專利名稱：靶細(xì)胞的定向細(xì)胞溶解、引起細(xì)胞溶解的試劑和組合物以及可用于制備這些試劑的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由有功能的超級(jí)抗原活化的T細(xì)胞所引起的靶細(xì)胞失活/細(xì)胞溶解。細(xì)胞溶解可用于治療和體外分析。定義超級(jí)抗原根據(jù)最先的定義(大約1988-1993年)，超級(jí)抗原是事先未經(jīng)細(xì)胞內(nèi)加工而能夠與MHC II類抗原結(jié)合并且通過與T細(xì)胞受體(TCR)的Vβ鏈可變區(qū)(Vβ)結(jié)合活化T細(xì)胞的細(xì)菌或病毒蛋白。此結(jié)合導(dǎo)致T細(xì)胞的相對(duì)大部分/亞群的Vβ家族限定的活化和表達(dá)MHC II類的細(xì)胞的溶解(超級(jí)抗原依賴型的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解＝SDCC)。一般超級(jí)抗原活化的T細(xì)胞亞群構(gòu)成個(gè)體T細(xì)胞總數(shù)的約1-30％。
符合上述定義的眾所周知的野生型超級(jí)抗原有葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEE和SEH)。進(jìn)一步的實(shí)例有毒性休克綜合癥毒素1(TSST-1，也是葡萄球菌來源)、剝脫性毒素(ExfoliatingToxin)(Exft)、葡萄球菌致熱性外毒素A、B和C(SPE A、B和C)、小鼠乳房腫瘤病毒蛋白(MMTV)、葡萄球菌M蛋白、產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridialperfringens)外毒素(CPET)、支原體關(guān)節(jié)炎超級(jí)抗原等。對(duì)于超級(jí)抗原及其特性的綜述，參見Kotzin等1993。
也已將野生型和嵌合超級(jí)抗原突變成具有降低的或無MHC II類結(jié)合和/或TCRVβ結(jié)合(Kappler等WO9314264；Kappler等1993；Blanco等；Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932；Antonsson等1997)。此類超級(jí)抗原毒性變得更小。在它們完全缺乏與MHC II類或TCRVβ結(jié)合的能力時(shí)，它們不再是有功能的超級(jí)抗原，因?yàn)樗鼈冸S后喪失了其活化T細(xì)胞的能力。
通過突變結(jié)構(gòu)上類似的野生型超級(jí)抗原構(gòu)建嵌合的有功能活性的超級(jí)抗原(雜合超級(jí)抗原)已是可能的(Lamphaer等，1996和Antonsson等WO9736932)。
已發(fā)現(xiàn)在野生型超級(jí)抗原與能結(jié)合細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的尋靶部分連接的情況下，活化和隨后的細(xì)胞溶解可以MHC II類非依賴型方式發(fā)生(Dohlsten等WO9201470)。這種新的作用機(jī)理已稱為超級(jí)抗原抗體依賴型的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(＝SADCC)。它包括針對(duì)靶向部分而不是抗體的類似機(jī)理(Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932)。
因此，當(dāng)今的超級(jí)抗原概念包括任何未經(jīng)細(xì)胞內(nèi)加工而能夠與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)(靶結(jié)構(gòu))和一種或多種多態(tài)性TCR鏈、特別是Vβ鏈結(jié)合，由此活化表達(dá)參與結(jié)合的特異性TCR鏈的T細(xì)胞亞群的化合物(優(yōu)選地多肽結(jié)構(gòu))。然后這些T細(xì)胞變成細(xì)胞毒性的T細(xì)胞并且介導(dǎo)它們針對(duì)帶有表面結(jié)構(gòu)的細(xì)胞(靶結(jié)構(gòu)，靶細(xì)胞)的細(xì)胞毒性。如果沒有另外說明，本發(fā)明上下文中使用的超級(jí)抗原(SAG)定義將包括靶向部分與游離超級(jí)抗原之間的綴合物，如上面對(duì)于SADCC所述的。
對(duì)于涉及到的術(shù)語超級(jí)抗原，如果沒有另外說明，僅指有功能的超級(jí)抗原。
游離超級(jí)抗原(Sag)是未與靶向部分或免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合的野生型、可能經(jīng)突變或其它修飾的超級(jí)抗原。游離超級(jí)抗原的MHC II類結(jié)合能力是固有的靶向特性。因?yàn)橛坞x超級(jí)抗原缺乏結(jié)合的靶向部分，所以它們將僅產(chǎn)生SDCC。
綴合超級(jí)抗原是游離超級(jí)抗原與靶向部分或免疫調(diào)節(jié)劑之間的綴合物。綴合超級(jí)抗原產(chǎn)生SDCC和SADCC中的任意一個(gè)或二者。
免疫調(diào)節(jié)劑(IM)是能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的化合物。在本發(fā)明上下文中，單獨(dú)對(duì)待超級(jí)抗原，并且當(dāng)使用免疫調(diào)節(jié)劑時(shí)不包括超級(jí)抗原在內(nèi)。免疫調(diào)節(jié)劑經(jīng)常例如對(duì)于對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞受體有固有的靶向能力。除非另有說明，否則免疫調(diào)節(jié)劑是非結(jié)合的形式。
靶向部分(T)是能與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和/或組織結(jié)構(gòu)結(jié)合的部分。
綴合物是由彼此共價(jià)連接的兩個(gè)或多個(gè)部分Sag、IM、T等組成。
活性成分的可溶形式是指溶于來自身體的液體如血清和血漿中的形式。背景領(lǐng)域-超級(jí)抗原的治療用途已經(jīng)提出非綴合的野生型和突變的超級(jí)抗原用于治療，其治療效應(yīng)可能通過免疫系統(tǒng)在與待治療疾病有關(guān)的表達(dá)II類的細(xì)胞局部活化或作為系統(tǒng)性活化來實(shí)現(xiàn)(Kalland等WO9104053；Terman等WO9110680和WO9324136；Antonsson等WO9736932和Newell等1991)。由于野生型超級(jí)抗原的極大毒性，此方法對(duì)于癌癥治療來說應(yīng)該僅適用于所有癌癥中很少的一部分。
也提出使用與尋靶部分結(jié)合的超級(jí)抗原(Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932和Ochi等1993)，所有這三篇公開文獻(xiàn)引用作為參考)。
在關(guān)于通過IL-2在體內(nèi)防止超級(jí)抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性的下調(diào)的研究方面，已推測(cè)同時(shí)施用IL-2與非綴合的野生型超級(jí)抗原和與抗體結(jié)合的野生型超級(jí)抗原應(yīng)該是有利的(Belfrage論文1996年8月/9月；Belfrage等1994；Belfrage等1995；Belfrage等1997a；Belfrage等1997b(野生型超級(jí)抗原))。
也已證明細(xì)胞膜錨定的CD80在無MHC II類抗原存在的情況下在T細(xì)胞的超級(jí)抗原活化中有作用(Lando等1993和1996)。
Lando等1996中的圖4顯示了分析只與抗體結(jié)合的超級(jí)抗原或與IL-2聯(lián)合誘導(dǎo)靜止人T細(xì)胞增殖的能力的實(shí)驗(yàn)。在此4天實(shí)驗(yàn)中，將結(jié)合的超級(jí)抗原呈遞到親本CHO細(xì)胞和經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)II類或C215或II類加C215的CHO細(xì)胞上。IL-2的影響不明顯。
Kapper等(WO9314634)提出經(jīng)突變喪失其Vβ或MHC II類結(jié)合能力的非綴合的野生型SEB(在疫苗中并且作為中和超級(jí)抗原的毒性效應(yīng)的試劑)。Abrahmsen等(WO9601650)提出用具有修飾的、優(yōu)選地降低的與II類抗原結(jié)合的能力的結(jié)合的超級(jí)抗原進(jìn)行癌癥治療。Antonsson等(WO9736932)提出使用具有降低的血清反應(yīng)性的嵌合超級(jí)抗原和超級(jí)抗原的治療(也參見Abrahmsen等)。Abrahmsen等(WO9601650)和Antonsson等(WO9736932)所述的突變涉及在待治療的哺乳動(dòng)物中具有更低的系統(tǒng)毒性、降低的免疫原性和/或降低的血清反應(yīng)性的超級(jí)抗原。
已經(jīng)提出施用編碼野生型超級(jí)抗原的核酸的治療(Terman等WO9110680，WO9324136和Dow等WO9636366)。Dow等走得更遠(yuǎn)并提出編碼細(xì)胞因子或趨化因子的核酸與編碼超級(jí)抗原的核酸的共施用。雖未能有實(shí)驗(yàn)的支持，WO9636366也提出雙順反子基因構(gòu)建體形式的構(gòu)建體，其中一個(gè)順反子含有編碼超級(jí)抗原的基因并且另一個(gè)順反子含有編碼細(xì)胞因子或趨化因子的基因。
雖未能有實(shí)驗(yàn)的支持，但Pouletty P(Sangstat，EP510949)推測(cè)靶向部分如IL-2和野生型超級(jí)抗原之間的綴合物對(duì)于使表達(dá)IL-2受體的細(xì)胞失活可能是有用的。背景領(lǐng)域-免疫調(diào)節(jié)劑與對(duì)要使之失活的細(xì)胞特異的抗體聯(lián)合時(shí)的治療用途以前已經(jīng)提出帶有生物反應(yīng)性調(diào)節(jié)物，例如趨化因子或細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2的綴合抗體(Fell等EP439095；Rosenblum等EP396387，Pancook等1996和Becker等1996)。本發(fā)明著手解決的問題本發(fā)明著手提供對(duì)于涉及免疫系統(tǒng)活化的、為了使待治療哺乳動(dòng)物中不需要的靶細(xì)胞失活的超級(jí)抗原治療的改進(jìn)。具體地，這些改進(jìn)涉及1.在第一個(gè)治療周期過程中，例如在腫瘤中，局部延長活化時(shí)間；2)阻礙由于活化的T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成無反應(yīng)狀態(tài)的趨勢(shì)而出現(xiàn)的低反應(yīng)性；3)促進(jìn)腫瘤區(qū)域中MHC II類非依賴型的T細(xì)胞活化；和4)通過超級(jí)抗原活化拓寬細(xì)胞溶解的治療窗口。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)如果超級(jí)抗原(SAG)的施用與可溶形式免疫調(diào)節(jié)劑的施用結(jié)合，超級(jí)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑中至少一種是以帶有具有針對(duì)要使之失活的細(xì)胞的靶向特性的部分的綴合物形式，那么這些改進(jìn)可完全或部分實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的第一個(gè)主要方面使靶細(xì)胞失活的方法本發(fā)明的第一方面包括治療和體外分析，并且是一種通過在不是超級(jí)抗原(Sag)的免疫調(diào)節(jié)劑(IM)存在的情況下使兩種類型的細(xì)胞與超級(jí)抗原(SAG)、特別是通過與TCR Vβ結(jié)合活化T細(xì)胞的超級(jí)抗原接觸從而在T細(xì)胞存在的情況下使不需要的靶細(xì)胞失活的方法。在其最廣的方面，此方法的特征在于超級(jí)抗原與免疫調(diào)節(jié)劑中的至少一種是以帶有具有針對(duì)要使之失活的細(xì)胞的靶向特性的部分(T)的綴合物形式。在子方面中，此方法特征在于a.超級(jí)抗原(SAG)和免疫調(diào)節(jié)劑以包含超級(jí)抗原(Sag)、針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T)和免疫調(diào)節(jié)劑(IM)的三體綴合物形式(T，IM，Sag-綴合物)使用；b.超級(jí)抗原(SAG)以超級(jí)抗原(Sag)和針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T)之間的二體綴合物結(jié)合免疫調(diào)節(jié)劑(IM)和針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T’)之間的二體綴合物的形式(T，Sag-綴合物+T’，IM-綴合物)使用；c.超級(jí)抗原(SAG)以超級(jí)抗原(Sag)和針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T)之間的二體綴合物形式使用并且免疫調(diào)節(jié)劑(IM)以游離形式，即未與針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分結(jié)合的形式(T，Sag-綴合物+IM)使用；d.超級(jí)抗原(SAG)以自由形式(Sag)使用并且免疫調(diào)節(jié)劑以綴合物形式，即免疫調(diào)節(jié)劑(IM)與超級(jí)抗原(Sag)之間的二體綴合物形式(Sag+T，IM-綴合物)使用；以及e.超級(jí)抗原(SAG)與免疫調(diào)節(jié)劑以超級(jí)抗原(Sag)與免疫調(diào)節(jié)劑(IM)之間的二體綴合物形式(Sag，IM-綴合物)使用；超級(jí)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑可靶向相同類型的細(xì)胞，例如靶向相同或交叉反應(yīng)性結(jié)構(gòu)/表位或相同組織內(nèi)不同類型的細(xì)胞。靶向可以針對(duì)與一種和相同組織有關(guān)的正常細(xì)胞或患病細(xì)胞。超級(jí)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑中一種或二者可用同一種或多種抗體靶向。本發(fā)明方法要治療的疾病。
要治療的疾病原則上與以前提出的超級(jí)抗原治療的那些疾病相同。參見例如上述標(biāo)題“背景......”下的內(nèi)容。例證性實(shí)例有癌癥、自身免疫疾病、寄生蟲感染、病毒感染和其它與在其表面表達(dá)對(duì)各個(gè)疾病特異的MHC II類抗原和/或其它結(jié)構(gòu)的并且與插入符合本發(fā)明概念(化學(xué)式I)的超級(jí)抗原的尋靶部分結(jié)合的細(xì)胞有關(guān)的疾病。另外，通過使用本發(fā)明也可抵抗細(xì)菌感染。
本

發(fā)明內(nèi)容
