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      菠蘿蛋白酶成分的制作方法

      文檔序號(hào):1071473閱讀:970來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:菠蘿蛋白酶成分的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種作為菠蘿蛋白酶成分的蛋白。具體地,本發(fā)明涉及負(fù)責(zé)菠蘿蛋白酶抗癌活性并也具有作為免疫調(diào)節(jié)劑和抗微生物劑的活性的蛋白。
      菠蘿蛋白酶(菠蘿蛋白酶)是在鳳梨科植物組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白水解酶的統(tǒng)稱。盡管水果中菠蘿蛋白酶已知,但是菠蘿蛋白酶最常見(jiàn)的形式是來(lái)自鳳梨植物(Ananas comosus)莖的各種成分的混合物。已知莖中菠蘿蛋白酶(此后稱為菠蘿蛋白酶)包含至少五種蛋白水解酶,也包含非蛋白水解酶,包括酸性磷酸酶和過(guò)氧化物酶;它也可包含淀粉酶和纖維素酶活性。另外,也存在多種其它成分。
      菠蘿蛋白酶曾用于治療多種病癥包括炎癥,具體地,它已用于治療腹瀉。菠蘿蛋白酶在治療感染性腹瀉方面的用途在WO-A-9301800中得到,其中證明菠蘿蛋白酶通過(guò)蛋白水解作用破壞病原體的腸道受體從而發(fā)揮作用,在WO-A-8801506中,認(rèn)為菠蘿蛋白酶使病原體從腸道受體上脫離下來(lái)。
      Taussig等,Planta Medica,1985,538-539和Maurer等,PlantaMedica,1988,377-381都提出菠蘿蛋白酶可用于抑制腫瘤生長(zhǎng)。US 5,233,406、DE-A-4302060和JP-A-59225122也說(shuō)明了菠蘿蛋白酶在治療癌癥方面的用途。US 5,223,406認(rèn)為菠蘿蛋白酶能夠誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF),而DE-A-4302060認(rèn)為菠蘿蛋白酶能夠通過(guò)腫瘤表面蛋白CD44的結(jié)構(gòu)修飾防止轉(zhuǎn)移。
      在WO-A-9400147中描述了各種實(shí)驗(yàn),這些實(shí)驗(yàn)證明蛋白水解酶,尤其是菠蘿蛋白酶能抑制分泌。此申請(qǐng)也公開(kāi)了菠蘿蛋白酶能降低毒素結(jié)合活性并能抑制諸如熱不穩(wěn)定毒素(LT)和霍亂毒素(CT)的毒素及諸如熱穩(wěn)定毒素(ST)的毒素的分泌效應(yīng)。這些觀察結(jié)果通過(guò)菠蘿蛋白酶混合物的一個(gè)成分莖菠蘿蛋白酶看來(lái)能調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸途徑這一事實(shí)得到解釋,并且這一點(diǎn)在WO-A-9500169中得到進(jìn)一步討論。另外,也證明菠蘿蛋白酶抑制由鈣依賴的途徑導(dǎo)致的分泌。
      WO-A-9600082也涉及了菠蘿蛋白酶并且公開(kāi)了粗制菠蘿蛋白酶能夠干涉對(duì)生長(zhǎng)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,尤其是導(dǎo)致生長(zhǎng)因子如白細(xì)胞介素-2(IL-2)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。此文獻(xiàn)認(rèn)為作為其封閉信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力的結(jié)果,菠蘿蛋白酶能作用為抗癌劑。另外,依據(jù)要處理的細(xì)胞類型以及細(xì)胞以前是否已活化,菠蘿蛋白酶可用作免疫抑制劑或免疫刺激劑。
      從現(xiàn)有技術(shù)看,菠蘿蛋白酶很明顯是具有多種不同生理效應(yīng)的混合物。并不是所有的菠蘿蛋白酶組分都已得到鑒定,因此除了我們已描述了其活性的莖菠蘿蛋白酶,還不清楚哪一個(gè)成分負(fù)責(zé)菠蘿蛋白酶各種不同效應(yīng)的哪一種。如果菠蘿蛋白酶混合物要用作藥物,這當(dāng)然是主要缺點(diǎn),因?yàn)楸M管菠蘿蛋白酶的一個(gè)成分可能產(chǎn)生希望的效果,菠蘿蛋白酶混合物的某些其它成分的作用可能產(chǎn)生不利的副作用。
      因此,如果產(chǎn)生特定醫(yī)學(xué)活性的菠蘿蛋白酶單獨(dú)成分可以得到分離并且單獨(dú)施用以便減少副作用的可能性,這將是有益的。
      本發(fā)明已分離、純化和鑒定了一個(gè)這樣的菠蘿蛋白酶成分,它與混合物的其它已知成分不同,并且已發(fā)現(xiàn)它具有抗癌性。
      在本發(fā)明的第一方面,提供了作為菠蘿蛋白酶成分的蛋白,具有由SDS-PAGE測(cè)定的約22.2-25.08kDa的分子量,并具有等電點(diǎn)3.8-4.79,且具有如下氨基末端序列Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Asn Glu Val Lys Asn(SEQ ID NO1)并且,另外還包含以下序列Gly Gly Trp Glu Phe Lys(SEQ ID NO2)Lys Ala Val Asn Gly(SEQ ID NO3)Tyr Trp Ile Val Arg(SEQ ID NO4)Asn Ser Trp Gly Ser Ser Trp Gly Glu Gly Gly Tyr Val Arg(SEQ ID NO5)Thr Ser Leu Asn His Ala Ile Thr Ile Ile Val Tyr(SEQ ID NO6)
      Leu Pro Glu Phe (Gln) Pro (Gln) Val Leu Asp-Ala-(SEQ ID NO7)Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Ala Cys Gly Ile Ala Met Ser Pro Leu-Thr-(SEQ ID NO8)Gly Gly Val Phe Ser Gly Pro Ala Gly(SEQ ID NO9)Asn Asn Ala Tyr(SEQ ID NO10)Ser Ser Gly Thr Lys Tyr Trp-Val-(SEQ ID NO11);其中括號(hào)中的氨基酸表示對(duì)前面氨基酸的替換氨基酸,而“-”表示未鑒定的氨基酸。
      本發(fā)明的蛋白(本發(fā)明人命名為CCX2)主要負(fù)責(zé)菠蘿蛋白酶的抗癌活性,因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)其它已知成分如莖菠蘿蛋白酶(SBP)、comosain和ananain都降低抗癌活性。而且,因?yàn)楸景l(fā)明的蛋白是單一分子,所以用作醫(yī)藥制劑時(shí)沒(méi)有多成分混合物的缺點(diǎn)。
      本發(fā)明的蛋白可以用常規(guī)方法例如層析從菠蘿蛋白酶混合物分離。高效液相層析(HPLC)適于此目的,通過(guò)快速蛋白液相層析(FPLCTM),使用裝有諸如S-sepharose的物質(zhì)的柱子可以得到特別好的菠蘿蛋白酶蛋白的分離。正如將在實(shí)施例中更詳細(xì)描述的,在S-sepharose上使用300ml以上的乙酸緩沖液中的0-0.8M氯化鈉線性梯度進(jìn)行層析,本發(fā)明的蛋白包含在由從柱上下來(lái)的第二個(gè)尖峰所代表的組分中。此組分稱為CCX組分。本發(fā)明的蛋白是CCX組分的主要成分,并且通過(guò)下面將更詳細(xì)描述的常規(guī)方法將其與次要成分分離。
      因此,在本發(fā)明的第二方面中,提供了作為菠蘿蛋白酶成分的蛋白,具有由SDS-PAGE測(cè)定的約22.2-25.08kDa的分子量,并且可通過(guò)下列方法得到i.將菠蘿蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸緩沖液中;ii.通過(guò)在S-Sepharose上快流高效液相層析,用300ml以上的溶于乙酸緩沖液中的0-0.8M氧化鈉線性梯度洗脫以分離菠蘿蛋白酶組分;iii.收集對(duì)應(yīng)于從柱上下來(lái)的第二個(gè)尖峰的組分;并且iv.通過(guò)陰離子層析和疏水相互作用層析從(iii)中收集的組分分離主要蛋白。
      從US 5,223,406和WO-A-9600082可知,菠蘿蛋白酶混合物具有抗癌活性,并且以前已設(shè)想菠蘿蛋白酶的已知成分之一,可能是莖菠蘿蛋白酶(stem bromelain protease)負(fù)責(zé)此活性。目前已發(fā)現(xiàn)事實(shí)并非如此,本發(fā)明的蛋白是抗癌劑,而莖菠蘿蛋白酶沒(méi)有抗癌活性。
      本發(fā)明的蛋白與水果菠蘿蛋白酶(fruit bromelain protease,由Muta等從水果中的菠蘿蛋白酶分離的一種酶,并于1997年8月28日遞交到DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù))有高度同源性。然而序列相同性不是完全的,當(dāng)然兩種酶來(lái)自不同來(lái)源。然而蛋白間的高度同源性使水果菠蘿蛋白酶有可能也具有與CCX2相似的抗癌活性。
