專利名稱：全身性送遞口服疫苗及治療劑的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用修飾型肉毒桿菌毒素向全身送遞口服疫苗及治療劑的組合物和方法，其中該毒素保留了其穿透腸壁的能力但已沒有毒性。
背景技術：
梭菌神經毒素是目前已知毒性最強的蛋白質毒素。破傷風梭菌產生的神經毒素(破傷風毒素)經由開放性傷口進入人體。但至少在工業(yè)化國家，由于有安全、有效、便宜的疫苗大量提供和廣泛應用，破傷風的毒性作用已不再是主要的有害公眾健康的問題。這種破傷風疫苗主要是將發(fā)酵罐中破傷風梭菌培養(yǎng)物的上清用甲醛滅活而產生的。
由肉毒梭菌、丁酸梭菌、巴氏梭菌產生的肉毒桿菌神經毒素(BoNT)是肉毒中毒的主要病因(Simpson，L．藥理學毒理學年鑒(Annu．Rev．Pharmacol．Toxicol．)1986 26427-453)。人們經常因食物中毒而接觸這種神經毒素，由創(chuàng)傷引起的肉毒中毒很少見。已開發(fā)出類似于破傷風疫苗的肉毒疫苗以預防肉毒中毒的毒性作用。但由于肉毒桿菌毒素有七種不同血清型，只有分別制備出七種疫苗再聯合給藥才能用這樣的滅活疫苗產生全面的保護作用。目前的肉毒桿菌毒素疫苗只包含七種血清型中的五種。況且，某些血清型的產生菌株人工培養(yǎng)時毒素產量不高。因此，由于對完全活性毒素進行操作有很大危險性，這使得疫苗用毒素的生產、純化和滅活既費時又消耗很大(Clayton等，感染與免疫199563(7)2738-2742)。目前，只有疾病控制中心可為實驗用途提供這種疫苗。
通常，肉毒中毒是由于攝取了被毒素污染的食物，或攝取了被能在腸道中產生毒素的生物體污染的食物。不管來源如何，對肉毒桿菌毒素首先合成的是相對無毒性、分子量約150kDa的單鏈多肽。要具備完整毒性必須進行翻譯后加工，即由蛋白酶將該分子切割得到雙鏈結構，其中的重鏈(約100，000道爾頓)通過二硫鍵與輕鏈(約50，000道爾頓)連接。這一雙鏈分子是具有生物活性的全毒素。BoNT自腸道轉移至全身循環(huán)(淋巴和血液)，再到達毒素作用的靶位點膽堿能神經末梢，在此作為鋅依賴性內切蛋白酶對胞吐作用所必需的多肽進行切割(Montecucco，D．＆Schiavo，G．分子微生物學1994 131-8)。對這些多肽的切割導致遞質釋放受阻及麻痹。
一般認為毒素的重鏈是毒素結合并自膽堿能神經末梢外轉運至內部所必需的，而輕鏈則有鋅依賴性內切蛋白酶活性，使毒素能抑制膽堿能神經末梢(Neimann等，Behring Inst．Mitt．1991 89153-162)。因此，有關文獻描述了包含肉毒梭菌無毒性的50kDa羧基端片段的抗肉毒中毒疫苗。LaPenotiere等，Toxicon 1995 33(10)1383-6和Clayton等，感染與免疫1995 63(7)2738-2742。此外，有人提出可將這種強選擇性神經毒素和破傷風毒素改造成無毒性治療工具，以便向中樞神經系統(tǒng)送遞藥物、激素、酶或抗病毒物質。
發(fā)明簡述本發(fā)明目標之一是提供修飾型肉毒桿菌毒素，它保留了自腸道向全身循環(huán)轉運的能力但不具毒性。這種修飾型肉毒桿菌毒素可作為針對包括肉毒桿菌毒素在內的抗原肽的口服疫苗，以及用于經口服送遞其它治療劑至全身循環(huán)。
附圖簡述

圖1為天然肉毒桿菌毒素。此圖顯示在天然毒素中帶有鋅結合基元的輕鏈通過二硫鍵與重鏈連接。
圖2為本發(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素的例圖。此圖顯示帶有修飾的鋅結合基元的輕鏈與肉毒桿菌毒素的完整重鏈連接。
發(fā)明詳述現代醫(yī)學的主要挑戰(zhàn)之一是口服藥物的開發(fā)。激活全身免疫的口服肽疫苗的開發(fā)尤其存在很多問題。有關開發(fā)口服肽疫苗的難題包括在人的腸道中因低pH和蛋白酶裂解而致的降解；藥物中引起疾病的抗原區(qū)過大，無法從腸腔顯著地非特異性擴散到達全身循環(huán)；不能設計出能有效地結合腸道受體并經主動運輸到達全身循環(huán)的肽疫苗。盡管有這些困難，人們還是在口服疫苗研究領域進行著很大努力。例如近來有人提出用基因工程食物如土豆或香蕉等為載體大范圍免疫接種。但將抗原肽經基因工程導入隨后將被攝取的食物并沒克服這些困難。因此，需要能從腸道將抗原肽或其它治療劑可靠并可重復地轉運至全身循環(huán)的藥物送遞載體。