中重要的癌癥形式有黑素瘤、癌、造血細(xì)胞瘤和纖維肉瘤并且包括具體的形式如鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、頭頸部癌、甲狀腺癌、軟組織癌、骨肉瘤、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮膚癌、腦癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、肥大細(xì)胞瘤、早期肝癌、肺癌、宮頸癌、腎細(xì)胞癌、白血病和淋巴瘤。包括的是任何類型的惡性或良性腫瘤以及多藥抗性腫瘤、轉(zhuǎn)移的腫瘤、各種形式的化學(xué)或病毒(皰疹病毒、SV40、HIV等)誘導(dǎo)的癌癥。本發(fā)明的第二主要方面本發(fā)明的超級(jí)抗原綴合物本發(fā)明的這方面包括符合化學(xué)式(I)(T)x(Sag)y(IM)z的綴合物。T是靶向部分，Sag對(duì)應(yīng)于游離超級(jí)抗原并且IM是非超級(jí)抗原的免疫調(diào)節(jié)劑。T，Sag和IM通過在一種和相同綴合物分子或物質(zhì)內(nèi)不同或相同的有機(jī)接頭B連接在一起。符合化學(xué)式I的綴合物包括化學(xué)綴合物以及重組合成的綴合物(融合蛋白)。x，y和z是一般選自0-10的整數(shù)如0-5，并且分別代表T、Sag和IM部分在給定綴合物分子中的數(shù)目，其中y＞0并且同時(shí)x和z中的一個(gè)或二者＞0?；瘜W(xué)綴合物一般是含有不同綴合物分子混合物的綴合物物質(zhì)。因此，在化學(xué)綴合物中x，y和z也可能是0-10范圍如0-5范圍內(nèi)的非整數(shù)。
在化學(xué)式I的第一個(gè)子方面中，Sag和IM和T存在于綴合物中(x和y和z＞0；T，Sag，IM-綴合物)。x，y和z一般為整數(shù)1-3，優(yōu)選1-2。x，y和z之間的典型關(guān)系是x＝y(tǒng)＝z；x＝y(tǒng)＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
在符合化學(xué)式I的綴合物的第二個(gè)子方面中，靶向部分缺乏(IM，Sag-綴合物，x＝0)。y和z一般是整數(shù)1-3。X和y之間優(yōu)選的關(guān)系為x＝y(tǒng)；x＝0.5y；0.5x＝y(tǒng)；x＝1/3y和1/3x＝y(tǒng)。
在兩個(gè)子方面中，整數(shù)或關(guān)系主要指這樣的融合蛋白，其中靶向部分可能是含有1、2、3或4條多肽鏈的蛋白并且其中每個(gè)綴合分子中有一個(gè)T。
根據(jù)第二個(gè)子方面，綴合物的化學(xué)式I縮減為(Sag)y(IM)z化學(xué)式II這種綴合物主要適于治療與表達(dá)MHC II類抗原的細(xì)胞有關(guān)的疾病、特別是表達(dá)II類的癌癥如造血系統(tǒng)癌癥以及一些自身免疫疾病、病毒感染和寄生蟲感染，并且適于治療與免疫調(diào)節(jié)劑的細(xì)胞膜錨定受體有關(guān)的疾病，表達(dá)例如IL-2受體的T細(xì)胞淋巴瘤。A.化學(xué)式I中的免疫調(diào)節(jié)劑IMIM代表不是游離的或結(jié)合的超級(jí)抗原的免疫調(diào)節(jié)劑。
免疫調(diào)節(jié)劑可以是細(xì)胞因子或趨化因子。舉例說明的細(xì)胞因子有粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α或β(TNFα或TNFβ)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IGF。舉例說明的趨化因子有C5a、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白1α(MIP1α)或單核細(xì)胞趨化蛋白1β(MIP1β)、單核細(xì)胞化學(xué)吸引劑蛋白1(MIP-1)、單核細(xì)胞化學(xué)吸引劑蛋白2(MIP-2)、單核細(xì)胞化學(xué)吸引劑蛋白3(MIP-3)、血小板活化因子(PAFR)、N-甲?；?甲硫氨酰基-亮氨?；?苯丙氨酸(FMLPR)、白三烯B4(LTB4R)、胃泌素釋放肽(GRP)、RANTES、eotaxin、淋巴細(xì)胞趨化因子、IP10、I-309、ENA78、GCP-2、NAP-2、MGSA/gro、DC-CK1、Flt3L(異位結(jié)構(gòu)域)、fractalkin、PF-4等。
另一種類型的免疫調(diào)節(jié)劑是那些源自參與調(diào)節(jié)激發(fā)的免疫反應(yīng)如共刺激的細(xì)胞膜錨定受體/配體對(duì)的免疫調(diào)節(jié)劑(例如淋巴細(xì)胞表面結(jié)合的受體和相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)合的配體)。舉例說明的實(shí)例有選自配對(duì)CD40L/CD40、4-BB1/4-BB1L、CD28/B7、CTLA-4/B7等的成員。B7包括變異體如CD80和CD86，其中前者是優(yōu)選的。優(yōu)選的形式是可溶的，含有胞外部分(異位結(jié)構(gòu)域)并且沒有細(xì)胞內(nèi)和膜錨定的部分。
特別優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑能夠例如通過阻礙超級(jí)抗原活化的T-細(xì)胞轉(zhuǎn)變成無反應(yīng)狀態(tài)在體內(nèi)增強(qiáng)超級(jí)抗原的效應(yīng)。典型的適當(dāng)?shù)募?xì)胞結(jié)合的受體/配體是CD28/B7，包括上述類似物和片段。此組典型的細(xì)胞因子有作為CD28/B7信號(hào)途徑下游主要效應(yīng)物的IL-2以及IL-2樣細(xì)胞因子IL-7和IL-15。在T細(xì)胞表面結(jié)合的受體/配體對(duì)中，優(yōu)選將不與待活化T細(xì)胞結(jié)合的成員插入根據(jù)本發(fā)明所述的綴合物中。對(duì)于CD40L/CD40、4-BB1/4-BB1L和CD28/B7，這意味著有上述優(yōu)選的可溶形式的CD40、4-BB1L和B7。本文的實(shí)驗(yàn)部分說明在本發(fā)明中于優(yōu)先權(quán)日發(fā)現(xiàn)為最佳的免疫調(diào)節(jié)劑變體。
免疫調(diào)節(jié)劑優(yōu)選地應(yīng)該是與要治療的個(gè)體相同的品種來源。天然免疫調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞因子和趨化因子通常在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)高系統(tǒng)毒性和相對(duì)短的半衰期。有很多文獻(xiàn)是關(guān)于如何將免疫調(diào)節(jié)劑修飾成相對(duì)于氧化有增強(qiáng)的穩(wěn)定性、更長的體內(nèi)半衰期、更低的毒性和通過重組技術(shù)制備時(shí)改進(jìn)的折疊等。例如美國專利US5,229,109(Gram等)描述了由于缺乏與受體的p55α亞單位的結(jié)合而對(duì)高親和性IL-2受體(IL-2R)具有下降親和性的IL-2的低毒性類似物。這些類似物主要通過突變IL-2中33-46位氨基酸(例如Arg38Ala和Phe42Lys或Phe42Ala)的密碼子加以制備。Asp20Lys突變體具有對(duì)IL-2受體的p75/β鏈100-500倍降低的親和性而不影響對(duì)p55的結(jié)合(Collins等1988)。其它突變?nèi)鏏sp20Ser程度較輕(Berndt等1994)。對(duì)鼠IL-2的研究表明人IL-2的Asp84和Asn88也參與p75結(jié)合(Zurawski等1993)。這通過模擬人IL-2與其受體間的結(jié)合而得到支持(Bamborough等1994)。這些突變親和性預(yù)期的下降是Asp20＞Asn88＞Asp84。
結(jié)合Arg38與Phe42中的突變與位置88和20中突變將導(dǎo)致對(duì)IL-2R更低的親和性。另一種有效的并且在優(yōu)先權(quán)日優(yōu)選的IL-突變是得到具有更低的細(xì)胞內(nèi)化率和更長的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)持續(xù)時(shí)間的IL-2類似物的Thr51Pro(Chang等1996)。
氨基酸位置的編號(hào)根據(jù)Taniguchi等1983。
Grimm等；Collins等1988；Berndt等1994；Zurawski等1993；Bamborough等1994；Chang等1996和Taniguchi等1983在此引用作為參考。
上述對(duì)其正常受體有降低的親和性的細(xì)胞因子和趨化因子類似物在綴合物中的應(yīng)用將增強(qiáng)它們靶向預(yù)定的靶細(xì)胞?？梢韵胂笈c帶有天然形式的免疫調(diào)節(jié)劑的相應(yīng)綴合物相比，經(jīng)突變?cè)诮Y(jié)合其各自細(xì)胞受體時(shí)表現(xiàn)降低的細(xì)胞內(nèi)化率并且插入符合化學(xué)式I的綴合物的細(xì)胞因子和趨化因子將導(dǎo)致更長的超級(jí)抗原活性。
因此術(shù)語免疫調(diào)節(jié)劑(IM)包括能興奮或拮抗免疫調(diào)節(jié)劑的相應(yīng)天然形式效應(yīng)的任何修飾形式，例如任何突變形式。B.化學(xué)式I中的超級(jí)抗原部分SAG化學(xué)式I中的Sag代表在上述標(biāo)題“背景...”下對(duì)游離超級(jí)抗原定義的超級(jí)抗原，即野生型超級(jí)抗原可能例如通過突變而修飾成a.與相應(yīng)的野生型超級(jí)抗原相比，具有降低的與MHC II類抗原結(jié)合的能力(參見例如Abrahmsen等(WO9601650))；b.與相應(yīng)的野生型超級(jí)抗原相比，在人血清中具有降低的血清反應(yīng)性(參見例如Abrahmsen等(WO9601650)和Antonsson等WO9736932和Antonsson等1997)；c.與相應(yīng)的野生型超級(jí)抗原相比，在人類中具有降低的免疫原性(參見例如Antonsson等WO9736932和Antonsson等1997)；d.是兩種或多種類似野生型超級(jí)抗原之間的嵌合體，其中第一種野生型超級(jí)抗原中的一個(gè)區(qū)域已用第二種類似超級(jí)抗原中的相應(yīng)區(qū)域替換。所述區(qū)域可以是決定與TCRVβ結(jié)合的區(qū)域，例如對(duì)SEE/SEA和SEA/SEE嵌合體所述的(參見例如Antonsson等WO9736932；Antonsson等1997和Lamphaer等1996)。
發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)钠渌揎?突變也包括在內(nèi)從而例如在真核細(xì)胞中合成時(shí)避免不想要的糖基化。
以前SEA/SEE樣超級(jí)抗原的典型突變有(編號(hào)如Antonsson等1997和Antonsson等WO9736932所用的)a.降低的MHC II類結(jié)合Asp227Ala(＝SEAm9)，Phe47Ala和/或Asp70Arg。突變體Phe47Ala/Asp227Ala＝SEAm23。
b.和d.SEA和SEE間的嵌合體，旨在降低人體中的血清反應(yīng)性，同時(shí)維持相應(yīng)結(jié)合的超級(jí)抗原的SADCC能力SEE具有以下的替換Gly20Arg，Thr21Asn，Gly24Ser，Lys27Arg。
用于實(shí)驗(yàn)部分的突變體是SEA(Asp227Ala)＝SEAm9，SEA(Phe47Ala/Asp227Ala)＝SEAm23和SEA(Phe47Ala/Asn102Q/Asn149Asp/Thr218Val/Asp227Ala)＝SEAm57。以前提出的優(yōu)選的超級(jí)抗原選自1.表現(xiàn)2個(gè)MHC II類結(jié)合位點(diǎn)的超級(jí)抗原(Sag)(例如葡萄球菌腸毒素A和E)，2.與MHC II類的最佳結(jié)合需要Zn離子的以其未突變形式的超級(jí)抗原(Sag)(例如SEA、SEE和SEH)，3.葡萄球菌腸毒素。
待插入根據(jù)本發(fā)明所述的綴合物中的Sag分子不必須是有功能的超級(jí)抗原，主要問題是最終的綴合物產(chǎn)生上述的SADCC和SDCC中的一個(gè)或二者。C.化學(xué)式I中的靶向部分T。
T原則上可以是任何能與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、優(yōu)選地疾病特異性結(jié)構(gòu)結(jié)合的結(jié)構(gòu)。T靶向的結(jié)構(gòu)通常不同于(a)Sag結(jié)合的多態(tài)性TCR鏈表位和(b)Sag結(jié)合的MHC II類表位。尋靶部分可選自白細(xì)胞介素(例如白細(xì)胞介素2)、激素、抗體包括抗體的抗原結(jié)合片段、生長因子等。參見例如Woodworth 1993(在此引用作為參考)。
因此靶向部分可以是含有1、2、3或4條多肽鏈的蛋白。
在優(yōu)先權(quán)日，優(yōu)選T細(xì)胞是抗體(全長抗體、Fab、F(ab)2、Fv、ScFv(單鏈抗體)、多個(gè)單鏈抗體(ScFv)n和任何其它結(jié)合抗原的抗體片段)，包括上述抗體的任何有功能活性的截短形式。其它變體是單特異性和雙特異性的。抗體原則上可以針對(duì)任何疾病相關(guān)/特異的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，例如與上述任何給定腫瘤形式連接的結(jié)構(gòu)，其中特別強(qiáng)調(diào)抗體活性片段(如Fab)。通常抗體可針對(duì)結(jié)腸和/或胰腺特異性表位如所謂的C242表位(Lindholm等WO9301303)、肺癌特異性表位如5T4抗體的表位(Stern等WO8907947)、淋巴瘤特異性表位如CD19上黑素瘤特異性表位，例如HMW-MAA等。
術(shù)語“抗體”包括單克隆以及多克隆變體，其中優(yōu)選單克隆制劑。
在靶向部分是Fab片段時(shí)，通常將使重輕鏈Fab鏈連接在一起的半胱氨酸殘基優(yōu)選地用不允許二硫橋形成的氨基酸如絲氨酸替換。也參見Antonsson等WO9736932。
上面所述的也包括T可能針對(duì)或多或少的調(diào)節(jié)或控制疾病發(fā)生的健康細(xì)胞上的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。D.接頭B接頭B可按前述(Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650和Antonsson等WO9736932)選擇；即B優(yōu)選地應(yīng)是親水性的并且表現(xiàn)選自酰胺、硫醚、二硫化物等的一種或多種結(jié)構(gòu)。最重要的接頭是通過重組技術(shù)得到的那些接頭，即結(jié)合發(fā)生在基因組水平從而得到寡肽接頭。通常，接頭含有1-30個(gè)如1-20個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選地選擇這些氨基酸殘基使得接頭總體上為親水性。因此接頭殘基優(yōu)選地選自親水性氨基酸殘基如Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、His和Arg。典型的寡肽接頭包括三肽GlyGlyPro或所謂的在氨基末端可能用gly-pro修飾的Q接頭(Wootton等1989，在此引用作為參考)。E.T、SAG和IM的結(jié)合點(diǎn)化學(xué)綴合物通常將含有連接位點(diǎn)不同的綴合物分子的混合物。綴合物物質(zhì)將含有異型以及同型綴合物。
