專利名稱：改變體毛生長和其色素形成的方法及用于該方法的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在毛囊乳頭中引起程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡的方法以及用于該方法的組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及通過局部應(yīng)用蛋白酶或影響受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑的分子來改變體毛生長和體毛色素形成速度的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動物體毛的一個主要功能是提供環(huán)境保護。但是，在人類中該功能大部分已喪失，人類當(dāng)中，體毛的去留基本上取決于美容目的。
多種方法用于去除不想要的體毛，包括剃除、電針去除、拔除和注射治療用抗雄激素。這些常規(guī)方法有其缺點。如剃除可能在皮膚表面產(chǎn)生切口，使人感到體毛重新生長的速度加快，還可能會留下不希望有的毛樁。而電針去除雖然可能會使某一區(qū)域在較長時間內(nèi)不再出現(xiàn)不想要的體毛，但該方法通常費用昂貴，使人痛苦，還可能會引起疤痕。拔除不但使人疼痛不適，而且經(jīng)常難以除去短毛。使用抗雄激素則經(jīng)常伴有某些討厭的副作用，如對肌肉的影響。而且，除電針去除之外，所有這些方法都必須反復(fù)進行，通常是每日進行，這使得使用者深感不便。由于以上原因，需要有延遲體毛生長的化學(xué)方法。
Ahluwalia等的美國專利5,455,234中報導(dǎo)，哺乳動物的體毛生長可通過向皮膚使用半胱氨酸途徑酶抑制劑而加以改變，該抑制劑會延緩或阻止影響與半胱氨酸相關(guān)的體毛生長速度和特性的代謝途徑。但是，對半胱氨酸的這種抑制也會引起處理區(qū)域該氨基酸的缺乏。與此類似，Ahluwalia的美國專利5,095,007,Ahluwalia等的美國專利5,096,911和5,468,476以及Shander等的美國專利5,132,293和5,143,925中，使用酶抑制劑來改變體毛生長。在上述各例中，一個生化途徑被改變以抑制一種終產(chǎn)物的產(chǎn)生。
若能提供一種從化學(xué)上影響體毛生長和體毛色素形成，而又不致引起使用者中所需氨基酸的缺乏或不想要的副作用的方法，則是比較理想的。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，我們發(fā)明了一種改變哺乳動物體毛生長和體毛色素形成的方法，該方法包括以下步驟，基本上由以下步驟組成或由以下步驟組成在相對體毛生長終期的體毛生長誘導(dǎo)足夠的時間內(nèi)，向哺乳動物皮膚局部應(yīng)用有效量的含蛋白酶的局部活性組合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，我們發(fā)明了一種誘導(dǎo)毛囊乳頭中程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括以下步驟，基本上由以下步驟組成或由以下步驟組成向哺乳動物皮膚局部應(yīng)用局部活性藥物，其具有的第一部分形狀上與胰蛋白酶三維結(jié)構(gòu)中的第二部分類似，因而該第一部分和第二部分均能影響受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，我們發(fā)明了一種組合物，其包括以下成分，基本上由以下成分組成或由以下成分組成a)一種局部活性藥物，其具有的第一部分形狀上與胰蛋白酶三維結(jié)構(gòu)中的第二部分類似，因而該第一部分和第二部分均能影響受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)；和b)一種可藥用或美容用的載劑。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，我們發(fā)明了一種組合物，其包括以下成分，基本上由以下成分組成或由以下成分組成a)含有蛋白酶、能夠在毛囊乳頭中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的局部活性藥物；知b)一種可藥用或美容用的載劑。
本發(fā)明的組合物和方法，通過誘導(dǎo)毛囊乳頭中的細(xì)胞凋亡，提供了延遲體毛生長和體毛色素形成的獨特而又方便的手段。
附圖簡述本專利的文件中包括至少一幅彩圖。向美國專利與商標(biāo)局提出請求并支付所需費用之后，專利與商標(biāo)局可以提供帶有彩圖的該專利文件副本。
參照以下詳述和附圖，可以更好地理解本發(fā)明，本發(fā)明的其它優(yōu)點也是顯而易見的

圖1(a)和1(c)為熒光胰蛋白酶標(biāo)記的C57BI/6小鼠未處理皮膚的橫切面圖。圖1(b)為熒光胰蛋白酶標(biāo)記的C57BI/6小鼠用胰蛋白酶局部處理12天后皮膚的橫切面圖。
圖2為C57BI/6小鼠背部皮膚彩色視圖，其中一些小鼠在誘導(dǎo)體毛生長后立即以載劑或胰蛋白酶處理，處理時間為(a)誘導(dǎo)體毛生長后8天；(b)誘導(dǎo)體毛生長后11天；(c)誘導(dǎo)體毛生長后14天。圖2(a)中，左側(cè)為處理小鼠，右側(cè)為未處理小鼠。圖2(b)和2(c)中，左側(cè)為未處理小鼠，中間為載劑處理小鼠，右側(cè)為胰蛋白酶處理小鼠。
圖3A為體毛誘導(dǎo)后(a)4天；(b)5天；(c)8天；和(d)12天，未處理小鼠皮膚的毛囊組織切片。圖3B為體毛誘導(dǎo)后(a)4天；(b)5天；(c)6天；(d,e)8天；和(f)12天，胰蛋白酶處理小鼠皮膚毛囊組織切片。
