專利名稱：L－蘇糖酸鈣預(yù)防、抑制和治療骨質(zhì)疏松和佝僂病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種L-蘇糖酸鈣的用途。具體地說，本發(fā)明涉及L-蘇糖酸鈣預(yù)防、抑制和治療骨質(zhì)疏松癥和佝僂病的用途。
骨質(zhì)疏松癥是一種常見的新陳代謝性的骨疾病。盡管它可能是許多疾病的繼發(fā)病，但90％的骨質(zhì)疏松癥是原發(fā)性的。隨年齡的增加(或婦女的絕經(jīng))骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使骨的正常荷載功能發(fā)生變化，骨折危險(xiǎn)明顯增大，伴有周身骨骼疼痛和體態(tài)變化。
原發(fā)性骨質(zhì)疏松的確切的病因至今仍不清楚，一般認(rèn)為是多因素、多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為骨質(zhì)硫松病的發(fā)生與增齡及激素水平下降，鈣代謝障礙等諸多因素有關(guān)。對于婦女特別是絕經(jīng)的婦女，許多學(xué)者認(rèn)為其骨質(zhì)疏松的發(fā)生與雌激素減少和鈣代謝障礙有關(guān)。老年男性骨質(zhì)疏松的發(fā)生也是由多種原因造成的。老年雄性激素與雌激素一樣參與骨的代謝，對骨生成、骨量維持起重要作用；雄性激素的蛋白同化作用促使膠原合成，提供了鈣磷的沉積部位；此外，老年男性甲狀旁腺激素分泌增加，而使骨形成減少，骨吸收增加；老年男性腎功能減退(腎虛)，活化VD的羥基酶功能減弱，使腸鈣吸收減少，導(dǎo)致負(fù)鈣平衡及骨質(zhì)丟失。已有許多采用不同的藥理學(xué)試劑治療骨質(zhì)疏松的嘗試，如采用雌激素。正因?yàn)楣琴|(zhì)疏松癥成因的復(fù)雜性，有事實(shí)表明有的方法如服用碳酸鈣并不能十分有效來預(yù)防骨質(zhì)疏松癥(見Recker等人發(fā)表在Annals of Int.Med，1977，第87卷，第6期第649-655頁的文章)。因此，人們盼望有一種更有效地預(yù)防和抑制骨質(zhì)疏松的方法。
嬰幼兒骨質(zhì)軟化或佝僂病的發(fā)生也是一種較普通的疾病，然而，目前發(fā)現(xiàn)仍有一些弊端?，F(xiàn)有的鈣制劑對于治療骨質(zhì)軟化或佝僂病并不十分有效，如常用的碳酸鈣，存在吸收率低、消耗大量胃酸、損傷胃粘膜等缺點(diǎn)。這些方法特別對于嬰兒有更大的限制。因此，人們也一直希望能得到一種更有效地預(yù)防、抑制或治療佝僂病的方法。
本發(fā)明的目的是提供一種L-蘇糖酸鈣的新用途，具體地說，本發(fā)明涉及L-蘇糖酸鈣在預(yù)防和抑制骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)軟化和佝僂病功或治療佝僂病中的用途。另一個(gè)目的是提供一種用來預(yù)防、抑制和治療骨質(zhì)疏松癥和佝僂病的方法。
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，經(jīng)過深入的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)服用L-蘇糖酸鈣產(chǎn)生了凈骨質(zhì)，增加了骨密度和骨的力學(xué)性能，達(dá)到預(yù)防、抑制或治療骨質(zhì)疏松癥和佝僂病的目的。


圖1是給藥后不同時(shí)間的血鈣濃度的增加值。
圖2是給藥后不同時(shí)間的血鈣濃度的增加值(不同劑量)。
圖3是犬給藥后血鈣濃度/時(shí)間變化曲線。
本發(fā)明所用的L-蘇糖酸鈣，為白色顆粒，幾乎無味，能溶于水，不溶于醇，醚及氯仿，其分子式為C8H14O10Ca，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
其制備方法是在水中加入一定量的L-抗壞血酸(Vc)，使L-抗壞血酸完全溶解后，攪拌下緩緩加入碳酸鈣，在10～60℃下，向上述體系中慢慢滴加過氧化氫，在40～80℃內(nèi)保溫1～4小時(shí)后，再加入活性碳，過濾，濾液在30～90℃下濃縮，在室溫下結(jié)晶，在50～100℃下干燥。
在所述L-蘇糖酸鈣的制備方法中，碳酸鈣的加入要緩慢，以免突然產(chǎn)生大量的二氧化碳?xì)怏w，帶著體系中液體沖出容器外。