本發(fā)明提供修飾型肉毒桿菌毒素，它可作為口服送遞載體將包括但不限于肉毒桿菌毒素在內的抗原肽和其它治療劑送遞至全身循環(huán)?，F已發(fā)現肉毒桿菌毒素通過與單層細胞生長的極化腸道細胞粘膜側上的漿膜特異性(serospecific)受體結合，而從腸道轉運至全身循環(huán)。結合的毒素被主動轉運穿過細胞，完好無損地轉移至單層細胞培養(yǎng)的漿膜側。有人提出，附屬蛋白如血凝素(非共價蛋白復合物的成分，這種復合物包含有梭菌釋放的肉毒桿菌毒素)可能介導毒素的結合和跨腸壁轉運過程。但用重組全毒素進行的實驗已證實，肉毒桿菌毒素自身就有識別腸細胞表面受體的結合區(qū)。而且還證實，可通過修飾毒素的輕鏈，而在不改變該蛋白由腸道轉運至全身循環(huán)之能力的前提下使之不再有毒性。因此，本發(fā)明中“修飾型肉毒桿菌毒素”指保留其從腸道轉運至全身循環(huán)能力而無毒性的肉毒桿菌毒素。使肉毒桿菌毒素無毒的改變包括輕鏈氨基酸序列的突變及輕鏈或其部分的缺失。在一個優(yōu)選實施方案中，突變的是輕鏈的鋅結合區(qū)或底物結合區(qū)。本發(fā)明中“無毒”指膽堿能神經末梢遇到修飾型肉毒桿菌毒素不會導致神經末梢中的遞質釋放受阻和麻痹。使肉毒桿菌毒素無毒性的改變對毒素從腸道轉運至全身循環(huán)能力的影響可按本文的教導常規(guī)分析，因此技術人員可鑒別本發(fā)明的修飾型肉毒桿菌毒素。屬于這種修飾型肉毒桿菌毒素的肉毒桿菌毒素可另含有除肉毒桿菌毒素或治療劑之外的蛋白抗原。
例如，可制備包含其中全毒素輕鏈的鋅結合區(qū)被滅活的肉毒桿菌神經毒素的組合物。修飾型毒素無毒，因為全毒素沒有保留導致神經肌肉阻斷的能力，但對輕鏈的修飾不影響毒素分子的其余部分脫離腸腔進入全身循環(huán)的能力。在這一優(yōu)選實施方案中，輕鏈鋅結合區(qū)的至少3個氨基酸得到了修飾。尤其是天然序列中的His(第229位)、Glu(第230位)、His(第233位)分別由Gly、Thr和Asn取代，產生SEQ ID N01。編碼該修飾型肉毒桿菌毒素的核酸序列示于SEQ ID NO2。這些氨基酸取代消除了全毒素與催化鋅或其它二價陽離子結合的能力。
還有實驗證實無切割型或單鏈型肉毒桿菌毒素也能結合并跨腸壁轉運。因此，本發(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素還包括除去了切割位點的組合物。
本發(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素的生物活性經體內毒性試驗、體外對小鼠膈神經一半膈制備物的活性、和在突觸小體粗制劑中的酶活性進行測定。在這些實驗中，修飾型肉毒桿菌毒素(本文稱為修飾型重組體或修飾型rBoNT／C)由肉毒桿菌毒素C血清型經定點誘變滅活全毒素輕鏈上內切蛋白酶活性必需的鋅結合區(qū)而產生。但本領域內技術人員也可應用肽合成的其它方法，包括但不限于生化技術，如酶切肽并使所得片段交聯。此外，由于不同肉毒中毒(botulism)血清型結構和功能都相似，因而技術人員也可按常規(guī)方法由不同于肉毒梭菌C血清型的其它血清型制備修飾型肉毒桿菌毒素。例如，肉毒桿菌毒素的所有血清型都先合成為相對無活性前體，分子量約150，000。每一例中，前體必須經蛋白酶切割產生雙鏈分子，其中重鏈(100，000 kDa)經二硫鍵與輕鏈(50，000 kDa)連接。肉毒桿菌毒素的每種血清型優(yōu)先作用于膽堿能神經末梢以阻斷遞質釋放，其中重鏈主要作為組織定位區(qū)指導毒素結合膽堿能神經末梢，輕鏈在神經末梢內部發(fā)揮作用，阻礙遞質釋放。作為鋅依賴性金屬內切蛋白酶而對遞質釋放所必需的多肽家族中一個或多個成員進行切割的是每種血清型的輕鏈。每種血清型中都有酶活性必需的鋅結合區(qū)His-Glu-X-X-His(SEQ ID NO3)。對結合區(qū)的修飾總是導致酶活性的喪失。此外，將包含鋅結合區(qū)的每種血清型中一部分的核酸和氨基酸序列對比，證實鋅結合區(qū)附近及區(qū)內的序列具有高度一致性。所以，肉毒梭菌C血清型實例可代表整類蛋白。
