專利名稱：用于緩釋蛋白質(zhì)的多元醇/油懸浮劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備含有生物活性劑的多元醇/增稠油懸浮劑，以緩慢傳遞所述生物活性劑。
背景技術(shù)：
由于最近基因工程技術(shù)和細胞工程技術(shù)方面的進展，能夠大量生產(chǎn)已知在體內(nèi)具有各種藥理作用的蛋白質(zhì)以作藥學(xué)應(yīng)用。這類藥用蛋白質(zhì)包括紅細胞生成素(EPO)、新紅細胞生成刺激蛋白(NESP)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、干擾素(α、β、γ、共有序列(consensus))、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白(TNFbp)、白介素-1受體拮抗劑(IL-lra)、腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、角質(zhì)細胞生長因子(KGF)、干細胞因子(SCF)、巨核細胞生長分化因子(MGDF)、osteoprotegerin(OPG)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、生長激素和肥胖蛋白(OB蛋白)。在本文中OB蛋白還可稱為leptin。
大多數(shù)采用藥用蛋白質(zhì)治療的疾病或病癥需要保持持續(xù)的蛋白質(zhì)水平，以取得最有效的治療效果。然而，正如大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物一樣，一般生物半衰期短而需要頻繁給藥。以不同時間間隔重復(fù)注射給予，導(dǎo)致藥物水平波動，給患者造成明顯的物質(zhì)經(jīng)濟負擔。因為許多病癥對調(diào)控的藥物水平反應(yīng)較好，所以需要控制藥物的釋放以提供較長時間的恒定釋放。這類緩釋藥物將提供一種控制活性成分的血液濃度水平的方法，因此給患者帶來較好的預(yù)防、治療或診斷效果，并且安全性更好、更方便患者以及患者順從性更好。這類持續(xù)釋放的組合物還能節(jié)約劑量并因此降低蛋白質(zhì)生產(chǎn)成本。遺憾的是大多數(shù)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性(如遇熱、有機溶劑時變性和喪失生物活性等)嚴重限制了緩釋制劑的開發(fā)和評價。
研制開發(fā)緩釋制劑的嘗試包括使用各種含有所述活性成分的生物降解及非生物降解的聚合物(如聚(丙交酯-共-乙交酯))微粒(參見例如Wise等，Contraception，8227-234(1973)和Hutchinson等，Biochem.Soc.Trans.，13520-523(1985))和各種技術(shù)，已知通過這些技術(shù)能將諸如蛋白質(zhì)的活性劑加入到聚合的微球體中(參見例如美國專利第4,675,189號及其中所引用的文獻)。遺憾的是一些使用微粒的緩釋裝置仍然存在以下問題包埋效率低；形成活性劑聚集物；初始活性劑大量釋放，然后以最低量釋放；以及活性劑的不完全釋放。
還對其它載荷藥物的聚合物裝置就各種疾病進行了長期的治療性治療研究，衍生自α-羥基羧酸(特別是外消旋和旋光活性形式的乳酸以及乙醇酸)及其共聚物。這些聚合物市面有售并已用于FDA-批準的系統(tǒng)如Lupron DepotTM，它由注射微粒組成，這些微粒釋放醋酸亮丙瑞林約30天以治療前列腺癌。
這類聚合物的使用中出現(xiàn)的各種問題包括某些大分子不能經(jīng)基質(zhì)擴散出來；藥物變質(zhì)和分解(如使用有機溶劑引起的變質(zhì))；對機體的刺激作用(如使用有機溶劑產(chǎn)生的副作用)；生物降解性差(例如發(fā)生于聚合物與多官能團醇或多官能團羧酸的縮聚反應(yīng)，即軟膏劑)；以及降解速率緩慢。