      在本發(fā)明的另一方面,提供了水果菠蘿蛋白酶或作為菠蘿蛋白酶成分的分離純化蛋白,具有由SDA-PAGE測(cè)定的約22.2-25.08kDa分子量,具有等電點(diǎn)3.8-4.79,并具有氨基末端序列Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Asn Glu Val Lys Asn(SEQ ID NO1)并且,還包含下列序列Gly Gly Trp Glu Phe Lys(SEQ ID NO2)Lys Ala Val Asn Gly(SEQ ID NO3)Tyr Trp Ile Val Arg(SEQ ID NO4)Asn Ser Trp Gly Ser Ser Trp Gly Glu Gly Gly Tyr Val Arg(SEQ ID NO5)Thr Ser Leu Asn His Ala Ile Thr Ile Ile Val Tyr(SEQ ID NO6)Leu Pro Glu Phe (Gln) Pro (Gln) Val Leu Asp-Ala-(SEQ ID NO7)Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Ala Cys Gly Ile Ala Met Ser Pro Leu-Thr-(SEQ ID NO8)Gly Gly Val Phe Ser Gly Pro Ala Gly(SEQ ID NO9)Asn Asn Ala Tyr(SEQ ID NO10)Ser Ser Gly Thr Lys Tyr Trp-Val-(SEQ ID NO11);其中括號(hào)中的氨基酸表示對(duì)前面氨基酸的替換氨基酸,而“-”表示未鑒定的氨基酸;用于人或獸醫(yī)藥學(xué)。
      具體地,本發(fā)明提供用于在人或其它動(dòng)物中治療或預(yù)防癌癥的蛋白。
      本發(fā)明也提供本發(fā)明的第一或第二方面的分離純化蛋白或水果菠蘿蛋白酶在制備抗癌劑方面的用途。
      由于此抗癌活性,CCX2蛋白或水果菠蘿蛋白酶可用于治療癌癥的方法,此方法包括向病人施用有效量的本發(fā)明第一方面的分離純化蛋白。
      如我們先前申請(qǐng)WO-A-950019中所討論的,這看來(lái)是由于菠蘿蛋白酶影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,具體地由MAP激酶調(diào)節(jié)的通路的能力。因此,這可能是本發(fā)明蛋白的作用機(jī)制。但是本發(fā)明不依賴于此理論或此理論的正確性。
      Ras蛋白有助于轉(zhuǎn)導(dǎo)從細(xì)胞表面上生長(zhǎng)因子受體到轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的信號(hào)以刺激細(xì)胞增殖或分化。致癌的(或突變的)ras基因產(chǎn)生缺陷型ras蛋白,它有不依賴外部提供的生長(zhǎng)因子的獨(dú)立性,并且同時(shí)可能不再對(duì)外部的生長(zhǎng)抑制信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答。突變的ras蛋白因此是持續(xù)機(jī)能亢進(jìn)的,并且它們無(wú)限制的催化活性具有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)控制的有害效應(yīng)。因此致癌ras基基通過(guò)破壞對(duì)細(xì)胞增殖和分化的正常控制促使癌癥和腫瘤形成。約30%的人類癌癥在ras基因中有突變。
      由ras活化的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一是促細(xì)胞分裂原活化的蛋白(MAP)激酶[也稱為胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶(ERK)],此激酶向細(xì)胞核轉(zhuǎn)導(dǎo)生長(zhǎng)信號(hào)。WO-A-9500169的圖2-6表明菠蘿蛋白酶可以防止MAP激酶ERK-1和ERK-2的活化。如果由ras轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)可以經(jīng)由MAP激酶受到阻斷,那么可以預(yù)測(cè)菠蘿蛋白酶混合物會(huì)阻斷癌癥和腫瘤生長(zhǎng),有可能本發(fā)明的蛋白也通過(guò)此作用機(jī)制起作用。
      另一解釋是本發(fā)明的蛋白通過(guò)活化先天免疫系統(tǒng)起作用。免疫反應(yīng)有兩個(gè)功能性分類先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)。先天免疫反應(yīng)由巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)。獲得性免疫反應(yīng)由B和T細(xì)胞介導(dǎo)。當(dāng)病原體侵入機(jī)體時(shí),獲得性免疫反應(yīng)和先天免疫反應(yīng)都會(huì)活化。先天免疫反應(yīng)在感染因子和大多數(shù)潛在病原體建立感染前提供針對(duì)它們的第一道防線。在先天免疫的初始階段,獲得性免疫反應(yīng)正在發(fā)展。如果第一道防御被突破,獲得性免疫系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)充分地發(fā)展以產(chǎn)生針對(duì)感染因子的特異反應(yīng),特異反應(yīng)在正常情況下清除此因子。先天免疫系統(tǒng)在殺死腫瘤細(xì)胞方面也是至關(guān)重要的。
      已證明本發(fā)明的蛋白活化巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞(NK),它們是對(duì)控制腫瘤生長(zhǎng)重要的先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵介體。也證明蛋白增加干擾素γ介導(dǎo)的氧化氮(NO)的產(chǎn)生。多個(gè)公開(kāi)文獻(xiàn)也將NO產(chǎn)生與抗腫瘤活性聯(lián)系起來(lái)。例如,Hibbs(1991,免疫學(xué)研究142,565-569)已證明在體外,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO時(shí)殺死腫瘤細(xì)胞。因此,NO的產(chǎn)生增加可能是本發(fā)明蛋白針對(duì)腫瘤作用的機(jī)制。然而,CCZ作為抗癌劑的效力不依賴于此理論的正確性。
      本發(fā)明的蛋白也可用于治療多種不同類型的癌癥包括實(shí)體癌如卵巢瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤以及非實(shí)體腫瘤和白血病。
      如上所述,CCX2能活化NK細(xì)胞,NK細(xì)胞是能識(shí)別和破壞被各種病毒、細(xì)菌或寄生蟲侵染的細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。它們能通過(guò)特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞上病毒誘導(dǎo)的分子或與腫瘤相關(guān)的其它分子的表達(dá)來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞。因此,因?yàn)镃CX2能活化NK細(xì)胞,所以它也可用于治療或預(yù)防病毒誘導(dǎo)的腫瘤。這樣的腫瘤的例子包括肝細(xì)胞癌(由肝炎B病毒引起);非何杰金氏淋巴瘤,鼻咽癌或伯基特淋巴瘤(由Epstein-Barr病毒引起);卡波西肉瘤(由HIV侵染的病人中的細(xì)胞肥大病毒引起);T細(xì)胞白血病(由人T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒引起)和宮頸癌(由人類乳頭狀瘤病毒如HPV16和HPV18引起)。而且,因?yàn)楦叨韧葱?,水果菠蘿蛋白酶也可能具有與CCX2蛋白相同的活性。
      除了其作為抗腫瘤劑的用途,本發(fā)明的蛋白活化先天免疫反應(yīng)的能力表明它或水果菠蘿蛋白酶可用于其中獲得性免疫反應(yīng)如B或T細(xì)胞反應(yīng)功能不完全的情況。這可能出現(xiàn)在由營(yíng)養(yǎng)不良、感染(例如HIV和瘧疾)、腫瘤(例如淋巴瘤、骨髓瘤及其它)、創(chuàng)傷(例如灼傷、擊傷和手術(shù))、醫(yī)學(xué)治療(例如用藥如類固醇、環(huán)孢菌素和環(huán)磷酰胺)、蛋白質(zhì)丟失(如腹瀉和灼傷)、遺傳異常(如在缺乏丁和/或B細(xì)胞的復(fù)合免疫缺陷病人中發(fā)現(xiàn)的那些)糖尿病和老齡引起的次生免疫缺陷中。
      本發(fā)明人已證明本發(fā)明蛋白能提高干擾素-γ介導(dǎo)的氧化氮(NO)的合成。因此,CCX2或水果菠蘿蛋白酶可用于治療對(duì)增加的NO合成應(yīng)答的疾病或癥狀。
      NO在宿主防御侵染方面起關(guān)鍵作用。NO及其衍生物具有針對(duì)包括真菌、細(xì)菌和病毒的許多病原體的有效抗微生物活性。因此,蛋白可用于接受化療的病人以防止免受機(jī)會(huì)感染。它也可用于治療病原體侵染包括寄生蟲如baesia、Brugia、Cryptosporidium、Encephalitoxoon、entamoeba、Leishmania、Naegleria、Ochocerca、Opisthorchis、Plasmldium、Schistosoma、Toxoplasma和Trypanosom。受NO影響的細(xì)菌包括芽孢桿菌屬、布魯氏菌屬、伯克氏菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、埃里希氏體屬、弗朗西絲氏菌屬、克雷伯氏菌屬、軍團(tuán)菌屬、利斯特氏小菌屬、微球菌屬、Pseudomonas Rickettsia、沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、耶爾森氏菌屬、衣原體尤其是沙眼衣原體和分枝桿菌屬如貪食分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌。NO具有抵抗真菌如曲霉屬、念珠菌屬、隱球酵母屬、組織孢漿菌屬和酵母屬和病毒如柯薩奇病毒、Ectomelia virus、腦心肌炎病毒、Epstein-Barr病毒、單純皰疹病素(Herpes simplex virus)、人免疫缺陷病毒I型、日本腦炎病毒、小鼠肝炎病毒、細(xì)小病毒屬、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、猿猴病毒40、牛痘病毒和水皰性口腔炎病毒(Fang,1997,ASM News,63,668-673)的活性。