修飾型rBoNT／C全毒素的體內毒性試驗證實，鋅結合區(qū)內有突變的修飾型肉毒桿菌毒素在給藥后16周監(jiān)控期內對小鼠即使在高劑量(每只小鼠腹膜內注射10μg)也沒產生急性毒性作用。無一只小鼠出現明顯的神經毒性或其它明顯的有害影響。相反，腹膜內接受100ng天然BoNT／C的小鼠在注射2-2．5小時后死亡。
另在小鼠膈神經-半膈制備物中比較了修飾型BoNT／C全毒素與天然BoNT／C的體外毒性。結果發(fā)現，膈神經-半隔制備物中加入修飾型肉毒桿菌毒素不產生神經肌肉阻礙(1×10-10M；n=4)。對比之下，加入天然BoNT／C(1×10-12M；n=8)總是產生傳導麻痹(平均值±標準誤差=152±17分鐘)。
這種修飾型肉毒桿菌毒素激活免疫應答的能力也在口服(p．o．)給藥和皮下(s．c．)注射后檢測。如免疫印跡試驗測得，修飾型rBoNT／C全毒素經p．o．和s．c．給藥刺激了體液中抗體的產生。因此，本發(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素保留了它穿過腸壁仍有活性和經主動運輸轉移出腸道的能力。這一點在以下發(fā)現中更進一步證實經s．c．給予該修飾型肉毒桿菌毒素的不均一制劑(其中包含少量無關蛋白)，可激活針對這些無關蛋白的免疫應答，而經p．o．給藥產生的抗體只針對該修飾型肉毒桿菌毒素。
經p．o．和s．c．給予修飾型肉毒桿菌毒素所產生抗體的保護作用隨后在血清中和試驗和體內毒性試驗中得到證實。不管用哪種給藥途徑，修飾型肉毒桿菌毒素免疫動物的血清都可滅活大劑量(約10，000 LD50)的天然BoNT／C。類似地，在體內毒性試驗中，無論經p．o．還是s．c．途徑免疫接種修飾型肉毒桿菌毒素，均明顯降低了隨后注射的天然毒素的效力?？诜揎椥腿舛緱U菌毒素的動物在其血清中有至少3個月可測到抗體。此外，無論經p．o．還是s．c．途徑免疫接種修飾型肉毒桿菌毒素的動物，在第三次加強免疫的3個月后均能受到保護而免于天然BoNT／C的攻擊。
因此，這些實驗的結果證實，可根據本文教導構建無毒性、但保留自腸道轉移至全身循環(huán)并刺激產生保護性抗體的修飾型肉毒桿菌毒素。而且，包含本發(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素的組合物作為口服疫苗保護動物免于肉毒中毒很顯然是有效的。
此外，由于本發(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素保留了它們自腸道轉移并完整無損地送遞至全身循環(huán)的能力，這些修飾型肉毒桿菌毒素可作為送遞載體將口服給予的非肉毒桿菌毒素的蛋白和治療劑送遞至全身循環(huán)。應用修飾型肉毒桿菌毒素作為口服疫苗的載體的方法很多。例如，因輕鏈鋅結合區(qū)的滅活不會負面影響毒素從腸道轉移的能力，故天然肉毒桿菌毒素的鋅結合區(qū)可被所選另一種蛋白，即非肉毒桿菌毒素的蛋白的抗原替換，以產生針對這另一種蛋白的口服疫苗。或者，可應用蛋白質化學和分子生物學的已知技術使所選抗原或其部分附著至修飾型肉毒桿菌毒素上。所得修飾型肉毒桿菌毒素不僅無毒，而且保留了其自腸道轉移至全身循環(huán)的能力，因此所選抗原口服后可到達全身循環(huán)而激活對抗該蛋白的全身免疫?？膳c修飾型肉毒桿菌毒素一起經口服給藥的疫苗實例有但不限于卡介苗、霍亂、白喉、乙型肝炎、麻疹、腦膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、鼠疫、脊髓灰質炎、狂犬病、風疹、破傷風、傷寒和黃熱病的疫苗。該口服疫苗可單獨使用或聯合應用，如DTP(白喉、破傷風、百日咳)。送遞口服疫苗的能力對于醫(yī)護人員不易獲得的地區(qū)尤其重要。而且，本發(fā)明的口服疫苗除了不需要技術人員外，還有重要的經濟優(yōu)勢，因為它避免了使用注射器和／或處置用過的注射器的費用。