對(duì)于重組綴合物(融合蛋白)，得到的綴合物物質(zhì)在連接位點(diǎn)上將是相同的。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的亞單位(T，Sag，IM)，氨基末端優(yōu)選地通過插入的寡肽橋與另一亞單位的羧基末端融合或者反之亦然。在綴合物含有T，Sag，IM每種各一個(gè)時(shí)，組合將是T-IM-Sag，IM-T-Sag，Sag-IM-T，Sag-T-IM，T-Sag-IM，IM-Sag-T(B接頭結(jié)構(gòu)的存在未顯示)。在一個(gè)或多個(gè)亞單位含有兩條或多條多肽鏈時(shí)，可能性的數(shù)目增加。對(duì)于T為抗體Fab片段時(shí)，可能性將是(寡肽接頭B未顯示)1.Sag-Fab(輕鏈)-IM 2.Fab(輕鏈)Fab(重鏈) Sag-Fab(重鏈)-IM3.Sag-Fab(輕鏈) 4.Fab(輕鏈)-IMFab(重鏈)-IM Sag-Fab(重鏈)5.Sag-Fab(輕鏈) 6.IM-Fab(輕鏈)IM-Fab(重鏈) Sag-Fab(重鏈)7.Fab(輕鏈)-Sag 8.Fab(輕鏈)-IM
Fab(重鏈)-IMFab(重鏈)-Sag在進(jìn)一步的變異體中，免疫調(diào)節(jié)劑和超級(jí)抗原可依次在抗體任何鏈的任何末端融合。
在優(yōu)先權(quán)日，重組綴合物是優(yōu)選的，其中最優(yōu)選的是Fab片段作為靶向部分以及使游離超級(jí)抗原的氨基末端與抗體重鏈(CHl)或輕鏈的第一個(gè)恒定區(qū)連接并使免疫調(diào)節(jié)劑與剩下的羧基末端連接(對(duì)化學(xué)式I-IV有效)。
為了最佳的制備與功能，將融合蛋白重組表達(dá)為兩條鏈的產(chǎn)物，其中超級(jí)抗原通過可彎曲的3-11個(gè)殘基的親水性氨基酸接頭在C-末端與抗體Fab片段的CHl-結(jié)構(gòu)域融合。此接頭可以具有序列Gly-Gly-Pro或Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ IN NO19)或基于SEQ IN NO19的4-9個(gè)殘基，其中SEQ IN NO19是優(yōu)選的。免疫調(diào)節(jié)劑部分通過10-20個(gè)殘基的親水性并且中性或帶正電的接頭(接頭Q)在C-末端與輕鏈融合。優(yōu)選，接頭Q可具有以下序列Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO23)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ ID NO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ ID NO22)，其中SEQ IN NO20和21是最優(yōu)選的(更多細(xì)節(jié)參見實(shí)施例2)。
據(jù)信此時(shí)氨基末端的類似組合或在VH和VL結(jié)構(gòu)域氨基和羧基末端的結(jié)合的組合導(dǎo)致有活性但是效率更低的綴合物。F.不符合化學(xué)式I但根據(jù)本發(fā)明方法中上述組合a-e使用的活性整體。
游離超級(jí)抗原(Sag)參見標(biāo)題“定義”。典型的Sag列于標(biāo)題“背景”和“B.化學(xué)式I中超級(jí)抗原部分Sag”。
非結(jié)合的免疫調(diào)節(jié)劑參見標(biāo)題“定義”。原則上可使用與在標(biāo)題“A?；瘜W(xué)式I中的免疫調(diào)節(jié)劑IM”下給出的相同的免疫調(diào)節(jié)劑。細(xì)胞因子和趨化因子是優(yōu)選的，其中強(qiáng)調(diào)IL-2和IL-2樣細(xì)胞因子。
定向免疫調(diào)節(jié)劑(T，IM-綴合物)這些綴合物符合基本化學(xué)式(T’)x(IM’)z化學(xué)式III其中T’和IM’通過有機(jī)接頭B’連接在一起。T’、IM’和B’選自與T、IM和B相同組的化合物/結(jié)構(gòu)。x和z以與化學(xué)式I相同的方式定義(y＝0)，其中每個(gè)T’和綴合物分子優(yōu)選一個(gè)或兩個(gè)IM’。T’和IM’之間的結(jié)合點(diǎn)如化學(xué)式I中所定義。也參見標(biāo)題“E.結(jié)合點(diǎn)......”，其中化學(xué)式1-8及對(duì)其的注解除了省略Sag外也適用于T，IM綴合物?；瘜W(xué)式III的綴合物可根據(jù)已知技術(shù)即常規(guī)化學(xué)連接或重組技術(shù)(融合蛋白)制備，其中后者是優(yōu)選的(Fell等EP439095；Rosenblun等EP396387)。特別重要的T，IM-綴合物包括已經(jīng)修飾如突變而具有上述降低的親和性和/或降低的內(nèi)化率的IM’-部分。
定向超級(jí)抗原(T，Sag-綴合物)這些綴合物符合基本化學(xué)式(T’)x(Sag’)y化學(xué)式IV其中T’和SAG’通過有機(jī)接頭B’連接在一起。T’、Sag’和B’選自與T、IM和B相同組的化合物/結(jié)構(gòu)。x和y以與化學(xué)式I相同的方式定義(z＝0)，其中每個(gè)T’和綴合物分子優(yōu)選一個(gè)或兩個(gè)Sag’。T’和Sag’之間的結(jié)合點(diǎn)如化學(xué)式I中所定義。也參見標(biāo)題“E.結(jié)合點(diǎn)......”，其中化學(xué)式1-8及對(duì)其的注解除了從化學(xué)式省略IM外也適用于T，Sag綴合物?；瘜W(xué)式IV的綴合物可根據(jù)已知技術(shù)即常規(guī)化學(xué)連接或重組技術(shù)(融合蛋白)制備，其中前者是優(yōu)選的。參見例如Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650；和Antonsson等WO9736932。本發(fā)明的第三主要方面含有修飾的免疫調(diào)節(jié)劑的綴合物。
這些新的綴合物符合化學(xué)式(T)x(Sag)y(IM)z化學(xué)式V其中T和Sag選自與化學(xué)式I的T和Sag相同的化合物。IM是經(jīng)修飾如通過突變而對(duì)其細(xì)胞膜錨定的受體表現(xiàn)降低的親和性和/或降低的通過結(jié)合其受體的內(nèi)化率的免疫調(diào)節(jié)劑(與相應(yīng)的天然形式相比)。IM優(yōu)選地是細(xì)胞因子或趨化因子。進(jìn)一步參見標(biāo)題“A.化學(xué)式I中的免疫調(diào)節(jié)劑IM”。本發(fā)明這方面的一個(gè)重要免疫調(diào)節(jié)劑是修飾的IL-2。x，y和z以與化學(xué)式I相同的方式定義。
在符合化學(xué)式V的綴合物的第一個(gè)子方面中，T、Sag和IM總是存在(所有x和y和z＞0)，即T，Sag，IM-綴合物。x，y和z一般是整數(shù)1-3，其中優(yōu)選1-2。x，y和z之間的典型關(guān)系為x＝y(tǒng)＝z；x＝y(tǒng)＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
在符合化學(xué)式V的綴合物的第二個(gè)子方面中，超級(jí)抗原部分缺乏(y＝0)，即T，IM-綴合物。x和z一般是整數(shù)1-3。x和z之間的優(yōu)選關(guān)系為x＝z；x＝0.5z；0.5x＝z；x＝1/3z和1/3x＝z。
在符合化學(xué)式V的綴合物的兩個(gè)子方面中，給定的整數(shù)范圍或它們的相互關(guān)系主要指這樣的融合蛋白，其中靶向部分可能是含有1、2、3、4條多肽鏈的蛋白并且其中每個(gè)綴合分子中有一個(gè)T。化學(xué)式V的融合蛋白的結(jié)合點(diǎn)與符合化學(xué)式I的相應(yīng)融合蛋白相同。也參見標(biāo)題“E.結(jié)合點(diǎn)......”，其中化學(xué)式1-8及對(duì)其的注解除了對(duì)于第二個(gè)子方面省略Sag外也適用于T，IM綴合物。上述綴合物的制備。
綴合物的制備原則上可根據(jù)兩個(gè)主要途徑進(jìn)行1.將各個(gè)亞單位T、Sag和IM化學(xué)連接在一起。每個(gè)單獨(dú)亞單位或其組合可通過重組技術(shù)加以制備。
2.如上述任何化學(xué)式中定義的直接提供綴合物的重組技術(shù)。
實(shí)際方法對(duì)于普通技術(shù)人員是眾所周知的并且包括大量變化。
化學(xué)連接一般利用通常天然存在于超級(jí)抗原、蛋白性免疫調(diào)節(jié)劑和蛋白性靶向部分的多個(gè)位置中的官能團(tuán)(例如伯氨基、羧基、巰基、碳水化合物基團(tuán))。這些技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
本發(fā)明超級(jí)抗原與免疫調(diào)節(jié)劑之間的綴合物(融合形式以及非綴合形式)的大規(guī)模重組制備的主要宿主細(xì)胞是大腸桿菌。此宿主原則上提供兩條途徑細(xì)胞內(nèi)合成和分泌。后一種變化形式是優(yōu)選的，因?yàn)樗峁﹣碜灾苜|(zhì)和培養(yǎng)基的正確折疊蛋白的純化。上述并不排除有可能在其它宿主，例如真核細(xì)胞如酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備有活性的綴合物。到目前為止的初步結(jié)果已經(jīng)表明真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)于插入與CD28相互作用的免疫調(diào)節(jié)劑如B7及其類似物可能是優(yōu)選的。本發(fā)明的第四方面編碼新發(fā)明綴合物的基因構(gòu)建體。
本發(fā)明的第四方面是編碼上述超級(jí)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑、優(yōu)選地編碼上述IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、RANTES、CD80異位結(jié)構(gòu)域、CD86異位結(jié)構(gòu)域、4-BB1L和Flt3L及它們的類似物的重組核酸分子、優(yōu)選地DNA如cDNA或RNA。在本發(fā)明的這一方面，核酸一般應(yīng)該含有與免疫調(diào)節(jié)劑和超級(jí)抗原要在其中表達(dá)的宿主細(xì)胞相容的用于免疫調(diào)節(jié)劑和超級(jí)抗原等中的一個(gè)或二者的調(diào)控序列如翻譯調(diào)控序列、復(fù)制起點(diǎn)、分泌信號(hào)序列。編碼超級(jí)抗原與免疫調(diào)節(jié)劑的序列部分間的區(qū)域可包含編碼核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的序列如雙順反子基因構(gòu)建體。后者將允許包括在綴合物中的每條多肽鏈的分別表達(dá)。在含有IM，Sag，靶向綴合物和適當(dāng)信號(hào)序列的多鏈綴合物中，雙順反子構(gòu)建體將促進(jìn)折疊并且裝配成有完全活性的綴合物，其中IM與其中的一條鏈結(jié)合。在其中靶向部分是兩條鏈的抗體分子并且超級(jí)抗原(Sag)和免疫調(diào)節(jié)劑中的至少一個(gè)與抗體鏈的末端融合的情況下，這將是重要的。參見上述。藥物組合物、劑量和施用途徑。
本發(fā)明的第五方面是含有本發(fā)明超級(jí)抗原(Sag)、靶向部分(T)和免疫調(diào)節(jié)劑(IM)組合的藥物組合物。本發(fā)明的此方面的典型特征是超級(jí)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑中的至少一個(gè)以上述允許靶向待失活細(xì)胞的綴合物形式。
所討論的組合物在本領(lǐng)域中已知，除了現(xiàn)在它們含有本發(fā)明的綴合物組合。在具體的組合物中，組合可包括a.包括超級(jí)抗原(Sag)、針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T)和免疫調(diào)節(jié)劑(IM)的三體綴合物(T，IM，Sag-綴合物)；b.兩種二體綴合物一種在靶向抗體(T)與超級(jí)抗原之間而一種在靶向抗體(T’)與免疫調(diào)節(jié)劑之間(即T，Sag-綴合物+T’，IM-綴合物)。根據(jù)表位的特異性，T和T’可以是不同或相同的；c.一種超級(jí)抗原(Sag)和靶向部分(T)之間的二體綴合物以及游離形式的免疫調(diào)節(jié)劑(IM)(T，Sag-綴合物+IM)；
d.一種免疫調(diào)節(jié)劑(IM)和靶向部分(T)之間的二體綴合物以及游離形式的超級(jí)抗原(Sag)(T，IM-綴合物+Sag)；或者e.以二體綴合物形式的超級(jí)抗原(Sag)和免疫調(diào)節(jié)劑(IM)(Sag，IM綴合物)；進(jìn)一步參見上述本發(fā)明方法的內(nèi)容。在組合物含有兩種活性組分時(shí)(上述b-d)，組合物可允許在給藥前分開保存這些成分。
這些組合物可以是凍干顆粒狀物質(zhì)、無菌或無菌制備的溶液、片劑、安瓿等形式。可以存在賦形劑如水(優(yōu)選地通過例如PBS緩沖至生理上可接受的pH值)或其它惰性固體或液體物質(zhì)。一般而言通過將綴合物(可能結(jié)合非結(jié)合的活性組分)混合于、溶解于、結(jié)合到或以別的方式合并到一種或多種水溶性或水不溶性的水性或非水性賦形劑中(如果必要與適當(dāng)添加劑和佐劑混合)來制備這些組合物。這些賦形劑和條件必須不能對(duì)上述a-e中定義的活性組分的活性有不利影響，這是必不可少的。
通常用于本發(fā)明的超級(jí)抗原(SAG)將以預(yù)先分裝的劑量出售和給藥，根據(jù)現(xiàn)在所有的結(jié)果，每劑量含有據(jù)信在1pg-50mg范圍內(nèi)的有效量的SAG。確切的劑量將在不同病例間不同，取決于患者的體重和年齡以及對(duì)所用SAG特異的抗體的預(yù)滴定、給藥途徑、疾病類型、尋靶部分、超級(jí)抗原、連接(-B-)、免疫調(diào)節(jié)劑等。
決定用于本發(fā)明方法的組合的劑量的重要因素是超級(jí)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用的最佳劑量范圍。太低的劑量將導(dǎo)致無效應(yīng)或低于最佳效應(yīng)而太高的劑量將產(chǎn)生不能接受的副作用如可能致死的毒性。因此不得不強(qiáng)調(diào)上面給出的寬范圍試圖包括對(duì)本發(fā)明方法所有變化可能的范圍。因此，根據(jù)本發(fā)明方法所述的每個(gè)具體組合具有0.1pg-50mg范圍內(nèi)的劑量子范圍。這不排除將來的開發(fā)和結(jié)果可能導(dǎo)致此范圍外的劑量水平。
給藥途徑將是本領(lǐng)域中常用的那些，即使殺死目標(biāo)有效量或有治療活性量的根據(jù)本發(fā)明所述的超級(jí)抗原-免疫調(diào)節(jié)劑組合與靶細(xì)胞接觸。對(duì)于上述適用癥，這最可能意味著腸道外施用如(皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi))注射或灌注給哺乳動(dòng)物如人類。本發(fā)明的綴合物組合可局部或系統(tǒng)給藥。
術(shù)語“殺死目標(biāo)有效量”是指活化和介導(dǎo)T細(xì)胞破壞靶細(xì)胞時(shí)有效的量。
在優(yōu)先權(quán)日，優(yōu)選的給藥途徑與對(duì)于根據(jù)Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650和Antonsson等PCT/97/00537所述的超級(jí)抗原綴合物所用的相同。這意味著每天1-5小時(shí)(優(yōu)選地4小時(shí))結(jié)合退熱劑(撲熱息痛)的靜脈內(nèi)灌注。給藥在一些天如5-8天內(nèi)重復(fù)，同時(shí)認(rèn)真考慮增強(qiáng)針對(duì)綴合物的抗體的風(fēng)險(xiǎn)。最好進(jìn)行多個(gè)治療周期，每個(gè)周期含有一天或多天時(shí)間的治療接著一天或多天時(shí)間的停止期，例如分別為5天和2天時(shí)間的治療和休息。
