專利名稱：草本提取物的化學(xué)和藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使提取過(guò)程具有可靠重現(xiàn)性的方法。本發(fā)明還涉及一種可再現(xiàn)性地從生物來(lái)源，特別是植物原料中提取化學(xué)組分的藥理活性混合物的方法。此外，本發(fā)明涉及一種從具有高效藥理活性的生物來(lái)源中獲得藥理活性物質(zhì)的混合物的方法。
背景技術(shù)：
除了在烹飪中普遍使用草本之外，草本已在人類開始耕種后不久就被用于草藥治療和草藥劑中。草本還可以作為飼料添加劑應(yīng)用于某些飼養(yǎng)動(dòng)物以促進(jìn)日間活動(dòng)。在上述治療中所采用的草本以及作為飼料添加劑的草本通常以冷浸劑或茶劑方式攝入，或作為泥敷劑外用。在這些應(yīng)用中，所用草本常常是多種化學(xué)化合物的混合物。一般地，適當(dāng)使用被普遍接受的草藥治療不會(huì)在患者中引起有害的副作用。雖然那些已在治療中使用了數(shù)個(gè)世紀(jì)的培養(yǎng)物業(yè)已確立了草藥治療的有效性，但它仍未被西方科學(xué)界的“合法化”。
西藥通常采用單一化合物或較少化合物的混合物單獨(dú)地或更優(yōu)選地與可藥用載體一起給藥。強(qiáng)大的科學(xué)發(fā)明和臨床觀察使對(duì)單一化合物作為藥物的研究和開發(fā)成為主流。不幸的是，這些藥物中的許多具有較短的用藥史，而且多種藥物已經(jīng)顯現(xiàn)出嚴(yán)重的副作用。
盡管是在一定程度上，西藥法被認(rèn)為是治療的科學(xué)，而傳統(tǒng)草本藥物被認(rèn)為是治療的技術(shù)。如今，草本藥物雖然在西方社會(huì)得到一定承認(rèn)，但仍然面臨著一些特殊的挑戰(zhàn)。首先，在偏向于高技術(shù)和科學(xué)的當(dāng)今社會(huì)中，許多高度訓(xùn)練有素的行醫(yī)者持有的觀點(diǎn)是草本藥物缺乏足夠的科學(xué)證明數(shù)據(jù)。其次，他們關(guān)心的是草藥劑中的哪些組分具有藥學(xué)效果。此外，對(duì)草藥劑中藥學(xué)有效組分的濃度或劑量提出質(zhì)疑。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)行醫(yī)者缺乏對(duì)草本藥物的定量和定性標(biāo)準(zhǔn)。缺乏標(biāo)準(zhǔn)化被認(rèn)為是有礙于此類非傳統(tǒng)藥物或草本藥物的處方和劑量調(diào)整。缺乏標(biāo)準(zhǔn)還導(dǎo)致管理機(jī)構(gòu)不愿意進(jìn)一步調(diào)查和接受這些非傳統(tǒng)藥物。
雖然不符合一些西方傳統(tǒng)藥物的標(biāo)準(zhǔn)，但已知草本組合物在多種疾病的治療中相當(dāng)有效且具有很低或沒有副作用。在許多情況中，藥學(xué)活性不但歸因于存在具有特定生物活性的化合物，而且還在于草本混合物所含的兩種或多種化學(xué)化合物的相互組合而具有的協(xié)同作用。
由于被稱作草藥劑和生物強(qiáng)化草本組合物的草藥治療劑衍生自植物，所以草藥治療劑的化學(xué)組合物根據(jù)多種因素而變化，而不單單取決于遺傳組成和植物生長(zhǎng)的生長(zhǎng)條件、收獲條件以及植物活性組分的分離。因此，特定的植物生物變種通常被認(rèn)為能夠使在植物中所發(fā)現(xiàn)的具體化學(xué)組分的數(shù)量產(chǎn)生某些變化。同樣地，甚至就植物的相同生物變種而言，土壤、濕度和其它生長(zhǎng)條件的不同也可以顯著影響植物生產(chǎn)特定化學(xué)組分的數(shù)量。
最后，處理植物的方式也嚴(yán)重影響從植物得到特定化學(xué)組分的相對(duì)比例和總量。所以，收獲、儲(chǔ)存、粒度減小、液體組分的壓榨和提取都會(huì)決定化學(xué)組分的比例和含量，由此影響被分離產(chǎn)物的藥學(xué)活性。
鑒于有許多因素影響草本組合物的組成和藥學(xué)活性，人們期望應(yīng)用能夠使草本組合物在其化學(xué)組成以及化學(xué)混合物的藥學(xué)活性兩方面中都得以標(biāo)準(zhǔn)化的方法。此外，盡管不可能令大規(guī)模種植的植物生長(zhǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)化，但希望能夠使加工條件標(biāo)準(zhǔn)化，以便獲得標(biāo)準(zhǔn)化的草本組合物。而且，應(yīng)能夠精確測(cè)定和比較生物混合物，特別是植物或草本混合物的組成，由此應(yīng)對(duì)加工條件進(jìn)行控制以獲得高效藥理活性。若這樣的方法能被科學(xué)界采用時(shí)，不但醫(yī)師能夠有信心對(duì)草本組合物的具體劑量進(jìn)行處方，而且草本組合物的“制造商”將從混合物獲得更高的藥學(xué)活性、提高質(zhì)量控制并且能夠區(qū)分出不同來(lái)源的草本組合物。發(fā)明公開本發(fā)明提供一種獲得具有高度藥學(xué)活性的標(biāo)準(zhǔn)化生物組合物的方法和一種獲得標(biāo)準(zhǔn)化加工過(guò)程的方法。本發(fā)明還能夠通過(guò)特殊加工(如提取)分離出具有高或最高藥理活性的生物組合物，特別是草本組合物。此處的“生物組合物”是指從生物源得到的組分的混合物。所述生物源是動(dòng)物或植物。預(yù)計(jì)本發(fā)明可最廣泛地應(yīng)用于植物或植物原料。此處的術(shù)語(yǔ)“組合物”是指不同組分的混合物。此處所用的術(shù)語(yǔ)“組分”是指化學(xué)化合物、此類化合物的鹽、復(fù)合物以及自然界中發(fā)現(xiàn)的其它分子或離子。此處所用的術(shù)語(yǔ)“草本”及其變化形式是指可食用植物或植物物質(zhì)或材料。
本發(fā)明的用于標(biāo)準(zhǔn)化得自于生物源(優(yōu)選植物)且具有生物或藥理活性的化學(xué)組分的混合物的方法包括首先，對(duì)許多得自于相同生物源，優(yōu)選植物源的樣本進(jìn)行多種不同的加工，從而得到多種產(chǎn)物。隨后，對(duì)分離的產(chǎn)物進(jìn)行藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)并選出在實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)具有最高藥理學(xué)活性的產(chǎn)物。此后，重復(fù)進(jìn)行用于制備被選產(chǎn)物的特殊加工過(guò)程以制得試驗(yàn)產(chǎn)物。此后，同時(shí)對(duì)被選產(chǎn)物和試驗(yàn)產(chǎn)物進(jìn)行物理和/或化學(xué)試驗(yàn)，以獲得與產(chǎn)物的化學(xué)組分有關(guān)的定性信息，并且在多數(shù)情況下還可以獲得定量信息。開始時(shí)應(yīng)用于多種產(chǎn)物的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)隨后只針對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)物反復(fù)進(jìn)行。比較被選產(chǎn)物和試驗(yàn)產(chǎn)物彼此之間的定性和定量信息(有時(shí)也稱作“化學(xué)指紋圖譜”)以及藥理學(xué)活性。在某些情況中，當(dāng)試驗(yàn)產(chǎn)物中的一種或多種化學(xué)組分的含量與同一化學(xué)組分在被選產(chǎn)物中的含量的差別不超過(guò)約±10％，同時(shí)試驗(yàn)產(chǎn)物的藥理學(xué)活性與被選產(chǎn)物的相應(yīng)藥理學(xué)活性之間的差別不超過(guò)±10％時(shí)，用于制備被選產(chǎn)物的方法則被選擇作為制備藥理活性混合物的標(biāo)準(zhǔn)方法。此外，如果發(fā)現(xiàn)了最高的藥理學(xué)活性，那些經(jīng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)(或“藥理學(xué)指紋圖譜”)測(cè)定具有最高藥理活性且得到物理和/或化學(xué)實(shí)驗(yàn)(或“化學(xué)指紋圖譜”)鑒別的混合物亦可被選擇作為優(yōu)選的藥理活性混合物。
通常所用的加工方法都相似或基本相同。例如，當(dāng)化學(xué)組分的混合物來(lái)源于植物原料時(shí)，例如是草本藥物或組合物中所用的混合物時(shí)，加工方法一般可以包括收獲方法、儲(chǔ)存方法、液體組分的壓榨法以及適合提取化學(xué)組分且首選提取具有藥理學(xué)活性的化學(xué)組分的方法。具體加工時(shí)須對(duì)方法進(jìn)行選擇并且可加以改變，如果可能的話，一次可以獲得多種方法產(chǎn)物。在提取法中，優(yōu)選的被選產(chǎn)物和試驗(yàn)產(chǎn)物分別是被選植物提取物(得自于多種植物提取物)和試驗(yàn)植物提取物。
對(duì)加工產(chǎn)物，特別是植物提取物所進(jìn)行的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)可以是體外和/或體內(nèi)形式的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。在本發(fā)明中，優(yōu)選進(jìn)行至少兩種體外和至少兩種體內(nèi)的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)一般與改變生命體的生物狀態(tài)有關(guān)。所采取的形式既可以是加強(qiáng)機(jī)體體質(zhì)，也可以是有效治療患者臨床狀況。增強(qiáng)體質(zhì)的例子是作為具有加強(qiáng)孱弱體態(tài)、鎮(zhèn)靜作用等的刺激劑。