圖4(A)為體毛誘導(dǎo)后(a)1天；(b)2天；(c)3天，未處理小鼠TUNEL染色皮膚組織的橫切面圖。圖4(B)為體毛誘導(dǎo)后(a)1天；(b)2天；(c)3天；(d)4天；(e)5天；和(f)8天((a)-(e)為使用一次胰蛋白酶，(f)為每日使用胰蛋白酶)，胰蛋白酶處理小鼠TUNEL染色皮膚組織的橫切面圖。
圖5為在一延遲體毛周期中，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定的胰蛋白酶處理小鼠和未處理小鼠皮膚的基因表達(dá)圖。圖5(A)示出該延遲體毛周期中1到11天的mRNA水平。圖5(B)示出該延遲體毛生長周期中第8天的mRNA水平。圖中示出25ng(A)和250ng(B)總RNA的RT-PCR產(chǎn)物。
發(fā)明詳述本文中，“哺乳動物”指包括哺乳綱的高等脊椎動物的任何成員，同Webster＇s Medical Desk Dictionary 407(1986)的定義，包括但不限于人類?！?％,w/v)”指每100ml組合物中給定成分的克數(shù)。“受體”包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外受體，指能接收和傳導(dǎo)信號的分子。
適合用于本發(fā)明組合物的局部活性藥物包括蛋白酶，結(jié)構(gòu)基本上與胰蛋白酶三維結(jié)構(gòu)的一部分類似的化合物或其混合物。
優(yōu)選的蛋白酶為絲氨酸蛋白酶，包括但不限于胰蛋白酶，羧肽酶Y，蛋白酶Ⅳ，枯草溶菌素或混合物。選用的蛋白酶為胰蛋白酶。若不囿于理論，我們認(rèn)為這些蛋白酶能夠延遲體毛生長和體毛色素形成，原因在于它們通過誘導(dǎo)毛囊乳頭中的程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡而改變了體毛生長周期，這種改變可能是由受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)的。優(yōu)選本發(fā)明組合物的總體積中，蛋白酶的量為約0％(w/v)到約5％(w/v)，更優(yōu)選約0.01％(w/v)到約1％(w/v)。
如本文實施例10所述，我們意外地發(fā)現(xiàn)，蛋白酶的蛋白水解活性不是影響誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的唯一因素。若不囿于理論，我們還認(rèn)為，受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)事件可能也有助于誘導(dǎo)毛囊乳頭中的程序性細(xì)胞死亡，這類藥物可能與局部活性藥物的結(jié)構(gòu)成分有關(guān)。
因此，第二種合適的局部活性藥物包括下述化合物，其具有的一個部分形狀上與影響該受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的胰蛋白酶分子三維結(jié)構(gòu)部分類似。本文中，“形狀上基本類似”指所述化合物包括充足的表現(xiàn)類似于配體的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能占據(jù)一個受體，或取代受體的配體，或者通過蛋白水解激活或滅活受體，因而有助于誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。這類形狀上基本與胰蛋白酶三維結(jié)構(gòu)中的一部分類似的化合物包括但不限于蛋白水解滅活胰蛋白酶，其為不能消化膠原等蛋白的胰蛋白酶形式。優(yōu)選在本發(fā)明組合物總體積中，這些化合物的量為約0％(w/v)到約5％(w/v)，最優(yōu)選約0.01％(w/v)到約1％(w/v)。
如果局部活性藥用或美容用藥物的釋放參數(shù)要求的話，本發(fā)明的局部活性組合物可優(yōu)選進一步包括可藥用或美容用載劑，所述載劑能作為釋放系統(tǒng)，使得局部活性藥物能進入毛囊中。盡管可向皮膚附屬結(jié)構(gòu)(此處為毛囊)釋放蛋白酶的任何商用載劑均可用作所述可藥用或美容用載劑，但優(yōu)選的是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體優(yōu)選非離子型，并由以下成分組成a)二月桂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯；b)具有見于膽固醇中的類固醇骨架的化合物；c)具有大約12到18個碳原子的脂肪酸醚，其中細(xì)成脂質(zhì)體的化合物各自比例約為53∶10∶22到63∶20∶32，優(yōu)選約55∶12∶24到61∶18∶30。最優(yōu)選由二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚(GDL)組成的脂質(zhì)體。優(yōu)選在本發(fā)明的組合物總體積中，脂質(zhì)體的量約為10mg/mL到100mg/mL，更優(yōu)選約25mg/mL到50mg/mL。最優(yōu)選比例約為58∶15∶27。合適的脂質(zhì)體優(yōu)選根據(jù)實施例2的方法制備，但其它本領(lǐng)域常用的方法也可使用。
上述組合物可通過以下方法制備在合適的容器中合并所需成分，在室溫下，采用非離子型脂質(zhì)體制備中熟知的高剪切混合手段將各成分混合，例見Niemiec等“非離子型脂質(zhì)體組合物對肽藥物局部釋放進入毛皮脂單位的影響倉鼠耳模型的活體研究”，12 Pharm.Res.1184-88(1995)(“Niemiec”)，本文全文引作參考。