本發(fā)明的組合物可作為主要療法或在優(yōu)選模式中作為輔助療法與手術(shù)或其它藥物結(jié)合。實(shí)驗(yàn)部分圖解

圖1.用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色后與PE標(biāo)記的抗小鼠κ鏈mAb一起培養(yǎng)的CHO-CD28細(xì)胞的FACS分析。染色在4℃進(jìn)行而不進(jìn)行任何洗滌?？v軸平均通道。
圖2.用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色后與PE標(biāo)記的抗小鼠κ鏈mAb一起培養(yǎng)的Colo205細(xì)胞的FACS分析。染色在4℃進(jìn)行并在每個(gè)染色步驟之間進(jìn)行三次洗滌?？v軸平均通道。橫軸效應(yīng)器(E)對(duì)靶細(xì)胞(T)的比例。
圖3.增殖將T細(xì)胞與Colo205細(xì)胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培養(yǎng)4天后計(jì)數(shù)摻入的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷。無任何CD80-C215Fab時(shí)得到的活性是20039cpm+/-1750。
圖4.IL-2的制備將T細(xì)胞與Colo205細(xì)胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培養(yǎng)4天后收集上清液并測(cè)定IL-2量。無任何CD80-C215Fab時(shí)得到的IL-2量是2849pg/ml。
圖5.將T細(xì)胞與Colo205細(xì)胞和不同量CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEAm23一起培養(yǎng)4天后計(jì)數(shù)摻入的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷。
圖6.IL-2的制備將T細(xì)胞與Colo205細(xì)胞和不同量CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEAm23一起培養(yǎng)4天后收集上清液并測(cè)定IL-2量。
圖7.與所示蛋白和照射的(irradiated)、轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(用于呈遞SEA)一起培養(yǎng)7天時(shí)人血T細(xì)胞的增殖能力?？v軸3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入(cpm)。
圖8.同時(shí)施用靶向的SEA和IL-2導(dǎo)致體內(nèi)T細(xì)胞增強(qiáng)的活化。針對(duì)來自用C215FabSEA(FS)、C215Fab-Q-hIL2(FI)、兩個(gè)(FS+FI)的組合或C215FabSEA-Q-hIL2(FSI)的1次或3次注射處理的小鼠的脾細(xì)胞的SEA-包被的MHC II+類Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性(表示為百分率)。效應(yīng)器靶細(xì)胞比例為30∶1，并且細(xì)胞毒性用標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放分析加以測(cè)定。
圖9.用C215FabSEA(FS)、C215Fab-Q-hIL2(FI)、C215FabSEA+C215Fab-Q-hIL2(FS+FI)或C215Fab-Q-hIL2(FSI)的三次注射(腫瘤接種后5、6和7天)對(duì)C57B1/6小鼠中第5天B16-C215腫瘤的治療。使用等摩爾量的FabSEA和Fab-Q-hIL2。橫軸注射蛋白的量?？v軸以百分率表示的腫瘤減少。
圖10.C215Fab-SEA(FS)、C215Fab-Q-IL2(FI)或C215Fab-Q-IL2治療后CD25+T細(xì)胞增加的腫瘤浸潤。浸潤到帶有確定的B16-GA733肺癌的小鼠肺中的CD25陽性細(xì)胞通過免疫組織化學(xué)法評(píng)估?？v軸染色面積的百分比。橫軸1＝PBS；2＝第一次注射；3＝第二次注射；4＝第三次注射；5＝第四次注射。
圖11.每日一次(37mg/注射)四次注射C215FabSEA-Q-hIL2(FSI)(37mg/天)后干擾素γ的持續(xù)水平。最后一次注射后4小時(shí)收集血液并用重組鼠干擾素γ(Pharmingen)作為標(biāo)準(zhǔn)通過ELISA測(cè)試測(cè)定干擾素γ的含量(縱軸中)。相似實(shí)驗(yàn)用等摩爾量(30mg/注射)的C215FabSEA(FS)進(jìn)行。
圖12.針對(duì)來自用PBS或C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)的1、4或6次注射處理的小鼠的脾細(xì)胞的SEA-包被的MHC II+類Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性(縱軸中表示為百分率)。細(xì)胞毒性用標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放分析加以測(cè)定。PBS用作陰性對(duì)照。
圖13.用C215FabSEAD227A(＝FSm9)或C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)的8次注射處理后C57B1/6小鼠中第3天B16-C215腫瘤的治療。連續(xù)8天每天進(jìn)行治療。在21天殺死動(dòng)物，并且計(jì)數(shù)肺部的轉(zhuǎn)移?？v軸以百分率表示的腫瘤減少。
圖14.用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A(＝FSm9-IL2(F42A))，C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)或C215FabSEAD227A(＝FSm9-IL2)的8次注射處理后Vb3 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠中第3天B16-C215腫瘤的治療。連續(xù)8天每天進(jìn)行治療。在21天殺死動(dòng)物，并且計(jì)數(shù)肺部的轉(zhuǎn)移?？v軸以百分率表示的腫瘤減少。
圖15.用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A(F42A)，C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42KF42K(＝FSm9-Il2)或C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A/D20S(＝F42A/D20S)的8次注射處理后Vb3 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠中第3天B16-C215腫瘤的治療。連續(xù)8天每天進(jìn)行治療。在21天殺死動(dòng)物，并且計(jì)數(shù)肺部的轉(zhuǎn)移。縱軸以百分率表示的腫瘤減少。實(shí)施例1 CD80-C215FAB融合蛋白用于用SAG靶向的FAB進(jìn)行腫瘤治療的共刺激的生物學(xué)活性。
概述已經(jīng)構(gòu)建CD80-C215Fab和CD80-C215Fab-SEAm57融合蛋白從而含有人CD80的胞外結(jié)構(gòu)域。融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成，并且用CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染子測(cè)定對(duì)CD28的結(jié)合且用Colo205細(xì)胞測(cè)試對(duì)C215抗原的結(jié)合。兩種融合蛋白結(jié)合CD28和C215抗原，后一結(jié)合與C215Fab-SEA相比下降100倍。既然CD80與L-鏈的N-末端部分連接，那么CD80部分干擾C215Fab結(jié)合是可能的。兩種融合蛋白共刺激SAG活化的人T細(xì)胞，表明可溶性CD80保持了其生物學(xué)功能。材料和方法重組DNA技術(shù)和酶質(zhì)粒DNA制備與其它操作基本上按照Sambrook等(Sambrook等1989)進(jìn)行。大腸桿菌HB101(Boyer等1969)用作宿主菌株。限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶I的Klenow片段獲自BoehringerMannheim或New England Biolabs，并且按照供應(yīng)商說明使用。Taq聚合物獲自Perkin Elmer。用GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer)從總RNA中制備cDNA。寡核苷酸在Gene Assembler(Pharmacia Biotech AB)或ABI 392 DNA/RNA合成儀(Applied Biosystems)上合成，并且通過反相層析在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia Biotech)上加以純化。測(cè)序根據(jù)雙脫氧鏈終止原理(Sanger等1977)用Applied BiosystemsTaq染料雙脫氧終止循環(huán)測(cè)序試劑盒進(jìn)行并且將產(chǎn)物在DNA測(cè)序儀ABI 392(AppliedBiosystems)上分離和測(cè)定。在每升含有2 X YT和15g瓊脂基質(zhì)并補(bǔ)加70mg/L卡那霉素或100mg/L氨芐青霉素的平板上選擇帶有不同質(zhì)粒的細(xì)菌。液體培養(yǎng)基為2X YT(每升10g酵母提取物(Difco)，16g胰蛋白胨(Difco)和5g NaCl)。
表ILAKQ5 ATA TAA GCT TCC ACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG(SEQ ID NO 1)LAKQ7 ACG CAG ATC TTT AGT TAT CAG GAA AAT GCT CTTGC(SEQ ID NO 2)LAKQ30TCA AAG CTT CTC GAG CGC GCT GTT ATC AGG AAAATG CTC(SEQ ID NO 3)LAKQ37CGC GCG TCA GGC TAA CGA ACT GCC AGG CGC CCCGTC ACA GAG ACG A(SEQ ID NO 4)LAKQ38AGC TTC GTC TCA CGC GCG TTC TTC CTG TGA CGGGGC GCC TGG CAG TTC GTT AGC CTG ACG(SEQ ID NO 5)LAKQ88TGG TAC ACC ACA GAA GAC AGC TTG TAT GTA TG(SEQ ID NO 6)LAKQ89CAT ACA TAC AAG CTG TCT TCT GTG GTG TAC CA(SEQ ID NO 7)LAKQ90CGA ATA AGA AAG ACG TCA CTG TTC AGG AGT TGG(SEQ ID NO 8)LAKQ91CCA ACT CCT GAA CAG TGA CGT CTT TCT TAT TCG(SEO ID NO 9)LAKQ92GAG ATA ATA AAG TTA TTA ACT CAG AAA ACA TG(SEQ ID NO 10)LAKQ93CAT GTT TTC TGA GTT AAT AAC TTT ATT ATC TC(SEQ ID NO 11)LAKQ108 CGC GGA TCC GCG CGG CAC CAG GCC GCT GTT ATCCGG AAA ATG CTC TTG C(SEQ ID NO 12)LAKQ117 CCG GAT AAC AGC GCG CGT CAG CTA ACG AAC TCCAGG CGC CCC GTC ACA GGA AGAA CGC CCG CAG GTCCAA CTG CA(SEQ ID NO 13)LAKQ118 GTT GGA CCT GCG GGC GTT CTT CCT GTG ACG GGGCGC CTG GCA GTT CGT TAG CCT GAC GCG CGC TGT TAT(SEQ ID NO 14)質(zhì)粒構(gòu)建按照以前所述(Dohlsten等1994)構(gòu)建編碼含有鼠抗體C215可變區(qū)的Fab片段的基因。以前已描述葡萄球菌腸毒素A(SEA)基因的克隆和誘變得到替換F47A和D227A(Abrahmsen等1995)。用引物L(fēng)AKQ88-93(使用的所有引物列于表I中)將其它3個(gè)突變導(dǎo)入SEA基因中以獲得SEA突變體57。將LAKQ5和LAKQ7用于RT-PCR以在上游導(dǎo)入kozak盒，并且從人脾總RNA克隆編碼信號(hào)肽和人CD80胞外部分的基因。發(fā)現(xiàn)核苷酸序列對(duì)應(yīng)于CD80的基因庫序列(錄入號(hào)M27533)。制備在3’末端具有不同克隆位點(diǎn)的兩個(gè)CD80基因變體在分開的PCR中，使用引物L(fēng)AKQ30和LAKQ108以分別得到BssHII或MroI位點(diǎn)。通過在相關(guān)CD80基因與緊接κ基因前面的DsaI位點(diǎn)之間插入DNA接頭LAKQ37/38 BssHII-Esp3I來構(gòu)建編碼通過Q-接頭在κ鏈前融合的CD80的基因融合。通過將編碼前面為CD80信號(hào)肽的CD80-(Q-接頭)-κ的基因融合插入除了CMV啟動(dòng)子和polyA尾外還含有用于轉(zhuǎn)化子選擇的新霉素基因的載體中，獲得質(zhì)粒pKGE987。將CD80基因的最后版本用于構(gòu)建基因融合，其中此基因位于Fd-SEA突變體57基因融合前面將編碼Q-接頭的DNA片段(LAKQ117/118)插入CD80基因中的MroI位點(diǎn)與C215VH基因中密碼子4和5處的PstI位點(diǎn)之間。將此基因融合插入第二個(gè)CMV啟動(dòng)子載體中以得到質(zhì)粒pMB189，從而編碼通過三個(gè)殘基間隔GGP連接在Fd和SEA突變體57后的CD80信號(hào)肽和胞外部分。在質(zhì)粒pKGE961中，F(xiàn)d基因插入在信號(hào)序列(源自另一鼠VH基因)之后。質(zhì)粒pMB156編碼前面為其天然信號(hào)肽的天然κ鏈，并含有新霉素基因。合成用pKGE961和pKGE987或pMb156和pMB189轉(zhuǎn)染倉鼠胚腎293細(xì)胞以得到分別產(chǎn)生CD28-C215Fab和CD28-C215Fab-SEAm57的細(xì)胞系。為了獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，選擇培養(yǎng)基為補(bǔ)加L-谷氨酰胺(GIBCO BRL no 25030-24)、10％小牛血清和1mg/ml遺傳霉素的無苯酚紅的DMEM(Pharmacia noMS 0127)。生產(chǎn)培養(yǎng)基是補(bǔ)加L-谷氨酰胺和0.1％HAS(Pharmacia & UpjohnAB，瑞典)的無苯酚紅的DMEM。通過在蛋白G Sepharose FF(PharmaciaBiotech AB)上親和層析，然后通過抗-CD80親和純化(固定化的抗人CD80抗體；Camfolio L307.4)或在SP Sepharose FF(Pharmacia Biotech AB)上離子交換層析從過濾(Sartobran 0.65-0.4um)的培養(yǎng)基純化融合蛋白。