應(yīng)該選擇那些表現(xiàn)出最佳或最高藥理學(xué)活性的產(chǎn)物，當(dāng)采用草本原料時(shí)，應(yīng)優(yōu)選植物提取物。這對(duì)應(yīng)于最大程度地促進(jìn)生物狀態(tài)的改善或使患者產(chǎn)生最理想的臨床情況。
在獲取試驗(yàn)產(chǎn)物的過(guò)程中，例如在對(duì)提取方法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)獲得的試驗(yàn)提取物，應(yīng)重復(fù)采用與獲取被選產(chǎn)物如被選植物提取物所用的相同的條件。實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明所述的方法在鑒別、改進(jìn)和獲得草本加工技術(shù)(具體地講，是從植物源中獲得藥理學(xué)活性混合物的提取技術(shù))的重現(xiàn)性或標(biāo)準(zhǔn)化以及獲得高藥理學(xué)活性的植物提取物方面具有最廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明的重現(xiàn)性和標(biāo)準(zhǔn)化方法涉及將藥理學(xué)指紋分析法和化學(xué)指紋分析法聯(lián)合應(yīng)用于被分離的產(chǎn)物(一般得自于提取過(guò)程)?；瘜W(xué)指紋圖譜化學(xué)指紋分析法是一種方法，通過(guò)這種方法可以對(duì)單一化合物或化合物的混合物如草藥混合物進(jìn)行試驗(yàn)，從而獲得定性信息，而且在許多情況下也可以獲得定量信息，這些信息是所含化學(xué)化合物的特征。以適當(dāng)和特定含量存在的特征組分具有化學(xué)唯一性，這種唯一性與該組分的藥理學(xué)性質(zhì)有關(guān)。在對(duì)樣本進(jìn)行化學(xué)指紋分析之前或在分析過(guò)程中，在對(duì)得自于植物源的原料進(jìn)行指紋分析時(shí)所述樣本通常是提取物，需對(duì)樣品進(jìn)行分離，分離方法包括層析法或電泳法，之后是分析在分離法中洗脫出的化學(xué)組分。為了獲得被洗脫化學(xué)組分的真實(shí)化學(xué)指紋圖譜，可以采用多種檢測(cè)方法。最適合從草藥組合物中分離出化學(xué)組分的分離方法是高效液體色譜(HPLC)，并且對(duì)被洗脫化合物的特征分析是通過(guò)一系列紫外吸收檢測(cè)法和電噴質(zhì)譜法進(jìn)行的。對(duì)于化學(xué)組分的復(fù)雜混合物，如那些在草藥制劑中發(fā)現(xiàn)的混合物，該分析方法提供了最明確的特征。由指紋分析法獲取的數(shù)據(jù)不但提供了有關(guān)草藥制劑中化學(xué)組分的化學(xué)特征信息，而且提供了與樣品組合物的真實(shí)性、純度和稠度有關(guān)的信息。
對(duì)復(fù)雜化學(xué)混合物(如草藥產(chǎn)物)的化學(xué)指紋分析法包括使化學(xué)混合物的組分溶解，常常包括制備草藥產(chǎn)物的可溶性提取物。隨后，將溶液或提取液進(jìn)行分離加工，由此將混合物分離成多組組分，或更優(yōu)選分離成單一組分。當(dāng)與化學(xué)分析法結(jié)合時(shí)，這種分離方法能夠鑒別且常常是明確鑒別出產(chǎn)物中常見的并且是特征性的重要化學(xué)組分。
所用分離方法優(yōu)選是色譜法，例如高效液體色譜(HPLC)、(凝膠或毛細(xì)管)電泳、薄層層析(TLC)和氣相色譜法(GC)。為了獲得隨后可進(jìn)行藥理學(xué)評(píng)估的樣品，優(yōu)選采用HPLC。在HPLC中，優(yōu)選的檢測(cè)系統(tǒng)包括吸收光譜和熒光光譜、折射率、電化學(xué)分析法、蒸發(fā)光散射法、電噴質(zhì)譜或它們的混合法。在GC中，經(jīng)常采用的是電子俘獲檢測(cè)器、鈉-磷檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器。當(dāng)采用TLC和電泳分離法時(shí)，可以采用不同的量熱和/或質(zhì)譜檢測(cè)法。對(duì)于草藥產(chǎn)物，采用HPLC與紫外吸收度檢測(cè)和電噴質(zhì)譜相結(jié)合的方法可以得到吸收度指紋圖譜，并且可以給許多吸光性組分的分子量賦值。將柱的洗脫曲線、吸收特性和分子量特征加以綜合，可以定性和定量鑒別出草本產(chǎn)物中的各化學(xué)成分。
化學(xué)指紋分析法通常是將HPLC與吸收度和電噴質(zhì)譜檢測(cè)法聯(lián)合應(yīng)用。下面將描述對(duì)CVT-E001的指紋分析。
簡(jiǎn)單而言，用適當(dāng)溶劑提取有關(guān)草本產(chǎn)物，常常選用水、醇、乙腈、乙酸乙酯或這些溶劑的混合液作為溶劑(酊劑常常無(wú)需進(jìn)一步加工即可用于分析)。隨后過(guò)濾提取液以除去所有的顆粒物，干燥除去干擾性溶劑。將提取液冷凍儲(chǔ)存直至用于分析試驗(yàn)。分析時(shí)將提取物溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?。通常采用含?.05％三氟乙酸(TFA)的20％乙腈，但這可以根據(jù)被測(cè)提取物的溶解性而改變。隨后將已知量的提取物進(jìn)樣到HPLC儀中(一般測(cè)定溶于100ml溶劑的等于或小于1mg的提取物)。HPLC儀可以是多種市售型號(hào)中的任意一種，其具有0.01ml-5ml/分鐘或更高的流速，而且盡管可以采用等度洗脫系統(tǒng)，但HPLC儀應(yīng)有能力提供溶劑梯度。通常，利用水、乙腈和TFA的梯度洗脫來(lái)分離出草本產(chǎn)物的化學(xué)成分。溶劑A是由水或含有少量乙腈(2％-5％)的水和0.05％TFA組成。溶劑B由高濃度的乙腈(70％-95％)和0.05％TFA組成。流速一般為1ml/分鐘(也可以采用0.5ml-1.5ml/分鐘或其它流速)。采用從少量溶劑A到大量溶劑B的洗脫梯度。為了分離出被選的化學(xué)組分，可以改變?cè)撎荻?。梯度洗脫可例如溶劑A(5％乙腈，0.05％TFA)，溶劑B(70％乙腈，0.05％TFA)；流速1ml/分鐘；當(dāng)時(shí)間＝0分鐘時(shí)，流動(dòng)相由100％溶劑A組成，當(dāng)時(shí)間＝30分鐘時(shí)，流動(dòng)相由100％溶劑B組成。在0-30分鐘內(nèi)所述梯度呈線性變化。在第30-35分鐘內(nèi)，流動(dòng)相由100％溶劑B組成。在第35-40分鐘內(nèi)，流動(dòng)相溶劑重新恢復(fù)到100％溶劑A，并且在對(duì)下一樣品分析之前使分離體系重新達(dá)到平衡。
雖然HPLC是化學(xué)指紋分析的優(yōu)選試驗(yàn)，但還可以采用TLC、蛋白測(cè)定法、碳水化合物測(cè)定法、有機(jī)提取或其它化學(xué)分析法，這些方法是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
樣品分離是在分析高效液相色譜柱(一般內(nèi)徑為4.6mm，長(zhǎng)度為25cm)上進(jìn)行，但也可以采用其它尺寸的色譜柱(例如1mm×25cm)。色譜柱含有任意一種用于分離化學(xué)品的填料(反相材料、硅膠、親水性相互作用材料等)。通常采用含有C8反相材料的反相色譜柱。
對(duì)化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)包括選用上述適當(dāng)檢測(cè)器。通常將紫外吸收法和電噴質(zhì)譜相結(jié)合。當(dāng)含有有關(guān)化合物的溶劑從HPLC柱中洗脫出來(lái)后，立刻通過(guò)紫外吸收檢測(cè)儀并記錄下吸收度，由此獲得典型的吸收度分布圖(根據(jù)有關(guān)化學(xué)物的吸收特性在多個(gè)波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè))。經(jīng)過(guò)紫外吸收檢測(cè)器后，含有有關(guān)化合物的溶劑立刻連續(xù)進(jìn)入到電噴質(zhì)譜檢測(cè)器中。在分析色譜柱中，一定量的流動(dòng)溶劑被分流，這是因?yàn)殡妵娧b置只能容納小流量的溶劑(至多50-100ml/分鐘)。對(duì)于較小的色譜柱，所有流動(dòng)相可以被允許進(jìn)入到電噴裝置中。在分析色譜柱中，分流過(guò)程通常只使10％或更少的流動(dòng)相進(jìn)入到電噴裝置內(nèi)，而剩余的90％或更多的流動(dòng)相則作為含有特殊化合物的餾分被收集并用于后繼的藥理學(xué)評(píng)估。進(jìn)入電噴質(zhì)譜儀中的化學(xué)物如果獲取一個(gè)質(zhì)子，它們將成為適合于進(jìn)行正電式分析的帶正電離子(例如某些胺、甾類或黃酮)。這些化學(xué)物將能夠提供有關(guān)其精確化學(xué)質(zhì)量的信息，還可以通過(guò)碎裂過(guò)程圖進(jìn)行化學(xué)鑒別。必須以略微不同的方式測(cè)定那些在堿性環(huán)境中不是獲取而是失去質(zhì)子的化學(xué)物(糖、某些酚和羧酸)。對(duì)于沒有獲取電荷的化學(xué)物中，從色譜柱洗脫并通過(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器(例如紫外吸收或折射率檢測(cè)器)之后收集各餾分。此后將各個(gè)餾分干燥并再溶于適當(dāng)?shù)娜軇?例如含有50％乙腈的水溶液與10％氫氧化銨的混合物)中，直接注射到電噴裝置中，該電噴裝置以負(fù)電方式操作。再次獲得有關(guān)精確化學(xué)質(zhì)量的信息，并且碎裂過(guò)程圖提供了進(jìn)一步的化學(xué)鑒別。