在一個優(yōu)選實施方案中，局部活性藥用或美容用組合物的pH可使用已知的pH調(diào)節(jié)劑進行調(diào)節(jié)，使得最終組合物的pH為約2-8。pH調(diào)節(jié)劑包括但不限于N-2-羥乙基哌嗪-N′2-乙烷磺酸，其可購自例如Life Technologies，商品名為“Hepes”，或(羥甲基)氨基甲烷，其可購自Life Technologies，商品名為“Tris”，檸檬酸及其混合物。
在另一個實施方案中，局部活性藥用或美容用組合物可以與其它成分組合，所述其它成分如保濕劑，發(fā)泡劑，美容佐劑，抗氧化劑，表面活性劑，發(fā)泡劑，調(diào)節(jié)劑，濕潤劑，芳香劑，增稠劑，緩沖劑，防腐劑等，其使用量應(yīng)不破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生美容用或藥用產(chǎn)品，包括但不限于剃毛乳膏，剃毛膠，剃毛粉，化學(xué)脫毛乳膏等。
在本發(fā)明另一個實施方案中，我們發(fā)明了改變哺乳動物體毛生長和體毛色素形成的方法，該方法是大致在體毛生長誘導(dǎo)之時，向動物皮膚表面使用局部活性藥用或美容用組合物。
體毛生長終期毛囊的體毛生長誘導(dǎo)可通過本領(lǐng)域熟知的任何方法實現(xiàn)，所述方法包括但不限于剃除，蠟脫毛，化學(xué)脫毛及其組合。
盡管局部活性藥用或美容用組合物使用于皮膚的時機及組合物保持在皮膚上的時間長短可以變動，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員無需過多試驗就可以認(rèn)識到，局部活性組合物優(yōu)選在體毛生長終期進行體毛生長誘導(dǎo)之前、之后立即或同時用于皮膚表面。本文中，“立即”限定為大約一小時之內(nèi)。更優(yōu)選局部活性藥用或美容用組合物在體毛生長誘導(dǎo)同時或之后立即使用，留置于皮膚上的時間應(yīng)足以延遲體毛生長，優(yōu)選時間為使用后至少約5分鐘，更優(yōu)選使用后至少約15分鐘。
局部活性藥用或美容用組合物的用量應(yīng)可以有效改變哺乳動物的體毛生長和體毛色素形成。本文中，“有效量”指足以覆蓋需要延遲體毛生長和體毛色素形成的皮膚表面區(qū)域的量。優(yōu)選組合物用于皮膚表面使得需要延遲體毛生長和體毛色素形成的區(qū)域，局部活性藥物的量為約2μl/cm2到8μl/cm2。
我們意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)局部活性藥物如絲氨酸蛋白酶大致在體毛生長誘導(dǎo)之時局部用于動物皮膚時，獲得了至少約9天的體毛生長和體毛色素形成的明顯延遲。我們進一步認(rèn)為，由于人類體毛生長周期通常要慢于小鼠，人類的體毛生長延遲可能會大大超過9天。
通過本文公開的內(nèi)容，無需本文具體公開的成分、組分或步驟亦可實施本發(fā)明。以下提供了一些實施例進一步說明本發(fā)明的本質(zhì)和實施方式。但是，本發(fā)明并不由具體細(xì)節(jié)所限定。實施例實施例1小鼠受試者的脫毛12只C57BI/6雌性小鼠獲自Charles River(Kingston,NY)，它們均為6-10周齡，分別處于體毛生長的靜止期(體毛生長終期)，根據(jù)Stenn等的方法(“再論糖皮質(zhì)激素對體毛生長起始的作用”，6 Skin Pharmacol.,125-134(1993))，每只動物背部通過蠟脫毛(拔除)誘導(dǎo)體毛生長。眾所周知，在小鼠中脫毛時，所有毛囊的生長周期(生長期)同步起始。
如表1所示，在誘導(dǎo)部位觀察到下列現(xiàn)象表1誘導(dǎo)部位觀察結(jié)果
由表1可見，脫毛后幾天當(dāng)動物粉色皮膚開始變暗時可見體毛生長。這可能是由于毛干中的體毛色素形成，因為C57BI/6小鼠只有毛囊中含有黑素細(xì)胞，而表皮中沒有。
也通過化學(xué)脫毛誘導(dǎo)12只類似的C57BI/6小鼠始于體毛生長終期的體毛生長，化學(xué)脫毛劑購自Carter-Wallace，商品名為“Nair”，其用量為使每只小鼠背部濕潤?；瘜W(xué)脫毛中，深部的毛囊不受影響，深部的前一周期中的毛干在真皮中不受影響，直至被新生毛推出。新體毛周期的生長方式與表1所述相同。
由于鼠的體毛周期不僅在不同品系間不同，在不同個體中也不相同，用剪子自每只小鼠取2cm×1cm皮膚樣品，用來自Stephens Scientific的10％福爾馬林緩沖液，pH6.9-7.1 25℃下固定，然后根據(jù)公知的方法制成石蠟包埋塊。按本領(lǐng)域公知的方法，用包埋塊切片，H&E染料染色，進行組織學(xué)檢查，確證體毛周期的階段。本實施例所得的組織切片圖示于圖3A。
該實施例顯示，C57BI/6小鼠的體毛生長周期平均約為25天，不管使用何種脫毛方法，毛囊及毛干發(fā)育的時間均相似。實施例2局部活性組合物的制備獲自Sigma-Aldrich Corporation的足量凍干胰蛋白酶與0.05M N-2-羥乙基哌嗪-N＇-2-乙烷磺酸緩沖水溶液混合，上述溶液購自LifeTechnologies，商品名為“Hepes”，使所得溶液pH為約7.4，其中胰蛋白酶濃度為約2％(w/v)。1體積所得胰蛋白酶溶液與1體積水為載劑的(5％)二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚脂質(zhì)體混合，后者按Niemiec所述方法制備，以使所得局部活性組合物中胰蛋白酶濃度為1％(w/v)。實施例3將胰蛋白酶釋放到毛囊中4只7-8周齡雌性C57BI/6小鼠購自Charles River(Kingston,NY)，由6cm×2cm區(qū)域拔毛后12天，向該區(qū)域使用實施例2的局部活性組合物約100μl/鼠。本實施例中所用的胰蛋白酶用FluoReporter蛋白標(biāo)記試劑盒進行熒光標(biāo)記，試劑盒來自Molecular Probes,Inc.，使用方法如所附說明書(1997)，使用異硫氰酸熒光素(FITC)熒光標(biāo)記，其也購自MolecularProbes,Inc。