試劑將補(bǔ)加2mM L-谷氨酰胺(GIBCO，Middlesex，英國)、0.01MHEPES(Biological Industries，以色列)、1mM NaHCO3(Biochrom KG，柏林，德國)、0.1mg/ml硫酸慶大霉素(Biological Industries，KibbutzBeit Haemek，以色列)、1mM丙酮酸鈉(JRH Biosciences Industries，美國)和10％加熱滅活胎牛血清(GIBCO，Middlesex，英國)的RPMII 1640培養(yǎng)基(GIBCO，Middlesex，英國)用作所有細(xì)胞培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基。
抗體針對(duì)人CD57(HNK1)和CD56(HB55)的mAb獲自產(chǎn)生mAb的雜交瘤細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，ND)。用PE標(biāo)記的抗小鼠κ鏈的mAb獲自Becton Dickinson(San Jose，CA)。
細(xì)胞用Pharmacia和Upjohn，Stockholm，瑞典的編碼CD28基因的人cDNA轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢(CHO)K1細(xì)胞。常規(guī)分析轉(zhuǎn)染子的CD28表達(dá)并通過FACS分選在相似抗原表達(dá)水平維持轉(zhuǎn)染子。人直腸癌細(xì)胞系Colo205獲自ATCC。所有細(xì)胞系不含支原體。
T淋巴細(xì)胞增殖分析按照以前所述(Lando等1996)通過使用CD57、HLA-DR4、CD14和CD56 mAb的負(fù)選擇淘選從外周血單核細(xì)胞(PMB)得到T細(xì)胞。所有對(duì)T細(xì)胞的測(cè)試用平底96孔板(Nunc，Roskilde，丹麥)以200μl體積用0.1×106個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行。按照前述(10)使培養(yǎng)物暴露于[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷[3H]TdR(0.5mCi/孔)后研究DNA合成。
流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析流式細(xì)胞計(jì)量分析和分選根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置在FACStarPlus流式細(xì)胞計(jì)量儀(Becton Dickinson，Mountain View，CA)上進(jìn)行。由于CD80對(duì)CD28的低親和性，用CD80-C215Fab融合蛋白對(duì)CHO-CD28細(xì)胞的染色通過省略細(xì)胞洗滌來進(jìn)行。
細(xì)胞因子分析用IL-2 ELISA試劑盒(huIL-2 Duoset，Genzyme)分析IL-2的產(chǎn)量。結(jié)果CD80-Fab融合蛋白的描述Fab部分具有鼠IgG1/k的同種型，盡管它含有IgG2A/k單克隆抗體C215的可變區(qū)(Dohlsten等1995)。三肽序列GGP在CH1結(jié)構(gòu)域中形成鏈間二硫鍵的鏈內(nèi)半胱氨酸之后。在CD80-C215Fab-SEAm57三體融合蛋白中，它作用為Fd和具有5個(gè)替換的葡萄球菌腸毒素A之間的間隔(SEA；Betley等1988)。導(dǎo)入替換F47A和D227A以降低對(duì)MHC II類的親和性(Abrahmsen等1995)，并且導(dǎo)入替換N102Q、N149Q和T218V以避免在真核細(xì)胞中合成時(shí)偶然的糖基化。借助X-衍射結(jié)構(gòu)選擇后面的這些替換(Soundstrom等1996)。將最終的五突變體命名為SEA突變體57。兩種融合蛋白均含有人CD80的胞外結(jié)構(gòu)域(限定為末端FPDN)。使用天然CD80信號(hào)肽，并且正如通過純化CD80-C215Fab的氨基酸測(cè)序測(cè)定的，發(fā)現(xiàn)成熟蛋白起始VIHV。18個(gè)氨基酸的間隔連接CD80與CD80-C215Fab中的κ鏈或CD80-C215Fab-SEAm57三體融合蛋白中的Fab片段的Fd部分。這些間隔象Q-接頭(Wooton等1996)并分別具有序列SARQANELPGAPSQEERA(SEQ ID NO 15)和SARQANELPGAPSQEERP(SEQ ID NO 16)。Facs分析CD80-C215Fab融合蛋白與CD28陽性細(xì)胞和C215陽性細(xì)胞的結(jié)合CD28陽性細(xì)胞CHO-CD28細(xì)胞用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色后與PE標(biāo)記的抗小鼠κ鏈mAb一起培養(yǎng)。染色在4℃進(jìn)行而不進(jìn)行任何洗滌。
CD80-C215Fab和三體融合蛋白以劑量依賴型方式與CHO細(xì)胞上表達(dá)的CD28結(jié)合。正如所預(yù)期的，用對(duì)照融合蛋白C215Fab-SEA未觀察到染色。
CD215陽性細(xì)胞融合蛋白對(duì)C215抗原的結(jié)合針對(duì)Colo205細(xì)胞來評(píng)估。Colo205細(xì)胞用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色后與PE標(biāo)記的抗小鼠κ鏈mAb一起培養(yǎng)。染色在4℃進(jìn)行并在每個(gè)染色步驟之間進(jìn)行三次洗滌。
結(jié)果(圖1-2)CD80-C215Fab和CD80-C215Fab-SEAm57均以劑量依賴型方式結(jié)合C215抗原陽性的Colo205細(xì)胞。此結(jié)合比C215Fab-SEA低50-100倍。這表明CD80在融合蛋白N-末端部分的導(dǎo)入可能干擾C215Fab部分與C215抗原的結(jié)合。二體融合超級(jí)抗原活化的T細(xì)胞的共刺激。
為了測(cè)定融合蛋白的生物學(xué)活性，對(duì)它們進(jìn)行超級(jí)抗原活化的T細(xì)胞的共刺激測(cè)試。
增殖將T細(xì)胞與Colo205細(xì)胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培養(yǎng)4天后計(jì)數(shù)摻入的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷以測(cè)定增殖。無任何CD80-C215Fab時(shí)得到的活性是20039cpm+/-1750。
IL-2的制備將T細(xì)胞與Colo205細(xì)胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培養(yǎng)4天后收集上清液并測(cè)定IL-2量。無任何CD80-C215Fab時(shí)得到的IL-2量是2849pg/ml。
結(jié)果(圖3-4)正如在增殖和IL-2合成時(shí)觀察到的，CD80-C215Fab以劑量依賴型方式共刺激C215Fab-SEA誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化。三體融合超級(jí)抗原活化的T細(xì)胞的共刺激。
為了測(cè)試三體融合蛋白的生物學(xué)活性，將純化的T細(xì)胞與Colo205細(xì)胞上呈遞的C215Fab-SEAm23(m23是用于三體融合蛋白影響MHC II類結(jié)合的相同突變體，即Phe47Ala/Asp227Ala)或CD80-C215Fab-SEAm57一起培養(yǎng)。增殖4天后計(jì)數(shù)摻入的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷。IL-2的制備4天后收集上清液并測(cè)定IL-2量。
結(jié)果(圖5-6)當(dāng)呈遞于Colo205細(xì)胞上時(shí)，三體融合蛋白誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和IL-2合成。用C215Fab-SEAm23時(shí)未見到這樣的活性，表明CD80共刺激對(duì)活化的重要性。由于三體融合蛋白更低的結(jié)合親和性(比C215Fab-SEA低50-100倍，參見FACS數(shù)據(jù))，實(shí)際與細(xì)胞結(jié)合的C215Fab-SEAm23的量很可能實(shí)際上比三體融合蛋白更高。實(shí)施例2靶向的IL-2增強(qiáng)和延長了FabSEA對(duì)T細(xì)胞活化和腫瘤治療中的作用材料與方法IL-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用從已用超級(jí)抗原SEA刺激24小時(shí)的人外周血單核細(xì)胞(PMB)分離的mRNA通過RT-PCR克隆IL-2 cDNA。用Dynal，Oslo的mRNA Direct試劑盒根據(jù)制造商說明從5×106個(gè)細(xì)胞分離mRNA。通過加熱到95℃洗脫退火到oligo(dT)26-包被的磁珠上的mRNA。隨后利用RT和Taq聚合酶的DNA聚合酶活性通過RT-PCR得到PCR產(chǎn)物。將洗脫的mRNA的1/10與PCR引物IL2-1和IL2-2混合并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)(30個(gè)循環(huán))。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠中切下此條帶并用Prep-a-gene試劑盒(Bio-Rad)加以純化。用EcoRI和BamHI酶切后將片段克隆入EcoRI/BamHI酶切的pBluescript KS II中。對(duì)插入進(jìn)行測(cè)序并且證實(shí)與以前報(bào)道的IL-2 cDNA(Taniguchi等1983)一致。然而，作為PCR反應(yīng)，DNA片段編碼Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg-(SEQ ID NO23)，“Gly-Pro-Q-接頭”已加到編碼成熟人IL-2片段的5’。將Q-hIL2作為RsrII-NheI片段克隆入來自保藏中心的質(zhì)粒(用RsrII-XbaI切割)中。得到的質(zhì)粒pMS306介導(dǎo)C215FabSEA-Q-hIL2分泌到大腸桿菌的外周質(zhì)中。按如下進(jìn)一步優(yōu)化這些部分間的接頭。用定點(diǎn)誘變將編碼Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO19)的接頭編碼區(qū)(替代原來的Gly-Gly-Pro)導(dǎo)入超級(jí)抗原與Fab部分的編碼區(qū)之間。相似地，用接頭Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ ID NO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ IDNO22)。替代IL-2與Fab部分之間原來的Q-接頭。對(duì)于二體融合蛋白組合，也分別比較IL-2與重鏈或輕鏈融合的構(gòu)建體。
引物IL2-15′-GCG GAT CCC GGT CCG CGT CAG GCT AAC GAA CTG CCAGGA GCT CCG TCT CAG GAA GAG CGT GCA CCT AC TTCAAG TTC TAC AAA G-3′(SEQ ID NO 17)IL2-25′-CCG AAT TCG CTA GCT TAT CAA GTT AGT GTT GAG ATGAT-3′(SEQ ID NO 18)融合蛋白在發(fā)酵罐中的表達(dá)用帶有卡那霉素抗性基因和lacUV5啟動(dòng)子的質(zhì)粒在大腸桿菌菌株UL 635(xyl-7，ara-14，T4R，deltaompT)中表達(dá)融合蛋白。將來自冷凍原種的細(xì)菌于25℃在搖瓶中培養(yǎng)約21小時(shí)，搖瓶中含有(g/l)(NH4)2SO4，2.5；KH2PO4，4.45；K2HPO4，11.85；檸檬酸鈉，0.5；MgSO4·7H2O，1；葡萄糖一水化物，11；0.11mM卡那霉素和1ml/l微量元素溶液(Forsberg等，1989)，但是不含Na2MoO4·2H2O。將細(xì)胞培養(yǎng)至OD6001-2并且使用450ml培養(yǎng)物培養(yǎng)基接種發(fā)酵罐(Chemap，瑞士)至終體積5升。發(fā)酵罐培養(yǎng)基含有(g/l)(NH4)2SO4，2.5；KH2PO4，9；K2NPO4，6；檸檬酸鈉，0.5；葡萄糖一水化物，22；MgSO4·7H2O，1；0.11mM卡那霉素；1ml adecanol(Asahi Denka Kogyo K.K，日本)和1ml/l微量元素溶液。通過用25％氨水滴定將pH保持在7.0，溫度為25℃并且以5l/分鐘用大氣通氣。通過在間歇期將攪拌從300增加到1000rpm并且在進(jìn)料間歇期調(diào)節(jié)60％(w/v)葡萄糖進(jìn)料而將溶解的O2分壓控制在30％。通過加入0.1mM異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷IPTG在OD60050時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物形成。發(fā)酵后，通過在4℃以8000xg離心去除細(xì)胞。澄清的培養(yǎng)基或者直接分析和純化或者于-20℃保存。
融合蛋白的純化通過在30分鐘內(nèi)用0.19％聚乙烯亞胺和0.2M NaCl沉淀來去除澄清培養(yǎng)基中存在的DNA(Atkinson和Jack，1973)。如上所述離心后，收集上清液并且將NaCl濃度調(diào)節(jié)到0.5M。將此溶液上樣到以含有0.05％ Tween 80的10mM磷酸鈉、150m NaCl(PBST’pH7.4)平衡的蛋白G Sepharose柱(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞典)上。然后用5倍柱體積的PBST洗柱并用pH3.2的0.1M乙酸、0.02％ Tween 80洗脫結(jié)合的蛋白。用pH8.0的1M Tris-HCl將樣品pH調(diào)節(jié)至5.0并上樣到以50mM乙酸胺、0.02％ Tween 80平衡的SP Sepharose HP柱(Pharmacia Biotech)上。然后用2倍柱體積的平衡緩沖液洗柱并用超過10倍柱體積的50到500mM的乙酸胺梯度洗脫融合蛋白。對(duì)于C215Fab-IL2融合蛋白，使用6.0的pH而對(duì)于C215Fab-SEA-IL2三體融合蛋白，在分離過程中pH為5.7。將融合蛋白通過0.22um濾膜過濾并保存于-70℃。如果稀釋度太大，就用Centricon(Amicon)根據(jù)制造商說明將洗脫物濃縮至0.5-1mg/ml。
細(xì)胞毒性分析按照前述(Dohlstein等1990)進(jìn)行MHC II類依賴型和非依賴型細(xì)胞毒性分析。簡(jiǎn)言之，對(duì)于MHC II類依賴型分析，將51Cr-標(biāo)記的Raji細(xì)胞(每孔200μl終體積內(nèi)2500個(gè)細(xì)胞)與通過在低水平重組hIL-2存在的情況下培養(yǎng)人PBM而產(chǎn)生的SEA依賴型效應(yīng)細(xì)胞系混合。效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞比例是30∶1。對(duì)于MHC II類非依賴型分析，將51Cr-標(biāo)記的C215+colo細(xì)胞(2500)與SEA依賴型效應(yīng)細(xì)胞以45∶1的E∶T比例一起培養(yǎng)。培養(yǎng)4小時(shí)后通過閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定釋放到培養(yǎng)基中的51Cr。