在L-蘇糖酸鈣制備方法中還可以包括將加入活性碳后過濾的濾餅，用80℃熱水洗兩次，洗液與濾液合并濃縮。該方法中工藝合理，簡單易行，產(chǎn)率最高可達(dá)90％。且純度高。具體實(shí)例可參見中國專利CN1143464。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣也可以采用現(xiàn)有技術(shù)的已知方法來制備。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣可以采用口服的方法；可以各種藥物制劑如片劑，膠囊和藥學(xué)可接受組合物的形式使用。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其含有一定量的L-蘇糖酸鈣作為活性成分，也可含有藥學(xué)可接受的載體。這些藥學(xué)可接受的載體可以是現(xiàn)有技術(shù)中廣泛用于藥物中的各種載體，如賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可以按現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法如混合、造粒、壓片來制備。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣藥物組合物還可以包括各種藥學(xué)使用的任選組分，如香味劑、著色劑、甜味劑等。本發(fā)明優(yōu)選的L-蘇糖酸鈣藥物組合物包括高達(dá)60，優(yōu)選80，更優(yōu)選90％的L-蘇糖酸鈣，其余為賦形劑和其它任選組分。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣也可以添加劑如食品添加劑的形式加入食品中使用，如用作各種飲料的添加劑，面包或餅開等的固體食品添加劑和味精等調(diào)味品添加劑。
L-蘇糖酸鈣的使用量可以根據(jù)使用者的不同如成人或嬰兒而變化。在各種應(yīng)用中，L-蘇糖酸鈣的使用量對于成人(60公斤)為12克-0.5克/天，優(yōu)選10.7克-2克/天，如3.6克/天最優(yōu)選7克-3克/天，如3克/天，以鈣計(jì)如1.4克/天元素鈣，0.9克/天元素鈣，0.45克/天元素鈣。對于嬰幼兒，可以按其體重比例減少。
在本發(fā)明中，經(jīng)過對L-蘇糖酸鈣在動物體內(nèi)隨時(shí)間變化的代謝規(guī)律，藥代動力學(xué)參數(shù)以及尿鈣排泄量的研究表明L-蘇糖酸鈣在大鼠體內(nèi)吸收代謝為一室模型，與其它鈣劑，如葡萄糖酸鈣，醋酸鈣，碳酸鈣等比較，吸收較為緩慢，血鈣達(dá)峰時(shí)間較晚，Tmax＝0.79hr，但吸收完全，半衰期較長，T1/2＝4.45hr，在體內(nèi)能長時(shí)間維持在較高水平，曲線下面積AUC＝191.75μg/ML.hr(見附圖1)，表明L-蘇糖酸鈣代謝時(shí)間長，生物利用度高，從而更有利于骨鈣和血鈣的平衡向生成骨鈣的方向移動，產(chǎn)生凈骨質(zhì)，達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的目的。L-蘇糖酸鈣在家犬體內(nèi)的血藥濃度動態(tài)變化，及藥代動力學(xué)參數(shù)和在大鼠體內(nèi)所得結(jié)果一致。具體內(nèi)容見下文L-蘇糖酸鈣藥代動力學(xué)的試驗(yàn)一。
在本發(fā)明中，還對L-蘇糖酸鈣預(yù)防去勢雌鼠、去勢雄鼠骨質(zhì)疏松癥和預(yù)防幼鼠佝僂病進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并與鈣爾奇-D(碳酸鈣+VD)進(jìn)行了對比。
在去卵巢大鼠長期喂飼低鈣飼料所致的大鼠骨質(zhì)疏松模型的實(shí)驗(yàn)中中，L-蘇糖酸鈣能夠明顯增加血鈣水平，降低血清AKP及Tr-ACP水平，提高骨密度、骨干重、骨灰分及鈣含量，增加股骨折斷的受力強(qiáng)度(P)及做功的能量(S)，同時(shí)也增強(qiáng)了骨鈣化程度(K)和韌性(Y)。與鈣爾奇D相比，L-蘇糖酸鈣能減慢骨質(zhì)丟失。L-蘇糖酸鈣可用于預(yù)防婦女特別是絕經(jīng)婦女的骨質(zhì)疏松癥。具體內(nèi)容見下文實(shí)驗(yàn)二。
在本發(fā)明中，對去勢雄鼠的研究也表明L-蘇糖酸鈣具有預(yù)防和抑制骨質(zhì)疏松癥的作用。因此，L-蘇糖酸鈣可用于老年男性骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)治療和預(yù)防藥物。具體內(nèi)容見下文實(shí)驗(yàn)三。
在本發(fā)明中，對剛斷乳的幼鼠的研究表明L-蘇糖酸鈣能有效地控制骨量的丟失，預(yù)防和抑制佝僂病(見下文實(shí)驗(yàn)四)。
本發(fā)明還對L-蘇糖酸鈣增加學(xué)前兒童骨密度及治療嬰兒佝僂病進(jìn)行了臨床研究。
L-蘇糖酸鈣對增加學(xué)前兒童骨密度臨床研究結(jié)果顯示服用L-蘇糖酸鈣I、II組1.5個(gè)月和3個(gè)月時(shí)，BMD顯著高于碳酸鈣組和空白對照組。服用1.5和3個(gè)月后，L-蘇糖酸鈣組分別有12％和72％左右兒童的BMD達(dá)正常值范圍，而碳酸鈣組在3個(gè)月后也僅有1/6的兒童的BMD達(dá)正常值范圍。表明L-蘇糖酸鈣在增加學(xué)前兒童BMD作用上顯著優(yōu)于碳酸鈣。