綜合分析洗脫圖形、紫外吸收特性、化學(xué)質(zhì)量和碎裂過(guò)程圖，可以獲得草本產(chǎn)物中所發(fā)現(xiàn)的各特征化合物的大量鑒定信息。這些信息告知研究人員樣品的特殊化學(xué)特征是否可信，而且當(dāng)與含有已知量被選化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比時(shí)，可以定量估計(jì)出被選化合物的含量。如果在分析中存在外來(lái)化合物時(shí)，還可以獲得有關(guān)摻雜物的信息。所得信息將提示研究人員所用原料是否含有所需物質(zhì)、其含量是多少(即質(zhì)量控制)以及是否可能存在摻雜物。這將能夠了解購(gòu)買的原材料，并且在生產(chǎn)和向用戶銷售材料時(shí)提供質(zhì)量一致性的證據(jù)?；瘜W(xué)指紋分析對(duì)草本提取物的應(yīng)用例CVT-E001是一種西洋參(花旗參)的特征提取物。已知它富含多種特殊皂甙和脂肪酸。表1列出了西洋參和其它人參品種中多種皂甙的特征。據(jù)說(shuō)CVT-E001具有刺激膽堿攝取和提高動(dòng)物模型學(xué)習(xí)和記憶能力的性質(zhì)。取兩個(gè)批次的CVT-E001進(jìn)行試驗(yàn)且利用連接有紫外吸收檢測(cè)儀和電噴質(zhì)譜儀的高效液體色譜(HPLC)獲得化學(xué)指紋圖譜。
表1.西洋參和其它人參品種的皂甙特征

將各10mg的第3批和第4批CVT-E001產(chǎn)物分別溶解在不同的瓶中，瓶?jī)?nèi)裝有1.0ml的含有5％乙腈和0.05％三氟乙酸(TFA)的水溶液。
將含有1mg原料的100ml上述儲(chǔ)備液分別安放到HPLC儀上。該色譜系統(tǒng)是由裝配有自動(dòng)進(jìn)樣器和紫外吸收檢測(cè)器的Hewlett Packard1050梯度HPLC系統(tǒng)構(gòu)成。色譜柱是Zorbax 300SB-C8反相色譜柱(4.6mm×25cm)。
利用由水、乙腈和TFA組成的梯度洗脫劑實(shí)現(xiàn)分離。流動(dòng)相A是含5％乙腈的水溶液和0.05％TFA作為抗衡離子。流動(dòng)相B是含70％乙腈的水溶液和0.05％三氟乙酸作為抗衡離子。流速為1.0ml/分鐘。當(dāng)時(shí)間＝0分鐘時(shí)，流動(dòng)相由100％溶劑A組成，當(dāng)時(shí)間＝30分鐘時(shí)，流動(dòng)相由100％溶劑B組成。在0-30分鐘內(nèi)洗脫劑梯度呈線性變化。在第30-35分鐘內(nèi)，流動(dòng)相由100％溶劑B組成。在第35-40分鐘內(nèi)流動(dòng)相從100％溶劑B恢復(fù)為100％溶劑A。在下一次注射進(jìn)樣前，最少用100％溶劑A洗脫10分鐘。在203nm檢測(cè)紫外吸收度。
采用Fisons Instruments VG的Quatro儀完成電噴質(zhì)譜。在從紫外吸收檢測(cè)器中洗脫出來(lái)之后，來(lái)自HPLC儀的流體被分流并且有2％(20ml/分鐘)的流量進(jìn)入到電噴裝置內(nèi)。對(duì)從HPLC儀中洗脫出的化學(xué)物以正電性方式對(duì)分子量介于200-1200的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。多種化學(xué)物給出了此產(chǎn)物的質(zhì)譜特征。
圖24和25分別表示第3批和第4批CVT-E001的紫外吸收特征(uv ANOLOG)和總離子數(shù)(TIC)。
兩個(gè)批次幾乎具有相同的紫外吸收色譜圖，其突出特征是在13.7-13.9分鐘之間有一個(gè)特征峰，在17.6-19.4分鐘之間有5個(gè)特征峰，在31.7分鐘時(shí)有一個(gè)特征峰，在33.6分鐘處有一個(gè)特征峰。許多較低的峰也較明顯。7個(gè)最相似的峰被標(biāo)記為1-7。
作為從一個(gè)檢測(cè)儀流至另一檢測(cè)器的流動(dòng)相，在紫外信號(hào)和質(zhì)譜信號(hào)之間存在約1分鐘的延遲。其結(jié)果是，第14.90分鐘時(shí)的總離子計(jì)數(shù)結(jié)果相當(dāng)于第13.71分鐘時(shí)的紫外吸收度。下列圖譜(附圖3-13)表示得自于多個(gè)離子計(jì)數(shù)結(jié)果的質(zhì)譜，它們是在CVT-E001中所發(fā)現(xiàn)的化學(xué)物的特征。各離子活動(dòng)是由光譜左上角的數(shù)字確定。例如，在圖2中，D791 175(14.900)Cm(170∶179)是指色譜展開號(hào)D791，其中該光譜的中心位于第14.90分鐘時(shí)的掃描號(hào)175并且得自170-179的混合掃描。
下面列出了與7個(gè)主峰的各個(gè)峰有關(guān)且可以作為鑒別這些峰的質(zhì)量數(shù)。M+H是指分子量加一個(gè)質(zhì)子。
峰1M+H 801，碎片423、440、587、767。被鑒定為人參皂甙Rg1 MW＝800。同時(shí)存在的是人參皂甙Re M+H948MW＝947。這些化合物共同用色譜分析且得出混合光譜；峰2M+H 1110，碎片767、486、667、947，被鑒定為人參皂甙Rb1MW＝1109；峰3M+H 1180，碎片899、456、637。被鑒定為人參皂甙RcMW＝1079；峰4無(wú)法分辨的質(zhì)量，其信號(hào)被其它組成遮蔽；峰5無(wú)法分辨的質(zhì)量，其信號(hào)被其它組成遮蔽；峰6M+H 1151，碎片767、424、529、323。被鑒定為西洋參皂甙R1。它是在美國(guó)人參中發(fā)現(xiàn)但未在其它西洋參品種中報(bào)導(dǎo)的Rb1的乙酰化形式。其結(jié)構(gòu)如下所示。作為西洋參提取物的特征，西洋參皂甙R1的化學(xué)結(jié)構(gòu)是

峰7M+H 266。未鑒定。
第33.6分鐘處的小峰被鑒定為亞油酸。
為與那些得自于不同CVT-E001樣品的光譜分別比較(圖14和15)，還提供了純的人參皂甙Rb1和Rg1的光譜。
當(dāng)以上述方式分離時(shí)，第3批和第4批的CVT-E001各自產(chǎn)生一個(gè)特征紫外吸收色譜。電噴質(zhì)譜明確鑒定了多種通過(guò)HPLC分離出的化學(xué)物并提供了CVT-E001的特征。從西洋參中得到了兩種樣品并將其進(jìn)行化學(xué)對(duì)比。藥理學(xué)指紋分析法藥理學(xué)指紋分析法包括試驗(yàn)一種或多種化合物的樣品以測(cè)定所用材料是否具有藥理學(xué)活性。樣品的藥理學(xué)性質(zhì)或藥理學(xué)活性取決于所用的具體生物或藥理學(xué)模型。這些模型應(yīng)適合測(cè)試對(duì)個(gè)體生態(tài)的生物學(xué)增強(qiáng)作用或?qū)颊吲R床病癥的有效治療。所述患者適宜是人體，但也可以是另一種動(dòng)物如狗、貓、馬等。所以，上述藥理學(xué)試驗(yàn)或指紋分析法包括體內(nèi)和/或體外生物模型。通常，樣品在試驗(yàn)時(shí)是作為純凈化合物存在于適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)載體和/或溶劑中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品為草本提取物或草本提取物的色譜餾分。
本發(fā)明所用的藥理學(xué)指紋分析法包括，取原始提取物和得自于上述化學(xué)指紋分析法的色譜法且含有有關(guān)被分離化學(xué)物的被選色譜餾分，對(duì)在這些餾分中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化藥理學(xué)評(píng)估。盡管可以進(jìn)行多不同的藥理學(xué)評(píng)估，但所用評(píng)估實(shí)驗(yàn)通常局限在那些能夠說(shuō)明被估測(cè)化學(xué)組分或草本原料預(yù)期作用的提示性方法。在本發(fā)明中，最優(yōu)選用至少兩種體內(nèi)和兩種體外生物模型進(jìn)行評(píng)估以判斷出樣品或提取物的生物活性。還優(yōu)選在各個(gè)體外實(shí)驗(yàn)中包括至少三種劑量的提取物給藥組和一個(gè)溶劑對(duì)照組。還優(yōu)選在至少兩個(gè)模型中，應(yīng)證明樣品溶液或提取液與對(duì)照組相比具有明顯不同的藥理學(xué)作用。
所用的生物學(xué)或藥理學(xué)模型很大程度取決于提取物的組分。例如，可以對(duì)含有低聚糖的人參提取物進(jìn)行是否能夠刺激免疫系統(tǒng)的評(píng)估。兩種體外模型包括小鼠或大鼠脾臟的總淋巴細(xì)胞生產(chǎn)和抗體產(chǎn)生。兩種體內(nèi)模型包括血清總抗體水平和免疫球蛋白G的水平。對(duì)于據(jù)稱具有抗抑郁活性的產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，可以評(píng)估其單胺氧化酶A和B的體外抑制能力以及在接受行為試驗(yàn)(accepted behavioral test)(例如小鼠強(qiáng)制游泳試驗(yàn)和自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn))中的抗抑郁作用。采取測(cè)量大鼠進(jìn)食時(shí)的體內(nèi)血壓或采取靜脈內(nèi)注射有關(guān)提取物并測(cè)量體內(nèi)血管和心臟的收縮力等方法來(lái)評(píng)估抗高血壓模型；對(duì)于神經(jīng)保護(hù)劑，可以利用參與氧化應(yīng)激和神經(jīng)保護(hù)試驗(yàn)的體外或體內(nèi)酶及底物進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于抗抑郁藥，可以通過(guò)其單胺氧化酶抑制程度、對(duì)腦內(nèi)去甲腎上腺素和5-羥色胺水平的提高、對(duì)腦內(nèi)5-羥基吲哚醋酸水平的降低以及在小鼠強(qiáng)制游泳試驗(yàn)和黑白箱試驗(yàn)中的抗抑郁樣和抗焦慮樣作用進(jìn)行評(píng)估。