對(duì)純化人T細(xì)胞的體外共刺激分析基本上按照Lando等(1993)所述純化天然的人T細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，通過Ficoll梯度離心，然后通過明膠柱分離，并且最后通過在含有HNK1和HLA-DR mAB的培養(yǎng)皿上淘選的負(fù)選擇從人血PBM純化天然的人T細(xì)胞?；旧习凑誏ando等(1996)所述的用天然的人T細(xì)胞進(jìn)行增殖分析。簡(jiǎn)言之，將天然的人T細(xì)胞(每孔100,000個(gè)細(xì)胞)在含有添加劑的200μl總體積RPMI-1640中與照射的CHO轉(zhuǎn)染子(每孔10,000個(gè)細(xì)胞)混合(Lando等1993)。對(duì)于含有IL-2的融合蛋白的實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞在1nM所示物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)7天。在實(shí)驗(yàn)的最后一天，用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記以測(cè)定向分裂細(xì)胞DNA中的摻入。
B16-C25腫瘤的治療基本上按照前述的(Dohlsten等1994；Hansson等1997)進(jìn)行治療。在0天將75000-150000個(gè)同系B16-F10黑素瘤細(xì)胞靜脈注射入C57B1/6小鼠尾靜脈內(nèi)。這些B16細(xì)胞表達(dá)由C215 mAb識(shí)別的人GA-733抗原。在21天時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，此時(shí)取出肺并且計(jì)數(shù)擴(kuò)散的肺部腫瘤。
免疫組織化學(xué)基本上按照前述的(Dohlsten等1995)在帶有18天B16-C25腫瘤的動(dòng)物肺上進(jìn)行。最后一次注射后4小時(shí)提取樣品。人工測(cè)定染色的區(qū)域。
免疫藥理學(xué)基本上按照前述的(Rosendahl等1996)進(jìn)行。最后一次注射后48小時(shí)從已每日一次接受1或3次注射的C57 B1/6小鼠取出脾臟并在前述的標(biāo)準(zhǔn)51Cr分析中用Raji細(xì)胞作為靶細(xì)胞測(cè)定SEA依賴型細(xì)胞毒性。E∶T比例為100∶1。結(jié)果和討論含有IL2的融合蛋白的合成和純化編碼C215FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白的大腸桿菌表達(dá)載體得到構(gòu)建。此載體編碼位于從LacUV5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的雙順反子mRNA上的三體融合蛋白的兩個(gè)亞單位。這兩個(gè)亞單位中的每一個(gè)前面是指導(dǎo)其轉(zhuǎn)送到大腸桿菌周質(zhì)間隙的信號(hào)肽。第一個(gè)亞單位是C215Fab的VH，其后是Gly-Gly-Pro-接頭(VH-CHl-Gly-Gly-Pro-SEA)。另一個(gè)亞單位是C215Fab的VK，其后是通過Gly-Pro-Q-接頭與人IL2連接的C242Fab的CK(Vk-Ck-Gly-Pro-Q-hIL2)。Gly-Pro-Q-接頭序列(SEQ ID NO23)是OmpR大腸桿菌蛋白(Wotton等1989)中發(fā)現(xiàn)的天然接頭的略微修飾的版本。更完整的信息參見材料和方法。也制備了C215Fab-Q-hIL2融合蛋白。除了去除了蛋白的Gly-Gly-Pro-SEA部分之外，它與C215FabSEA-Q-hIL2相同。因此表達(dá)載體中相應(yīng)的DNA序列缺失。用標(biāo)準(zhǔn)方法通過PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變產(chǎn)生C215FabSEA-Q-hIL2的突變衍生物以合成大量蛋白如C215FabSEAD227A-Q-hIL2和C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A。在三體融合蛋白的后一變體中，亞單位間的半胱氨酸用兩個(gè)絲氨酸殘基替換。
將編碼含有IL2的蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌生產(chǎn)菌株UL635中，并且然后進(jìn)行發(fā)酵。用蛋白G親和層析從培養(yǎng)基中純化融合蛋白。用離子交換層析去除融合蛋白的降解變體。如通過SDS-PAGE(材料和方法)測(cè)定的，獲得的產(chǎn)物是至少90％全長的融合蛋白。用融合蛋白的最佳設(shè)計(jì)，在培養(yǎng)基中獲高達(dá)130mg/ml的融合蛋白并且一般從1升培養(yǎng)基中獲得70mg三體融合蛋白。
含有IL2的Fab融合蛋白的功能鑒定含有IL2的融合蛋白如C215FabSEA-Q-hIL2和C215Fab-Q-hIL2融合蛋白誘導(dǎo)IL-2依賴型鼠細(xì)胞系CTLL-2增殖的能力在摩爾基礎(chǔ)上基本上與重組人IL2類似(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，發(fā)現(xiàn)C215FabSEA-Q-hIL2和C215FabSEA的抗原結(jié)合能力和SEA活性在眾多分析中是難以區(qū)分的，表明將IL2導(dǎo)入分子沒有不利影響。這些分析包括在4小時(shí)51Cr釋放分析中SEA反應(yīng)性T細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞系誘導(dǎo)MHC II類非依賴型殺死C215+人結(jié)腸癌細(xì)胞系colo205的能力。同樣SEA反應(yīng)性效應(yīng)T細(xì)胞的MHC II類依賴型殺死MHC II類+Raji(大鼠淋巴瘤)細(xì)胞以相似效率進(jìn)行(數(shù)據(jù)未顯示)。通過FSCS分析到更直接的未損傷C215抗原和MHC II類結(jié)合的證據(jù)。發(fā)現(xiàn)C215FabSEA和C215FabSEA-Q-hIL2與Raji細(xì)胞結(jié)合的劑量依賴型在摩爾基礎(chǔ)上相似(數(shù)據(jù)未顯示)。同樣，發(fā)現(xiàn)C215FabSEA-Q-hIL2和C215Fab-Q-hIL2與colo205細(xì)胞的劑量依賴型結(jié)合與對(duì)C215FabSEA觀察到的相似(數(shù)據(jù)未顯示)，表明在含有IL2的融合蛋白中抗原結(jié)合沒有受到損傷。
FabSEA誘導(dǎo)的IL2依賴型增殖靜止人T細(xì)胞需要信號(hào)1和信號(hào)2激發(fā)最佳T細(xì)胞增殖和活化(Schwartz，1990)。如果呈遞到細(xì)胞上，超級(jí)抗原可傳遞信號(hào)1。預(yù)期作為B7/CD28信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要下游效應(yīng)器的IL-2產(chǎn)生信號(hào)2。
在此我們使用從人血純化的靜止T細(xì)胞表明C215FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白或C215FabSEA聯(lián)合C215Fab-Q-hIL2或重組人IL-2的確在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖(圖7)。
將靜止人T細(xì)胞在IL2(以C215Fab-Q-hIL2、C215FabSEA-Q-hIL2或重組人IL-2的形式)存在的情況下與靶向的SEA(C215FabSEA或C215FabSEA-Q-hIL2)一起培養(yǎng)。將SEA呈遞于用C251抗原(通過Fab部分)、結(jié)合SEA的MHC II類/Dr轉(zhuǎn)染的照射的CHO細(xì)胞上。未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用作對(duì)照。T細(xì)胞與CH0轉(zhuǎn)染子和目的物質(zhì)一起培養(yǎng)7天后通過3H-胸腺嘧啶脫氧核苷向DNA中的摻入測(cè)定增殖。
當(dāng)呈遞于用Fab所針對(duì)的人C251抗原(CHO-C215)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上時(shí)，C215FabSEA-Q-hIL2誘導(dǎo)人T細(xì)胞的增殖(圖7)。同樣，當(dāng)將蛋白呈遞于CHO-Dr(人MHC II類)上時(shí)也誘導(dǎo)增殖，而在未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(CHO)存在時(shí)或無CHO細(xì)胞(R10)存在時(shí)未觀察到增殖。當(dāng)呈遞于CHO細(xì)胞上時(shí)C215FabSEA或C215Fab-Q-hIL2本身不誘導(dǎo)任何明顯的增殖，表明SEA和IL2二者對(duì)增殖的誘導(dǎo)的確是必須的。因?yàn)镃215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2或C215FabSEA和重組人IL2的組合誘導(dǎo)與C215FabSEA-Q-hIL2誘導(dǎo)的數(shù)量上相似的效應(yīng)，這一點(diǎn)得到證實(shí)。這也表明在此分析中IL2是必須的，但是與SEA不同，它不需要不是細(xì)胞結(jié)合的。
C215FabSEA-Q-hIL2以及C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的組合導(dǎo)致體內(nèi)增強(qiáng)和持續(xù)的T細(xì)胞活化和改善的腫瘤浸潤正如通過誘導(dǎo)SEA依賴型殺死靶細(xì)胞的能力測(cè)定的，C215Fab-Q-hIL2+C215FabSEA和C215FabSEA-Q-hIL2均是比C215FabSEA更有力的T細(xì)胞活化誘導(dǎo)劑。簡(jiǎn)言之，小鼠每日施用所示蛋白，共接受1或3次注射。最后一次注射2天后，從處理的小鼠取出脾并在標(biāo)準(zhǔn)4小時(shí)51Cr釋放分析中測(cè)定對(duì)SEA包被的Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
C215FabSEA-Q-hIL2和C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2不僅誘導(dǎo)增強(qiáng)的而且誘導(dǎo)持續(xù)的T細(xì)胞活化。在第四次注射C215FabSEA后徹底浸入的血清細(xì)胞因子如INFγ的水平即使在第四次注射C215FabSEA-Q-hIL2后仍維持在很高水平(數(shù)據(jù)未顯示)。一般地，INFγ和INFα的水平比C215FabSEA的情況高得多(高達(dá)10倍)。
用C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2聯(lián)合處理對(duì)確定的B16-C215腫瘤的改進(jìn)治療在鼠B16黑素瘤模型中研究IL2增強(qiáng)FabSag腫瘤治療的效應(yīng)(圖9)。在所示實(shí)施例中，在0天用150,000個(gè)轉(zhuǎn)染了C215 mAb所針對(duì)的人腫瘤抗原GA-733的B16細(xì)胞(下面的B16-C215)接種8-12周齡的C57 B1/6雌性小鼠。所示物質(zhì)在5、6和7天注射。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)相當(dāng)于7只動(dòng)物。在第21天殺死動(dòng)物，并且計(jì)數(shù)有黑色素形成的B16腫瘤建群的肺。與未處理的對(duì)照相比，在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯示C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的組合比C215FabSEA誘導(dǎo)更好的治療(圖9)。在所示的實(shí)驗(yàn)中，C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的組合治療比C215FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白給出更好的治療效果。
隨后的免疫組織化學(xué)研究揭示只有C215FabSEA或C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的組合得到相似數(shù)目的B16-C215腫瘤浸潤的CD4和CD8T細(xì)胞。然而，有趣的是CD25(IL2Ra)陽性細(xì)胞的數(shù)目(T細(xì)胞活化的良好標(biāo)記)在第三和第四次注射C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2之間顯著增加(圖10)。相反，在C215FabSEA情況下則減少，表明開始無反應(yīng)力。因此在組合治療時(shí)浸潤T細(xì)胞的質(zhì)量看來比只有C215FabSEA時(shí)更高，這可能有助于解釋改善的治療效應(yīng)。同樣，第四次注射FabSEA后T細(xì)胞活化之后產(chǎn)生的血清細(xì)胞因子如干擾素γ顯著下降(圖11)。然而，用FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白，即使在第四次注射后干擾素仍維持在高水平。此觀察結(jié)果提供了另外的提示，即在構(gòu)建體中包含IL2可阻礙FabSEA誘導(dǎo)的T細(xì)胞無反應(yīng)狀態(tài)。
用C215FabSEAD227A-Q-hIL2對(duì)B16-C215腫瘤的改進(jìn)治療超級(jí)抗原在人類中比小鼠中的毒性更大，部分因?yàn)樵谌祟愔袑?duì)MHC II類的親和性高得多(Hansson等1997)。因此預(yù)期FabSEA蛋白的系統(tǒng)毒性是用于人類治療的主要限制因素。與系統(tǒng)免疫活化(SEA-MHC II類依賴型)相對(duì)增加腫瘤中局部活化(Fab依賴型)的一種方法將是增加SEA對(duì)MHC II類的親和性。根據(jù)SEA的晶體結(jié)構(gòu)，我們制備了對(duì)MHC II類的親和性減小100倍的C215FabSEA的突變體C215FabSEAD227A。與野生型C215Fab-SEA不同，它不具有結(jié)合MHC II類分子的能力，這種能力據(jù)信是SEA-介導(dǎo)系統(tǒng)毒性的主要原因(Hansson等1997)。