本發(fā)明口服疫苗的配方優(yōu)選包含修飾型肉毒桿菌毒素及藥學可接受載體，如無茵生理鹽水、含0．1％明膠的無菌鹽水、或含1．0mg／ml牛血清白蛋白的無菌鹽水?；蛘撸景l(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素可經基因工程導入植物，使該植物產生的食物如土豆或香蕉可作為大范圍預防接種的載體。通過基因工程使植物表達外源肽的方法為本領域內已知，如于1996年6月6日提交的PCT／US96／09558中的方法。
本發(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素還可用于構建嵌合型口服治療劑。此實施方案中將一種治療劑與修飾型肉毒桿菌毒素連接，產生兩大類口服給予的分子(1)帶有生物穩(wěn)定性連接的新藥，及(2)有生物或化學不穩(wěn)定性連接的偶聯前體藥物，到達血液后即與載體分離。聯合治療技術的實例參見Lautenslager，G．T．＆ Simpson，L．L“用內源物質構建的嵌合分子”分子和細胞生物學進展，第9卷，第233-262頁，JAI出版公司(1994)。例如，可以將治療肽附著劑修飾型肉毒桿菌毒素上，由此產生的制劑有取代物的特點但仍能經口服給藥。一個實例如口服溶血栓劑的生成。將P-選擇蛋白與組織纖溶酶原激活物(TPA)組合而成的融合蛋白極具應用價值，它顯示有溶血栓活性并可定向到血栓。這一嵌合體必須導入血流。然而，用分子生物學或蛋白質化學，都可將此“第一級”嵌合分子與本發(fā)明的修飾型肉毒桿菌毒素結合，從而產生具有新添加的可經口服轉運至全身循環(huán)優(yōu)點的較高級嵌合體。另一實例是口服抗腫瘤藥物的設計。已公開了各種抗腫瘤藥物，其中利用一分子的細胞毒特性，并與特異性定位毒素的另一分子一部分融合。一個更新的實例將假單胞菌外毒素(PE)的氨基端與表皮生長因子(EGF)融合，產生的EGF-PE嵌合體能用作有EGF受體的癌癥細胞的細胞毒藥物。將此嵌合體與本發(fā)明之修飾型肉毒桿菌毒素連接可產生口服用較高級嵌合體。
應用修飾型肉毒桿菌毒素作為疫苗或其它治療劑載體的概念對人和對非人類動物都適用，只有一個例外。肉毒桿菌毒素的所有血清型在各物種中作為藥物載體不可能具有同等效力。臨床證據提示，人類特別對A、B和E血清型的作用敏感。這可能與這三種血清型從胃腸道系統(tǒng)吸收的效率有關。因此，A、B和E血清型將為人用治療劑的優(yōu)選載體。
另一方面，大多數非人類動物均對C血清型特別敏感。這提示對獸醫(yī)學而言，非人類動物用治療劑的優(yōu)選載體是C血清型?？膳c修飾型肉毒桿菌毒素一起口服給藥的動物疫苗實例有但不限于針對腺病毒2型、支氣管炎博德特菌、肉毒中毒、杯狀病毒、鸚鵡熱衣原體、梭菌病如產氣莢膜梭菌C型、冠狀病毒、溫熱、馬腦脊髓炎、大腸桿菌、貓傳染性腹膜炎、貓白血病病毒、貓傳染性粒細胞缺乏癥、肝炎、鉤端螺旋體病、副流感病毒、細小病毒、狂犬病、鼻氣管炎病毒以及破傷風的疫苗。
以下實施例只為舉例說明，并非限制本發(fā)明。
限制性內切酶和DNA修飾酶購自New England Biolabs(Beverly，MA)。表達載體pQE-30和鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)瓊脂糖購自QIAGEN(Chatsworth，CA)。6xHis親和標記的特異性單克隆抗體(mAb)購自QIAGEN?？雇挥|融合蛋白mAb(S-0664；抗HPC-1)購自SIGMA(St．Louis，MO)，馬抗BoNT／C抗體來自疾病控制中心(CDC，Atlanta，GA)。帶有BoNT／C DNA的EcoRI片段的質粒pCL8和pCH3如Kimura等BBRC 19901711304-1311所述。
實施例1構建合成rBoNT／C全毒素所用的表達載體天然肉毒桿菌毒素如圖1所示。修飾型肉毒桿菌毒素rBoNT／C如圖2所示。修飾型肉毒桿菌毒素rBoNT／C的核酸和蛋白序列分別示于SEQ IDNO2和SEQ ID NO1。