本發(fā)明中，對40名3～10個(gè)月的佝僂病患兒隨機(jī)分為兩組，在相同劑量(300mg元素鈣)條件下進(jìn)行了L-蘇糖酸鈣與碳酸鈣療效的對照實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，L-蘇糖酸鈣在治療小兒佝僂病方面作用明顯優(yōu)于碳酸鈣，可以用于預(yù)防和治療小兒佝僂病(見實(shí)驗(yàn)六)。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣可用于鈣攝取不足的人群用來預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)軟化和佝僂病。使用者可以是兒童，青年，特別是老年人如男性或絕經(jīng)或閉經(jīng)后的婦女。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣可用于已患有骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)軟化和佝僂病的患者，用來防止病情進(jìn)一步發(fā)展，如患有骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)軟化和佝僂病的兒童，青年或老年人如絕經(jīng)或閉經(jīng)后的婦女。
實(shí)驗(yàn)一、L-蘇糖酸鈣藥代動力學(xué)的試驗(yàn)一、受試藥物L(fēng)-蘇糖酸鈣為白色結(jié)晶粉末，含鈣量13％，由北京巨能亞太生命科學(xué)研究中心提供。用0.5％CMC配制成含鈣量分別為15mg/mL、10mg/mL、5mg/mL液。醋酸鈣，白色結(jié)晶粉末，AR級化學(xué)試劑，含鈣量25.3％，用0.5％CMC配制成含鈣量為10mg/mL的混懸液。葡萄糖酸鈣，白色結(jié)晶粉末，含鈣量8.9％，哈爾濱第三制藥廠生產(chǎn)，用0.5％CMC配制成含鈣量為10mg/mL的混懸液。碳酸鈣，白色粉末，AR級化學(xué)試劑，含鈣量40％，用0.5％CMC配制成含鈣量為10mg/mL的混懸液。二、實(shí)驗(yàn)動物和儀器1.動物Wistar大鼠，雌雄兼用，體重分別為150～180g，180～220g，北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。普通雜種家犬，雄性，體重20.5～26.5kg，由北京海淀區(qū)通利實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場提供。
2.儀器WFX-IB型原子吸收分光光度計(jì)，北京市第二光學(xué)儀器廠83114；P-E 3030原子吸收分光光度計(jì)，美國PERKIN-ELMER公司；DT-100單盤天平(萬分之一)，北京光學(xué)儀器廠；TJ-6離心機(jī)，美國Beckman；漩渦混合器，型號MVS-1，北京北德科學(xué)器材有限公司。三、給藥方法及劑量設(shè)置采用灌胃給藥方法，與臨床擬給藥途徑一致。大鼠給藥劑量分設(shè)L-蘇糖酸鈣高劑量組，2.31g/kg體重(含鈣量300mg/kg體重)；L-蘇糖酸鈣中劑量組，1.54g/kg體重(含鈣量200mg/kg體重)；L-蘇糖酸鈣低劑量組，0.77g/kg體重(含鈣量100mg/kg體重)；醋酸鈣組，0.79g/kg體重(含鈣量200mg/kg體重)；葡萄糖酸鈣組；2.25g/kg體重(含鈣量200mg/kg體重)；碳酸鈣組，0.50g/kg體重(含鈣量200mg/kg體重)等六個(gè)劑量組。犬的L-蘇糖酸鈣給藥劑量為1.54g/kg體重(含鈣量200mg/kg體重)，與大鼠中劑量組相對應(yīng)。四、試驗(yàn)方法1.藥代動力學(xué)參數(shù)測定試驗(yàn)30只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，分別為L-蘇糖酸鈣高、中、低劑量組、醋酸鈣組、葡萄糖酸鈣組和碳酸鈣組。動物禁食12小時(shí)后，先由目內(nèi)眥取血0.5mL作為空白組，然后一次性灌胃給藥20mL/kg體重，分別于給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12和16小時(shí)由目內(nèi)眥取血0.5mL，室溫靜置30min，3000rpm離心20min，取血清0.2mL，用鑭稀釋液稀釋到2mL，混勻，用WFX-1B型原子吸收分光光度計(jì)測定鈣含量值。
2.L-蘇糖酸鈣在犬體內(nèi)血藥濃度的測定家犬3只，一次性灌胃給藥200ml/kg體重，分別于給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、16和24小時(shí)自股靜脈取血0.5mL，室混靜置30min，3000rpm離心20min，取血清0.2mL，用鑭稀釋液稀釋到2mL，混勻，待測。