使用熒光標(biāo)記的胰蛋白酶處理之后1小時和4小時，按實施例1的方法，每只小鼠取2cm×1cm皮膚樣品，制成石蠟包埋塊，然后切片，進行組織學(xué)檢查。
如圖1所示，幾乎所有熒光標(biāo)記見于毛囊內(nèi)。在1小時(圖1(c))和4小時(圖1(a))檢查的小鼠組織學(xué)染色特征相同，以后的時間點未見進一步皮膚穿透。該觀察結(jié)果揭示不存在非特異性細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶消化，否則在較后的時間點會顯示熒光標(biāo)記更深地穿透進入角質(zhì)層。
在4只類似的7-8周齡C57BI/6雌性小鼠中重復(fù)上述試驗，不同的是小鼠在誘導(dǎo)后12天每天用實施例2的1％(w/v)胰蛋白酶處理。誘導(dǎo)后第12天，在使用熒光胰蛋白酶之后4小時，使用類似的組織學(xué)方法分析小鼠皮膚。如圖1(b)所示，胰蛋白酶釋放進入處理區(qū)皮膚毛囊的途徑未見大的變化。然而，胰蛋白酶處理皮膚角質(zhì)層的外部輪微染色表明了屏障完整性的一定損失。
本實施例表明向生長期動物皮膚表面使用含胰蛋白酶的局部活性組合物導(dǎo)致胰蛋白酶主要向毛囊釋放，短期和長期使用后均是如此。實施例4胰蛋白酶延遲體毛生長和體毛色素形成根據(jù)實施例3的方法，體毛生長誘導(dǎo)后立即向12只7-8周齡C57 BI/6雌性小鼠局部使用單劑實施例2制備的局部活性組合物。
如圖2所示，體毛生長誘導(dǎo)后使用單劑胰蛋白酶延遲了體毛生長和體毛色素形成。較深的皮膚顏色表明體毛周期的進行性階段，該階段之后毛干可見。未處理和脂質(zhì)體(載劑)處理的對照在體毛生長誘導(dǎo)后7-8天可見深色皮膚(圖2a，左邊為處理小鼠，右邊為未處理小鼠)，它們的毛干在11-13天可見(圖2b，左邊為未處理小鼠，中間為載劑處理小鼠，右邊為處理小鼠)。相形之下，胰蛋白酶處理小鼠在第8天皮膚仍為粉紅色(圖2a，左側(cè)小鼠)；在第11天為略呈深紅(圖2b，右側(cè)小鼠)；在第14天皮膚為灰色(圖2c，右側(cè)小鼠)。盡管胰蛋白酶處理小鼠的毛干在第15-17天可見，但這些毛干質(zhì)量較差，不如對照濃密；然而，再過4-7天，除長度外這些毛干在各方面都與對照中相同。
本實施例表明胰蛋白酶可有效延遲體毛生長和體毛色素形成。實施例5胰蛋白酶處理毛囊的組織學(xué)按照實施例3的方法，體毛誘導(dǎo)后向3只7-8周齡雌性C57 BL/6小鼠皮膚表面使用單劑實施例2制備的局部活性組合物。
如實施例1的方法，取未處理、載劑處理(未示出)和胰蛋白酶處理小鼠1cm×2cm皮膚樣品，H&E染色，然后進行組織學(xué)檢查。如圖3所示，染色樣品的組織學(xué)分析揭示胰蛋白酶處理小鼠的毛囊發(fā)育明顯被延遲。更具體地說，首次觀察到特征性板層結(jié)構(gòu)、膨大的毛囊和新體毛色素形成，要較未處理和載劑處理的對照中首次觀察到這些特征晚幾天。此外，胰蛋白酶處理小鼠皮膚毛囊顯示出膨脹的漏斗形，圖3B(a-e)中最為清楚，如圖3A(a-b)所示，這一現(xiàn)象在未處理和載劑處理小鼠中不存在。這一觀察結(jié)果證實，用含胰蛋白酶的組合物處理也會導(dǎo)致體毛生長質(zhì)量下降，即更細(xì)、更稀。用胰蛋白酶處理后7-8天，某些處理毛囊的深部開始形成上皮層狀結(jié)構(gòu)，如圖3B(d-e)所示，但其淺部仍為中空結(jié)構(gòu)，圖3B(d)中最為清楚。用胰蛋白酶處理后11-12天，大多數(shù)處理的毛囊已成熟，但體毛色素形成較差，毛干長度較短，類似于未處理毛囊誘導(dǎo)后4-5天的特征(比較圖3A(d)與圖3B(f))。
本實施例通過組織學(xué)分析進一步表明，體毛生長誘導(dǎo)小鼠皮膚局部使用胰蛋白酶顯著延遲了體毛生長和體毛色素形成。實施例6胰蛋白酶誘導(dǎo)毛囊乳頭中的細(xì)胞凋亡按照實施例3的方法，在體毛誘導(dǎo)之后向3只7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2制備的局部活性組合物。
按實施例1的方法取未處理和胰蛋白酶處理小鼠的1cm×2cm皮膚樣品，然后通過TdT介導(dǎo)的dUTP-生物素切口末端標(biāo)記(TUNEL)法分析，該方法見Gavrieli等“通過核內(nèi)DNA片段的特異標(biāo)記原位識別程序性細(xì)胞死亡，”119 J.Cell Biology 493-501(1992)(“Gavrieli”)。在上述操作中，制備的皮膚石蠟切片使用購自O(shè)ncor,Inc.的“ApopTagTMPlus原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒”染色，方法如Oncor,Inc.的“ApopTagTMPlus原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒”說明書(1995年2月)，該方法基于Gavrieli所述的DNA片段末端標(biāo)記。圖4示出了組織學(xué)分析結(jié)果，其中染色包括過氧化物酶終點(棕色)和甲基綠復(fù)染。
類似地，由小鼠未處理皮膚制備適合TUNEL染色的石蠟切片。將切片染色并進行組織學(xué)分析；結(jié)果見圖4A(a-c)。
如圖4所示，TUNEL染色樣品通過形態(tài)(致密或片段化的胞核和胞質(zhì)或凋亡小體)或著色(致密的胞核中DNA片段染成棕色)限定了凋亡細(xì)胞。更具體而言，圖4B(a-e)顯示，在體毛生長誘導(dǎo)后第一周，處理的毛囊乳頭中均可檢測到凋亡小體。但是，胰蛋白酶處理不影響毛囊其它部分、表皮或真皮。相形之下，圖4A(a-c)未處理樣品的TUNEL染色顯示，未處理的早生長期毛囊中偶爾可檢測到極低水平的細(xì)胞凋亡；但是，在毛囊峽部總可見到細(xì)胞凋亡，因而毛囊濾泡以上細(xì)胞凋亡充分。大多數(shù)未處理毛囊未顯示任何細(xì)胞死亡。