      CCX2蛋白在增加NO產(chǎn)生方面的活性賦予其免疫刺激劑活性并意味著CCZ可用作針對(duì)諸如上面所列出的寄生蟲、細(xì)菌、真菌和病毒的抗微生物劑。
      因此,在另一方面,本發(fā)明提供CCX2蛋白或水果菠蘿蛋白酶以用作抗微生物劑和CCX2蛋白或水果菠蘿蛋白酶在制備抗微生物劑方面的用途。
      此蛋白通常在施用給病人之前經(jīng)過(guò)配制,因此在本發(fā)明的另一方面,提供包含本發(fā)明第一方面的分離純化蛋白及藥學(xué)上或畜醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑的藥物或畜醫(yī)組合物。
      此蛋白可通過(guò)多種途徑施用包括腸道如口、鼻、頰、局部或肛門施用或非腸道施用通過(guò)靜脈、皮下、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑。
      在許多情況下,口腔途徑是優(yōu)選的,因?yàn)檫@常常是病人發(fā)現(xiàn)最可接受的途徑。如果需要大劑量的蛋白,如治療癌癥時(shí)常見(jiàn)的,口服途徑可能是特別有用的。
      如果選擇口服給藥,可以將此蛋白配制成腸溶包衣制劑以幫助其經(jīng)過(guò)胃后仍然有效。選擇性地,可選用另一種可口服給藥的劑量形式如糖漿、配劑或硬或軟的明膠膠囊,它們?nèi)魏沃欢伎梢允悄c溶包衣的。
      然而,如果預(yù)期只施用蛋白的單一劑量,用非腸道途徑將更為方便。
      對(duì)于非腸道施用,此蛋白可在去離子水或另一種藥學(xué)上可接受的溶劑或懸浮劑中配制。
      給病人施用的蛋白的合適劑量由臨床醫(yī)生決定。然而,作為指導(dǎo),合適的劑量可以是約0.5-100mg/kg體重。預(yù)期在大多數(shù)情況下,此劑量將為約1-50mg/kg體重,優(yōu)選地1-20mg/kg體重。因此對(duì)于體重約70kg的人,通常劑量將為約70-7000mg。
      本發(fā)明將參照下列實(shí)施例和附圖得到進(jìn)一步描述,其中

      圖1是在SP Sepharose高效介質(zhì)上陽(yáng)離子交換層析后粗制菠蘿蛋白酶的紫外洗脫輪廓。
      圖2是表示在SP Sepharose高效介質(zhì)上陽(yáng)離子交換層析后菠蘿蛋白酶組分的蛋白水解活性和蛋白含量的曲線圖。
      圖3是SP Sepharose高效層析匯集的組分在4-20%T梯度膠上電泳的SDS-PAGE,其中1-4泳道和6-9泳道分別包含組分CCT、CCV、CCX和CCZ及CCY、CCW、CCU和CCS,5和10泳道包含分子量標(biāo)記。
      圖4表示在pH3-11梯度膠上電泳匯集的組分的等電聚焦,其中1、11和12泳道表示高IEF標(biāo)記,2和13泳道表示粗制菠蘿蛋白酶,3至10泳道分別表示組分CCT、CCV、CCX、CCZ、CCY、CCW、CCU和CCS。
      圖5是一系列曲線,表示CCX組分、莖菠蘿蛋白酶(SBP)和粗制菠蘿蛋白酶對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。結(jié)果通過(guò)等量蛋白組分表示,括號(hào)中數(shù)值表示每個(gè)樣品的蛋白水解活性(Z-Arg-Arg-pNA)。
      圖6是與圖7中的曲線相似的一系列曲線,但其中的數(shù)據(jù)已轉(zhuǎn)化為代表莖菠蘿蛋白酶和組分CCX的等價(jià)蛋白水解活性。
      圖7是莖菠蘿蛋白酶和組分CCX對(duì)CH1卵巢瘤體外生長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑制活性的比較。
      圖8表示各種劑量的組分CCX針對(duì)移植在裸鼠中的人卵巢瘤的生長(zhǎng)抑制活性。箭頭表示CCX施用的天數(shù)。0天是移植腫瘤后的四周。
      圖9是表示各種劑量的組分CCX不影響用腫瘤移植的小鼠體重的曲線圖。
      圖10表示組分CCX提高IFN-γ介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞亞硝酸鹽的合成并由此刺激先天免疫的能力。
      圖11表示組分CCX提高在從嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷(SCID)小鼠得到的spenocyte中IFN-γ合成并由此刺激先天免疫的能力。
      圖12表示粗制菠蘿蛋白酶使用SP Sepharose HP介質(zhì)的陽(yáng)離子交換層析的紫外輪廓。含有25ml介質(zhì)的柱子用含1mM EDTA的20mM乙酸緩沖液(pH5.0)以3ml/分鐘平衡。蛋白在10倍柱體積的乙酸緩沖液中的0-1.0M NaCl線形梯度上洗脫。在整個(gè)梯度收集35ml組分,在輪廓上表示的CCX組分從30輪收集。
      圖13表示CCX(從陽(yáng)離子交換層析得到)使用Q Sepharose FF的陰離子交換層析的紫外輪廓。將匯集和去鹽的組分CCX以12ml/分鐘的流速上樣到裝在XK50/20柱中的200ml介質(zhì)上。紫外輪廓的A部分表示在流過(guò)組分中洗脫的有雜質(zhì)的莖菠蘿蛋白酶。陽(yáng)離子CX通過(guò)逐步變化成含4M NaCl的磷酸緩沖液來(lái)洗脫。輪廓的B部分表示蛋白的快速洗脫峰及隨后從柱上更慢洗脫的蛋白尾部。流過(guò)、起始峰和尾部分開(kāi)收集用于分析和加工。
      圖14表示CCX“主峰”(從陰離子交換層析得到)使用PhenylSepharose HP介質(zhì)的疏水相互作用層析。將50ml介質(zhì)裝入XK26/20柱。將陰離子CCX上樣到在含4M NaCl的100mM磷酸緩沖液中以15ml/分鐘流速平衡的柱上。蛋白用遞減的NaCl梯度至磷酸緩沖液(不含NaCl)洗脫,然后用去離子水逐步洗脫。分開(kāi)匯集主峰(此處示作峰6)用于分析。
      圖15表示陰離子CCX“尾”用Phenyl HP介質(zhì)的疏水相互作用層析。將50ml介質(zhì)裝入XK26/20柱。將陰離子CCX上樣到在含4M NaCl的100mM磷酸緩沖液中平衡的柱上。蛋白用遞減的鹽梯度至磷酸緩沖液(不含NaCl)洗脫,然后用去離子水逐步洗脫。在逐步至去離子水的變化上洗脫的主峰以3個(gè)分開(kāi)的組分收集(此處表示為峰1-3)用于分析和加工。
      圖16表示純化的CCX蛋白的SDS-PAGE。樣品在Novex 4-12%TMini膠上電泳。列1,HIC純化的‘17 kDa蛋白’(來(lái)自陰離子主峰);2,來(lái)自陰離子流過(guò)的莖菠蘿蛋白酶;3,來(lái)自陽(yáng)離子層析的CCX;4,HIC純化的CCX蛋白酶;5,HIC純化的CCX1蛋白酶;6,分子量標(biāo)記。
      圖17表示純化的CCX蛋白的等電聚焦。樣品在Ampholine PAG板(pH3.5-9.0)上電泳。列1,PI標(biāo)記;2,HIC純化的“17 kDa蛋白”;3,HIC純化的CCX1蛋白酶(來(lái)自陰離子“尾組分”);4,HIC純化CCX2蛋白酶(來(lái)自陰離子主峰);5,陰離子純化的莖菠蘿蛋白酶;6,來(lái)自陽(yáng)離子層析的組分CCX;7,PI標(biāo)記。
      圖18表示純化的CCX1、CCX2、莖菠蘿蛋白酶(SBP)和“17kDa蛋白”針對(duì)裸鼠中移植的人卵巢腫瘤的生長(zhǎng)抑制活性。箭頭表示施用樣品的天數(shù)。0天是腫瘤移值的4周。
      實(shí)施例1-菠蘿蛋白酶蛋白的純化a.材料菠蘿蛋白酶來(lái)自Solvay Enzymes Inc(德國(guó))??焖賁 Sepharose、Pharmalyte 3-10TM、Ampholine 9-11TM、Ready Mix IEFTM(丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺)和IEFTM標(biāo)記來(lái)自pharmacia Biotech。預(yù)灌制的4-20%丙烯酰胺凝膠和大范圍分子量標(biāo)記來(lái)自Bio-Rad Laboratories。所有其它試劑是分析級(jí)的并來(lái)自Sigma Chemical Co.或British DrugHouse。b.蛋白酶測(cè)定菠蘿蛋白酶的水解活性用合成的底物Z-Arg-Arg-pNA通過(guò)使用室內(nèi)微量滴定板為基礎(chǔ)的分析法測(cè)定。此分析法根據(jù)Filippova等在Anal Biochem143,293-297(1984)中的描述。底物是根據(jù)Napper等在生物化學(xué)雜志,301,727-735(1994)中描述的Z-Arg-Arg-pNA。c.蛋白測(cè)定蛋白用Bio-Rad提供的試劑盒測(cè)定蛋白,它是Lowry等(生物化學(xué)雜志(1951)193,265-275)方法的改進(jìn)。將樣品與在0.9%鹽水或20mM乙酸緩沖液pH5.0中制備的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)(0-1.5mg/ml)比較。d.菠蘿蛋白酶的制備所有的下列步驟在室溫(20-25℃)下進(jìn)行。將450mg粉末溶于15ml含0.1mM EDTA鈉的20mM乙酸緩沖液(pH5.0)中制備菠蘿蛋白酶溶液(30mg/ml)。將溶液分裝在10個(gè)1.5ml微量離心管中并于13,000xg離心10分鐘以去除不溶物質(zhì)。匯集澄清的上清并用于層析。e.快速S-Sepharose高效層析快速S-sepharose柱(pharmacia Biotech)通過(guò)將25ml介質(zhì)填充到XK 16/50TM柱中并用含0.1mM EDTA的20mM乙酸緩沖液(pH5.0)在FPLCTM系統(tǒng)上以3ml/min平衡而得到制備。將5ml的菠蘿蛋白酶溶液加到柱上。收集未結(jié)合蛋白并用100ml乙酸緩沖液洗柱。與柱子結(jié)合的蛋白用300ml以上的溶于乙酸緩沖液中的0-0.8M NaCl線形梯度洗脫。整個(gè)梯度收集5ml組分,圖1表示從此方法得到的粗制菠蘿蛋白酶的典型的紫外層析譜。