五、試驗(yàn)結(jié)果1.藥代動力學(xué)參數(shù)測定試驗(yàn)(1)給藥后不同時(shí)間的血鈣濃度增加值，結(jié)果見表1和圖1和圖2。
表1給藥后不同時(shí)間的血鈣濃度增加值(X±SD)
<p>(2)經(jīng)計(jì)算機(jī)3P87軟件擬合，得大鼠灌胃給L-蘇糖酸鈣藥后的藥代動力學(xué)參數(shù)如下吸收速率常數(shù)ka＝6.14hr-1，消除半衰期T1/2＝4.45hr，清除率CL/F(S)＝1.04mg/kg/hr(μg/mL)，表觀分布容積V/F(c)＝6.69mg/kg(μg/mL)，曲線下面積AUC＝191.75(μg/mL).hr，血鈣峰值Cmax＝27.17μg/mL，達(dá)峰時(shí)間Tmax＝0.797hr。
表2.不同鈣劑口服給藥后藥代動力學(xué)參數(shù)比較
>2.L-蘇糖酸鈣在狗體內(nèi)血藥濃度的測定及藥代動力學(xué)參數(shù)計(jì)算給藥后不同時(shí)間的血鈣濃度，結(jié)果見表3和圖3。計(jì)算得到的藥代動力學(xué)參數(shù)見表4。
表3.給藥后不同時(shí)間的血鈣濃度(X±SD)<
n＝3表4.L-蘇糖酸鈣在狗體內(nèi)的藥代動力參數(shù)
>n＝3實(shí)驗(yàn)二、L-蘇糖酸鈣預(yù)防去勢雌鼠骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)中L-蘇糖酸鈣，含元素鈣量13％，白色粉末，由北京巨能亞太生命科學(xué)研究中心提供，鈣爾奇-D(陽性對照藥)，每片含元素鈣量為600mg/片，由中美合資州立達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)。
2動物及飼養(yǎng)Wistar種雄性大鼠，3月齡，由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供，試驗(yàn)室溫度22±1℃，相對濕度40～60％，人工照明12小時(shí)(12小時(shí)暗)，喂飼低鈣飼料，飲用去離子水。
3純合成低鈣飼料處方為40％富強(qiáng)粉，40％玉米面，10％酪蛋白，5％花生油，3％AIN-76混合鹽，1％AIN-76混合維生素，1％纖維素，0.3％DL-蛋氨酸，其中AIN-76混合鹽中的鈣鹽以葡萄糖取代，該處方中鈣含量為64mg/100g。
4儀器應(yīng)用中國原子能科學(xué)院北京市廣播技術(shù)研究所生產(chǎn)的BMD400G1型骨密度儀，WD-1型電子萬能試驗(yàn)機(jī)由長春非金屬實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)，用4010自動生化分析測定血清Ca、P和AKP。
二、方法1去卵巢骨質(zhì)疏松模型制備取3月齡雌性大鼠，無菌摘除雙側(cè)卵巢，喂飼低鈣飼料及飲用去離子水75天，造成骨質(zhì)疏松模型。
2.試驗(yàn)處理取3月齡經(jīng)無菌摘除雙側(cè)卵巢的雌性大鼠，飼養(yǎng)一周，待傷口愈合后，選其中健康大鼠的70只，隨機(jī)分為五組，每組14只。第一組為L-蘇糖酸鈣高劑量組2.31g/kg/d(相當(dāng)于300mg/kg/d元素鈣)；第二組為L-蘇糖酸鈣中劑量組，1.54g/kg/d(相當(dāng)于200mg/kg/d元素鈣)；第三組為L-蘇糖酸鈣低劑量組，0.77g/kg/d(相當(dāng)于100mg/kg/d元素鈣)；第四組為鈣爾奇D組300mg/kg/d元素鈣；第五組為模型組，每天給每只0.5mL去離子水；第六組為假手術(shù)組，喂飼正常飼料。1～5組每天給藥一次，每周給藥6次，同時(shí)喂飼料低鈣飼料、飲用去離子水，試驗(yàn)周期為75天。試驗(yàn)結(jié)束后，股動脈放血處死，分離血清供血Ca、P、AKP和TR-ACP等生化指標(biāo)的測定；剝離大鼠雙側(cè)股骨，低溫冰箱凍存；左側(cè)股骨測骨密度后供生物機(jī)械特征分析；右側(cè)股骨供股骨中鈣沉積量分析。
3.血清Ca、P、AKP、Tr-ACP的測定用4010自動生化分析測定血清Ca、P和AKP。血清鈣用甲基麝香草酚蘭比色法測定；血清磷用單一試劑法測定；血清堿性磷酸酶(AKP)用對硝基苯磷二鈉法測定；血清耐酒石酸酸生磷酸酶采用Piedra法[2]測定。上述所用試劑盒均由北京化工廠臨床試劑分廠生產(chǎn)。
4.骨密度測定取低溫冰箱凍存的新鮮股骨，用中國原子能科學(xué)院北京市廣播技術(shù)研究所生產(chǎn)的BMD400G1型骨密度儀測股骨中央(F50)及近端20％(F20)處的骨礦鹽含量，掃描速度為0.25mm/s，精確度為99％。采用積水潭醫(yī)院提供的標(biāo)準(zhǔn)儀校正，應(yīng)用臨床上使用的軟件來處理數(shù)據(jù)，單位為每平方厘米所含骨礦鹽量(BMC/cm2)。