本實施例顯示向已脫毛皮膚使用胰蛋白酶，使得相對于未處理或載劑處理對照，胰蛋白酶處理的毛囊乳頭中細(xì)胞凋亡增加。實施例7胰蛋白酶誘導(dǎo)體毛周期中基因表達(dá)的改變根據(jù)實施例3的方法，在體毛誘導(dǎo)之后向6只7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2制備的局部活性組合物。
在圖5所示時間間隔，按實施例1所述取未處理小鼠和胰蛋白酶處理小鼠的皮膚，然后使用來自Tel-Test“B”的“RNA Stat-60”試劑提取總RNA，上述試劑的描述見Chomczymski，“使用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取RNA的方法，”162 Anal.Biochem.156-59(1987)。向每只小鼠中提取的RNA中加入足量無RNase的DNase，酶來自Promega公司，商品名為“RQ1無RNase的DNase”使得各樣品均含200ng DNase消化的RNA，方法見Promega公司出版的“無RNase的DNase”說明書(1995年5月)。所得200ng DNase消化的RNA使用隨機六聚體進行反轉(zhuǎn)錄(“RT”)，方法見Gibco-BRL(現(xiàn)為Life Technologies,Incorporated)出版的“SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶”說明書(1992年4月)，隨機六聚體如購自Life Technologies,Incorporated的隨機引物。
所得RT產(chǎn)物通過聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)擴增，反應(yīng)使用約0.5單位(每100μl反應(yīng))熱穩(wěn)定性DNA聚合酶和約0.1μmol/反應(yīng)基因特異性引物，酶購自Rerkin-Elmer-Cetus公司，商品名為“Taq聚合酶”，引物獲自Clontech Laboratories,Inc.(“Clontech”)或按表2進行設(shè)計，方法同Clontech引物所附說明書中擴增小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的方法，或如表2所述。
表2列出了使用的某些DNA引物，PCR反應(yīng)所需的MgCl2量及PCR循環(huán)的長度。
表2用于RT-PCR試驗的DNA引物<
PCR產(chǎn)物通過2％瓊脂糖/溴化乙錠凝膠根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進行分析，以便比較胰蛋白酶處理和未處理小鼠體毛周期中某些基因的表達(dá)水平。為更好地進行觀察，所得PCR產(chǎn)物根據(jù)熟知的方法用乙醇沉淀。當(dāng)使用G3PDH引物時，只使用10％的PCR反應(yīng)產(chǎn)物。每一PCR擴增設(shè)置一個陰性對照，使用未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚RNA樣品。若陽性對照不能夠買得到，使用具有非同步體毛周期的6月齡雌性C57BI/6小鼠的皮膚RNA樣品作為陽性對照。RT-PCR產(chǎn)物在凝膠上的遷移均與陽性對照相同，亦與報道的擴增引物大小一致。
然后通過分析各產(chǎn)物中一種“管家”基因G3PDH的mRNA水平，比較各RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物的相對質(zhì)量。如圖5所示，在檢查的所有時間點G3PDH基因表達(dá)相近，因而可以對所需基因的相對表達(dá)水平進行比較。
為證實毛囊發(fā)育延遲不是由于非特異性刺激或炎癥應(yīng)答，我們分析了此種情況下一般下調(diào)的基因的mRNA水平。檢查了RT-PCR產(chǎn)物基因的mRNA水平之后，我們發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-10和GM-CSF的mRNA水平?jīng)]有變化，TNFα略微上調(diào)，TNFβ和TNF-RI略微下調(diào)，巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)蛋白(MIP)中度下調(diào)，如表3所示。
表3基因表達(dá)特征<
<p>- 未檢測到表達(dá)+ 強帶+/- - 極弱帶 + + 較強帶+/- 弱帶+ + + 極強帶表3的基因表達(dá)分布圖否定了炎癥反應(yīng)或?qū)φ嫫ご碳さ膽?yīng)答。
IL-1αmRNA水平中度上調(diào)(圖5b及表3),IL-1α為與培養(yǎng)物中體毛周期抑制相關(guān)的基因。由于IL-1α誘導(dǎo)也可能由于表皮屏障功能的喪失，我們通過測定經(jīng)表皮水損失(TEWL)分析了屏障完整性。TEWL使用獲自Servomecl AB的“Evaporimeter EPI”蒸發(fā)計測定，首先以室內(nèi)濕度標(biāo)定蒸發(fā)計，然后將探頭置于受試者皮膚上。結(jié)果顯示，TEWL僅中度增加，與胰蛋白酶濃度不一致，如表4所示。
表4胰蛋白酶處理皮膚的TEWL
因此，可能表3和圖5所示的RT-PCR產(chǎn)物中IL-1α的任何上調(diào)均與體毛生長抑制相聯(lián)系。
如圖5a-b及表3所示，IL-1B及IFNγ的mRNA水平均大幅增加，已知二者在簇狀脫發(fā)中均上調(diào)，均與體毛生長抑制相聯(lián)系。這進一步表明，只有胰蛋白酶上調(diào)的炎癥相關(guān)基因與體毛生長抑制相聯(lián)系。