分離DNA片段、用DNA聚合酶I的Klenow片段修復突出端、用T4連接酶進行連接的技術已為本領域內熟知并已有描述，如Sambrook等，1989分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY。所有克隆步驟及表達均在帶有pREP4阻遏蛋白質粒的大腸桿菌M-15菌株(QIAGEN)中完成。
編碼修飾型肉毒桿菌毒素重組體的基因是從PCR產生的三個不同毒素片段(片段I、II和III)裝配而成并連接至載體pQE-30得到質粒pQE-TCl。首先，由質粒pCL8經兩個連續(xù)步驟擴增BoNT／C氨基端部分(片段I和II)的編碼DNA，產生pBot C2。DNA片段I(第4-689位核苷酸)用以下寡核苷酸引物對擴增(正向)5′-CCCAATAACAATTAACAACTTTAAT-3′(SEQ ID NO4)KpnI(反向)5 ′-TTTGGTACCCATTAAAATTAGTATTGGATCCAT-3′(SEQ ID NO5)有一個胞嘧啶加在正向引物的5’端以便于重新構建BamHI限制性位點，以及將rBoNT／C DNA與pQE-30翻譯甲硫氨酸的起始區(qū)的閱讀框架一致地進行克隆。反向引物中包含KpnI限制性位點，以便在片段I的3’端產生氨基酸突變His229→Gly和G1u230→Thr。擴增的片段I經T4聚合酶處理，KpnI切割并插入表達載體pQE-30中Klenow補平的BamHI和KpnI位點之間，得到質粒pBot Cl。 DNA片段II(第689-1633位核苷酸)用寡核苷酸引物擴增KpnI(正向)5′-TTTGGTACCCTTAATAATGCAATGCATAATTTATATGGA-3′(SEQ ID NO6)EcoRI(反向)5 ′-GAATTCAAATAATCAACATTTTGAG-3′(SEQ ID NO7)正向引物中導入了核苷酸的改變，以產生KpnI位點并在片段II的5，端產生氨基酸突變His229→Gly、Glu230→Thr和His233→Asn。反向引物與BoNT／C序列互補并在第1633位核苷酸處包含一個內部EcoRI位點。擴增的片段II經T4聚合酶處理、KpnI切割、插入pBot Cl的KpnI和Klenow補平的SalI位點之間。所得質粒pBot C2含有與pQE30的ATG密碼子和6xHis親和序列讀框一致的BoNT／C 5’端片段(第4-1633位核苷酸)。
BoNT／C的羧基端結構域編碼DNA片段III(第1633-3873位核苷酸)由質粒pCH3用以下寡核苷酸引物擴增而得EcoRI正向5′-TTTGAATTCTTATTATTACCTAGAATC-3′(SEQ ID NO8)SacI反向5′-TTTGAGCTCTTATTCACTTACAGGTACAAAAC-3′(SEQ ID NO9)正向引物與BoNT／C序列互補并在第1632位核苷酸處包含一個內部EcoRI位點。反向引物中緊鄰終止密碼子下游導入了一個SacI限制性位點。擴增的片段III經EcoRI和SacI消化，分別克隆至EcoRI和SacI消化的質粒pQE-30中，產生質粒pBot C3。最后重新構建編碼全長的修飾型肉毒桿菌毒素的DNA，方式是將質粒pBot C2的EcoRI-EcoRI片段(第-88至+1632位核苷酸)導入EcoRI消化的、小牛腸堿性磷酸酶去磷酸化的質粒pBot C3，得到質粒pQE-TCl。所有PCR片段再次經DNA測序分析。
設計寡核苷酸引物以便在編碼鋅結合區(qū)的DNA片段中引入KpnI限制性位點。在該DNA片段中引入KpnI限制性位點可使鋅結合必需的三個氨基酸發(fā)生突變(His229→Gly、G1u230→Thr和His233→Asn)，而且無需先克隆野生型BoNT／C DNA便可重新構建編碼修飾型肉毒桿菌毒素的DNA。由質粒pQE-TCl合成的修飾型肉毒桿菌毒素重組體在氨基端包含11個額外的氨基酸Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser(SEQID N010)。