已描述了各種油基制劑。Welch在美國專利第2,491,537號中公開了利用油懸浮劑(膠凝植物油)達到24小時釋放青霉素。Buckwalter在美國專利第2,507,193號中公開了使用懸浮于用5％單硬脂酸鋁(AIMS)膠凝的花生油中的普魯卡因青霉素在兔體內(nèi)釋放時間長達11天。Anschel在美國專利第2,964,448號中公開了在AIMS膠凝的植物油中的松馳素懸浮劑。Anschel報告了5-7天的松馳作用并公開了通過對包含AIMS的懸浮液進行熱處理使作用時間延長(長達23天)。Yamahira等在美國專利第4,855,134號中公開了消炎痛或干擾素與諸如明膠的藥學(xué)上可接受的生物降解載體的混合物的緩釋制劑。Mitchell在美國專利5,411,951中公開了各種組合物,這些組合物中結(jié)合金屬的生長激素存在于生物相容性油中，并且證實所述組合物可胃腸外給予以延長生長激素在動物體內(nèi)的釋放時間。Ferguson等在美國專利4,977,140中公開了包含牛生長激素、蠟和油的緩釋制劑。Reichert等在WO 96/18417中公開了包含結(jié)晶G-CSF和植物油混合物的藥用組合物。
還有許多報告討論了對開發(fā)易產(chǎn)生聚集作用的應(yīng)用蛋白質(zhì)的藥物傳送系統(tǒng)的努力。例如，Grodsky等在美國專利第4,371,523號中描述了使用抗聚集劑如谷氨酸和/或天冬氨酸研制胰島素制劑。Blackshear等在美國專利4,439,181中描述了首先混合甘油或另一種多元醇與蛋白激素水溶液，然后將該溶液導(dǎo)入藥物傳送系統(tǒng)。Wigness等在PCT公布WO85/02118中描述了使用甘油來阻止蛋白質(zhì)在藥物傳送系統(tǒng)中沉淀；Azain等在EP公布0 374 120 A2中描述了特別使用穩(wěn)定多元醇的穩(wěn)定生長激素組合物。
盡管在上述方法中取得了一些進展，但是仍然需要研制藥用制劑，為臨床應(yīng)用提供更通用有效的緩釋方法。許多重組或天然蛋白質(zhì)可得益于恒量長時期釋放，并因此獲得更有效的臨床效果。
人重組G-CSF選擇性刺激嗜中性白細胞，它是一種用來對抗感染的血液白細胞。當前一種重組G-CSFFilgrastim可供治療之用。已充分研究了G-CSF在各種條件下的結(jié)構(gòu)；Lu等，J.Biol.Chem.Vol.267，8770-8777(1992)。
G-CSF不穩(wěn)定而且非常容易受到諸如溫度、濕度、氧以及紫外線的環(huán)境因素的影響。而且因為其疏水特性，由于在長期貯存中形成二聚物和更高序聚集物(大分子范圍)，G-CSF難于配制。已表明G-CSF非常易于聚集，特別是在中性pH、鹽和溫度水平提高的條件下(即生理血清條件)。這種不穩(wěn)定性使通過常規(guī)傳送系統(tǒng)實現(xiàn)的緩釋(一周或更長時間)很成問題，而且事實上，這類系統(tǒng)通常最多只提供幾天的釋放時間。
本發(fā)明目的之一是生產(chǎn)能夠提供緩釋G-CSF的包含G-CSF的制劑。使用包含G-CSF的甘油/油懸浮液實現(xiàn)這類制劑的生產(chǎn)，并且重要的是，利用這些G-CSF/甘油/油懸浮液的藥用組合物能夠提高生物利用度、保護蛋白質(zhì)、減少蛋白質(zhì)降解以及在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和效能增加的同時緩慢釋放蛋白質(zhì)。重要的是本發(fā)明的藥用組合物提供了簡單、迅速及廉價的控制重組蛋白釋放的方法，達到有效預(yù)防、治療或診斷的目的。
發(fā)明概述因此本發(fā)明涉及制備一種穩(wěn)定、延長釋放的包含生物活性劑的注射懸浮劑。本發(fā)明源于以下觀察結(jié)果當懸浮于甘油時G-CSF粉是穩(wěn)定的，且將該懸浮液進一步懸浮于增稠油如包含低百分量單硬脂酸鋁的芝麻油或蠟時仍然保持穩(wěn)定，由此提供穩(wěn)定的、延長釋放的注射制劑。重要的是本文所述方法可廣泛應(yīng)用于其它蛋白質(zhì)(或其類似物)以及G-CSF。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含加入于多元醇/增稠油懸浮液中的有效量生物活性劑(BAA)的藥用組合物，所述生物活性劑為粉或水性溶液形式，并且所述懸浮液能夠緩慢釋放所述生物活性劑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供對溫血動物胃腸外給予BAA/甘油/油懸浮劑的方法，其中所述懸浮劑經(jīng)皮下或肌肉給予，所述生物活性劑以控制速率在長達一周或一周以上的時間內(nèi)從所述懸浮劑中釋放。
本發(fā)明還涉及制備如上所述的BAA/多元醇/油懸浮劑的緩釋注射藥用組合物的方法。主要的實施方案包括(a)將BAA懸浮于多元醇以形成BAA/多元醇懸浮液；及(b)將所述BAA/多元醇懸浮液懸浮于包含增稠油或蠟的混合物中以形成BAA/多元醇/油懸浮液。