在治療Vb3 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠中的第一天B16-C215腫瘤時(shí)，有效治療與毒性之間的窗口對(duì)于C215FabSEAD227A突變體要比C215FabSEA寬至少50倍(Hansson等1997)。根據(jù)此發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)法揭示在導(dǎo)致相似治療的兩種蛋白劑量時(shí)，觀察到腫瘤中相似的免疫活化，而在含有C215FabSEAD227A的脾臟中觀察到小得多的系統(tǒng)免疫活化(Hansson等1997)。此外，在兔子中的藥物動(dòng)力學(xué)研究中揭示與C215FabSEA相比，C215FabSEAD227A向大多數(shù)MHC II類+細(xì)胞定位的脾和其它淋巴器官的靶向顯著下降(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了臨床使用，預(yù)期Fab-SEA-IL2三體融合蛋白含有突變的超級(jí)抗原。因此我們制備了C215FabSEAD227A-Q-hIL2三體融合蛋白。制備的蛋白能誘導(dǎo)靜止人類T細(xì)胞的增殖(數(shù)據(jù)未顯示)，并且在小鼠中誘導(dǎo)高達(dá)6次注射的持續(xù)的SEA依賴型CTL活性(圖12)。相反，用C215FabSEAD227A(＜10％-數(shù)據(jù)未顯示)和C215Fab-Q-hIL2(＜15％-數(shù)據(jù)未顯示)觀察到背景CTL活性。用每日施用的此蛋白的8次注射在正常C57B/6小鼠中對(duì)確定的(第三天)B16-GA733腫瘤的治療得到與最佳劑量C215FabSEA同樣好的治療(圖13)。在此系統(tǒng)中，設(shè)計(jì)為人而不是小鼠中最佳活性的C215FabSEAD227A的確僅具有較小的效應(yīng)(圖13)。然而，在最高劑量時(shí)，發(fā)現(xiàn)C215FabSED227A-Q-hIL2的部分毒性。相反，多個(gè)治療實(shí)驗(yàn)表明與只有C215FabSEAD227A相比，C215FabSEAD227A和C215Fab-Q-hIL2的組合(8次注射)的確也導(dǎo)致Vb3 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠中第3天B16-GA733腫瘤治療的實(shí)質(zhì)改善(數(shù)據(jù)未顯示)。在Vb3 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠中，＞90％的T細(xì)胞與SEA反應(yīng)，與正常小鼠中的10-20％不同。有趣的是，反復(fù)注射(高達(dá)8次)C215FabSEAD227A-Q-hIL2(以20μg/kg反復(fù)注射后0/4只兔子死亡)的兔中沒有表現(xiàn)比無IL-2的C215FabSEAD227A(以20μg/kg反復(fù)注射后0/4只兔子死亡；以20μg/kg時(shí)4/4死亡)更高的毒性以及比C215FabSEA(以1μg/kg反復(fù)注射后1/4只兔子死亡)低得多的毒性。同時(shí)，只有在用C215FabSEAD227A-Q-hIL2才觀察到而用C215FabSEAD227A或C215FabSEA沒有觀察到持續(xù)的免疫活化(淋巴細(xì)胞反彈效應(yīng))，表明IL-2的包含的確有助于阻礙FabSEA誘導(dǎo)的T細(xì)胞無反應(yīng)狀態(tài)(數(shù)據(jù)未顯示)。
用IL-2突變的C215FabSEAD227A-Q-hIL2蛋白治療B16-C215腫瘤含有IL2的三體融合蛋白的更高毒性和以C215FabSEA-Q-hIL2為例更低的治療效應(yīng)可能部分是由于SEA活性“反復(fù)靶向”到淋巴樣組織。這種反復(fù)靶向效應(yīng)是由于IL2對(duì)其受體的高親和性(Kd＝10pM)，這主要見于脾臟和其它淋巴樣組織中的T細(xì)胞。為了說明此問題，我們已制備了C215FabSEAD227A-Q-hIL2的衍生物，其中IL-2部分經(jīng)突變以降低對(duì)IL2R+細(xì)胞的親和性并因而減少系統(tǒng)活化。原則上使用相同方法增大C215FabSEAD227A蛋白的治療窗口。
IL-2與其高親和性受體之間的相互作用已得到非常充分的研究。受體由三個(gè)亞單位a，b和g組成。B和g的結(jié)合對(duì)生物學(xué)活性是必須的，而亞單位a對(duì)最佳結(jié)合是必須的。我們的策略是按照需要通過去除亞單位a的結(jié)合，并且隨后降低但不排除亞單位b和g的結(jié)合來降低IL-2與其高親和性受體之間的親和性。
設(shè)計(jì)C215FabSEAD227A-Q-hIL2的三個(gè)這樣的突變體以去除IL2Ra結(jié)合(F42A，F(xiàn)42K)并且另外影響IL2Rb結(jié)合(F42A/D20S)。這些蛋白在誘導(dǎo)IL-2依賴型鼠細(xì)胞系CTLL-2的增殖時(shí)分別具有100(F42A)、1000(F42K)和3000倍(F42A/D20S)降低的活性。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以更詳細(xì)地測(cè)定這些蛋白，特別是關(guān)于結(jié)合活化人T細(xì)胞和IL2受體的親和性和比例的特性。起初的治療實(shí)驗(yàn)表明這樣的策略是有希望的(圖14，圖15)。在所示的實(shí)施例中，對(duì)攜帶3天B16-GA733腫瘤的Vb3 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行8次注射(其中SEA活化＞90％的T細(xì)胞)。雖然在最高劑量仍觀察到一些毒性，但是使用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A或C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42K(8次注射)而不是C215FabSEAD227A-Q-hIL2(6次注射)時(shí)毒性變得更晚，并且在最高劑量的治療與PBS處理的對(duì)照相比導(dǎo)致多于90％的腫瘤減小(圖14)。目前我們正通過將其它突變導(dǎo)入SEA和IL2部分中來探索此高度有前途的方法以進(jìn)一步改進(jìn)對(duì)毒性窗口的治療。
此外，制備在IL-2部分中包含Thr51Pro突變的C215FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白(Chang等1996)的工作正在進(jìn)行中。此突變可用于阻斷IL2R介導(dǎo)的融合蛋白的內(nèi)化而不降低IL-2的生物學(xué)活性。這很可能是重要的，因?yàn)樗鼘p少通過此途徑對(duì)融合蛋白的去除，并因此增加藥物的局部濃度和效力。Thr51Pro突變的蛋白可在SEA和IL-2中含有進(jìn)一步的突變以分別降低對(duì)MHC II類和IL2受體的親和性。實(shí)施例3 證實(shí)(Sag，IM)-綴合物效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。靶細(xì)胞IM-受體陽性或MHCII類陽性細(xì)胞。
Sag-IM分子可與表達(dá)MHC II類的細(xì)胞結(jié)合，從而此促進(jìn)SDCC。選擇性地，可以靶向表達(dá)IM受體的細(xì)胞。因此有可能Sag-IM分子可用于誘導(dǎo)殺死不利的表達(dá)IM受體的細(xì)胞。
在效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞均不表達(dá)C215Fab所識(shí)別的抗原時(shí)，C215FabSEA-hIL2三體融合蛋白可看作是Sag-IM分子。效應(yīng)細(xì)胞將是正確Vβ亞型的T細(xì)胞。靶細(xì)胞可能例如是表達(dá)IL2受體如那些存在于某些白血病或淋巴瘤細(xì)胞上的受體的異常造血細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)A概念的體外證據(jù)效應(yīng)T細(xì)胞(反復(fù)以SEA刺激的人T細(xì)胞)和靶細(xì)胞(例如人“Raji”B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞)將與經(jīng)突變而降低與MHC I類結(jié)合的C215FabSEA-hIL2三體融合蛋白一起培養(yǎng)。這是SDCC分析的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置(效應(yīng)T細(xì)胞，Raji細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)物質(zhì))。我們實(shí)際上已發(fā)現(xiàn)具有嚴(yán)重下降的對(duì)MHC II類的親和性的C215FabSEAD227A-Q-hIL2蛋白在殺死Raji細(xì)胞方面具有比C215FabSEAD227A高約10倍的效力。對(duì)于增加的效力的明顯解釋是三體融合蛋白呈遞到Raji細(xì)胞上表達(dá)的IL2受體上。
實(shí)驗(yàn)B概念的體內(nèi)證據(jù)鼠淋巴瘤模型(如C57 B1/6小鼠中的RBL-5淋巴瘤)已很好地得到建立(Hoglund等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志168，1469-1474)。在這樣的模型中用Sag-IM蛋白靶向IL-2受體或其它IM-R可提供體內(nèi)靶向IM-受體陽性細(xì)胞的概念的證據(jù)。
Sag-IM靶向IM-R陽性細(xì)胞由于效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞均頻繁表達(dá)IM受體的事實(shí)而變得復(fù)雜化。不過，在有些情況下這種治療方式可能有效。諸如靶細(xì)胞上IM-R表達(dá)的密度、靶細(xì)胞的數(shù)目和位置等的因素很可能起作用。同時(shí)應(yīng)該強(qiáng)調(diào)例如IL2Rα在T細(xì)胞活化時(shí)僅受到正調(diào)節(jié)-因此在IM-R在靶細(xì)胞上而不是在效應(yīng)細(xì)胞上以高豐度表達(dá)時(shí)可能是暫時(shí)窗口。
可相似地使用SAG-IM融合蛋白，其中Sag代表經(jīng)突變而具有降低的對(duì)MHC II類的親和性的野生型超級(jí)抗原。參考文獻(xiàn)*-標(biāo)記的文章可能發(fā)現(xiàn)比其它文章與免疫調(diào)節(jié)劑更相關(guān)。
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序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱Parmacia&Upjohn AB(B)街道Lindhagensgatan(C)城市Stockholm(E)國家Sweden(F)郵政編號(hào)(Zip)S-11287(G)電話+46 8 695 80 00(ii)發(fā)明名稱靶細(xì)胞的定向細(xì)胞溶解、引起細(xì)胞溶解的試劑和組合物以及能用于制備這些試劑的化合物(iii)序列數(shù)23(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO1ATATAAGCTT CCACCATGGG CCACACACGG AGG33(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO2ACGCAGATCT TTAGTTATCA GGAAAATGCT CTTGC 35(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO3TCAAAGCTTC TCGAGCGCGC TGTTATCAGG AAAATGCTC 39(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸
(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO4CGCGCGTCAG GCTAACGAAC TGCCAGGCGC CCCGTCACAG AGACGA 46(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度60個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO5AGCTTCGTCT CACGCGCGTT CTTCCTGTGA CGGGGCGCCT GGCAGTTCGT TAGCCTGACG 60(2)關(guān)于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO6TGGTACACCA CAGAAGACAG CTTGTATGTA TG32(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO7CATACATACA AGCTGTCTTC TGTGGTGTAC CA 32(2)關(guān)于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO8CGAATAAGAA AGACGTCACT GTTCAGGAGT TGG 33(2)關(guān)于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO9CCAACTCCTG AACAGTGACG TCTTTCTTAT TCG 33(2)關(guān)于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO10GAGATAATAA AGTTATTAAC TCAGAAAACA TG 32(2)關(guān)于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO11CATGTTTTCT GAGTTAATAA CTTTATTATC TC 32(2)關(guān)于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸
(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO12CGCGGATCCG CGCGGCACCA GGCCGCTGTT ATCCGGAAAA TGCTCTTGC 49(2)關(guān)于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度77個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO13CCGGATAACA GCGCGCGTCA GGCTAACGAA CTCCCAGGCG CCCCGTCACA GGAAGAACGC 60CCGCAGGTCC AACTGCA 77(2)關(guān)于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度69個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO14GTTGGACCTG CGGGCGTTCT TCCTGTGACG GGGCGCCTGG CAGTTCGTTA GCCTGACGCG 60CGCTGTTAT 69(2)關(guān)于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Ser Ala Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg Ala(2)關(guān)于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Ser Ala Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg Pro(2)關(guān)于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度84個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO17GCGGATCCCG GTCCGCGTCA GGCTAACGAA CTGCCAGGAG CTCCGTCTCA GGAAGAGCGT 60GCACCTACTT CAAGTTCTAC AAAG 84(2)關(guān)于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO18CCGAATTCGC TAGCTTATCA AGTTAGTGTT GAGATGAT 38(2)關(guān)于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO19Pro Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Pro1 5 10(2)關(guān)于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Gly Pro Arg Gln Ser Asn Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg(2)關(guān)于SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO21Gly Pro Arg Gln Ala Lys Thr Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Thr Thr1 5 10 15Arg(2)關(guān)于SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Gly Pro Thr Glu Ala Asp Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Glu Glu Glu1 5 10 15Thr(2)關(guān)于SEQ ID NO23的信息(i)序列特征