在一些模型中，將提取物的活性與一種或多種衍生自該提取物的純凈化合物進(jìn)行比較。分析所得的結(jié)果，以便證實(shí)提取物中的混合化合物具有協(xié)同作用。由此在增加功效和降低副作用方面，提供所用提取物好于單一化合物的優(yōu)越性。藥理學(xué)指紋分析法對(duì)草本提取物，CVT-E001的應(yīng)用實(shí)例對(duì)具有上述特征化學(xué)指紋的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化草本提取物CVT-E001是否在提高記憶力方面具有藥理學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。對(duì)生物模型的選擇是基于如下發(fā)現(xiàn)(a)在阿耳茨海默氏病(AD)中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)明顯缺乏膽堿能體系；(b)已有報(bào)導(dǎo)稱，在老化大鼠和癡呆患者等中，單胺氧化酶B(MAO-B)的活性有所增高。在生物模型中進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)并獲取CVT-E001的藥理學(xué)指紋結(jié)果。在各試驗(yàn)中顯示出的陽(yáng)性結(jié)果表明CVT-E001可有效治療認(rèn)知和記憶損傷性病癥如阿耳茨海默氏病。(1)CVT-E001對(duì)大鼠離體腦突觸體中膽堿攝取的作用基本原理已證實(shí)人參皂甙Rb1能夠增加膽堿攝取(Benishin，1992)。神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿生產(chǎn)的降低與記憶喪失和阿耳茨海默氏病有關(guān)。已證明Rb1可以增加神經(jīng)元攝入膽堿并且有可能提高乙酰膽堿的生產(chǎn)，由此減輕記憶損傷。為了確定CVT-E001具有緩減記憶喪失的性能，必須證實(shí)CVT-E001能夠增強(qiáng)神經(jīng)組織標(biāo)本對(duì)膽堿攝取。
在Rb1、CVT-E001和HC3的存在下測(cè)試從全腦和海馬得到的突觸體標(biāo)本的膽堿攝取作用。Rb1是陽(yáng)性對(duì)照物，此前已經(jīng)證實(shí)Rb1能夠增加突觸體攝入膽堿，而HC3是陰性對(duì)照物，已知HC3抑制膽堿攝取。
圖1表示不同劑量的Rb1和HC3對(duì)大鼠腦突觸體膽堿攝取作用的影響。這個(gè)初始實(shí)驗(yàn)表明，我們采用的突觸體標(biāo)本是可行的，因Rb1促進(jìn)膽堿攝取而HC3抑制膽堿攝取。這些作用的大小與以前的研究一致。
對(duì)于采用Rb1和CVT-E001的實(shí)驗(yàn)表明，兩種材料均可以使得自于大鼠海馬的突觸體增加對(duì)膽堿的攝入(表2)。當(dāng)CVT-E001的濃度約為1×10-6M皂苷(分子量為900)時(shí)，其在促進(jìn)膽堿攝取中始終有效。更高的劑量(1×10-5M)并不一定總有效。這種觀察結(jié)果出乎意料，因?yàn)樵S多藥物化合物具有一個(gè)最佳的劑量范圍，且更多或更少的材料將產(chǎn)生較小的生物活性。表2Rb1和CVT-E001對(duì)得自于大鼠海馬的突觸體攝入膽堿的作用

表中數(shù)值是放射性膽堿攝取提高的平均百分比*與對(duì)照組存在顯著性差異，p＜0.05(ANOVA，Student/Newman/Kuels)表3證明了CVT-E001、總?cè)藚⒃磉?TS)和Rb1對(duì)大鼠腦突觸體中膽堿攝取的影響。由于CVT-E001只含有8.1％Rb1、32.4％TS，所以CVT-E001的效價(jià)明顯高于Rb1或TS的。
表3Rb1、100％總?cè)藚⒃磉?皂苷，TS)和CVT-E001對(duì)大鼠腦突觸體中膽堿攝取作用的比較(％對(duì)照)Rb1一種從美國(guó)人參中分離出的人參皂甙。純度＞98％。Rb1-52、Rb1-53和Rb1-54代表了Rb1的3個(gè)批次TS從美國(guó)人參中分離出的總?cè)藚⒃磉暗奶崛∥?，其中含?5％Rb1、19.4％Rc1和21.6％Rg1+ReCVT-E001分離自美國(guó)人參的提取物，含有8.1％Rb1、32.4％總?cè)藚⒃磉?

>表中數(shù)值代表平均值±SE，n＝4，*P＜0.05，**P＜0.01，Student T檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較效能CVT-E001＞TS＞Rb1結(jié)果表明，CVT-E001和Rb1明顯促進(jìn)膽堿攝取。雖然CVT-E001只含有8.1％的Rb1，但它仍然表現(xiàn)出相同于或高于相同重量濃度Rb1所具有的有效作用。這表示CVT-E001中的其它物質(zhì)對(duì)Rb1產(chǎn)生協(xié)同作用。
(2)3批CVT-E001對(duì)鼠腦中MAO-A和MAO-B體外活性的影響表4若干種人參提取物對(duì)單胺氧化酶A(MAO-A)和單胺氧化酶B(MAO-B)體外活性的影響

上述數(shù)值是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，它們基于對(duì)5個(gè)(MAO-A)和4個(gè)(MAO-B)的測(cè)定。在所有情況中測(cè)出顯著的劑量依賴型作用。
GLP＝總精油，是在HPLC-UV吸收光譜中在第24-35分鐘之間的含有CVT-E001的物質(zhì)部分。
(3)CVT-E001在Morris水迷宮試驗(yàn)和東茛菪堿誘發(fā)性記憶缺失模型中對(duì)學(xué)習(xí)能力的影響原理已證實(shí)含有Rb1和Rg1的人參皂甙能夠增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力和記憶力。由于CVT-E001是人參皂甙的混合物，所以其可能具有不同于純?cè)磉暗男再|(zhì)。為了確定CVT-E001是否可以增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力和記憶力，必須證明這種產(chǎn)物能夠?qū)茖W(xué)界接受的學(xué)習(xí)范例中的任務(wù)習(xí)得和/或任務(wù)記憶產(chǎn)生可測(cè)量的增強(qiáng)作用。Morris水迷宮是測(cè)試空間學(xué)習(xí)和記憶的科學(xué)證明方式。在該測(cè)試中大鼠需要學(xué)習(xí)尋找昏暗泳池中隱匿平臺(tái)所在的位置。如果經(jīng)CVT-E001處理大鼠比未經(jīng)CVT-E001處理大鼠能更快地找到隱匿平臺(tái)的位置，那么證明CVT-E001可以增強(qiáng)學(xué)習(xí)力。CVT-E001對(duì)記憶力的作用還可以通過(guò)東茛菪堿誘發(fā)性癡呆(東茛菪堿干擾膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)體系并妨礙學(xué)習(xí)和記憶)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。如果CVT-E001能夠增強(qiáng)學(xué)習(xí)力和/或記憶力，它應(yīng)該能夠使經(jīng)東茛菪堿處理的動(dòng)物提高任務(wù)習(xí)得和/或保護(hù)記憶不受損傷。試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)設(shè)計(jì)為，將CVT-E001作為試驗(yàn)化合物利用Morris水迷宮和東茛菪堿誘發(fā)性癡呆測(cè)定空間學(xué)習(xí)和記憶能力。該試驗(yàn)的具體目標(biāo)是測(cè)試CVT-E001在東茛菪堿誘發(fā)的癡呆條件下是否對(duì)新任務(wù)習(xí)得和/或記憶保留產(chǎn)生影響。試驗(yàn)開始時(shí)將大鼠(S/D系雄性大鼠，體重200-250g，約8周齡)分為兩組并且在試驗(yàn)期間給予水(0.5ml)或CVT-E001(200mg/kg/天的水溶液，管飼法)。當(dāng)開始CVT-E001給藥后8天時(shí)，令大鼠接受學(xué)習(xí)尋找隱匿在陰暗水池中的平臺(tái)位置的任務(wù)。將大鼠每天在水池中放置4次共5天并且記錄下發(fā)現(xiàn)平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間(最長(zhǎng)時(shí)間為5分鐘)。隨著大鼠學(xué)會(huì)了該任務(wù)，所需時(shí)間逐漸變短。在第14天時(shí)，將兩組大鼠進(jìn)一步分為4組。從開始的兩組中各選6只大鼠接受鹽水注射，而各起始組中剩余的6只大鼠接受東茛菪堿(2mg/kg)給藥，之后要求大鼠發(fā)現(xiàn)已移動(dòng)到新位置的平臺(tái)(嘗試3次，在接受鹽水或東茛菪堿注射后的30分鐘內(nèi)最長(zhǎng)所需的時(shí)間為3分鐘)。在第15天時(shí)，重復(fù)進(jìn)行第14天的過(guò)程，但平臺(tái)仍然位于第14天所在的位置。第16天，重復(fù)第14天的過(guò)程，但平臺(tái)被移動(dòng)到水池中的相反位置。在第17天時(shí)重復(fù)第14天的過(guò)程，但平臺(tái)仍然位于第16天所在的位置。在各種情況中記錄下找到平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間。
該試驗(yàn)每次用24只大鼠且重復(fù)2次。綜合兩個(gè)試驗(yàn)中所得的數(shù)據(jù)。一只CVT-E001處理大鼠死于CVT-E001給藥至肺內(nèi)的事故。一只對(duì)照大鼠在學(xué)習(xí)曲線的最后5天無(wú)法發(fā)現(xiàn)平臺(tái)。盡管對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響，但將此數(shù)據(jù)排除在外。一只管飼CVT-E001并注射東茛菪堿的大鼠在最后1天時(shí)無(wú)法發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，也作為異常值被排除。
通過(guò)對(duì)log換算數(shù)據(jù)的方差分析來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)Newman-Keuls試驗(yàn)進(jìn)行顯著性的后驗(yàn)試驗(yàn)。