      根據(jù)上述分析組分的蛋白和蛋白水解活性,圖2表示針對(duì)合成肽Z-Arg-Arg-pNA的蛋白水解活性及單個(gè)組分的蛋白含量。如所預(yù)測(cè)的,蛋白含量輪廓嚴(yán)密地反映了紫外輪廓,但主要的蛋白水解活性局限于符合莖菠蘿蛋白酶(SBP)的兩個(gè)主要峰。在層析譜其它區(qū)域中觀察到的小活性可能與菠蘿蛋白酶明顯不同的其它蛋白酶相一致,如后來(lái)洗脫的Ananain和Comasain(CCS)。
      從紫外模式圖確定的主要峰被從三個(gè)連續(xù)循環(huán)中匯集并根據(jù)表1所示的命名。匯集的部分用于物理化學(xué)定性。匯集的組分通過(guò)超濾濃縮,用PD10柱將緩沖液換成等滲鹽溶液(0.9%重量/體積NaCl)。在進(jìn)行生物檢測(cè)前計(jì)算蛋白濃度和Z-Arg-Arg-pNA活性,示于表2。
      表1 從SP Sepharose HP分級(jí)分離的菠蘿蛋白酶(QC2322)的匯集組分總結(jié)
      表2 用于檢測(cè)生物學(xué)活性的匯集的組分的計(jì)算蛋白含量和Z-Arg-Arg-pNA活性
      對(duì)匯集的組分進(jìn)行如下述的分析。f匯集組分的加工測(cè)定匯集組分的蛋白水解活性和蛋白含量,用含有最小排阻分子量10kDa的超濾膜的FiltronTM攪拌水室調(diào)節(jié)濃度至約1.4mg/ml蛋白或105nmoles/min/ml蛋白活性。然后用PD10TM柱(Pharmacia Biotech)將組分緩沖液換成等滲鹽(0.9%wv/Nacl),無(wú)菌過(guò)濾(0.2μm),然后調(diào)節(jié)蛋白含量或蛋白水解活性。g十二烷基磺酸鈉聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)通過(guò)十二烷基磺酸鈉聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)在預(yù)制的4-20%T梯度凝膠上分析匯集的FPLCTM樣品。將100μl樣品與等體積的20%w/v三氯乙酸(TCA)混合通過(guò)酸沉淀制備用于電泳的樣品。以13,000xg離心10分鐘收集沉淀的蛋白,棄去上清。用0.5ml二乙醚洗滌沉淀兩次,室溫下空氣中干燥沉淀。將沉淀溶解于300μl SDS-PAGE樣品緩沖液中(62.5mM Tris-Hcl pH68含10%v/v甘油、2%w/v十二烷基磺酸鈉和40mM二硫蘇糖醇)并在水浴中于95℃加熱。
      SDS-PAGE大范圍分子量標(biāo)準(zhǔn)以1∶20于SDS-PAGE樣品緩沖液中稀釋經(jīng)過(guò)相似的處理后與樣品同時(shí)電泳。根據(jù)Bio-Rad說(shuō)明書如前述以240V在微型Protean IITM電泳系統(tǒng)上進(jìn)行凝膠電泳,直到染色前沿到達(dá)凝膠底端(30-45分鐘)。
      電泳結(jié)束后,分離的蛋白在軌道混合器上于含0.075%w/v膠體亮藍(lán)G-250、1.5%v/v磷酸、11.25%w/v硫酸銨和25%v/v甲醇的溶液染色過(guò)夜。在含有25%v/v甲醇和10%v/v乙酸的溶液中對(duì)凝膠進(jìn)行脫色以得到清楚的背景。結(jié)果組分的純度通過(guò)SDS-PAGE示于圖3。除了柱流過(guò)(CCT)以外的所有匯集的組分表明存在的主要蛋白的分子量約25-28 kDa。這與由其他作者從菠蘿蛋白酶分離到的半胱氨酸蛋白酶的分子量相一致(Rowan等,酶學(xué)方法;(1994),244,555-568)。組分CCX、CCZ、CCY和CCW的純度看上去很高。在某些組分中可觀察到低分子量的次要組分,特別是CCT、CCV、CCX和CCS中。匯集的CCU和CCS組分中包含25-28 kDa的雙重線;較高的CCX、CCZ、CCY和CCW的凝膠上樣意味著雙重線帶可能也存在于這些組分中。組分及其由SDS-PAGE測(cè)定的匯集組分的計(jì)算的分子量的概括示于表3。
      匯集的CCX、CCZ、CCY+CCW和CCU組分中的蛋白經(jīng)SDS-PAGE后被Western印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜并用針對(duì)純化的莖菠蘿蛋白酶蛋白(SBP)的免抗血清進(jìn)行探測(cè)(結(jié)果未顯示)。匯集的組分中的所有蛋白帶都被血清中的抗體識(shí)別,表明免疫性相似的蛋白也許屬于半胱氨酸蛋白酶家族。h等電聚焦匯集的組分(0.5-1.0mg/ml)以1∶3稀釋于去離子水中并在pH3-11的梯度凝膠上進(jìn)行電泳。用Ready Mix IEFTM灌制凝膠產(chǎn)生含有10%v/v甘油、5.0%Phrmalyfe 3-10TMt 2.5%Ampholine 9-11TM的5.5%T、3%C的聚丙稀酰胺凝膠。在700V預(yù)聚集后,10μl樣品和高pI標(biāo)記被加到凝膠上。500V電泳10分鐘使樣品進(jìn)入,2500V電泳1.5小時(shí)進(jìn)行聚焦,3000V電泳10分鐘使條帶變細(xì)。電泳后,蛋白在含有20%W/V TCA的溶液中固定30分鐘,在脫色液中洗30分鐘以去除TCA,根據(jù)SDS-PAGE部分描述的(見(jiàn)上文),用亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色。表3存在于SP Sepharose HP匯集的組分中的蛋白根據(jù)SDS-PAGE測(cè)定的分子量總結(jié)
      結(jié)果圖4表示除CCX外所有組分包含9.3pI標(biāo)記之外聚焦的堿性蛋白。與層析介質(zhì)功能基團(tuán)的局部電荷相互作用可解釋為什么CCX中pI3.8和3.85的蛋白在pH5.0時(shí)吸附到陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上。CCZ在pI9.7處表現(xiàn)出一條單一的帶,而匯集的CCY、CCW和CCU組分包含在pH9.5-9.8范圍內(nèi)的多條等電點(diǎn)帶。至少這種異源性部分可由共同的莖菠蘿蛋白酶主鏈上碳水化合物部分的差異解釋。此值與文獻(xiàn)中報(bào)道的菠蘿蛋白酶的pI9.45-9.55相一致(Rowan等,酶學(xué)方法,(1994),244,555-568)。匯集的CCS組分包含兩個(gè)pI大于10.25的堿性蛋白。外推估計(jì)pI為10.4和10.45。這相當(dāng)于ananain和comasain,并且與其它的(Rowan等,上述)pI大于10的估計(jì)一致。在每一個(gè)匯集的組分的蛋白質(zhì)pI概括于表4。表4 SP Sepharose HP匯集組分中存在的蛋白的估計(jì)等電點(diǎn)總結(jié)
      i Western印跡根據(jù)廠商說(shuō)明,用TransblotTM儀器(Bio-Racl)以100V在Towbin緩沖液中轉(zhuǎn)移1小時(shí)將按上述SDS-PAGE電泳的樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(0.45μm孔徑)。蛋白轉(zhuǎn)移后,用蒸餾水洗膜然后在60℃培養(yǎng)箱中干燥過(guò)夜。干燥后,膜在含有500mM Nacl(Tris緩沖液)的20mMTris-HCl(pH7.5)的1%BSA溶液中封閉30分鐘,然后用Tris緩沖液將膜洗兩次,每次10分鐘。然后用含0.05%v/v Tween20TM的Tris緩沖液中含有的以1∶50稀釋的抗菠蘿蛋白酶抗血清(兔)探測(cè)膜2小時(shí)。用包含Tween20TM的Tris緩沖液洗膜3次并用抗兔辣根過(guò)氧化物酶與膜孵育2小時(shí)后對(duì)印跡顯色。通過(guò)與四氯荼酚物溫育觀察免疫反應(yīng)條帶。實(shí)施例2-菠蘿蛋白酶組分對(duì)一系列人腫瘤細(xì)胞系的體外生長(zhǎng)抑制。
      本研究的目的是測(cè)定組分CCS、莖菠蘿蛋白酶和粗制菠蘿蛋白酶對(duì)代表五種最常見(jiàn)人類中實(shí)體瘤卵巢瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤的十五種人腫瘤細(xì)胞系的比較生長(zhǎng)抑制特性。
      消化細(xì)胞系并將單個(gè)活細(xì)胞以每孔4×103的密度用160∶1生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種于96孔微量滴定板上。貼壁培養(yǎng)過(guò)夜后,將樣品加到四個(gè)孔的40μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,得到孔中的終濃度范圍為50、10、2.5、1和0.25μg/ml。8個(gè)孔作為未處理細(xì)胞對(duì)照。在加到孔中之前立即用無(wú)菌水稀釋提取物。根據(jù)以前描述的(Kelland等于,癌癥研究,53,2581-2586(1993)),抽提物暴露96小時(shí)后,用溶于1%乙酸中的0.4%硫氰酸鹽染色以測(cè)定每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)目。從濃度比%對(duì)照吸光度(在540nm處讀)曲線上計(jì)算50%抑制濃度(IC50以μg/ml)。結(jié)果所有提取物成功地得到溶解,IC值示于圖5。從圖5中看出,CCX蛋白在體外表現(xiàn)針對(duì)一些細(xì)胞系的效力與QC2322(粗制菠蘿蛋白酶)和莖菠蘿蛋白酶的相當(dāng)。它表現(xiàn)針對(duì)大多數(shù)細(xì)胞系的差異活性,對(duì)SKMe124(黑色素瘤)最有效并表現(xiàn)針對(duì)A2780和CH1(卵巢瘤)、HT29(結(jié)腸癌)、MCF-7(乳腺癌)和CORL23(肺癌)的中等活性。CCX對(duì)SKOV-3(卵巢瘤)、LOVO(結(jié)腸癌)、MDA231(乳腺癌)、MDA361(乳腺癌)A549、MOR(肺癌)G361和B005(黑色瘤)的可以忽略的活性。