如表3所示，在延遲期中，c-myb、c-myc和c-fos的mRNA水平略微下降，而c-jun水平略微上升。膠原酶基因通過AP-1應(yīng)答元件調(diào)節(jié)，其水平也略微下降。某些基因的mRNA水平的普遍略微下降進一步表明胰蛋白酶處理皮膚體毛生長的全面延遲。
如圖5A和表3所示，體毛色素形成的關(guān)鍵酶酪氨酸酶在體毛生長期延遲期間下調(diào)，而當(dāng)開始克服延遲時，其mRNA水平增加。如圖5A和表3所示，在延遲期間促黑素原肽促黑激素(MSH)的前體POMC中度下調(diào)。這兩個基因的下調(diào)表明胰蛋白酶也影響體毛色素形成的調(diào)節(jié)。
本實施例表明，胰蛋白酶對體毛周期的影響可通過觀察延遲期間一系列基因的表達(dá)特征而理解。已清楚地證實了在體毛周期中胰蛋白酶誘導(dǎo)的mRNA水平變化，表明了胰蛋白酶在體毛生長和體毛色素形成中的調(diào)節(jié)作用。并且，本實施例還反映了局部使用胰蛋白酶對體毛生長和體毛色素形成基因的特異性。實施例8其它影響體毛生長的絲氨酸蛋白酶按照實施例3的方法，在體毛誘導(dǎo)后向7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2制備的局部活性組合物。
重復(fù)實施例3的操作，但分別用羧肽酶-Y蛋白酶Ⅳ和枯草溶菌素代替胰蛋白酶。
處理后8天，每只小鼠的皮膚使用Minolta Chromameter CR300型比色計檢查，以比較其皮膚顏色。
我們注意到胰蛋白酶誘導(dǎo)的體毛生長延遲期最長，胰蛋白酶為內(nèi)肽酶家族的一個成員，它在精氨酸和賴氨酸的C側(cè)切斷蛋白。相形之下，羧肽酶-Y在蛋白的C末端水解L-氨基酸，蛋白酶Ⅳ在中性pH切斷56％的肽鍵，它是非特異性外肽酶家族的一個成員，二者只有極低的延遲效應(yīng)，而枯草溶菌素是非特異性肽酶家族的一個成員，它在堿性pH時切斷肽鍵，它略微增加體毛生長速度。本實施例的結(jié)果見表5。
表5絲氨酸蛋白酶處理皮膚的顏色測定
(L*標(biāo)尺0=黑，100=白，為根據(jù)皮膚表面觀察的體毛色素形成的測定值。)如表5所示，胰蛋白酶處理的毛囊發(fā)育最不充分，因而皮膚顏色最淺。本實施例表明，皮膚顏色表現(xiàn)與毛囊中體體毛育有關(guān)。
由于胰蛋白酶處理皮膚所得結(jié)果表明胰蛋白酶在延遲體毛生長和體毛色素形成方面相對更好，本實施例證實胰蛋白酶對體毛生長和體毛色素形成的作用不僅僅是由于非特異性的蛋白水解，還可能是由于胰蛋白酶誘導(dǎo)的特異活性引起程序性細(xì)胞死亡途徑的激活。實施例9胰蛋白酶影響體毛生長誘導(dǎo)的早期步驟按照實施例3的方法，在體毛生長誘導(dǎo)后向3只7-8周齡雌性C57BL/6小鼠的皮膚表面使用單劑如實施例2制備的局部活性組合物。另9只小鼠亦重復(fù)上述操作，但處理分別為每周2次、3次或7次。
觀察小鼠皮膚顏色8天后，可見處理小鼠皮膚顏色淺于未處理的對照。這進一步表明胰蛋白酶處理的毛囊發(fā)育最不充分，因而使得皮膚顏色最淺。
按實施例1的方法取各種處理小鼠的1cm×2cm皮膚樣品，H＆E染色，然后進行組織學(xué)檢查。染色樣品的組織學(xué)分析表明，增加胰蛋白酶處理動物的次數(shù)并未延長體毛生長的延遲期。這表明絲氨酸蛋白酶誘導(dǎo)細(xì)胞死亡由特異定時的事件引起。
為確定該特異事件的時間，按照實施例3的方法，在體毛誘導(dǎo)后向7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2制備的局部活性組合物，但處理在表6所示的不同時間點進行。
如表6所示，根據(jù)實施例8的方法對皮膚顏色的比色測定證實深色增加(色素更多，延遲更少)與體毛生長誘導(dǎo)和胰蛋白酶使用之間間隔時間增加相應(yīng)。體毛生長誘導(dǎo)后立即處理的小鼠體毛生長和體毛色素形成的延遲期最長。體毛生長誘導(dǎo)后2小時和4小時處理小鼠表現(xiàn)出延遲期更短的體毛周期。脫毛后6小時或更長時間處理的小鼠體毛生長未見延遲，與未處理的對照沒有區(qū)別。
表6胰蛋白酶處理皮膚的顏色測定
**皮膚樣品在脫毛后8天測試。
本實施例表明，在體毛生長誘導(dǎo)后4小時，優(yōu)選立即，向皮膚使用胰蛋白酶可有效延遲體毛生長和體毛色素形成。實施例10胰蛋白酶的作用可能涉及受體介導(dǎo)的途徑按照實施例3的方法，在體毛誘導(dǎo)后向7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用單劑如實施例2制備的局部活性組合物，但胰蛋白酶濃度由1％(w/v)到0.01％(w/v)(4×10-4M-4×10-6M)變化。脫毛后第9天，按實施例9的方法對小鼠進行比色分析。
如圖7所示，比色分析的結(jié)果表明亮色增加(L*，白色更多，色素更少)與胰蛋白酶濃度減少及體毛周期延遲增加相應(yīng)。
表7胰蛋白酶處理皮膚的亮色
L*標(biāo)尺0=黑，100=白**樣品在脫毛后9天分析。
本實施例表明存在著受體介導(dǎo)的機制，包括高劑量脫敏。實施例11胰蛋白酶的蛋白水解活性對延遲體毛生長不是必需的實施例2的組合物在室溫下溫育48小時，然后通過獲自Pan VeraCorporation的絲氨酸蛋白酶活性檢測試劑盒分析其蛋白水解活性，結(jié)果表明其中已檢測不到蛋白水解活性。按照實施例10的方法，在體毛誘導(dǎo)后向3只7-8周齡雌性C57BL/6小鼠皮膚表面使用該滅活組合物。脫毛后第9天，通過實施例8的方法對小鼠進行比色分析。如表7所示，很明顯胰蛋白酶缺乏蛋白水解活性并不降低其延遲體毛生長的活性。