實施例2 神經毒素表達的優(yōu)化利用PCR修飾pQE-30載體中編碼修飾型rBoNT／C的結構基因前面的序列。利用在5’端包含10個額外的核苷酸的新正向引物5’-CGGTACCATGCCAATAACAATTAACAACTTT-3’(SEQ ID NO11)和覆蓋BoNT／C序列第892位BglII限制性位點的新反向引物BglII5＇-AGCTATAGATCTATAATAATCCAA-3′(SEQ ID NO12)(Kimura等，生物化學及生物物理研究通訊1990 1711304-1311)重新擴增編碼rBoNT／C氨基端部分的DNA片段。所擴增的片段經T4聚合酶處理、BglII切割并插入pQE-TCl的Klenow補平的BamHI和BglII位點之間，得到質粒pQE-TC2。
實施例3 修飾型rBoNT／C全毒素的表達和純化在Lennox L肉湯培養(yǎng)基上37℃振蕩培養(yǎng)至A600達到0．6-0．8。加入異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷至終濃度為1．0mM，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。經4℃離心從1升已誘導的培養(yǎng)物中收獲細菌，重新懸浮于含300mM NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7．4)20ml中。在冰浴上用60型超聲破膜儀(Fisher Scientific，Malvern，PA)以每分鐘2個75％動力的脈沖超聲裂解細胞。裂解物在4℃以20，000xg離心30分鐘。將澄清的上清液與1ml包裝了Ni-NTA的樹脂混合，于4℃搖床溫育1小時，最終傾于25ml柱中。用30體積的洗滌緩沖液(50mM磷酸鈉，pH6．0，300mM NaCl，25mM咪唑)洗滌柱。結合的蛋白質用洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉，pH4．5，300mM NaCl)洗脫。純化蛋白在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上進行分析。
實施例4 免疫印跡分析大腸桿菌驅動質粒pQE-TCl上的修飾型肉毒桿菌毒素重組體表達的能力通過對細胞提取物的免疫印跡分析進行檢測。用于蛋白印跡分析的蛋白在10％聚丙烯酰胺凝膠上按Laemmli，U．K．自然1970 22680-685的方法分離，轉移至硝酸纖維素膜上，檢測帶有6xHis親和標記的免疫反應性蛋白。加入1∶2000稀釋的抗6xHis親和標記mAb或抗BoNT-C抗體于37℃溫育1小時以完成與第一抗體的共同溫育。用增強的化學發(fā)光法按說明書(ECL；Amersham公司，Arlington Heights，IL)進行膜顯色。重組體蛋白的合成用IPTG誘導，分為等份的溶解細胞進行SDS-PAGE。
用抗6xHis標記或抗BoNT／C抗體進行蛋白印跡分析顯示出極低水平的表達。因此，構建了一個新質粒pQE-TC2，它不含因將神經毒素DNA克隆至pQE-30載體的BamHI位點而帶的四個胞嘧啶核苷酸。抗6xHis標記抗體的蛋白印跡分析顯示pQE-TC2能較有效地驅動修飾型rBoNT／C全毒素的合成。事實上，1L Lennox肉湯培養(yǎng)物中可純化得到1-2mg修飾型rBoNT／C全毒素。
修飾型rBoNT／C全毒素被合成為可溶形式，無可見的降解，但不同于肉毒梭菌的是大腸桿菌不能使修飾型rBoNT／C全毒素有效切割。經考馬斯亮蘭染色或蛋白印跡只能在修飾型rBoNT／C全毒素中檢測到極微量的L鏈。但用固相TPCK-胰蛋白酶(Pierce，Roekford，IL)可使修飾型rBoNT／C全毒素有效切割，產生正確分子量的重鏈和輕鏈。由pQE-TC2合成的修飾型rBoNT／C全毒素在氨基端包含14個額外氨基酸(Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser-Gly-Thr(SEQID NO13))。此14氨基酸區(qū)段中的6xHis序列可用于合成蛋白的純化及隨后檢測。以此方式產生的重組體蛋白在Ni-NTA樹脂上用6xHis親和標記進行親和層析純化。特異性結合的蛋白質用低pH洗脫緩沖液(pH4．5)洗脫并在SDS-PAGE上進行分析。對從親和樹脂上洗脫的蛋白的分析顯示，毒素可純化至80-90％的純度。純化的修飾型重組體BoNT／C或修飾型rBoNT／C可用于本文提到的所有研究。