      從圖5,SBP和粗制菠蘿蛋白酶看來(lái)對(duì)腫瘤有與CCX組分相同或比之更大的效應(yīng)在此實(shí)施例中所用的方法依賴于檢測(cè)吸附于微量板孔上的細(xì)胞。用菠蘿蛋白酶組分處理后對(duì)細(xì)胞染色測(cè)定生長(zhǎng)抑制活性。死的或?qū)⒁赖募?xì)胞從孔上脫離下來(lái)從而不被染色。用高濃度的酶如胰蛋白酶處理也能使細(xì)胞從孔上下來(lái);一種被稱為“胰酶消化”的方法。因此,很可能CCX的生長(zhǎng)抑制活性由于蛋白水解活性使細(xì)胞從孔上非特異的移下來(lái)導(dǎo)致的而不是這些組分的特異的“抗腫瘤”效應(yīng)。
      鑒于此,圖5中給出的結(jié)果調(diào)整每一組分的蛋白水解活性。調(diào)整的結(jié)果示于圖6。
      用這種解釋,從圖6看出得到了有些不同的結(jié)果分析。一旦考慮到每一組分的蛋白水解活性,看來(lái)具有最明顯抗癌活性的組分是CCX。
      具有可以忽略的Z-Arg-Arg-pNA(蛋白酶)活性的CCX抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力將證明特異抗癌活性,而不是從加樣孔非特異地去除細(xì)胞。為了證實(shí)CCZ的確具有最有效的生長(zhǎng)抑制活性,將粗制菠蘿蛋白酶和莖菠蘿蛋白酶稀釋成含有與CCX等量的蛋白水解活性并測(cè)試它們抑制CH1卵巢腫瘤生長(zhǎng)的能力。圖7證實(shí)CCX具有最有效的生長(zhǎng)抑制活性。實(shí)施例3-CCX提取物對(duì)CHI人卵巢癌異種移植的體內(nèi)抗腫瘤效能因?yàn)榻M分CCX表現(xiàn)出體外抗腫瘤活性,我們下一步希望研究組分CCX是否將在動(dòng)物模型體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤活性。研究工作是由在TheInstitute of Cancer Research的CRC Center for Cancer Therapeutics的Dr Lloyd Kelland進(jìn)行的。方法a CCX按照實(shí)施例1所描述的制備對(duì)應(yīng)于從層析柱下下來(lái)的第二個(gè)尖峰組分CCX。以5mg/ml的0.9%鹽溶液提供組分CCX,在需要前一直貯存于-20℃。b CHI人卵巢癌異種移植用來(lái)自接種了CHI人卵巢瘤細(xì)胞系小鼠的2mm3CHI異種移植腫瘤塊在脅部皮下植入6-8周齡的雌性裸鼠(nn/nn)體內(nèi)。用鹵烷麻醉下進(jìn)行腫瘤植入。之所以選擇人CHI卵巢細(xì)胞系是因?yàn)樵趯?shí)施例2進(jìn)行的研究表明此細(xì)胞系在體外對(duì)組分CCX處理敏感。
      將動(dòng)物養(yǎng)在負(fù)壓柔韌膜隔離器中,以LabsureTM21%蛋白飲食,可接觸到無(wú)菌自來(lái)水,動(dòng)物可隨意食水。當(dāng)腫瘤的平均最大直徑達(dá)6-8mm時(shí),以12.5,25或50mg/kg劑量靜脈注射到尾部靜脈使小鼠隨機(jī)接受組分CCX(n=每劑量水平6只動(dòng)物)。隨機(jī)選擇10只動(dòng)物只注射鹽溶液(對(duì)照)。在動(dòng)物隨機(jī)化后第0、4和8天且腫瘤植入后約6周施用組分CCX。c CCX效能評(píng)估每天觀察小鼠中藥物或腫瘤誘導(dǎo)的壓力/毒性征象。在由CRCCenter for Cancer Therapeutics采用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)下,不允許動(dòng)物由于腫瘤或藥物誘導(dǎo)的效應(yīng)死亡;在開(kāi)始死亡時(shí)無(wú)痛處死動(dòng)物。用滑動(dòng)卡尺每周測(cè)腫瘤直徑(a)和(b)兩次,其中(a)代表最長(zhǎng)直徑,(b)代表與(a)成直角的最長(zhǎng)直徑。
      根據(jù)等式V=a×b2×pi/6計(jì)算腫瘤體積(V)并與處理開(kāi)始時(shí)的體積(第0天)標(biāo)準(zhǔn)化。用相對(duì)腫瘤體積(RTV)(代表“在那個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有存活動(dòng)物的SEM”)與從處理開(kāi)始的天數(shù)代表數(shù)據(jù)。
      用處理的平均腫瘤體積與對(duì)照組的比率(T/C)評(píng)估抗腫瘤效應(yīng)(在第11天,對(duì)照腫瘤長(zhǎng)到最大倫理限度的時(shí)間)。另外,計(jì)算生長(zhǎng)延遲(處理的與對(duì)照腫瘤體積加倍天數(shù)的差異)。
      為了評(píng)估藥物誘導(dǎo)的毒性,每周記錄兩次小鼠體重,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),檢測(cè)主要器官的組織學(xué)。d統(tǒng)計(jì)學(xué)用斯氏t檢測(cè)(獨(dú)立的,兩尾的)或通過(guò)ANOVA(所有群體聯(lián)合處理效應(yīng)一向分析)評(píng)估每個(gè)處理和對(duì)照組之間的差異顯著性。p<0.05被認(rèn)為顯著。結(jié)果圖8表明組分CCX表現(xiàn)出明顯的在所檢的三個(gè)劑量上對(duì)CHI人卵巢瘤的體內(nèi)抗腫瘤證據(jù)。在第8天,與未經(jīng)處理的對(duì)照相比,最高處理組(50mg/kg,第0,4,8天)觀察到63%的腫瘤減小。由于腫瘤太大在第11天時(shí)從分析中去掉兩只對(duì)照動(dòng)物,50mg/kg組中第11天時(shí)腫瘤大小實(shí)際的最大減小為70%(用對(duì)照動(dòng)物中得到的最高RTV值1800代替去掉的兩只對(duì)照動(dòng)物;p=0.023;t檢測(cè);p<0.05 ANOVA)。
      在第15天時(shí),因?yàn)槟[瘤太大從研究中去除所有的對(duì)照動(dòng)物。相反,從每個(gè)CCX處理組中只去掉一只動(dòng)物。這組數(shù)據(jù)表明CCX不僅明顯地阻止腫瘤生長(zhǎng),基本上也能延長(zhǎng)動(dòng)物的壽命。
      觀察到腫瘤生長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯降低的同時(shí),未觀察到CCX誘導(dǎo)的毒性。動(dòng)物體重沒(méi)有明顯減少(圖9)。同樣,死后也未見(jiàn)主要器官毒性。但是,除了兩只接受了最低(12.5mg/kg)劑量的小鼠外,其它所有經(jīng)CCX處理小鼠中觀察到了整個(gè)腸道的淡粉紅染色。實(shí)施例4-CCZ提高巨噬細(xì)胞合成硝酸鹽并因此能刺激先天免疫反應(yīng)在共同未決的申請(qǐng)中,我們已提到稱為CCZ的菠蘿蛋白酶的成分之一增強(qiáng)巨噬細(xì)胞合成氧化氮(NO)。已知NO是腫瘤細(xì)胞的有效殺傷劑并因此可能具有癌癥治療方面的用途。
      NO也是宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介體。已證明與NO相關(guān)的抗微生物活性在患胞內(nèi)病原體侵染如分枝桿菌、Plasmodium和Leishmania的人中是臨床上重要的。在患有活性肺結(jié)核或瘧疾的病人中,NO合成的高水平與更好的臨床結(jié)果相關(guān),與宿主防御中NO的有益作用一致。NO相關(guān)的生物活性也可容易地在從患各種引起炎癥的疾病包括肺結(jié)核、瘧疾和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人得到的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到。因此CCX可以通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成NO代謝物刺激先天免疫以控制各種胞內(nèi)侵染。
      用于實(shí)施例3中所述的腫瘤研究的裸鼠不含有T細(xì)胞,但含有巨噬細(xì)胞。因此有可能在實(shí)施例3中觀察到的CCX的抗腫瘤效應(yīng)可通過(guò)對(duì)先天免疫系統(tǒng)的影響介導(dǎo)。因此我們研究是否CCX可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞合成NO。a材料用重組IFN-γ(100u/ml)刺激培養(yǎng)的鼠巨噬細(xì)胞系RAW264。用Greiss實(shí)驗(yàn)(Roach等(1991),感染與免疫,59,3935-3944)測(cè)定培養(yǎng)上清中的硝酸鹽水平。NO是難以測(cè)定的不穩(wěn)定氣體。然而,硝酸鹽是可以容易測(cè)定的NO合成的穩(wěn)定終產(chǎn)物。b巨噬細(xì)胞處理用CCX(50μg/ml)、粗制菠蘿蛋白酶(50μg/ml)或莖菠蘿蛋白酶(50μg/ml)處理或以鹽溶液模擬處理RAW264巨噬細(xì)胞。然后洗細(xì)胞三次去除處理劑并用IFN-γ刺激細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)粗制菠蘿蛋白酶和CCX,而不是莖菠蘿蛋白酶顯著提高IFN-γ介導(dǎo)的硝酸鹽的合成(圖6)。在CCX處理的細(xì)胞中,IFN-γ介導(dǎo)的硝酸鹽合成增加比鹽溶液處理細(xì)胞明顯高,表明CCX與IFN-γ協(xié)同作用提高NO的合成。當(dāng)用CCX或菠蘿蛋白酶單獨(dú)刺激巨噬細(xì)胞時(shí),幾乎不合成硝酸鹽,表明CCX或菠蘿蛋白酶不能直接活化硝酸鹽的合成。為了保證已經(jīng)存在于CCX混合物中的可能污染的內(nèi)毒素負(fù)責(zé)NO的提高,實(shí)驗(yàn)中包含了多粘菌素B(內(nèi)毒素的強(qiáng)有力的抑制劑)。多粘菌素B的包含并不影響IFN-γ誘導(dǎo)的CCX處理細(xì)胞中NO的合成,暗示可能污染的內(nèi)毒素不負(fù)責(zé)觀察到的效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。CCX增強(qiáng)NO合成的能力提供了CCX體內(nèi)抗腫瘤活性的可能解釋。實(shí)施例5-CCX活化天然殺傷(NK)細(xì)胞在實(shí)施例4中,我們表明CCX與IFN-γ協(xié)同作用提高巨噬細(xì)胞的NO的合成。所以,CCX可活化天然免疫系統(tǒng)并用于抵御感染或作為抗癌劑。在這個(gè)實(shí)施例中,我們通過(guò)證明CCX也可活化天然免疫系統(tǒng)的另一個(gè)重要成分天然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)一步延伸了這些結(jié)果。