本發(fā)明還涉及包含所述制劑的預(yù)填充注射器。
本發(fā)明還涉及利用本文所述的穩(wěn)定的、延長釋放注射制劑治療各患者的方法。
本發(fā)明詳述本文所使用的以下術(shù)語的涵義如下“生物降解”定義為意指所述多元醇/油載體將在體內(nèi)腐蝕或降解或吸收或代謝形成小的無毒性組分。
“生物相容性”定義為意指所述油及其增稠劑以及其它賦形劑將對所述多肽或受治療的患者沒有不可耐受的副作用。
“胃腸外給予”定義為意指除消化道之外的任何給藥途徑，包括例如皮下、肌肉、鞘內(nèi)、眶內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肺、鼻、直腸及耳的途徑。
本文所用的生物活性劑是指不論人或動物的用于預(yù)防、治療或診斷用途的重組或天然蛋白質(zhì)。所述生物活性劑可以是天然、合成、半合成生物活性劑或它們的衍生物。另外，本發(fā)明的生物活性劑可以是PEG化生物活性劑或與諸如碳水化合物(例如葡聚糖)的水溶性加成物結(jié)合的生物活性劑。規(guī)劃了各種各樣的生物活性劑。這些生物活性劑包括但不限于激素、細胞因子、造血因子、生長因子、抗肥胖因子、營養(yǎng)因子、抗炎因子及酶(可用的生物活性劑的其它實例還見美國專利第4,695,463號)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠容易地將所需的生物活性劑用于本發(fā)明的組合物，還可包括小分子的有機化合物或有機金屬化合物。
這類蛋白質(zhì)將包括但不限于粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(見美國專利第4,810,643、4,999,291、5,581,476、5,582,823號及PCT公布第94/17185號，包括附圖
在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、干擾素(見美國專利第5,372,808、5,541,293、4,897,471以及4,695,623號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、白介素(見美國專利第5,075,222號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、紅細胞生成素(見美國專利第4,703,008、5,441,868、5,618,698、5,547,933以及5,621,080號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、干細胞因子(PCT公布第91/05795、92/17505及95/17206號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、osteoprotegerin(PCT公布第97/23614號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、新型紅細胞生成刺激蛋白(NESP)(PCT公布第94/09257號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)及l(fā)eptin(OB蛋白)。
以下提供的實施例為使用G-CSF的工作實施例，如上所述，G-CSF為用來治療造血性疾病的治療性蛋白質(zhì)。通常用于實施本發(fā)明的G-CSF可以是從哺乳動物機體分離的形式或者化學(xué)合成法的產(chǎn)物，或者原核生物或真核生物宿主表達外源性DNA序列的產(chǎn)物，所述外源性DNA序列通過基因組或cDNA克隆或通過DNA合成獲得。適合的原核生物宿主包括各種細菌(如大腸桿菌)；適合的真核生物宿主包括酵母菌(如啤酒酵母菌)和哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞、猴細胞)。根據(jù)所采用的宿主，所述G-CSF表達產(chǎn)物可以是具有哺乳動物或其它真核生物的碳水化合物的糖基化G-CSF，或可以是非糖基化G-CSF。所述G-CSF表達產(chǎn)物還可包括初始蛋氨酸氨基酸殘基(在位置-1)。雖然因為特別具有最大工業(yè)實用性而優(yōu)選重組G-CSF、尤其是由大腸桿菌獲得的G-CSF，但是本發(fā)明考慮使用任何G-CSF及所有此類形式的G-CSF。