在不同的天數(shù)內(nèi)獲取各單個(gè)試驗(yàn)和混合材料的數(shù)據(jù)。結(jié)果和討論大鼠很容易習(xí)得平臺(tái)定位的任務(wù)，因找到平臺(tái)所需時(shí)間從首次嘗試的約200秒縮短至第20次嘗試的約8秒(圖15)。當(dāng)所有動(dòng)物在第14次嘗試均已習(xí)得任務(wù)時(shí)，曲線變得平穩(wěn)。在第5、9和13次嘗試(第2、3和4天中的首次嘗試)中出現(xiàn)輕微的反彈效果，這表明經(jīng)夜會(huì)使記憶的信息有所喪失。
當(dāng)大鼠需要在東茛菪堿和CVT-E001存在或不存在的條件下學(xué)習(xí)尋找平臺(tái)的新位置時(shí)(圖16)，所有處理組在開始時(shí)均需花費(fèi)同樣長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)找到平臺(tái)(圖16，開始的2次嘗試)。由于這是新的體驗(yàn)，所以應(yīng)觀察不到差別。在第3次嘗試時(shí)，只有接受CVT-E001和鹽水的動(dòng)物能夠完成習(xí)得，而接受東茛菪堿但無(wú)CVT-E001給藥的動(dòng)物則無(wú)法完成。當(dāng)綜合這天所獲得的數(shù)據(jù)時(shí)，沒有證據(jù)顯示有治療作用(圖17)。這提示了在上述環(huán)境(對(duì)于東茛菪堿誘發(fā)的適度記憶損傷，開始短時(shí)間習(xí)得)下，CVT-E001不對(duì)信息的習(xí)得產(chǎn)生影響。
當(dāng)要求大鼠在以后的每天完成相同任務(wù)(即，測(cè)試動(dòng)物是否記住了頭天所學(xué)的任務(wù))時(shí)，大鼠在全部嘗試中接受東茛菪堿但無(wú)CVT-E001給藥(圖18)。在第2次嘗試時(shí)，所有處理組任務(wù)完成得比接受東茛菪堿而無(wú)CVT-E001給藥組的動(dòng)物完成得要好。當(dāng)將這天的所有嘗試進(jìn)行綜合后(圖19)，接受東茛菪堿但沒接受CVT-E001的動(dòng)物比其它組的動(dòng)物具有明顯長(zhǎng)的潛伏期，這表明東茛菪堿誘發(fā)性記憶缺損被CVT-E001的存在所彌補(bǔ)。由于此試驗(yàn)中出現(xiàn)對(duì)頭天記憶的恢復(fù)情況，由此表明CVT-E001可以防止長(zhǎng)期記憶整合的缺損而不是短期信息的習(xí)得。
當(dāng)大鼠再次被要求學(xué)習(xí)尋找新的平臺(tái)位置時(shí)，處理組之間不存在初始差異(圖20，第1次嘗試)。然而，直至第3次嘗試，經(jīng)東茛菪堿處理動(dòng)物被證實(shí)出現(xiàn)東茛菪堿誘發(fā)性學(xué)習(xí)缺損。當(dāng)綜合由這天開始的每次嘗試所得的數(shù)據(jù)時(shí)，各處理組之間沒有顯著性差異(圖21)，這再次表明CVT-E001和適度東茛菪堿誘發(fā)性癡呆在短時(shí)間內(nèi)作用很小。
隨后，當(dāng)大鼠在試驗(yàn)的最后一天被要求記住平臺(tái)的最終位置時(shí)，東茛菪堿誘發(fā)性缺損立刻變得很明顯(圖22)。在當(dāng)天的首次嘗試中，接受東茛菪堿但無(wú)CVT-E001給藥的動(dòng)物的能力明顯減弱，這表明喪失了長(zhǎng)期記憶。這種癡呆在同時(shí)接受CVT-E001和東茛菪堿給藥的動(dòng)物中則完全沒有出現(xiàn)，并且這些動(dòng)物與未接受東茛菪堿的動(dòng)物一樣能夠完成任務(wù)。當(dāng)綜合從這天開始的每次嘗試所得的數(shù)據(jù)時(shí)(圖23)，證明接受東茛菪堿但未受CVT-E001預(yù)處理的動(dòng)物出現(xiàn)學(xué)習(xí)缺損。接受CVT-E001和東茛菪堿的動(dòng)物與空白對(duì)照沒有差別，這表明CVT-E001徹底消除了東茛菪堿誘發(fā)的學(xué)習(xí)缺損。當(dāng)與未接受東茛菪堿或CVT-E001給藥的動(dòng)物相比時(shí)，接受CVT-001但無(wú)東茛菪堿給藥的動(dòng)物未顯示出有益效果。
CVT-E001是人參皂甙的混合物，當(dāng)它作為食品強(qiáng)化劑提供給大鼠時(shí)，可以預(yù)防東茛菪堿誘發(fā)性記憶缺損。這種作用只有在記憶損傷動(dòng)物中才存在，也就是CVT-E001似乎無(wú)法提高無(wú)記憶缺損動(dòng)物的學(xué)習(xí)力和記憶力。CVT-E001的作用似乎不包括信息習(xí)得和短期記憶，但包括長(zhǎng)期記憶整合，這是因?yàn)橐炎C實(shí)當(dāng)要求動(dòng)物回憶起24小時(shí)前所學(xué)任務(wù)時(shí)，CVT-E001具有最大作用。由于已知東茛菪堿可以損傷膽堿能體系，上述研究表示CVT-E001有益于一些病癥，例如膽堿能體系被損傷且空間記憶力缺失的阿耳茨海默氏病。
(4)CVT-E001(記憶-FX)在人類個(gè)體中的記憶試驗(yàn)方法采用記憶商數(shù)測(cè)定表。共進(jìn)行5項(xiàng)測(cè)試。
A直接記憶在告知24個(gè)單詞后，要求受試者按照類別重復(fù)單詞，例如蔬菜類。
B配對(duì)聯(lián)想記憶在告知受試者12對(duì)單詞后，重復(fù)出每對(duì)的第一個(gè)單詞，受試者被要求說(shuō)出剩下的配對(duì)單詞。一些配對(duì)單詞彼此相關(guān)，例如上-下和太陽(yáng)-月亮。一些配對(duì)單詞完全無(wú)關(guān)，例如馬-燈等等。
C圖畫的自由回憶在展示15張圖畫后，要求受試者回憶其所看過(guò)的圖畫。
D識(shí)別無(wú)意義的圖形首先將20張無(wú)意義的曲線圖形展示給受試者，隨后展示另外的20張且其中半數(shù)是先前展示過(guò)的圖形。隨后要求受試者指出那張是先前曾看過(guò)的圖形。
E回憶肖像的關(guān)系給受試者展示6幅肖像，每幅肖像注有人物的姓氏、職業(yè)和嗜好，例如，姓張，教師，愛好看電視。片刻后，以不同的順序重新展示肖像。要求受試者回憶每幅肖像。
對(duì)各試驗(yàn)評(píng)分并計(jì)算出各受試者的得分之和作為記憶力商數(shù)。每位受試者接受2次測(cè)試，并且分別是在給予“記憶-FX”或空白對(duì)照食物之前和之后進(jìn)行測(cè)試。對(duì)各受試者進(jìn)行體檢，分別在給予“記憶-FX”或空白對(duì)照食物之前和之后各1次。進(jìn)行體檢是為了確?！坝洃?FX”給藥無(wú)副作用。
年輕組10名大學(xué)生，5男5女，20-24歲之間，每天給予兩個(gè)膠囊(200mg/膠囊)的“記憶-FX”共13天。年輕對(duì)照組是由12人組成(9男3女)。老年組，46-64歲，每天給予兩個(gè)膠囊(200mg/膠囊)的“記憶-FX”共14天。老年對(duì)照組是由5人組成(3男2女)，年齡40-65歲。
統(tǒng)計(jì)學(xué)
T-試驗(yàn)組用來(lái)比較對(duì)照組和試驗(yàn)組。
結(jié)果對(duì)各試驗(yàn)評(píng)分且計(jì)算出各受試者得分值之和作為MQ(記憶力商數(shù))。每名受試者接受2次測(cè)試，分別在給予空白對(duì)照食物或“記憶-FX”之前和之后各1次。
表5年輕組和老年組攝取“記憶-FX”前后的MO年輕組 老年組給藥前給藥后給藥前給藥后1113.5 138 91982130 138 105 103.53127 135 97.5 1294124 131 931135118 131.5 96906119 135 951097116 130 107 1158118 133 105 1309106 124 123 13610 114 127 114 109MQ是由評(píng)分值按照一個(gè)公式計(jì)算的且被劃分為7個(gè)級(jí)別。MQ＞130是第1級(jí)—優(yōu)秀以上；129-120是第2級(jí)-優(yōu)秀；119-110，良好 109-90，中等89-80，一般；79-70，不良69-60，低下。
表6年輕人的MQ差別對(duì)照組 記憶-FX給藥組人數(shù) 12 10試驗(yàn)A3.8±3.23.9±3.1試驗(yàn)B1.9±4.74.2±3.8試驗(yàn)C3.2±5.53.8±5.1試驗(yàn)D-3.0±5.6 3.2±3.3**試驗(yàn)E-0.7±4.1 1.7±2.9加和 5.3±11.4 18.8±7.4**MQ 3.7±8.113.7±5.3**平均SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與對(duì)照組相比。試驗(yàn)A-E中的數(shù)值代表攝取“記憶-FX”前后之間的分?jǐn)?shù)差別表7老年組的MQ差異對(duì)照組 記憶-FX給藥組人數(shù) 510試驗(yàn)A2.6±2.4 6.4±5.0試驗(yàn)B-0.3±2.15.2±3.6**試驗(yàn)C2.8±2.4 -1.3±5.0試驗(yàn)D-7.3±4.93.2±3.7**試驗(yàn)E-4.8±6.4-2.2±5.9加和 -6.6±9.712.6±15.3*MQ -5.6±8.410.5±12.8*平均SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與對(duì)照組相比。
試驗(yàn)A-E中的數(shù)值代表攝取“記憶-FX”前后之間的分?jǐn)?shù)差別結(jié)論(1)表5顯示，除了第2人之外，其它9名受試者的MQ均有提高。第5名受試者提高了2個(gè)級(jí)別。在老齡組中，5人(第3、4、7、8和9名)顯示出MQ級(jí)別的提高。其中1人(第8名)提高了2級(jí)。但有1人(第10名)的MQ降了一級(jí)，其它4人(1、2、5和6名)維持原有級(jí)別(雖然有輕微改變)。