5.股骨機(jī)械特征測定取低溫冰箱凍存的新鮮股骨，應(yīng)用由長春非金屬實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)WD-1型電子萬能試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，跨度為2.5cm，使用25kg傳感器，標(biāo)定1/50，速度2mm/分，通過函數(shù)記錄儀記錄荷與撓度的函數(shù)關(guān)系。P為破壞性測試折斷最大屈服點(diǎn)受力；Y為撓度代表材料的韌性；K為斜率，是材料剛度的參數(shù)，在骨力學(xué)上與鈣化程度有關(guān)；S為股骨屈服折斷所做的功。
6.股骨干重、灰分、鈣含量測定取去掉軟組織的右側(cè)股骨，在120℃烘箱中烘5小時(shí)，恒重后稱重即為干重，然后置于800℃馬福爐中燒6小時(shí)，恒重后稱重即為灰分(全部為無機(jī)鹽量)。取部分灰分，用稀鹽酸溶解后通過EDTA絡(luò)合滴定法測定灰分中的鈣含量。所有數(shù)據(jù)均表示為X±SD(n)，組間的比較均采用兩組小樣本均數(shù)的“t-檢驗(yàn)”。
三、結(jié)果1.血清Ca、P、AKP、Tr-ACP從表5的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型組大鼠的血鈣水平明顯低于正常對照組大鼠(P＜0.01)，說明去卵巢大鼠長期喂飼低鈣飼料可引起低鈣血癥，而長期給予大鼠L-蘇糖酸鈣，可以預(yù)防和阻止低鈣血癥的發(fā)生，顯著提高血鈣水平，與模型比較均有顯著性差異；模型組血磷顯著高于正常對照組大鼠(P＜0.01)，但L-蘇糖酸鈣和鈣爾奇D組均未發(fā)現(xiàn)對血磷有明顯的影響。表5 L-蘇糖酸鈣對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清鈣、磷的影響(X±SD)
注n＝14與模型組比較**P＜0.01*P＜0.05表6 L-蘇糖酸鈣對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清AKP、Tr-ACP的影響
注n＝14與模型組比較**P＜0.01*P＜0.05血清堿性磷酶來自成骨細(xì)胞中的一種酶，當(dāng)骨形成旺盛時(shí)，該血清酶活性提高；血清耐酒石酸酸性磷酸酶(Tr-ACP)主要來源于骨，是存在于破骨細(xì)胞內(nèi)的同功酶，當(dāng)骨吸收增強(qiáng)時(shí)，骨中破骨細(xì)胞增加，使血清Tr-ACP增加。從表6可以看出，模型組大鼠血清AKP及Tr-ACP顯著高于正常對照組，說明去卵巢大鼠長期喂飼低鈣飼料可以引起骨再生及骨吸收的增加；而長期給予大鼠L-蘇糖酸鈣，能使血清AKP及Tr-ACP下降，從而預(yù)防和抑制骨吸收。
2.骨密度、股骨干重、灰分和鈣含量從表7可以看出，長期單獨(dú)給予L-蘇糖酸鈣的大鼠，其骨密度顯著高于模型組大鼠，并且發(fā)現(xiàn)L-蘇糖酸鈣對骨密度的影響有劑量反應(yīng)關(guān)系。表7 L-蘇糖酸鈣對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響(X±SD)
注與模型組比較***P＜0.001**P＜0.01*P＜0.05表8 L-蘇糖酸鈣對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股于重、灰分及鈣含量的影響(X±SD)
注n＝13從表8可以看出，長期給予L-蘇糖酸鈣，能明顯控制和阻止骨質(zhì)丟失，使其骨干重、灰分、鈣含量顯著高于模型大鼠，可防治去勢后所致的骨質(zhì)丟失。
3.骨機(jī)械特征的測定結(jié)果股骨生物力學(xué)的評價(jià)依據(jù)是骨強(qiáng)度、韌性、骨鈣化程度及使骨折斷所做的功等參數(shù)。從表9的試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，S值、L-蘇糖酸鈣組P、K、Y、S值比模型組顯著增加，說明L-蘇糖酸鈣能增加股骨強(qiáng)度(P值)、增加骨鈣化程序(K值)、提高骨的韌性(Y值)和提高使骨折斷所做的功(S值)，并優(yōu)于鈣爾奇D。表9 L-蘇糖酸鈣對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨生物力學(xué)的影響(X±SD)
注n＝13，與模型組比較***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05實(shí)驗(yàn)三、L-蘇糖酸鈣預(yù)防去勢雄鼠骨質(zhì)疏松癥的藥效學(xué)研究本實(shí)驗(yàn)中，所用的藥品同實(shí)驗(yàn)二。所用動物為Wistar種雄性大鼠，體重150±10g，由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供，其飼養(yǎng)同實(shí)驗(yàn)二。
所用的純合成低鈣飼料及儀器同實(shí)驗(yàn)二。