實施例5 重組體蛋白的生物分析如以下實施例所述，用體內毒性檢驗、體外對小鼠膈神經-半膈制備物的活性以及在突觸小體粗制品中的酶活性來分析純化重組體蛋白的生物活性。
A．體內毒性檢驗對修飾型rBoNT／C全毒素的毒性進行了檢驗。從組氨酸親和樹脂上洗脫純化的修飾型rBoNT／C全毒素用含1mg／ml BSA的PBS稀釋，對小鼠進行腹膜內注射(i．p．)。rBoNT／C全毒素按平均體重為25g的每只小鼠以10μg的濃度于PBS-BSA 100μl等分液中給藥。對小鼠進行為期16周的監(jiān)控，以排除非特異性毒性。
B．體外毒性檢驗在小鼠膈神經-半膈制備物中用Simpson等J．Pharmacol．Exp．THer．1990 25498-103的方法分析毒性。切取組織，懸浮于通有95％O2、5％CO2的生理緩沖液中，維持在35℃。生理溶液組成如下(毫摩爾)NaCl，137；KCl，5；CaCl2，1．8；MgSO4，1．0；NaHCO3，24；NaH2PO4，1．0；D-葡萄糖，11；明膠，0．01％。膈神經連續(xù)接受刺激(1．0Hz；持續(xù)0．1-0．3毫秒)，記錄肌肉顫搐。毒素誘導的麻痹以針對神經刺激的肌肉顫搐應答的50％減少計算。
C．底物的切割突觸小體(1mg／ml)按Rosahl等，細胞1993 75661-670的方法制備。在有修飾型rBoNT／C全毒素(100nM)存在的情況下將突觸小體于37℃在Tris緩沖鹽水(TBS)或含10mM二硫蘇糖醇的TBS中溫育90分鐘。在平行實驗中，在有或無天然BoNT／C的情況下溫育突觸小體膜。蛋白質在15％SDS-PAGE上分離，轉移至硝酸纖維素膜上，用抗突觸融合蛋白mAb檢測免疫反應性蛋白。
實施例6 用修飾型rBoNT／C全毒素免疫的小鼠的血清抗體應答體重約25克的Swiss-Webster雌性小鼠(Ace Animals，Boyertown，PA)在平行實驗中經s．c．或p．o．分別免疫接種rBoNT／C全毒素或TBS，以評估這種肽激發(fā)血清免疫應答的能力。
A．免疫接種和樣品收集s．c．注射組每只小鼠接受溶于0．1ml洗脫緩沖液中的2μg蛋白。口服組每只小鼠經胃內喂食針喂食溶于0．2ml洗脫緩沖液中的4μg蛋白。小鼠在第0天免疫，并在第14、28和42天加強免疫。在免疫接種后的第21、35和49天采集相同免疫方式小鼠的血清樣品并將血清集中。采集血清時，小鼠在異氟醚麻醉下用加有肝素的毛細管在眼眶后血管叢中放血。
B．分析血清中的抗體生成用免疫印跡試驗分析免疫小鼠或對照小鼠的血清對未切割的修飾型肉毒桿菌毒素的免疫反應性，檢測抗體。重組體抗原(修飾型肉毒桿菌毒素；0．1μg／泳道)經SDS-PAGE分離并轉移至硝酸纖維素膜上。膜用5％無脂奶粉的TBS封閉，剪成小條，用各種血清樣品檢測免疫反應性蛋白。第一次溫育用1∶1000稀釋的血清于室溫過夜(18小時)。辣根過氧化酶標記的抗小鼠IgG第二抗體以1∶10，000稀釋度室溫溫育1小時。充分洗滌后，用ECL(Amersham)使膜顯色。
實施例7 免疫小鼠血清的中和活性用實驗評估各種血清樣品中和天然BoNT／C的能力。檢驗了三種不同來源的血清，如下1)未免疫血清，2)經p．o．接受修飾型rBoNT／C全毒素免疫的動物的血清，和3)經s．c．接受修飾型rBoNT／C全毒素免疫的動物的血清。天然BoNT／C(10μl，100ng)與免疫前或免疫血清10μl，或與PBS-BSA于37℃溫育1小時。然后用含有1mg／ml BSA的PBS 80μl稀釋溫育混合液，腹膜內注射。對小鼠實行48小時監(jiān)控以評估各種混合物的殘留毒性。