(2)表6和表7表明，兩個(gè)試驗(yàn)組的MQ與對(duì)照組相比具有顯著性差異。在年輕組的試驗(yàn)D中存在差異，在老年組的試驗(yàn)B和試驗(yàn)D中存在差異。試驗(yàn)B是一種測(cè)試語(yǔ)言能力的試驗(yàn)，語(yǔ)言能力是受大腦左半球支配。而試驗(yàn)D是繪圖試驗(yàn)，不是描述能力試驗(yàn)，繪圖能力是由大腦的右半球支配。結(jié)果表明，“記憶-FX”能夠主要影響大腦的左半球，但它在老年組中影響整個(gè)大腦。
試驗(yàn)A和B測(cè)試的是大腦的言語(yǔ)(左)半球，但試驗(yàn)D測(cè)試的是非語(yǔ)言的右半球。試驗(yàn)C和E測(cè)試大腦的左、右兩個(gè)半球。


圖15每天(第8-13天)飼喂水(0.5ml)或CVT-E001(200mg/kg，0.5ml溶液)的大鼠的學(xué)習(xí)曲線。在5天內(nèi)大鼠需學(xué)習(xí)確定位于水池中心的隱匿平臺(tái)的位置。大鼠每天進(jìn)行4次嘗試。所得數(shù)值是基于35或36次嘗試時(shí)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。經(jīng)證實(shí)沒有顯著的治療作用。
圖16大鼠學(xué)習(xí)確定第1個(gè)新的隱匿平臺(tái)位置(第14天)的潛伏期。大鼠被分為4組。第1組(C/Scop)只接受水作為食物強(qiáng)化劑并在嘗試前15分鐘時(shí)注射東茛菪堿(2mg/kg)。第2組(HT/Scop)接受CVT-E001(200mg/kg/天)作為食物強(qiáng)化劑并在嘗試前15分鐘時(shí)注射東茛菪堿(2mg/kg)。第3組(C/Sal)只接受水作為食物強(qiáng)化劑并在嘗試前15分鐘時(shí)注射鹽水(0.2ml)。第4組(HT/Sal)只接受CVT-E001作為食物強(qiáng)化劑并在嘗試前15分鐘時(shí)注射鹽水(0.2ml)。*與C/Sop相比存在顯著性差異，p＜0.05。
圖17三次嘗試中的大鼠學(xué)習(xí)確定隱匿平臺(tái)第1個(gè)新位置的潛伏期(第14天)的綜合數(shù)據(jù)。處理過(guò)程與圖16的相同。所得數(shù)值是基于33或36次嘗試時(shí)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。經(jīng)證實(shí)沒有顯著的治療作用。
圖18大鼠記憶隱匿平臺(tái)第1個(gè)新位置的潛伏期(第1 5天)。處理過(guò)程與圖16的相同。所得數(shù)值是基于11或12次嘗試時(shí)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*與C/Sop相比存在顯著性差異p＜0.05。**與C/Sop相比存在顯著性差異p＜0.01。
圖19三次嘗試中的大鼠記憶隱匿平臺(tái)第1個(gè)新位置的潛伏期(第15天)的綜合數(shù)據(jù)。處理過(guò)程與圖16的相同。所得數(shù)值是基于33或36次嘗試時(shí)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*與C/Sop相比存在顯著性差異p＜0.05。**與C/Sop相比存在顯著性差異p＜0.01。***存在顯著性差異，與C/Sop相比p＜0.05并且與HT/Scop相比p＜0.05。
圖20大鼠學(xué)習(xí)尋找隱匿平臺(tái)第2個(gè)新位置的潛伏期(第16天)。處理過(guò)程與圖16的相同。所得數(shù)值是基于11或12次嘗試時(shí)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*存在顯著性差異，與C/Sop和HT/Scop相比p＜0.05。
圖21三次嘗試中的大鼠學(xué)習(xí)尋找隱匿平臺(tái)第2個(gè)新位置的潛伏期(第16天)的綜合數(shù)據(jù)。處理過(guò)程與圖16的相同。所得數(shù)值是基于33或36次嘗試時(shí)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。經(jīng)證實(shí)無(wú)顯著性差異。
圖22大鼠記憶隱匿平臺(tái)第2個(gè)新位置的潛伏期(第17天)。處理過(guò)程與圖16的相同。所得數(shù)值是基于11或12次嘗試時(shí)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*與C/Sop相比存在顯著性差異p＜0.05。
圖23三次嘗試中的大鼠記憶隱匿平臺(tái)第2個(gè)新位置的潛伏期(第17天)的綜合數(shù)據(jù)。處理過(guò)程與圖16的相同。所得數(shù)值是基于33或36次嘗試時(shí)的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*與C/Sop相比存在顯著性差異p＜0.01。
HT-1001對(duì)體外PC12培養(yǎng)物和成神經(jīng)細(xì)胞瘤N1E-115細(xì)胞系中的軸突突起(Neurite outgrowth)的刺激作用。介紹我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了HT-1001的新作用機(jī)理，該機(jī)理是HT-1001刺激PC12(嗜鉻細(xì)胞瘤)細(xì)胞系中的軸突突起。結(jié)果表明，HT-1001不但起緩解綜合征的作用，而且還起改變神經(jīng)變性疾病的進(jìn)程的作用。HT-1001的有益(預(yù)防/治療)作用適用于退化性疾病如老年性癡呆、帕金森氏病、多發(fā)性梗塞癡呆等。
有報(bào)導(dǎo)稱人參皂甙對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有多種作用。其中包括CNS興奮或抑制作用、抗驚厥活性、抗精神病作用、鎮(zhèn)痛作用、抗疲勞和抗緊張作用以及改善多種記憶功能的性能(Takagi K.等人，《日本藥理學(xué)雜志》(Japan.J.Pharmacol.)，22339(1972)；Satio H.andNabata H.，《日本藥理學(xué)雜志》，22245(1972)；Saita H.等人，《日本藥理學(xué)雜志》，2343(1973)；Takagi等人，《日本藥理學(xué)雜志》，2441(1974)；Saito等人；《日本藥理學(xué)雜志》，24119(1974)；Saito H.等人；《日本藥理學(xué)雜志》，27509(1977)；Hong S.A.，《韓國(guó)藥理學(xué)雜志》101(1974))。已知純?nèi)藚⒃磉癛b1和Rg1可以提高試驗(yàn)動(dòng)物的記憶力(Saito H.，“中草藥原料研究的進(jìn)展”，Chang H.M.等人編輯，World Sci.Publ.新加坡，1985，P509；Saito H.，“人參研究的最新進(jìn)展”，Shibata S.編輯，HirokawaPubl.Col，東京，1990，P99；Benishin C.G.等人，《藥理學(xué)》(Pharmacology)42223(1991))并且其作用機(jī)理被確定是作用于腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)。除公開了Rb/Rg1的行為作用之外，還發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rb1和Rd(另一種人參皂甙)通過(guò)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)增強(qiáng)背側(cè)和交感神經(jīng)節(jié)的軸突突起(Saito H.，“中草藥原料研究的進(jìn)展”，Chang H.M.等人編輯，World Sci.Publ.新加坡，1985，P509)，但對(duì)生長(zhǎng)因子本身沒有影響。迄今為止，很少有關(guān)于這種增強(qiáng)作用的細(xì)胞機(jī)理的信息。至今，仍然沒有公開過(guò)Rb1或其它任何皂甙對(duì)軸突突起作用的研究。最新報(bào)導(dǎo)已證實(shí)人參的“親脂性”提取物還具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用(Mohri T.等人《植物醫(yī)學(xué)》(Planta Med.)58321(1992))，但是，該提取物的活性成分仍有待闡明。
NGF是在二十世紀(jì)五十年代被首次發(fā)現(xiàn)的，它是一種原型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白。NGF具有許多與神經(jīng)通路的發(fā)育和維持有關(guān)的作用。而且，業(yè)已有人對(duì)上述生物作用作了回顧(Levi-Montalcini R.《科學(xué)》(Science)，2371154(1987)，Levi A.and Alema S.《藥理學(xué)、毒理學(xué)研究紀(jì)事》(Ann.Re.Pharmacol.Toxicol.)31205(1991))。外周NGF是腎上腺素能交感神經(jīng)元和初級(jí)感覺神經(jīng)元在發(fā)育過(guò)程中存活所必需的。它影響著體感纖維在發(fā)育期間(Hefti F.等人，《神經(jīng)生物學(xué)和老化》(Neurobiol.Aging)1075(1989))和成年受到損傷后(Raivich G andKreutzberg G.W.，《國(guó)際神經(jīng)科學(xué)進(jìn)展雜志》(Int.J.Devel.Neurosci.)11311，1993)的生長(zhǎng)和神經(jīng)元回路。在腦中，NGF促進(jìn)顱底前腦膽堿能神經(jīng)元的存活(Martin等人，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》(J.CellBiol.)106829(1988)；Mobley W.C.等人，Mol.Brain.Res.153(1986))，并且防止在后繼損傷中失去此類神經(jīng)元(Hagg.T等人，《腦研究》(BrainRes.)50529(1989)；Tuszynski M.H.等人，《神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事》(Ann Neurol.)30625(1991))。也有報(bào)導(dǎo)稱NGF可以促進(jìn)神經(jīng)元前體細(xì)胞的分化(Hartikka J.and Hefti F.J.，《神經(jīng)學(xué)研究》(Neurosci.Res.)21352(1988))。PC12細(xì)胞通過(guò)軸突突起和電興奮性(Green L.A.等人，《細(xì)胞學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)進(jìn)展》(Adv.Cell.Neurobiol.)3373(1982))以及其它性質(zhì)對(duì)NGF的處理產(chǎn)生反應(yīng)。現(xiàn)在，對(duì)用于治療多種退化性疾病的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的設(shè)計(jì)和開發(fā)正在活躍地進(jìn)行著(Hefti F.J.，《神經(jīng)生物學(xué)》(Neurobiol.)251418(1994)；Tonnaer JADM and Dekker AJAM，發(fā)表在《抗癡呆藥物學(xué)會(huì)》上(1994)，第139頁(yè))。