1、去勢雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型的制備雄性大鼠體重150±10g，無菌摘除雙側(cè)睪丸，喂飼低鈣飼料及飲用去離子水60天，造成骨質(zhì)疏松模型。
2、試驗(yàn)處理以上述實(shí)驗(yàn)二的相同方式，取去睪丸大鼠70只，分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同的是在試驗(yàn)的60天中共給藥52天。
本實(shí)驗(yàn)中，血清Ca、P、AKP的測定、骨密度的測定、股骨長度、濕重、干重、灰分、鈣含量的測定以及股骨生物力學(xué)的測定的方法同上文實(shí)驗(yàn)二中的方法。結(jié)果如下。
1.血清Ca、P、AKP水平表10 L-蘇糖酸鈣對去睪丸骨質(zhì)疏松大鼠血清鈣、磷的影響
注n＝14與模型組比較**P＜0.01*P＜0.05從表10可以看出，給予L-蘇糖酸鈣的大鼠，其血鈣水平明顯高于模型組，說明長期單獨(dú)給予L-蘇糖酸鈣能夠預(yù)防和抑制由于缺少雄性激素及鈣攝入不足所致的低鈣血癥。
2.血清AKP堿性磷酸酶是存在于成骨細(xì)胞中的一種酶，當(dāng)骨受損時(shí)，該酶活性提高；從表11的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型組大鼠的血清AKP明顯高于正常對照組，說明雄性大鼠去勢及喂飼低鈣飼料能夠造成骨的破壞；而給予L-蘇糖酸鈣，其血清AKP值明顯低于模型組，說明L-蘇糖酸鈣能阻止和預(yù)防骨的破壞，控制和減少骨的丟失。
表11 L-蘇糖酸鈣對去睪丸骨質(zhì)疏松大鼠血清AKP的影響
注n＝14與模型組比較***P＜0.0013.骨密度、股骨濕重、長度、干重、灰分和鈣含量表12 L-蘇糖酸鈣對去睪丸骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響(X±DS)
注與模型組比較***P＜0.001**P＜0.01*P＜0.05
表13-L蘇糖酸鈣對去睪丸骨質(zhì)疏松大鼠股骨濕重、干重、灰分及鈣含量的影響(X±SD)
注n＝14，與模型組比較***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05
從表12可以看出，長期單獨(dú)給予L-蘇糖酸鈣的大鼠，其骨密度顯著高于模型組大鼠，其中L-蘇糖酸鈣增加骨密度的作用有劑量反應(yīng)關(guān)系。
從表13可以看出，長期給予L-蘇糖酸鈣，能有效地控制和阻止骨丟失，維持股骨的正常生長發(fā)育，使其股長度、濕重、干重、灰分、鈣含量顯著高于模型組，可防治去勢后所致的骨質(zhì)丟失。
4.股骨生物力學(xué)測定結(jié)果從表14可以看出，L-蘇糖酸鈣組大鼠的P、K、S值比模型組顯著增加，說明L-蘇糖酸鈣能增加股骨強(qiáng)度(P值)、增加骨鈣化程度(K值)和提高使骨折斷的做的功(S值)。
表14L-蘇糖酸鈣對去睪丸骨質(zhì)疏松大鼠股骨生物力學(xué)的影響
注n＝13，與模型組比較***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05實(shí)驗(yàn)四、L-蘇糖酸鈣預(yù)防幼鼠佝僂病的藥效學(xué)研究。
動物及飼養(yǎng)昆明種剛斷乳小鼠，出生后20-22天，10-12克，由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供；24小時(shí)避光，共60天，溫度20-25，相對濕度40～60％，正常對照組喂普通飼料，置于非暗室飼養(yǎng)。
低鈣飼料同實(shí)驗(yàn)二，不同的是用葡萄糖代替AIN混合維生素中的VD。
佝僂病模型制備剛斷乳小鼠，置暗室中，喂飼缺VD的低鈣飼料60天，飲用去離子水，制備小鼠佝僂病模型。以剛斷乳的小鼠，喂飼普通飼料及飲用自來水，置非暗室中60天做為正常對照。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果L-蘇糖酸鈣對血清Ca、P、AKP的影響從表15可以看出在L-蘇糖酸鈣的高、低劑量組，其血鈣水平及血清AKP均接近了正常對照組水平，但都顯著高于模型組，而AKP都顯著低于模型組，說明服用L-蘇糖酸鈣，能預(yù)防和阻止血鈣的下降，抑制骨吸收，使AKP降低。表15L-蘇糖酸鈣對佝僂病小鼠血清Ca、P、AKP濃度的影響
注n＝18與模型組比較**P＜0.01，***P＜0.001L-蘇糖酸鈣對股骨干重、灰分、鈣總量的影響從表16可以看出，小鼠給予L-蘇糖酸鈣，對動物體重沒有明顯的影響，但是L-蘇糖酸鈣的高、低劑量組的股骨干重、灰分、鈣總量都顯著高于模型組，接近于正常對照組動物的數(shù)值，說明長期補(bǔ)充L-蘇糖酸鈣可以預(yù)防和阻止骨質(zhì)丟失，而預(yù)防佝僂病。此外，從表16還可以看出，L-蘇糖酸鈣在股骨中鈣的沉積量明顯高于葡萄糖酸鈣(P＜0.01)。表16L-蘇糖酸鈣對佝僂病鼠股骨干重、灰分、鈣量的影響(X±SD)