      NK細(xì)胞是識(shí)別和破壞感染了各種病毒、細(xì)菌或寄生蟲病原體的細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。另外,NK細(xì)胞通過(guò)特異性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞上病毒誘導(dǎo)的分子或其它與腫瘤相關(guān)分子的表達(dá)殺死腫瘤細(xì)胞。雌性中約20%腫瘤及雄性的8%是由病毒感染引起的。方法IFN-γ是由NK細(xì)胞合成的重要的免疫介質(zhì)。它是通過(guò)提高M(jìn)HCII類分子表達(dá)活化巨噬細(xì)胞的有效前炎癥細(xì)胞因子。IFN-γ也刺激包括NO的其它炎癥的介質(zhì)的合成。巨噬細(xì)胞的活化在抗腫瘤生長(zhǎng)和抵御多種病原體感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
      在來(lái)自重度復(fù)合免疫缺損(SCID)小鼠的脾細(xì)胞中研究了CCX對(duì)IFN-γ合成的效應(yīng)。因?yàn)镾CID小鼠無(wú)B或T細(xì)胞,所以由SCID脾細(xì)胞合成的任何IFN-γ將來(lái)自NK細(xì)胞。
      按照以前描述的(Kaye和Bancroft,1992,感染和免疫604335-4342)從SCID小鼠中分離脾細(xì)胞。然后用CCX(50μg/ml)或鹽溶液處理、洗滌脾細(xì)胞,然后在培養(yǎng)基中,或含重組IL-2(100U/ml)和IL-2(50U/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)脾細(xì)胞。IL-12和IL-2是NK細(xì)胞的強(qiáng)激活劑。
      24小時(shí)后收獲培養(yǎng)上清并用ELISA測(cè)定IFN-γ的水平(kaye和Bancroft,1992,感染和免疫604335-4342)。結(jié)果CCX明顯地提高SCID脾細(xì)胞的由IL-2和IL-12介導(dǎo)的IFN-γ的合成(圖11)。在鹽溶液處理的對(duì)照中,只觀察到了小量的IL-12和IL-2介導(dǎo)的IFN-γ合成提高。當(dāng)用CCX處理脾細(xì)胞而在無(wú)IL-2和IL-12時(shí)培養(yǎng),合成很少量的IFN-γ。經(jīng)數(shù)據(jù)提示CCX不直接活化NK細(xì)胞,而是由IL-2和IL-12協(xié)同作用提高IFN-γ的合成。
      為了保證CCX混合物可能潛在的內(nèi)毒素不負(fù)責(zé)IFN-γ的升高,實(shí)驗(yàn)中包含了多粘菌素B(內(nèi)毒素的強(qiáng)抑制劑)。包含多粘菌素B不會(huì)影響CCX處理的細(xì)胞合成IFN-γ,表明潛在污染的內(nèi)毒素不負(fù)責(zé)觀察到的效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
      CCX提高從SCID小鼠獲得的脾細(xì)胞中IFN-γ合成的能力提示CCX活化NK細(xì)胞并且進(jìn)一步支持CCX的體內(nèi)抗腫瘤活性。實(shí)施例6-CCX蛋白的純化在上述實(shí)施例1-5中,組分CCX蛋白用于體外和體內(nèi)研究。因此為肯定抗腫瘤活性的確是由于CCX蛋白而不是由于組分CCX混合物中的少量污染,我們分離出CCX組分成為其組成成分。方法a.材料菠蘿蛋白酶(3027 GDU/g)來(lái)自臺(tái)灣的Polyamine公司。SPSepharose HP、苯基Sepharose HP、Hitrap去鹽柱、Ampholine PAG板pH 3.5-9.0)和寬范圍IEFTM標(biāo)記購(gòu)自pharmacia。預(yù)灌制的4-12%丙烯酰胺凝膠來(lái)自Novex并且寬范圍分子量標(biāo)記來(lái)自Bio-Rad。DC蛋白分析試劑盒來(lái)自Biorad。Z-Arg-Arg-pNA、Z-Phe-Val-Arg-pNA和Bz-Phe-Val-Arg-pNA合成底物購(gòu)自Bachem(U.K.)公司。所有其它試劑是分析級(jí)的并來(lái)自Sigma Chemical Co.或British Drug House。b.蛋白酶測(cè)定粗制菠蘿蛋白酶、莖菠蘿蛋白酶、CCX和層析組分的蛋白水解活性用合成底物Z-Arg-Arg-pNA、Z-Phe-Val-Arg-pNA和Bz-Phe-Val-Arg-pNA通過(guò)使用微量滴定板為基礎(chǔ)的分析法測(cè)定。c.蛋白測(cè)定蛋白使用由Biorad提供的DC蛋白試劑盒測(cè)定。這是Lowry等(1951,生物化學(xué)雜志193265-275)的修飾方法。將樣品與在0.9%鹽水或20mM乙酸緩沖液(pH5.0)或100mM磷酸緩沖液(pH6.0)中制備的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)(0-1.5mg/ml)比較。d.菠蘿蛋白酶的制備所有下列步驟在室溫(20-25℃)下進(jìn)行。將450mg粉末溶于15ml含1mM EDTA(二鈉)的20mM乙酸緩沖液(pH5.0)中制備粗制菠蘿蛋白酶溶液(30mg/ml)。將溶液于13,000×g離心15分鐘以去除不溶物質(zhì)。匯集澄清的上清并用于層析。e.SP Sepharose HP陽(yáng)離子層析SP Sepharose HP柱(pharmacia Biotech)通過(guò)將25ml介質(zhì)填充到XK 16/50TM柱中并用含1mM EDTA(二鈉)的20mM乙酸緩沖液(pH5.0)在Perseptive Biosystem Workstation上以3ml/min平衡而得到制備。將5ml的粗制菠蘿蛋白酶溶液(30mg/ml)加到柱上并收集未與柱結(jié)合的蛋白并用50ml乙酸緩沖液洗柱。與柱子結(jié)合的蛋白用250ml以上的溶于乙酸緩沖液中的0-1.0M NaCl線形梯度洗脫。整個(gè)梯度收集5ml組分。從連續(xù)的30輪匯集含有CCX峰的組分并用于蛋白層析、蛋白水解活性、SDS-PAGE和等電聚焦。f.Q Sepharose HP陰離子交換層析將通過(guò)陽(yáng)離子層析得到的匯集的CCX組分濃縮并通過(guò)使用Filtron攪拌器(10kDa分子量去除)的滲濾和使用Hitrap去鹽柱的去鹽結(jié)合將緩沖液交換成50mM Tris-HCl(pH8.5)。然后將去鹽的CCX上樣到填充在XK 50/20柱中并用Tris緩沖液平衡的Q Sepharose HP并且與Gradific層析系統(tǒng)結(jié)合(Pharmacia)。收集含有莖菠蘿蛋白酶的流過(guò)液并用10倍柱體積的Tris緩沖液洗滌過(guò)夜。洗柱后,吸附在柱上的CCX通過(guò)加入100mM含4M NaCl的磷酸緩沖液逐步洗脫。以尖主峰洗脫的物質(zhì)后接著以主峰的尾從柱上緩慢洗脫的其它物質(zhì)。收集兩個(gè)組分一個(gè)含有主峰(稱為CCX2)和一些“尾”,另一個(gè)只含有“尾”物質(zhì)(稱為CCX2)。g.苯基Sephrose HP疏水相互作用層析通過(guò)疏水相互作用層析(HIC)對(duì)從Q Sephrose HP得到的兩個(gè)CCX組分進(jìn)一步純化。簡(jiǎn)言之,將50ml苯基Sephrose HP介質(zhì)裝入XK26/20柱中(與Gradific層析系統(tǒng)結(jié)合)并用100mM含4M NaCl的磷酸緩沖液中平衡。將來(lái)自陰離子交換層析的主峰(CCX2)和尾(CCX1)上樣并分別在苯基Sephrose柱上電泳。收集流過(guò)液中未結(jié)合的蛋白并且結(jié)合的蛋白用超過(guò)10倍柱體積的磷酸緩沖液中的遞減的線形鹽梯度4M-0M NaCl)洗脫。接著逐步變化至100%去離子水。整個(gè)梯度收集5ml組分并收集梯度結(jié)束時(shí)的物質(zhì)。主要CCX1峰以3組分收集用于分析并且分別匯集從柱上洗脫的CCX1蛋白和“17kDa”蛋白用于分析。h.加工CCX用于體外測(cè)試從陽(yáng)離子層析得到的CCX樣品、從陰離子交換得到的莖菠蘿蛋白酶以及從HIC得到的CCX1、CCX和“17kDa”蛋白通過(guò)在含有10kDa分子量去除膜的Filtron攪拌器中超濾濃縮。濃縮后通過(guò)使用PD10柱對(duì)樣品進(jìn)行緩沖液交換成含有Triton X-100(0.001%體積/體積、還原的、羰基,不含過(guò)氧化物)的鹽水(0.9%重量/體積),然后無(wú)菌過(guò)濾。保留等份樣品用于分析并將樣品送給在The Institute of Cancer Research的CRC Center for Cancer Therapeutics的Dr.LIoyd Kelland用于如實(shí)施例7中所說(shuō)明的體內(nèi)抗癌分析活性的評(píng)估。g十二烷基磺酸鈉聚丙烯凝膠電泳在減弱的條件下通過(guò)十二烷基磺酸鈉聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)使用Xcell II Mimi-Cell(Novex)在預(yù)制的Novex NuPAGE Bis 4-12%T梯度凝膠上分析CCX樣品。樣品通過(guò)酸沉淀制備用于電泳,其中樣品與等體積的20%重量/體積三氯乙酸(TCA)混合。樣品體積根據(jù)蛋白濃度變化。以13,000xg離心10分鐘收集沉淀的蛋白并棄去上清。沉淀用0.5ml二乙醚洗兩次使之在室溫下空氣中干燥。將沉淀溶解于Novex SDS-PAGE樣品緩沖液中并于70℃加熱10分鐘。