重復(fù)以上操作，但溫育的胰蛋白酶代之以100℃煮沸10分鐘的胰蛋白酶。結(jié)果表明，使用同樣滅活了蛋白水解活性的煮沸的胰蛋白酶，對體毛生長沒有延遲作用。煮沸破壞了胰蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)，這表明是胰蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)，而非其蛋白水解活性對體毛周期的延遲效應(yīng)起作用。無論胰蛋白酶是阻斷存活信號還是激活死亡受體來引發(fā)該過程，本實施例都表明胰蛋白酶分子的構(gòu)象可能也有助于誘導(dǎo)毛囊乳頭中的程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡。實施例12含胰蛋白酶組合物的應(yīng)用二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚脂質(zhì)體按Niemiec的方法制備，其中脂質(zhì)體各組成成分的比例為約58∶15∶27。
待脂質(zhì)體溫度降至約40℃后，將脂質(zhì)體按常規(guī)混合加至一定量的增稠劑中，增稠劑由聚丙烯酰胺(和)C13-C14異石蠟(isoparaffin)(和)Iaureth-7組成，獲自Seppic,Inc.，商品名為“SEPIGEL 305”，使得最終組合物中增稠劑的量為約1-3％(w/v)。
然后向其中加入足量胰蛋白酶，得到1％的胰蛋白酶(w/v)組合物。該組合物適于立即局部使用。
所得產(chǎn)品具有有效剃毛膠的特點和性質(zhì)。
權(quán)利要求
1．改變哺乳動物體毛生長和體毛色素形成的方法，包括在相對體毛生長終期的體毛生長誘導(dǎo)足夠的時間內(nèi)，向動物的皮膚局部使用有效量的含有蛋白酶的局部活性組合物。
2．權(quán)利要求1的方法，其中蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。
3．權(quán)利要求2的方法，其中蛋白酶選自胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶Ⅳ、枯草溶菌素或其混合物。
4．權(quán)利要求3的方法，其中蛋白酶是胰蛋白酶。
5．權(quán)利要求4的方法，其中蛋白酶的量為局部活性組合物總體積的約0％(w/v)到5％(w/v)。
6．權(quán)利要求5的方法，其中蛋白酶的量為局部活性組合物總體積的約0.01％(w/v)到1％(w/v)。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述的改變之一是延遲體毛生長和體毛色素形成。
8．權(quán)利要求1的方法，其中所述局部活性組合物還包括可藥用或美容用載劑。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述可藥用或美容用載劑為脂質(zhì)體或其混合物。
10．權(quán)利要求9的方法，其中所述脂質(zhì)體為非離子型。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述脂質(zhì)體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；b)具有見于膽固醇中的類固醇骨架的化合物或其混合物；及c)具有約12到18個碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
12．權(quán)利要求10的方法，其中所述脂質(zhì)體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯；b)膽固醇；及c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
13．權(quán)利要求11的方法，其中所述脂質(zhì)體中各組分的比例約為53∶10∶22到63∶20∶32。
14．權(quán)利要求8的方法，其中所述可藥用或美容用載劑的量基于所述局部活性組合物的總體積約為0mg/mL到100mg/mL。
15．權(quán)利要求1的方法，其中體毛生長終期體毛的生長誘導(dǎo)是通過剃除、電針去除、蠟脫毛、化學(xué)脫毛或所述方法的組合完成的。
16．權(quán)利要求1的方法，其中所述時間為與體毛生長終期毛囊的體毛生長誘導(dǎo)同時或在其之前或之后即時。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所述時間為與體毛生長誘導(dǎo)同時或在其之后即時。
18．權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物還包括表面活性劑、保濕劑、濕潤劑、調(diào)節(jié)劑、芳香劑、色劑或其混合物。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所述組合物的形式為剃毛乳膏、剃毛膠、剃毛粉、化學(xué)脫毛乳膏、其它目的在于促進體毛去除或?qū)嶋H去除體毛的產(chǎn)品或其組合。
20．權(quán)利要求1的方法，還包括使所述組合物在皮膚上保留足夠的時間從而實現(xiàn)所述改變。
21．權(quán)利要求20的方法，其中所述時間為至少約15分鐘。
22．權(quán)利要求1的方法，還包括將所述蛋白酶與含N-2-羥乙基哌嗪-N＇-2-乙烷磺酸、(羥甲基)氨基甲烷或其混合物的緩沖液混合。
23．在哺乳動物的毛囊乳頭中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡的方法，包括向哺乳動物的皮膚局部使用局部活性藥物，其具有的第一部分形狀上與胰蛋白酶三維結(jié)構(gòu)的第二部分類似，因而所述第一部分和第二部分均能影響受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。
24．權(quán)利要求23的方法，其中所述藥物為胰蛋白酶、蛋白水解活性滅活的胰蛋白酶或其組合。