注n＝18，與模型組比較**P＜0.01，***P＜0.001；與葡萄糖酸鈣組比較P＜0.05L-蘇糖酸鈣對佝僂病小鼠脛骨的受力分析從表17脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果可以看出，L-蘇糖酸鈣及葡萄糖酸鈣組，其折斷力顯著高于模型組，而與正常對照組相當(dāng)，說明長期補(bǔ)充L-蘇糖酸鈣，可以增加脛骨抗折斷強(qiáng)度，阻止和預(yù)防佝僂病。表17L-蘇糖酸鈣對佝僂病小鼠脛骨強(qiáng)度的影響(X±SD)
注與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05實(shí)驗(yàn)五L-蘇糖酸鈣增加學(xué)前兒童骨密度效應(yīng)的研究。
一、實(shí)驗(yàn)對象選取北京某郊縣中心幼兒園3-6歲健康普查骨密度中度降低者共70名為受試對象(男13人，女57人)。全部受試對象均為無代謝性疾病、肝腎疾病、骨損傷和畸型病史的健康兒童。
二、分組70名兒童隨機(jī)分為4組，實(shí)驗(yàn)觀察3個(gè)月。觀察期間使用雙盲法，每人每天兩次服用鈣制劑或安慰劑，每次1袋。I組(實(shí)驗(yàn)1組)，服用L-蘇糖酸鈣，每袋含200mg元素鈣，每天服用兩袋；II組(實(shí)驗(yàn)2組)，服用L-蘇糖酸鈣，每袋含150mg元素鈣，每天服用兩袋；III組(碳酸鈣組)，服碳酸鈣，每袋含150mg元素鈣，每天服用兩袋。IV組為空白對照組，服用安慰劑，不含鈣。上述口服制劑均由北京巨能亞態(tài)生命科學(xué)研究中心提供。
三、方法1于實(shí)驗(yàn)前及補(bǔ)鈣后1.5個(gè)月和3個(gè)月各做一次骨密度測定。
2BMD測定方法利用核工業(yè)部原子能研究所和北京廣播所生產(chǎn)的BMD400型單光子骨密度儀，測量非優(yōu)勢手橈骨遠(yuǎn)端1/3處，每點(diǎn)掃描兩次，得平均骨密度(BMD，g/cm2)。掃描速度為0.5mm/秒。
3數(shù)據(jù)處理利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包對全部數(shù)據(jù)進(jìn)行方法分析。
四、結(jié)果1.隨機(jī)分組后，4組兒童BMD之間差別沒有顯著性，所以開始補(bǔ)鈣實(shí)驗(yàn)，所測BMD見表18。
表18四組兒童實(shí)驗(yàn)前后骨密度變化情況(g/cm2)
由表18可見，實(shí)驗(yàn)觀察1.5個(gè)月和3個(gè)月時(shí)，四組兒童BMD均較實(shí)驗(yàn)前顯著提高(P＜0.05)，而且除了空白對照組(IV)3個(gè)月和1.5個(gè)月BMD之間不具備顯著性外，其余三組兒童3個(gè)月時(shí)BMD均顯著高于1.5個(gè)月時(shí)的BMD，P＜0.05。1.5個(gè)月和3個(gè)月時(shí)四組間兒童BMD比較可見，L-蘇糖酸鈣I、II組間差別沒有顯著性(P＞0.05)，但均顯著高于碳酸鈣組和空白對照組(P＜0.05)。碳酸鈣組的BMD僅在3個(gè)月時(shí)顯著高于空白對照組(P＜0.05)，而1.5個(gè)月時(shí)兩組間不具有顯著性差別2.四組兒童BMD增長幅度見表24。
表19四組兒童BMD增長幅度比較(％)
由表19可見L-蘇糖酸鈣組BMD增長幅度明顯提高于碳酸鈣組和空白對照組，約為碳酸鈣組的2倍。
3.四組兒童補(bǔ)鈣實(shí)驗(yàn)后BMD達(dá)到正常值范圍的兒童比例見表20。
表20四組兒童補(bǔ)鈣實(shí)驗(yàn)后BMD達(dá)到正常值范圍情況(％)
>注與碳酸鈣組、空白對照比**P＜0.05由表20可見，服用3個(gè)月后，L-蘇糖酸鈣組近2/3兒童BMD已達(dá)正常水平，碳酸鈣組僅1/6兒童達(dá)到正常水平，空白對照組雖然顯著增加，但全部兒童仍處于低BMD水平。
實(shí)驗(yàn)六L-蘇糖酸鈣治療嬰兒佝僂病的實(shí)驗(yàn)研究將40名3-10個(gè)月的患兒隨機(jī)分為兩組，每組各20人。實(shí)驗(yàn)組I為L-蘇糖酸鈣組，每人每日口服L-蘇糖酸鈣兩次，每次1袋。實(shí)驗(yàn)組II為碳酸鈣組，每人每日口服碳酸鈣兩次，每次1袋。兩種鈣制劑每袋的元素鈣含量相等，均為150mg。L-蘇糖酸鈣和碳酸鈣均由北京巨能亞態(tài)生命科學(xué)研究中心提供。
實(shí)驗(yàn)方法佝僂病患兒的篩選及服用兩種鈣制劑后治療效果的評價(jià)均依據(jù)臨床癥狀和血生化檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評價(jià)。
(1)臨床癥狀主要包括小兒佝僂病常見的癥狀，如盜汗、枕禿、顱骨軟化等。