實施例8 保護小鼠抵抗天然BoNT／C的攻擊第三次加強免疫的三個月后，rBoNT／C免疫小鼠經腹膜內途徑按每只小鼠100ng天然BoNT／C的劑量接受攻擊。對受攻擊小鼠的存活情況監(jiān)控5天。
本文引用的各專利、專利申請和出版物均全文引入本文作為參考。
本發(fā)明參照具體實施方案進行了公開，本領域內其他技術人員可在不背離本發(fā)明之精神和超出本發(fā)明之范圍的前提下設計其它實施方案并作其它修改。所附權利要求書意在包括所有這類實施方案和等價變異形式。
序列表<110>SIMPSON，LANCEKIYATKIN，NIKITAMAKSYMOWYCH，ANDREW<120>全身性送遞口服疫苗和治療劑的組合物和方法<130>JEFF-0256<140><141><150>08／954，302<151>1997-10-20<160>13<170>PatentIn Ver．2．0<210>1<211>1291<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述修飾型肉毒桿菌毒素<400>1Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn1 5 10 15Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu20 25 30Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Iie Pro Asp35 40 45Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val50 55 60Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp65 70 75 80Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg85 90 95Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr100 105 110Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp115 120 125Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn130 135 140Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly145 150 155 160Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser 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Ser His His His His His His Gly Ser Gly Thr1 5 10
權利要求
1．一種修飾型肉毒桿菌毒素，其中包含能從腸道轉運至全身循環(huán)并已變?yōu)闊o毒性的肉毒桿菌毒素。
2．權利要求1的修飾型肉毒桿菌毒素，其中還包含一種選擇的抗原。
3．權利要求1的修飾型肉毒桿菌毒素，其中還包含一種治療劑。
4．一種抗肉毒中毒的口服疫苗，其中包括權利要求1的修飾型肉毒桿菌毒素以及藥學可接受的載體。
5．抗所選抗原的口服疫苗，其中包含權利要求2的修飾型肉毒桿菌毒素以及藥學可接受的載體。
6．向動物口服送遞治療劑的方法，包括給予該動物權利要求3的修飾型肉毒桿菌毒素。
全文摘要
用所提供的能從腸道轉運至全身循環(huán)、但已變?yōu)闆]有毒性的修復型肉毒桿菌毒素口服送遞抗原或治療劑至全身循環(huán)的組合物和方法。
文檔編號A61P31/04GK1290174SQ98811298
公開日2001年4月4日 申請日期1998年10月16日 優(yōu)先權日1997年10月20日
發(fā)明者L·辛普森, N·基亞特肯, A·馬克思莫威克 申請人:托馬斯杰斐遜大學