      根據(jù)生產(chǎn)商的步驟(Novex)將20μl樣品上樣到膠上并以恒定電壓(200V)電泳直到染色前沿到達(dá)凝膠底端(約40分鐘)將SDS-PAGE寬范圍分子量標(biāo)準(zhǔn)以1∶400稀釋于SDS-PAGE樣品緩沖液中,70℃加熱10分鐘并與樣品同電流電泳。電泳后。蛋白通過(guò)使用Gelcode拷馬斯膠體藍(lán)染色試劑(Pierce Chemmical Co.)染色。j.等電聚焦按照生產(chǎn)商的說(shuō)明,使用Pharmacia Multiphor II電泳系統(tǒng),在Ampholine PAG板(pH3.5-9.0)上對(duì)CCX樣品進(jìn)行等電聚焦(IEF)。首先通過(guò)將50μl放在漂浮在30ml去離子水上的Millipore0.025μm膜上,對(duì)IEF樣品透析45分鐘。簡(jiǎn)言之,將10μl或20μl樣品或?qū)抪I標(biāo)記(Pharmacia)上樣到凝膠并于IEF在1500V泳進(jìn)行1.5小時(shí)。電泳后,蛋白用TCA(20%重量/體積)溶液固定20分鐘,接著在去離子水中洗兩次各15分鐘以去除TCA。蛋白用Gelcode拷馬斯膠體藍(lán)染色試劑染色1小時(shí)并在去離子水中脫色過(guò)夜。i Western印跡對(duì)匯集的組分進(jìn)行SDS-PAGE并Western印跡至PVDF膜上。蛋白轉(zhuǎn)移后,膜用溶解在甲醇(40%體積/體積)中的拷馬斯藍(lán)R-250(0.025%重量/體積)染色10分鐘,接著在甲醇(50%體積/體積)中脫色。膜在室溫下空氣干燥,并將染色的蛋白送至利物浦大學(xué)生物化學(xué)系Mark Wilkinson博士進(jìn)行NH2末端氨基酸測(cè)序。簡(jiǎn)言之,將結(jié)合在膜上的蛋白切下并放在測(cè)序的上槽。CCX蛋白的NH2末端氨基酸分析使用裝有phenylthiohydantion氨基酸分析儀的氣相測(cè)序儀通過(guò)Edman降解進(jìn)行。l.CCX的肽圖譜和N末端氨基酸分析陽(yáng)離子和陰離子CCX(CCX2)是還原的、羧甲基化的,并用胰蛋白酶消化。將所得的消化物給利物浦大學(xué)Mark Wilkinson博士在細(xì)bore C18柱上通過(guò)HPLC進(jìn)行肽作圖。肽通過(guò)含有三氟乙酸(0.1%體積/體積)的0-65%線形梯度從柱上洗脫40分鐘。收集從柱上洗脫的主要肽并用于NH2末端測(cè)序。結(jié)果a CCX的純化圖12表示在SP Sepharos高效介質(zhì)上泳動(dòng)的粗制菠蘿蛋白酶典型的紫外層析譜,從30輪匯集含有所述CCX組分的樣品。為了去除污染的莖菠蘿蛋白酶,通過(guò)脫鹽柱將陽(yáng)離子CCX脫鹽至Tris/HCl緩沖液(pH8.5)中并將它吸附到Q Sepharose HP上。由于莖菠蘿蛋白酶與CCX蛋白酶的pI不同,我們預(yù)測(cè)主要CCX蛋白應(yīng)吸附在柱上,而污染了莖菠蘿蛋白酶的洗液在柱流過(guò)液中。圖13A表示了Q Sepharose柱的紫外踉蹤,證實(shí)污染的莖波蘿蛋白酶收集在流過(guò)液中。主要的CCX蛋白在含4M NaCl的磷酸緩沖液中得到分段洗脫。圖13B表示蛋白不以尖峰洗脫,而是經(jīng)過(guò)最初快速的升降后,由于蛋白從柱上洗脫很慢有明顯的拖尾。這表明CCX組分中的蛋白行為有差異。蛋白的拖尾也許由于與層析基質(zhì)(Sepharose)非特異疏水作用造成的。從柱上洗脫的蛋白收集成兩個(gè)組分;一個(gè)含首先洗脫的物質(zhì)和某些拖尾蛋白(CCX2),一個(gè)只含拖尾蛋白(CCX1)。
      將兩個(gè)陰離子組分用Phenyl Sepharose HP介質(zhì)上的HIC處理。圖14表示的CCX2從HIC柱的洗脫輪廓。某些蛋白洗脫在流過(guò)液中,其它在梯度上(峰1-5),而大部分蛋白在改為100%水后的梯度末尾(峰6)。流過(guò)液和峰1含有約17kDa大小的蛋白。當(dāng)CCX1在HIC柱上泳動(dòng)時(shí),出現(xiàn)了不同的洗脫輪廓(圖15)。在流過(guò)液中無(wú)蛋白,鹽梯度上無(wú)蛋白洗脫液;主要蛋白洗脫液位于梯度的末尾及在100%水步驟后。b SDS PAGE圖16表示了在實(shí)施例7中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所用的CCX樣品的SDS-PAGE分析。陽(yáng)離子CCX(泳道3)表示了位于22.1kDa處的主要蛋白,但有與先前實(shí)施例1中描述的蛋白相似的位于24.9kDa和16.6kDa的少量污染物。此制備物中沒(méi)有實(shí)施例1中描述的少量76kDa蛋白。從陽(yáng)離子柱中的流過(guò)液中的莖菠蘿蛋白酶清楚地表明它與主要CCX蛋白不同分子量并且以單一的25kDa主要帶出現(xiàn)(泳道2)。從HIC柱中得到的CCX2和CCX1分別在泳道4和5中表示。CCX2表示了制備物中污染了少量低或高分子量污染物的主要22.2kDa帶。CCX1以單一22.2kDa帶出現(xiàn)。標(biāo)為“17kDa”的蛋白揭示了主要的16.2kDa帶和某些位于19.35和51kDa的少量污染物。c等電聚焦圖17表示了在實(shí)施例7中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所用的CCX樣品的IEF。陽(yáng)離子CCX表示了焦聚于pI4.67和4.79處的兩個(gè)主要蛋白帶。少量污染物也出現(xiàn)于pI4.3-4.4內(nèi)。正如所期望的,從此陽(yáng)離子流過(guò)液中得到的莖菠蘿蛋白酶流過(guò)液聚焦在堿性端(外推pI=9.3)。從HIC柱得到的CCX2和CCX1表示了分別聚焦于pI4.79和pI4.67處的一個(gè)主要蛋白帶。IEF提示兩個(gè)緊密相關(guān)的蛋白酶存在于陽(yáng)離子CCX制備物中?!?7kDa”蛋白有兩條聚焦于pI8.01和8.16處的帶;少量污染物出現(xiàn)于pI6.67。d蛋白酶測(cè)定每個(gè)純化階段中的CCX蛋白的水解活性示于表5。以比活表示結(jié)果以使各種組分之間可以直接比較。Z-Arg-Arg-pNA是莖菠蘿蛋白酶的好底物,而Z-Phe-Val-Arg-pNA和Bz-Phe-Val-Arg-pNA是果實(shí)菠蘿蛋白酶的好底物。陽(yáng)離子CCX表示對(duì)兩個(gè)底物都有活性而對(duì)Z-Phe-Val-Arg-pNA的活性最強(qiáng)。來(lái)自陽(yáng)離子流過(guò)液的莖菠蘿蛋白酶對(duì)Z-Arg-Arg-pNA的比活性較高而對(duì)Z-Phe-Val-Arg-pNA的活性較低。來(lái)自陽(yáng)離子柱的CCX主峰和CCX尾巴對(duì)Z-Phe-Val-Arg-pNA有不同的活性而對(duì)Z-Arg-Arg-pNA的有低的活性。HIC后,純化的CCX2和CCX1對(duì)Z-phe-Val-Arg-pNA-有不同的比活性,而實(shí)際上對(duì)Z-Arg-Arg-pNA沒(méi)有活性。為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加工的CCX2和CCX1對(duì)Bz-Phe-Val-Arg-pNA表現(xiàn)出的比活性有差異。此數(shù)據(jù)證實(shí)莖菠蘿蛋白酶最初存在于CCX陽(yáng)離子交換制備物中,設(shè)計(jì)得到純CCX2的進(jìn)一步的程序成功地去除了污染的莖菠蘿蛋白酶。CCX2和CCX1比活性的差異提示這些酶有不同的底物特異性。e NH2氨基酸分析表6表示了來(lái)自Western印跡的內(nèi)部肽序列及陽(yáng)離子和陰離子CCX的肽圖譜。這些序列與貯存于DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白序列進(jìn)行比較。CCX肽與莖菠蘿蛋白酶有同源性但與從果實(shí)菠蘿蛋白酶得到的序列最密切地相配。但是,沒(méi)有果實(shí)和菠蘿蛋白酶序列與CCX100%相匹配。這提示CCX是不同的但與貯存于DDB/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的酶緊密相關(guān)。結(jié)論通過(guò)陽(yáng)離子交換層析得到的CCX含一個(gè)分子量估計(jì)為22.2kDa的蛋白同時(shí)也含許多其它蛋白。描述的純化流程使這四種成分的量足以用于鑒定研究和體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。這些蛋白鑒定為莖菠蘿蛋白酶、“17kDa蛋白和兩個(gè)稱為CCX1和CCX2的CCX蛋白酶。首先經(jīng)陽(yáng)離子層析,然后經(jīng)陰離子和疏水作用層析分離的CCX蛋白酶表現(xiàn)出對(duì)多種合成肽底物的比活性的差異;它們也有不同的等電點(diǎn)。內(nèi)部肽的NH2末端氨基酸序列表明從風(fēng)梨莖中分離的CCX蛋白酶與來(lái)自風(fēng)梨果實(shí)的果實(shí)菠蘿蛋白酶序列緊密相關(guān)。
      表5 CCX蛋白對(duì)合成蛋白酶底物的比活性<