(2)血生化檢驗(yàn)于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后，采集患兒的靜脈血，進(jìn)行血清鈣、血清磷和堿性磷酸酶(AKP)的測定，并計(jì)算[Ca]×[P]之積。生化檢測選用美國7170型全自動生化分析儀進(jìn)行比色測定。
(3)數(shù)據(jù)處理對全部數(shù)據(jù)采用直接計(jì)算概率法、成組t檢驗(yàn)和配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.患兒癥狀改善情況全部患兒隨機(jī)分為兩組后，兩組兒童三種癥狀分布情況均勻一致，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，兩組間無顯著性差別(P＞0.05)。在給藥后的第2周和第4周，分別對兩組40名患兒進(jìn)行佝僂病癥狀檢驗(yàn)，結(jié)果顯示第2周時(shí)L-蘇糖酸鈣組患兒癥狀改善率為62.5％，而碳酸鈣組患兒癥狀改善率僅為11.5％。第4周時(shí)，L-蘇糖酸鈣組患兒所有癥狀均有明顯改善，而碳酸鈣組患兒癥狀的改善率只有57.6％。結(jié)果見表21和22。
表21兩組患兒實(shí)驗(yàn)前后(兩周)癥狀發(fā)生情況(例)
表22兩組患兒實(shí)驗(yàn)前后(四周)癥狀發(fā)生情況(例)
2.血液生化指標(biāo)變化情況考慮實(shí)驗(yàn)操作中患兒取血存在的實(shí)驗(yàn)困難，實(shí)驗(yàn)第2周時(shí)沒有取血測定，僅在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)取血進(jìn)行測定。結(jié)果見表23。
表23兩組患兒實(shí)驗(yàn)前后生化檢測結(jié)果比較(X±S)
從表23可以看出，兩組患兒實(shí)驗(yàn)前四項(xiàng)指標(biāo)間無顯著性差異，說明隨機(jī)分組后的兩組患兒血液生化結(jié)果也均衡一致。兩組患兒血清鈣實(shí)驗(yàn)前后變化不明顯(P＞0.05)，且平均水平均在正常值范圍內(nèi)。其余三項(xiàng)指標(biāo)，兩組兒童實(shí)驗(yàn)前后配對t檢驗(yàn)，除碳酸鈣組AKP的P＜0.05外，其余均P＜0.01，即差別有高度顯著性。兩組間血清磷、AKP、[Ca]×[P]實(shí)驗(yàn)后結(jié)果相比差別均具高度顯著性(P＜0.01)。
盡管碳酸鈣組實(shí)驗(yàn)后的血清磷、AKP、[Ca]×[P]與實(shí)驗(yàn)前具有顯著差別，但是血清磷、AKP仍未達(dá)到正常值范圍。結(jié)果見表24。
表24兩組患兒補(bǔ)鈣四周后血生化檢驗(yàn)達(dá)正常值范圍情況(％)
經(jīng)直接計(jì)算概率法檢驗(yàn)，血清鈣、AKP在兩組間差別有高度顯著性(P＜0.01)，[Ca]×[P]在兩組間差別有顯著性(P＜0.05)。
經(jīng)過與碳酸鈣對比實(shí)驗(yàn)研究可見，在嬰兒佝僂病癥狀改善上，L-蘇糖酸鈣有非常明顯的且迅速的效果，服藥2周即可62％的患兒癥狀消失，而碳酸鈣僅可使50％的患兒癥狀消失。在血生化檢驗(yàn)上，也顯示服用L-蘇糖酸鈣4周可使全部患兒血生化指標(biāo)顯著改善，而且達(dá)到正常值范圍，而碳酸鈣雖然也使嬰兒生化指標(biāo)改善，但血清磷、AKP仍未達(dá)到正常值范圍。
權(quán)利要求
1.L-蘇糖酸鈣在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用。
2.L-蘇糖酸鈣在預(yù)防佝僂病中的應(yīng)用。
3.一種預(yù)防或抑制骨質(zhì)疏松癥的方法，包括給有骨質(zhì)疏松癥傾向或鈣攝取量偏低或已經(jīng)患有骨質(zhì)疏松癥的患者服用一定量的L-蘇糖酸鈣。
4.權(quán)利要求3的方法，其中L-蘇糖酸鈣的量以成人計(jì)為12-0.5克/天，優(yōu)選10.6-2克/天，更優(yōu)選7-3克/天。
5.一種預(yù)防、抑制和治療佝僂病的方法，包括給有佝僂病傾向或鈣攝取量偏低的患者服用一定量的L-蘇糖酸鈣。
6.權(quán)利要求5的方法，其中L-蘇糖酸鈣的量以成人計(jì)為12-0.5克/天，優(yōu)選10.6-2克/天，更優(yōu)選7-3克/天。
7.一種用于預(yù)防、抑制和治療骨質(zhì)疏松癥或佝僂病的藥用組合物，其包括一定量的L-蘇糖酸鈣和藥物可接受的載體。
8.用于預(yù)防、抑制或治療骨質(zhì)疏松癥或佝僂病的L-蘇糖酸鈣。
全文摘要
本發(fā)明為L－蘇糖酸鈣的用途。即用L－蘇糖酸鈣預(yù)防、抑制和治療骨質(zhì)疏松癥和佝僂病的方法。
文檔編號A61P19/08GK1240647SQ9811545
公開日2000年1月12日 申請日期1998年7月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月8日
發(fā)明者于凱, 王志文, 寇福平 申請人:北京巨能亞太生命科學(xué)研究中心