阿耳茨海默氏病(AD)與膽堿能神經(jīng)束的退化有關(guān)，其中包括從顱底前腦突起到皮層和海馬的神經(jīng)束。PC12細(xì)胞系(Greene L.A.andTischlerA.S.，《細(xì)胞學(xué)和神經(jīng)病學(xué)進(jìn)展》(Ad.CellNeurol.)3373(1982))是一種研究上述神經(jīng)束機(jī)能的模型。該細(xì)胞系是原型嗜鉻細(xì)胞系，但可以被誘發(fā)來(lái)表達(dá)腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)(Greene L.A.and Tischler A.S.《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA)732424(1976)；Aloe L and Levi-Montalicini R.，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》761246(1979))，和膽堿能標(biāo)識(shí)物(Greene L.A.and Relin G.，《腦研究》(Brain Res.)138521(1977)；Ritchie A.K.，《生理學(xué)雜志》(J.Physiol)(倫敦)286541(1979)；Schubert D.等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA)742579(1977)；Jumblatt J.E.and Tischler A.S.，《自然》(Nature)297152(1982))。該模型的優(yōu)點(diǎn)在于(Shibata S.等人，《經(jīng)濟(jì)型和治療性植物的研究》(Economic and Medicinal Plant Res.)1；217(1985))它是不滅化細(xì)胞系(Saito H.《中草藥原料研究的進(jìn)展》ChangH.M.等人編輯，World Sci.Publ.新加坡，1985，509頁(yè))，該細(xì)胞系的存活對(duì)于NGF敏感但不依賴于NGF(Saito H.，公開在《人參研究的最新進(jìn)展》，Shibata S.編輯，Hirokawa Publ.Co.Tokyo 1990，P99)，這種細(xì)胞系有許多與顱底前腦的中樞膽堿能神經(jīng)元相同的性質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞并不對(duì)所有中樞膽堿能神經(jīng)元反應(yīng)性營(yíng)養(yǎng)因子敏感，但中樞膽堿能神經(jīng)元卻對(duì)所有PC12細(xì)胞反應(yīng)性營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)生反應(yīng)。因此，PC12細(xì)胞系可以被認(rèn)為是理想的模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)似乎不會(huì)產(chǎn)生假的陽(yáng)性結(jié)果，但可能會(huì)出現(xiàn)假的陰性結(jié)果，即，它可能會(huì)遺漏對(duì)中樞膽堿能神經(jīng)元起作用的營(yíng)養(yǎng)因子。
已報(bào)導(dǎo)PC12細(xì)胞通過(guò)多種途徑對(duì)NGF產(chǎn)生應(yīng)答，其中包括但不限于以下途徑膜興奮性的發(fā)展，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的合成、裝配和穩(wěn)定化，提高細(xì)胞粘著性，過(guò)度生長(zhǎng)和提高合成作用；減少DNA合成和細(xì)胞增殖(Werrback-Perez K.等人，《腦研究進(jìn)展》(Prog.Brain Res.)86183(1990))；選擇性誘導(dǎo)的抗氧劑(例如過(guò)氧化氫酶)和能量代謝酶(Perez-Polo J.R.and Werback-Perez K.，《修復(fù)神經(jīng)病學(xué)的最新成果》(Recent Achievements in Restorative Neurology)30321(1985)；Perez-Polo J.R.and Werback-Perez K.《神經(jīng)的發(fā)育和再生》(NeuralDevelopment and Regeneration)；Sringer-Verlag，Heidelberg，339(1987)；Perez-Polo J.R.and Werback-Perez K.《神經(jīng)系統(tǒng)的再生》(Nervous System regeneration)，Alan Liss，New York，201(1988))；刺激膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的代謝(例如CHAT活性)(Greene L.A.and Rein G.，《腦研究》(Brain Res.)138521(1977)；Ritchie A.K.《生理學(xué)雜志》(倫敦)286541(1979)；Schubert D.等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》742579(1977)；Jumblatt J.E.and Tischier A.S.，《自然》(Nature)297152(1982))；改變基因表達(dá)(Szebereni J.and Erhardt P.，《生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》(Biochim.Biophys.Acta)1222187(1994)；增加軸突突起(Greene L.A.and Tischler A.S.《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》732424(1976)；提高表面膜受體的表達(dá)(Greene LA and Tischler AS，《細(xì)胞神經(jīng)病學(xué)進(jìn)展》(Adv.Cell Neurol.)3；373(1982)；提高APP-695的表達(dá)(這對(duì)阿耳茨海默氏病的病因很重要)(Schubert D.等人，《神經(jīng)元》(Neuron)3689(1989))；提高ω-CgTx敏感Ca2+通道的表達(dá)(UsowiczM.M.等人，《生理學(xué)雜志》(倫敦)42695(1990))；提高ζ-PKC的表達(dá)并且向下調(diào)節(jié)其它同種型PKC以增強(qiáng)軸突突起(Coleman E.S.andWooten M.W.，《分子神經(jīng)學(xué)雜志》(J.Mol.Neurosci.)539(1994))。由于PC12細(xì)胞對(duì)NGF產(chǎn)生不同的反應(yīng)，它們是研究其它物質(zhì)的NGF樣性質(zhì)的適當(dāng)候選物。它支持了認(rèn)為這些細(xì)胞是顱底前腦中樞膽堿能神經(jīng)元的良好模型的看法。
成神經(jīng)細(xì)胞瘤N1E-115是未分化的鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤，它可用于研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。材料和方法將PC12細(xì)胞接種并保存于100cm2組織培養(yǎng)皿內(nèi)的37℃RRMI1640中，其中，水中含有1％抗生素、10％熱滅活馬血清和5％胎牛血清并被95％空氣和5％ CO2飽和。N1E-115細(xì)胞被保存在含有90％ DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，Gibco，Grand Island，NYUSA)和10％FBS和抗生素PNS(青霉素、新霉素、鏈霉素)的燒瓶中。將培養(yǎng)平板保存在溫控(37℃)加濕氣氛(由95％空氣和5％CO2組成)下。為了試驗(yàn)，用Pasteur移液管通過(guò)有力吸入細(xì)胞使其機(jī)械性移位并置于35mm的以膠原涂敷的組織培養(yǎng)皿中，皿內(nèi)含有共2.0ml完全培養(yǎng)基，密度為1×104細(xì)胞/ml。每周更換3次培養(yǎng)基。