      實(shí)施例7-純化的CCX蛋白對(duì)CHI人卵巢瘤異種移植的體內(nèi)抗腫瘤效能為了證實(shí)純化的CCX蛋白的確是組分CCX中的活性抗腫瘤成分而不是任何認(rèn)識(shí)到的污染物,我們檢測(cè)了實(shí)施例6中分離成分在動(dòng)物模型中的體內(nèi)抗腫瘤活性。同樣,研究工作是由在TheInstitute of Cancer Research的CRC Center for CancerTherapeutics的Dr.LIoyd Kelland進(jìn)行的。a CCXCCX1、CCX2和17kDa蛋白污染物分別以溶解在0.9%鹽溶液的1.25mg/ml、0.97mg/ml和1.22mg/ml的濃度提供。莖菠蘿蛋白酶以0.66mg/ml的濃度提供。樣品放在冰上提供,首次注射在受到樣品后立即施用。剩余的材料在需要前一直貯存于-20℃,bCHI人卵巢瘤異種移植此研究用6-8周齡的雌性裸鼠(nu/nu)并按照前文實(shí)施例3所述維持。當(dāng)腫瘤的平均最大直徑達(dá)6-8mm時(shí),以CCX1(12.5mg/kg)、CCX2(12.5mg/kg)、莖菠蘿蛋白酶(4mg/kg)或17kDa蛋白(12.5mg/kg)靜脈注射到隨機(jī)選擇的小鼠尾部靜脈(n=每個(gè)處理5只動(dòng)物)。隨機(jī)選擇5只動(dòng)物只注射鹽溶液(對(duì)照)。在動(dòng)物隨機(jī)化后第0、4和8天且腫瘤植入后約6周進(jìn)行處理。c CCX效能評(píng)估按照實(shí)施例3所述,每天觀察小鼠中藥物或腫瘤誘導(dǎo)的壓力/毒性征象。按照實(shí)施例3所述用滑動(dòng)卡尺每周測(cè)兩次腫瘤直徑及腫瘤體積。用處理的平均腫瘤體積與對(duì)照組的比率評(píng)估抗腫瘤的效應(yīng)。另外,計(jì)算生長(zhǎng)延遲(處理的與對(duì)照腫瘤體積加倍天數(shù)的差異)。
      為了評(píng)估藥物誘導(dǎo)的毒性,每周記錄兩次小鼠體重,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),檢測(cè)主要器官的組織學(xué)。d統(tǒng)計(jì)學(xué)用斯氏t檢驗(yàn)(獨(dú)立的,兩尾)評(píng)估每個(gè)處理和對(duì)照組之間的差異顯著性。認(rèn)為p<0.05有意義。結(jié)果圖18表明是CCX2而不是CCX1表現(xiàn)出明顯的對(duì)CHI人卵巢瘤的體內(nèi)抗腫瘤活性證據(jù)。包含于組分CCX內(nèi)的少量污染物,如莖菠蘿蛋白酶和17kDa蛋白不表現(xiàn)任何抗腫瘤活性。
      在第8天,與未經(jīng)處理的對(duì)照相比,CCX2處理組中觀察到了36%的腫瘤減小(p<0.04)。第11天時(shí),觀察到腫瘤大小減小47%(p<0.03)。觀察到腫瘤生長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯降低的同時(shí),未觀察到CCX2誘導(dǎo)的毒性。與實(shí)施例3的結(jié)果相似,動(dòng)物體重沒(méi)有明顯的減小。
      這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)證實(shí)組分CCX混合物中的活性成分的確是稱為CCX2的蛋白。還不清楚為什么非常相關(guān)的酶CCX1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有影響。目前CCX1和CCX2不能通過(guò)陽(yáng)離子交換層析區(qū)分,但可通過(guò)它們不同的陰離子交換柱的洗脫輪廓及酶比活性的差異區(qū)分(實(shí)施例6)。該數(shù)據(jù)提示CCX2有非常特異的作用模式。
      權(quán)利要求
      1.一種作為菠蘿蛋白酶成分的蛋白,具有由SDS-PAGE測(cè)定的約22.2-25.08kDa的分子量,并具有等電點(diǎn)約3.8-4.79,且具有如下氨基末端序列Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Asn Glu Val Lys Asn(SEQ ID NO1)并且,另外還包含以下序列Gly Gly Trp Glu Phe Lys(SEQ ID NO2)Lys Ala Val Asn Gly(SEQ ID NO3)Tyr Trp Ile Val Arg(SEQ ID NO4)Asn Ser Trp Gly Ser Ser Trp Gly Glu Gly Gly Tyr Val Arg(SEQ ID NO5)Thr Ser Leu Asn His Ala Ile Thr Ile Ile Val Tyr(SEQ ID NO6)Leu Pro Glu Phe (Gln) Pro (Gln) Val Leu Asp-Ala-(SEQ ID NO7)Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Ala Cys Gly Ile Ala Met Ser Pro Leu-Thr-(SEQ ID NO8)Gly Gly Val Phe Ser Gly Pro Ala Gly(SEQ ID NO9)Asn Asn Ala Tyr(SEQ ID NO10)Ser Ser Gly Thr Lys Tyr Trp-Val-(SEQ ID NO11);其中括號(hào)中的氨基酸表示對(duì)前面氨基酸的替換氨基酸,而“-”表示未鑒定的氨基酸。
      2.一種作為菠蘿蛋白酶成分的蛋白,具有由SDS-PAGE測(cè)定的約22.2-25.08kDa的分子量,并可通過(guò)下列方法得到i.將菠蘿蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸緩沖液中;ii.通過(guò)在S-Sepharose上的快流高效液相層析,用300ml以上的溶于乙酸緩沖液中的0-0.8M氧化鈉線性梯度洗脫來(lái)分離菠蘿蛋白酶的成分;iii.收集對(duì)應(yīng)于從柱上下來(lái)的第二個(gè)尖峰的組分;并且iv.通過(guò)陰離子層析和疏水相互作用層析從(iii)中收集的組分分離主要蛋白。
      3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶,用于人或獸醫(yī)藥。
      4.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶,用于治療或預(yù)防人或其它哺乳動(dòng)物中的癌癥。
      5.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶在制備用于治療或預(yù)防癌癥的制劑方面的用途。
      6.如權(quán)利要求4中所述的蛋白或權(quán)利要求5中所述的用途,其中癌癥是實(shí)體癌如卵巢瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌或黑色素瘤,非實(shí)體腫瘤,白血病或病毒誘導(dǎo)的腫瘤如肝細(xì)胞癌、非何杰金氏淋巴瘤、鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、卡波西肉瘤、T細(xì)胞白血病或?qū)m頸癌。
      7.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶,用作免疫刺激劑。
      8.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶在制備免疫刺激劑方面的用途。
      9.如權(quán)利要求7中所述的蛋白或如權(quán)利要求8中所述的用途,其中免疫刺激劑用于治療由營(yíng)養(yǎng)不良、感染(例如HIV和瘧疾)、腫瘤(例如淋巴瘤、骨髓瘤及其它)、創(chuàng)傷(例如灼傷、擊傷和手術(shù))、醫(yī)學(xué)治療(例如用藥如類固醇、環(huán)孢菌素和環(huán)磷酰胺)、蛋白丟失(如腹瀉和灼傷)、遺傳異常(如在缺乏T和/或B細(xì)胞的復(fù)合免疫缺陷病人中發(fā)現(xiàn)的)糖尿病和老齡引起的次級(jí)免疫缺陷。
      10.如權(quán)利要求7中所述的蛋白或如權(quán)利要求8所述的用途,其中免疫刺激劑是疫苗佐劑。
      11.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶,用于治療或預(yù)防對(duì)增加的NO合成應(yīng)答的疾病或病癥。
      12.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶在制備用于治療或預(yù)防對(duì)增加的NO合成應(yīng)答的疾病或病癥的制劑方面的用途。
      13.如權(quán)利要求1或如權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶,用作抗微生物劑。
      14.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶在制備抗微生物劑方面的用途。
      15.具有編碼如權(quán)利要求1中所述的蛋白的序列或與其互補(bǔ)序列的核酸。
      16.一種藥物或獸醫(yī)組合物,包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白及藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的賦形劑。
      17.如權(quán)利要求16中所述的組合物,配制成用于腸道如口、鼻、頰或肛門施用。
      18.如權(quán)利要求16中所述的組合物,配制成用于非腸道施用,例如通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑。
      19.一種疫苗組合物,包含如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的蛋白或水果菠蘿蛋白酶作為佐劑。
      全文摘要
      新型蛋白是菠蘿蛋白酶成分,并且是抗癌劑、免疫刺激劑、并具有抗微生物活性。蛋白可以通過(guò)諸如HPLC的方法從菠蘿蛋白酶分離。
      文檔編號(hào)A61P31/04GK1252101SQ9880393
      公開(kāi)日2000年5月3日 申請(qǐng)日期1998年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月25日
      發(fā)明者T·L·邁諾特, C·英格沃達(dá), K·皮克 申請(qǐng)人:科特克斯(英國(guó))有限公司
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