(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Gly Pro Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg
權(quán)利要求
1.一種通過在免疫調(diào)節(jié)劑存在的情況下使兩種類型的細(xì)胞與超級(jí)抗原(SAG)接觸從而在T細(xì)胞存在的情況下使靶細(xì)胞失活的方法，其特征在于超級(jí)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑中至少一種以“游離”超級(jí)抗原(Sag)和將綴合物靶向靶細(xì)胞的部分之間的綴合物形式存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于a.超級(jí)抗原(SAG)和免疫調(diào)節(jié)劑以包含超級(jí)抗原(Sag)、針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T)和免疫調(diào)節(jié)劑(IM)的三體綴合物形式(T，IM，Sag-綴合物)使用；b.超級(jí)抗原(SAG)以超級(jí)抗原(Sag)和針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T)之間的二體綴合物結(jié)合免疫調(diào)節(jié)劑(IM)和針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T’)之間的二體綴合物的形式(T，Sag-綴合物+T’，IM-綴合物)使用；c.超級(jí)抗原(SAG)以超級(jí)抗原(Sag)和針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分(T)之間的二體綴合物形式使用并且免疫調(diào)節(jié)劑(IM)以游離形式，即未與針對(duì)靶細(xì)胞的靶向部分結(jié)合的形式(T，Sag-綴合物+IM)使用；d.超級(jí)抗原(SAG)以自由形式(Sag)使用并且免疫調(diào)節(jié)劑以綴合物形式，即免疫調(diào)節(jié)劑(IM)與超級(jí)抗原(Sag)之間的二體綴合物形式(Sag+T，IM-綴合物)使用；以及e.超級(jí)抗原(SAG)與免疫調(diào)節(jié)劑以超級(jí)抗原(Sag)與免疫調(diào)節(jié)劑(IM)之間的二體綴合物形式(Sag，IM-綴合物)使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于使用選擇性的a。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于使用選擇性的b，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)劑綴合物中的靶向部分可能與超級(jí)抗原綴合物中的靶向部分不同的可能性。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于使用選擇性的c。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于使用選擇性的e并且其中IM和T是常見的，例如細(xì)胞因子受體、例如靶向帶有受體的綴合物細(xì)胞的IL-2。
7.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于在患有與靶細(xì)胞有關(guān)的疾病如癌癥的個(gè)體中體內(nèi)使細(xì)胞失活。
8.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于靶向部分是抗體，優(yōu)選地其抗原結(jié)合片段如Fab或Fab2-片段或單鏈抗體。
9.權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于超級(jí)抗原Sag例如通過突變而修飾成a.與相應(yīng)的野生型超級(jí)抗原相比，具有降低的與MHC II類抗原結(jié)合的能力；b.與相應(yīng)的野生型超級(jí)抗原相比，在人血清中具有降低的血清反應(yīng)性；c.與相應(yīng)的野生型超級(jí)抗原相比，在人類中具有降低的免疫原性；d.是兩種或多種游離超級(jí)抗原之間的嵌合體。
10.權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于超級(jí)抗原例如通過在編碼對(duì)于MHC II類親和性重要的氨基酸殘基的密碼子中的突變而修飾成具有降低的MHC II類親和性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于免疫調(diào)節(jié)劑選自a.細(xì)胞因子如IL-2，或b.趨化因子，或c.結(jié)合淋巴細(xì)胞表面的受體和配體的胞外部分，例如B7分子的胞外部分如CD80和CD86。
12.權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于免疫調(diào)節(jié)劑選自能夠例如通過阻礙超級(jí)抗原活化的T-細(xì)胞轉(zhuǎn)變成無反應(yīng)狀態(tài)而在體內(nèi)增強(qiáng)超級(jí)抗原效應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑。
13.權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于免疫調(diào)節(jié)劑是B7配體的胞外部分如CD80和CD86或CD28/B7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游效應(yīng)器如IL-2。
14.權(quán)利要求11-13中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于免疫調(diào)節(jié)劑例如通過突變而修飾成與相應(yīng)的天然形式相比表現(xiàn)對(duì)其淋巴細(xì)胞受體降低的親和性。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于免疫調(diào)節(jié)劑是IL-2或CD80的胞外部分或其已按照權(quán)利要求14修飾的形式。
16.符合下面化學(xué)式的超級(jí)抗原(T)x(Sag)y(IM)z化學(xué)式Ia.T是靶向部分，Sag對(duì)應(yīng)于游離超級(jí)抗原，IM是非超級(jí)抗原的免疫調(diào)節(jié)劑，并且T、Sag和IM通過在一個(gè)和相同綴合物分子內(nèi)可能不同或相同的有機(jī)接頭B連接在一起；b.x，y和z是一般選自0-10的整數(shù)如0-5，并且分別代表T、Sag和IM部分在給定綴合物分子中的數(shù)目，其中y＞0并且同時(shí)x和z中的一個(gè)或二者＞0。
17.權(quán)利要求16的超級(jí)抗原綴合物，其特征在于它是融合蛋白，其中x，y和z均是整數(shù)1-3、優(yōu)選1-2，并且x，y和z之間的典型關(guān)系選自x＝y(tǒng)＝z；x＝y(tǒng)＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
18.權(quán)利要求16的超級(jí)抗原綴合物，其特征在于它是表達(dá)為兩條鏈產(chǎn)物的融合蛋白。
19.權(quán)利要求18的融合蛋白，其中超級(jí)抗原部分SAG融合在靶向部分T’的C-末端上并且免疫調(diào)節(jié)劑IM融合在靶向部分T”的C-末端上。
20.權(quán)利要求19的融合蛋白，其中T’和T”如權(quán)利要求8中所定義，和/或SAG如權(quán)利要求9-10中任意一項(xiàng)所定義和/或IM如權(quán)利要求11-15中任意一項(xiàng)所定義。
21.權(quán)利要求20的融合蛋白，其中SAG是葡萄球菌腸毒素A(SEA)，T’是C215 Fab片段的CHl-結(jié)構(gòu)域，T”是C215抗體的輕鏈而IM是白細(xì)胞介素2。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21所述的融合蛋白，其中SAG通過3-11氨基酸殘基的易彎曲親水性氨基酸接頭B’與T’融合并且IM通過10-20個(gè)氨基酸殘基的親水并且中性或帶正電的氨基酸接頭Q與T”融合。
23.權(quán)利要求22的融合蛋白，其中B’選自Gly-Gly-Pro和Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO19)，并且Q選自Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO23)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ IDNO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ ID NO22)。
24.權(quán)利要求16的超級(jí)抗原綴合物，其特征在于它是融合蛋白，其中靶向部分不存在(x＝0)，并且y和z是整數(shù)1-3、優(yōu)選1-2，并且x和y之間的優(yōu)選關(guān)系選自x＝y(tǒng)；x＝0.5y；0.5x＝y(tǒng)；x＝1/3y和1/3x＝y(tǒng)。
25.權(quán)利要求16的超級(jí)抗原綴合物，其特征在于具有化學(xué)式(Sag)y(IM)z化學(xué)式II其中y＝z＝1。
26.根據(jù)權(quán)利要求16、17、24或25所述的超級(jí)抗原綴合物，其特征在于靶向部分如權(quán)利要求8中所定義，和/或超級(jí)抗原部分如權(quán)利要求9-10中任意一項(xiàng)中所定義和/或免疫調(diào)節(jié)劑部分如權(quán)利要求11-15中任意一項(xiàng)中所定義。
27.一種定向免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于作為靶向部分(T‘’‘)與經(jīng)修飾例如通過突變而對(duì)其淋巴細(xì)胞受體有更低的親和性或在與其淋巴細(xì)胞受體結(jié)合時(shí)有更低的內(nèi)化率(與相應(yīng)的天然形式相比)的非超級(jí)抗原免疫調(diào)節(jié)劑(IM)之間的綴合物，所述綴合物符合化學(xué)式(T)x(Sag)y(IM)z化學(xué)式Va.T是靶向部分，Sag對(duì)應(yīng)于游離超級(jí)抗原，IM是修飾的免疫調(diào)節(jié)劑，Sag和IM通過在一個(gè)和相同綴合物分子內(nèi)可能不同或相同的有機(jī)接頭B連接在一起；b.x，y和z是一般選自0-10的整數(shù)如0-5，并且分別代表T、Sag和IM部分在給定綴合物分子中的數(shù)目，其中z＞0并且同時(shí)x和y中的一個(gè)或二者＞0。
28.權(quán)利要求27的定向免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于它是融合蛋白，其中x，y和z均為整數(shù)1-3、優(yōu)選1-2，并且x，y和z之間的典型關(guān)系為x＝y(tǒng)＝z；x＝y(tǒng)＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
29.權(quán)利要求27的定向免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于它是融合蛋白，其中超級(jí)抗原部分不存在(y＝0)，并且x和z是整數(shù)1-3，并且x和y之間的優(yōu)選關(guān)系選自x＝y(tǒng)；x＝0.5y；0.5x＝y(tǒng)；x＝1/3y和1/3x＝y(tǒng)。
30.權(quán)利要求29的定向免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于它符合化學(xué)式(T)y(IM)z其中y＝z＝1。
31.編碼超級(jí)抗原和不是超級(jí)抗原的免疫調(diào)節(jié)劑如IL-2的DNA分子。
32.權(quán)利要求31的DNA分子，其特征在于它是以雙順反子構(gòu)建體形式，其中a.第一個(gè)順反子含有編碼包含可能經(jīng)如權(quán)利要求9-10中定義的修飾的非綴合超級(jí)抗原(Sag)的多肽I的序列I，并且b.另一個(gè)順反子含有編碼包含可能如權(quán)利要求11-15中定義的得到修飾的免疫調(diào)節(jié)劑的多肽II的序列II。
33.權(quán)利要求32的DNA分子，其特征在于序列I和II中的一個(gè)或兩個(gè)與各個(gè)編碼抗體的至少一部分的序列融合使得多肽I和II可結(jié)合并形成包含游離超級(jí)抗原、免疫調(diào)節(jié)劑和抗體的三體融合蛋白。
34.權(quán)利要求31的DNA分子，其特征在于超級(jí)抗原是非綴合超級(jí)抗原并且編碼超級(jí)抗原的序列可能通過編碼寡肽接頭的序列與編碼免疫調(diào)節(jié)劑的序列融合。
全文摘要
一種通過在免疫調(diào)節(jié)劑存在的情況下使兩種類型的細(xì)胞與超級(jí)抗原(SAG)接觸從而在T細(xì)胞存在的情況下使靶細(xì)胞失活的方法,其特征在于超級(jí)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑中至少一種以“游離”超級(jí)抗原(Sag)和將綴合物靶向靶細(xì)胞的部分之間的綴合物形式存在。超級(jí)抗原符合化學(xué)式(Ⅰ):(T)
文檔編號(hào)A61K38/00GK1275085SQ98808475
公開日2000年11月29日 申請(qǐng)日期1998年7月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月21日
發(fā)明者M·索加爾德, L·阿布拉姆森, P·蘭多, G·福斯伯格, T·卡蘭德, M·多爾斯坦 申請(qǐng)人:法瑪西雅和厄普約翰公司