通過(guò)對(duì)含有的PC12細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而測(cè)定出對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和樣品的細(xì)胞反應(yīng)。在處理后的第7天和第14天時(shí)拍攝細(xì)胞照片。在顯影和印刷之前在某個(gè)培養(yǎng)皿中選擇兩個(gè)區(qū)域。
對(duì)細(xì)胞和軸突的評(píng)分如下將呈環(huán)狀或球形且無(wú)軸突突起的細(xì)胞評(píng)為0分(S0)；將變長(zhǎng)或具有短軸突突起的細(xì)胞評(píng)為S1；將胞體上具有兩個(gè)以上的小軸突的細(xì)胞被評(píng)為S2；將具有一個(gè)或兩個(gè)軸突且軸突的長(zhǎng)度至少是胞體直徑的兩倍的細(xì)胞被評(píng)為S3；將具有兩個(gè)以上的長(zhǎng)軸突的細(xì)胞被評(píng)為S4；軸突指數(shù)計(jì)算如下軸突指數(shù)(In)＝總軸突評(píng)分(∑S)/總細(xì)胞數(shù)∑N)∑S＝S1*N+S2*N+S3*N+S4*N N是各細(xì)胞域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。
試驗(yàn)結(jié)果1.NGF在處理7天后以劑量依賴方式增加PC12中的軸突突起(圖26)。
2.HT-1001在處理7天后以劑量依賴方式增加PC12中的軸突突起(圖27)。
3.HT-1001在處理7天后以劑量依賴方式增加N1E-115中的軸突突起(圖28)。圖29和圖30分別是對(duì)照細(xì)胞和經(jīng)處理細(xì)胞的原始照片。在對(duì)照組中觀察到?jīng)]有或很小的軸突突起，但在經(jīng)處理細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)明顯的軸突突起。結(jié)論HT-1001在刺激PC12和N1E-115細(xì)胞系的軸突突起中誘發(fā)NGF樣作用。這可能歸因于其在治療和預(yù)防神經(jīng)變性疾病中的有益作用。
權(quán)利要求
1.一種獲得作為從植物中提取化學(xué)組分的藥理活性混合物的標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程的可再現(xiàn)提取過(guò)程的方法，該方法包括(a)以多種不同的提取方法從植物中提取出多種化學(xué)組分的藥理學(xué)活性混合物，得到多種提取物；(b)對(duì)各個(gè)提取物進(jìn)行至少兩種體外的和至少兩種體內(nèi)的藥理學(xué)試驗(yàn)，從而獲得步驟(a)所得各提取物的藥理學(xué)活性的生物指紋圖譜，其中已知各試驗(yàn)與有效治療患者臨床病癥有關(guān)；(c)從上述多種提取物中選擇出在步驟(b)中顯示出最佳藥理學(xué)活性的提取物；(d)至少重復(fù)一次用于制備步驟(c)的被選提取物的提取過(guò)程，以制得至少一種試驗(yàn)提取物；(e)(1)通過(guò)辨別各提取物中的藥理活性混合物中的化學(xué)組分的特征和相對(duì)含量，獲得被選提取物和上述至少一種試驗(yàn)提取物的化學(xué)指紋圖譜；和(2)對(duì)上述至少一種試驗(yàn)提取物重復(fù)所述的步驟(b)；和(f)比較被選提取物和上述至少一種試驗(yàn)提取物的化學(xué)指紋圖譜和生物指紋圖譜，其中當(dāng)上述至少一種試驗(yàn)提取物中的化學(xué)組分的含量比被選提取物中的相同化學(xué)組分的含量至多多或少10％時(shí)，和當(dāng)上述至少一種試驗(yàn)提取物的各藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果比被選提取物的相應(yīng)藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果至多高或低10％時(shí)，選擇用于制備被選提取物的提取過(guò)程作為由植物中制備化學(xué)組分的藥理活性混合物的標(biāo)準(zhǔn)化方法。
2.一種從衍生自植物源的化學(xué)組分的藥理學(xué)活性混合物獲得可再現(xiàn)的和高度的藥理學(xué)活性的方法，該方法包括(a)對(duì)來(lái)自相同植物源的多個(gè)樣品實(shí)施多種不同的提取過(guò)程以制得多種植物提取物；(b)對(duì)各植物提取物進(jìn)行至少一個(gè)與改變生命體的生物狀態(tài)有關(guān)的藥理學(xué)試驗(yàn)；(c)選擇出在步驟(b)中顯示出最高藥理學(xué)活性的植物提取物；(d)重復(fù)進(jìn)行用于制備步驟(c)的被選提取物的提取過(guò)程以制得試驗(yàn)提取物；(e)獲得被選提取物和試驗(yàn)提取物的化學(xué)指紋圖譜，所述化學(xué)指紋圖譜至少提供了有關(guān)被選提取物和試驗(yàn)提取物中的化學(xué)組分的定性信息；(f)對(duì)試驗(yàn)提取物重復(fù)步驟(b)的試驗(yàn)；和(g)比較被選提取物和試驗(yàn)提取物的化學(xué)指紋圖譜和藥理學(xué)活性，這樣當(dāng)試驗(yàn)提取物中的一種或多種化學(xué)組分以一定量存在且該量與被選提取物的相應(yīng)藥理學(xué)試驗(yàn)活性的差別不超過(guò)約±10％時(shí)，那么用于制備被選提取物的提取過(guò)程被選擇作為由植物源中制備化學(xué)組分的藥理活性混合物的標(biāo)準(zhǔn)化提取方法。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述至少一種藥理學(xué)試驗(yàn)是至少一種體外和體內(nèi)的藥理學(xué)試驗(yàn)。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述至少一種藥理學(xué)試驗(yàn)是至少兩種體外和至少兩種體內(nèi)藥理學(xué)試驗(yàn)。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述改變生命體的生物狀態(tài)是有效治療患者的臨床病癥。
6.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述至少提供定性信息包括提供定性和定量信息。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述患者是人。
8.一種獲得化學(xué)組分的藥理學(xué)活性混合物的方法，所述混合物具有衍生自植物源的高再現(xiàn)藥理學(xué)活性，該方法包括(a)對(duì)得自相同植物源的多個(gè)樣品進(jìn)行多種不同的提取過(guò)程以制得多種植物提取物；(b)對(duì)各植物提取物進(jìn)行至少兩種體外和至少兩種體內(nèi)的藥理學(xué)試驗(yàn)，已知所述藥理學(xué)試驗(yàn)與有效治療患者臨床病癥有關(guān)；(c)選擇出在步驟(b)中顯示出最高藥理學(xué)活性的植物提取物；(d)重復(fù)進(jìn)行用于制備步驟(c)的被選提取物所采用的提取過(guò)程，從而制得試驗(yàn)提取物；(e)獲得被選提取物和試驗(yàn)提取物的化學(xué)指紋圖譜，這些化學(xué)圖譜提供有關(guān)于被選提取物和試驗(yàn)提取物中化學(xué)組分的定性和定量信息中的至少一種；(f)對(duì)試驗(yàn)提取物重復(fù)步驟(b)的試驗(yàn)；和(g)比較被選提取物和試驗(yàn)提取物的化學(xué)指紋圖譜和生物學(xué)活性，這樣當(dāng)試驗(yàn)提取物中的一種或多種化學(xué)組分以一定量存在且該量與被選提取物的相應(yīng)藥理學(xué)活性的差別不超過(guò)約±10％時(shí)，那么用于制備被選提取物的提取過(guò)程被選擇作為制備具有高再現(xiàn)藥理學(xué)活性的化學(xué)組分的藥理活性混合物的標(biāo)準(zhǔn)化提取方法。
9.一種衍生自植物源的化學(xué)組分的藥理學(xué)活性混合物，該混合物具有可再現(xiàn)的和高度的藥理學(xué)活性，該混合物由包括下列步驟的方法制備得到(a)對(duì)得自相同植物源的多個(gè)樣品進(jìn)行多種不同的提取過(guò)程以制得多種植物提取物；(b)對(duì)各植物提取物進(jìn)行至少一種已知與改變生命體的生物狀態(tài)有關(guān)的藥理學(xué)試驗(yàn)；(c)選擇出在步驟(b)中顯示出最高藥理學(xué)活性的植物提取物；(d)重復(fù)進(jìn)行用于制備步驟(c)的被選提取物所采用的提取過(guò)程，從而制得試驗(yàn)提取物；(e)獲得被選提取物和試驗(yàn)提取物的化學(xué)指紋圖譜，這些化學(xué)指紋圖譜至少提供了有關(guān)被選提取物和試驗(yàn)提取物中化學(xué)組分的定性信息；(f)對(duì)試驗(yàn)提取物重復(fù)步驟(b)的試驗(yàn)；和(g)比較被選提取物和試驗(yàn)提取物的化學(xué)指紋圖譜和藥理學(xué)活性，這樣當(dāng)試驗(yàn)提取物中的一種或多種化學(xué)組分以一定量存在且該量與被選提取物的相應(yīng)藥理學(xué)試驗(yàn)活性的差別不超過(guò)約±10％時(shí)，那么用于制備被選提取物的提取過(guò)程被選擇作為從植物源制備化學(xué)組分的藥理活性混合物的標(biāo)準(zhǔn)化提取方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種確保草本提取物的化學(xué)和藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化的方法。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1268027SQ98808588
公開日2000年9月27日 申請(qǐng)日期1998年8月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月28日
發(fā)明者彼得·K·T·龐, 杰奎琳·J·單, 卡姆·W·丘 申請(qǐng)人:Cv技術(shù)公司