和150微克的每種重組HA0，或者含有各33.5微克的每種重組NA和100微克的每種重組HA0。在所述的NA三價抗原制劑中，含有在用來制備該組合疫苗的市售疫苗中存在的三株流感病毒的各自的NA。
該組合疫苗的劑量為一劑1ml在三角肌肌內(nèi)注射該組合疫苗。優(yōu)選在秋季在流行性流感爆發(fā)之前進行該注射。
以上描述的意圖是使本領域的技術人員能夠實施本發(fā)明，本文所引用的所有的文獻均引入本文作參考。在此不打算詳盡所有可能的改進和變化，本領域的技術人員在閱讀了本說明書之后，這些改進和變化是顯而易見的。然而這些改進和變化應包括在由權利要求所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。除非在上下文中明確做出了相反的說明，權利要求意欲覆蓋以有效滿足本發(fā)明目的的任何序列和順序排列的所述要素和步驟。
權利要求
1.人用流感病毒疫苗組合物，含有致免疫量的滅活流感病毒和致免疫量的來自該病毒的純化的重組包膜蛋白或該蛋白的片段或前體。
2.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述的重組包膜蛋白是血細胞凝集素。
3.根據(jù)權利要求2的組合物，其中所述的血細胞凝集素是未斷裂的HA0。
4.根據(jù)權利要求3的組合物，其中所述的血細胞凝集素是用桿狀病毒載體在鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生、提取并在非變性條件下純化出來的，其純度至少為90％。
5.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述的滅活流感病毒包括該病毒的三個株系，所述的重組包膜蛋白至少包括源自一株病毒的一種血細胞凝集素。
6.根據(jù)權利要求5的組合物，其中所述的重組包膜蛋白包括對應于每一株病毒的血細胞凝集素。
7.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述的重組包膜蛋白是神經(jīng)氨糖酸苷酶。
8.根據(jù)權利要求7的組合物，其中所述的神經(jīng)氨糖酸苷酶是四聚體。
9.根據(jù)權利要求8的組合物，其中所述的神經(jīng)氨糖酸苷酶是用桿狀病毒載體在鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生、提取并在非變性條件下純化出來的，其純度至少為90％。
10.根據(jù)權利要求7的組合物，其中所述的滅活流感病毒包括該病毒的三個株系，所述的重組包膜蛋白至少包括源自一株病毒的一種神經(jīng)氨糖酸苷酶。
11.根據(jù)權利要求10的組合物，其中所述的重組包膜蛋白包括對應于每一株病毒的神經(jīng)氨糖酸苷酶。
12.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述的重組包膜蛋白包括神經(jīng)氨糖酸苷酶和血細胞凝集素。
13.根據(jù)權利要求10的組合物，其中所述的滅活病毒組份包括該病毒的三個株系，所述的包膜蛋白包括三株病毒中至少一株病毒的血細胞凝集素和三株病毒中至少一株病毒的神經(jīng)氨糖酸苷酶。
14.根據(jù)權利要求1的組合物，還含有佐劑集落刺激因子。
15.根據(jù)權利要求14的組合物，其中所述的佐劑是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。
16.哺乳動物疫苗組合物，含有包含至少兩種組份的組合，所述組合的組份選自致免疫量的滅活病毒、致免疫量的來自該病毒的純化的包膜蛋白或其片段或前體、和有效量的集落刺激因子。
17.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述的集落刺激因子是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。
18.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述的病毒是水痘皰疹病毒，所述的重組蛋白是水痘皰疹病毒包膜糖蛋白D，所述的集落刺激因子是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。
19.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述的病毒是麻疹病毒，所述的集落刺激因子是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，所述的重組蛋白選自病毒包膜F蛋白、病毒包膜G蛋白、病毒包膜FG聚蛋白、或其混合物。
20.根據(jù)權利要求16的組合物，含有三株滅活的流感病毒和該三株病毒中各株的血細胞凝集素，其中所述的血細胞凝集素是未斷裂的HA0，該HA0是用重組桿狀病毒載體在鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生、提取并在非變性條件下純化出來的，其純度至少為90％。
21.根據(jù)權利要求16的組合物，含有三株滅活的流感病毒和該三株病毒中各株的神經(jīng)氨糖酸苷酶，其中所述的神經(jīng)氨糖酸苷酶是四聚體，是用重組桿狀病毒載體在鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生、提取并在非變性條件下純化出來的，其純度至少為90％。
22.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述的組合選自(a)滅活的Epstein Barr病毒和重組的病毒gp 340包膜蛋白的組合；(b)滅活的呼吸道合胞體病毒和重組蛋白的組合，所述重組蛋白選自病毒包膜F蛋白、病毒包膜G蛋白、病毒包膜FG聚蛋白或其混合物；(c)滅活的副流感3型病毒和重組蛋白的組合，所述重組蛋白選自病毒包膜F蛋白、病毒包膜G蛋白、病毒包膜FG聚蛋白或其混合物；(d)滅活的單純性皰疹1型病毒和重組的病毒包膜糖蛋白D的組合；和(e)滅活的單純性皰疹2型病毒和重組的病毒包膜糖蛋白D的組合。
23.根據(jù)權利要求21的組合物，還包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。
24.用于使人抗病毒感染的免疫方法，所述病毒感染選自流感、水痘，該方法包括給人接種疫苗組合物，該疫苗組合物含有包含至少兩種組份的組合，所述組合的組份選自致免疫量的引起所述感染的相應的減毒病毒、有效量的集落刺激生長因子、和致免疫量的源自該病毒的純化的重組包膜蛋白或其片段或前體。
25.根據(jù)權利要求21的方法，其中所述的病毒是流感病毒，所述的集落刺激生長因子是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，所述的重組包膜蛋白選自血細胞凝集素、神經(jīng)氨糖酸苷酶或其混合物。
26.根據(jù)權利要求24的方法，其中所述的疫苗組合物含有三株病毒和對應于每一病毒株的至少一種包膜蛋白。
全文摘要
改進的哺乳動物病毒疫苗是組合物,該組合物包括致免疫量的滅活病毒(如流感病毒、水痘皰疹病毒、麻疹病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感3型病毒、單純性皰疹1型病毒和單純性皰疹2型病毒)和致免疫量的源自病毒的純化的重組包膜蛋白或該蛋白的片段或前體。另外,所述的疫苗可包括滅活病毒和/或包膜蛋白抗原和佐劑如粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子。一種流感疫苗是通過將滅活病毒(優(yōu)選為三株病毒)和血細胞凝集素(優(yōu)選為所述的三株病毒的各自的血細胞凝集素)混合而制得的。另一種流感疫苗是通過將滅活病毒(優(yōu)選為三株病毒)和神經(jīng)氨糖酸苷酶(優(yōu)選為所述的三株病毒的各自的神經(jīng)氨糖酸苷酶)混合而制得的。在第三種實施方案中,疫苗含有滅活病毒和血細胞凝集素和神經(jīng)氨糖酸苷酶,優(yōu)選各使用三株。粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子可任意地加入到這些疫苗中。
文檔編號A61P31/12GK1189103SQ96195070
公開日1998年7月29日 申請日期1996年4月26日 優(yōu)先權日1995年4月28日
發(fā)明者富蘭克林·沃爾沃維茨 申請人:富蘭克林·沃爾沃維茨