25．含有以下成分的組合物a)一種局部活性藥物，其具有的第一部分形狀上與胰蛋白酶三維結(jié)構(gòu)的第二部分類似，因而所述第一部分和第二部分均能影響受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)；及b)可藥用或美容用載劑。
26．權(quán)利要求25的組合物，其中局部活性藥物為胰蛋白酶、蛋白水解活性滅活的胰蛋白酶或其組合。
27．權(quán)利要求25的組合物，其中局部活性藥物為組合物總體積的約0％(w/v)到5％(w/v)。
28．權(quán)利要求25的組合物，其中局部活性藥物為組合物總體積的約0.01％(w/v)到1％(w/v)。
29．權(quán)利要求25的方法，其中所述可藥用或美容用載劑為脂質(zhì)體。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述脂質(zhì)體為非離子型。
31．權(quán)利要求30的方法，其中所述脂質(zhì)體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；b)具有見于膽固醇中的類固醇骨架的化合物或其混合物；及c)具有約12到18個碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
32．權(quán)利要求30的方法，其中所述脂質(zhì)體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯；b)膽固醇；及c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
33．權(quán)利要求31的組合物，其中所述脂質(zhì)體中各組分的比例約為53∶10∶22到63∶20∶32。
34．權(quán)利要求25的組合物，其中所述可藥用或美容用載劑的量基于所述組合物的總體積約為0mg/mL到100mg/mL。
35．權(quán)利要求25的組合物，其中所述組合物還包括表面活性劑、保濕劑、濕潤劑、發(fā)泡劑、美容佐劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、調(diào)節(jié)劑、芳香劑、色劑或其混合物。
36．權(quán)利要求35的組合物，其中所述組合物的形式為剃毛乳膏、剃毛膠、剃毛粉、化學(xué)脫毛乳膏、其它目的在于促進體毛去除或?qū)嶋H去除體毛的產(chǎn)品或其組合。
37．含有以下成分的組合物a)一種局部活性藥物，其含有能誘導(dǎo)毛囊乳頭中細(xì)胞凋亡的蛋白酶；及b)可藥用或美容用載劑。
38．權(quán)利要求37的組合物，還包括選自以下的一種組分表面活性劑、保濕劑、濕潤劑、發(fā)泡劑、美容佐劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、調(diào)節(jié)劑、芳香劑、色劑或其混合物。
39．權(quán)利要求37的組合物，其中所述蛋白酶為絲氨酸蛋白酶。
40．權(quán)利要求39的組合物，其中所述蛋白酶選自胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶Ⅳ、枯草溶菌素或其混合物。
41．權(quán)利要求37的組合物，其中局部活性藥物為組合物總體積的約0％(w/v)到5％(w/v)。
42．權(quán)利要求37的組合物，其中局部活性藥物為組合物總體積的約0.01％(w/v)到1％(w/v)。
43．權(quán)利要求37的組合物，其中可藥用或美容用載劑為脂質(zhì)體。
44．權(quán)利要求43的組合物，其中脂質(zhì)體為非離子型。
45．權(quán)利要求43的組合物，其中所述脂質(zhì)體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；b)具有見于膽固醇中的類固醇骨架的化合物或其混合物；及c)具有約12到18個碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
46．權(quán)利要求43的組合物，其中所述脂質(zhì)體由以下組分組成a)二月桂酸甘油酯；b)膽固醇；及c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
47．權(quán)利要求45的組合物，其中所述脂質(zhì)體中各組分的比例約為53∶10∶22到63∶20∶32。
48．權(quán)利要求37的組合物，其中所述可藥用或美容用載劑的量基于所述組合物的總體積約為0mg/mL到100mg/mL。
49．權(quán)利要求37的組合物，其中所述組合物的形式為剃毛乳膏、剃毛膠、剃毛粉、化學(xué)脫毛乳膏、其它目的在于促進體毛去除或?qū)嶋H去除體毛的產(chǎn)品或其組合。
全文摘要
本發(fā)明利用絲氨酸蛋白酶及其誘導(dǎo)毛囊乳頭中程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡的能力來改變哺乳動物的體毛生長和體毛色素形成。本發(fā)明還介紹了含有下述藥物的組合物,所述藥物的一部分結(jié)構(gòu)上與胰蛋白酶分子的一部分類似,使得所述藥物以類似于胰蛋白酶的方式誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡。
文檔編號A61K8/37GK1225575SQ97196355
公開日1999年8月11日 申請日期1997年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月12日
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