已有報告某些G-CSF類似物具有生物功能，并且這些類似物還可通過諸如加入一個或多個聚乙二醇分子進行化學(xué)修飾。G-CSF類似物報告于美國專利第4,810,643號。報告具有生物活性的其他G-CSF類似物的實例是在AU-A-76380/91、EP 0 459 630、EP 0 272 703、EP 0473 268以及EP 0 335 423中提出的那些物質(zhì)，雖然沒有對報告公開的每種類似物的活性進行陳述。還參見AU-A-10948/92、PCT 94/00913以及EP 0 243 153。當然，如果治療非人類哺乳動物時的確需要的話，可使用重組非人類G-CSF，例如重組鼠、牛、犬的G-CSF等。參見例如PCT WO 9105798和PCT WO 8910932。
本發(fā)明制劑所用的G-CSF類型可選自以上引用的PCT公布第94/17185號中描述的那些類型，而且所述PCT通過整體引用結(jié)合到此。成熟的、重組甲硫氨酰人G-CSF的174個氨基酸的序列本文表示為SEQ ID NO1，其中所述成熟蛋白的第一個氨基酸為蘇氨酸(T)(在位置1)，甲硫氨?；鶜埢挥谖恢?1(不包含于以下序列中)。SEQ ID NO1TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP然而，與任何目前的G-CSF部分一樣，在位置-1上的甲硫氨?；鶜埢梢匀笔А?br> 還包括具有氨基酸取代的上述那些蛋白，按照酸度、電荷、疏水性、極性、大小或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它任何特點，所述氨基酸取代是“保守的”。這些蛋白在下表1中列出。一般參閱Creighton，proteins，passim(W.H.Freeman and Company，N.Y.，1994)；Ford等，protein Expression and Purification 295-107(1991)，通過引用將其結(jié)合到本文中。
表1保守的氨基酸取代
另外，生物活性劑還可包括但不限于胰島素、胃泌素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、甲狀腺刺激激素(TSH)、黃體生成激素(LH)、卵泡刺激激素(FSH)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、胃動素、干擾素(α、β、γ)、白介素(IL-1至IL-12)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白(TNF-bp)、腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨核細胞源生長因子(MGDF)、角質(zhì)細胞生長因子(KGF)、血小板生成素、血小板源生長因子(PGDF)、集落刺激生長因子(CSF)、骨形成蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶(SOD)、組織纖溶酶原激活物(TPA)、尿激酶、生長激素、鏈激酶及血管舒緩素。本文所用術(shù)語蛋白質(zhì)包括肽、多肽、共有分子、類似物、及其衍生物或組合物。
用來制備本發(fā)明緩釋組合物的BAA可以是溶液或散劑形式，并且首先與諸如甘油的多元醇混合。所述BAA可以是存在于甘油中的散劑形式，或者是溶解或懸浮于甘油水溶液中。加入足量多元醇以在BAA懸浮液的長期貯存中穩(wěn)定(如防止聚集)BAA。
其它考慮使用的生物相容性C-4至C-19多元醇包括但不限于C-4赤蘚醇；C-5阿拉伯糖、木糖、核糖；C-6肌醇、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖；C-12麥芽糖和蔗糖。如果使用的多元醇為固體形式，則首先通過加熱或加壓的方法將其制備成水性溶液或水性有機溶液或使其流體化，然后將其與BAA混合。所用多元醇水平按重量可優(yōu)選5％-90％，更優(yōu)選10％-50％，最優(yōu)選10％-30％。在一個其中G-CSF為所述生物活性劑、甘油為所述多元醇的優(yōu)選實施方案中，使用20％的水性甘油。在其他優(yōu)選實施方案中，在幾乎沒有或沒有水的存在的情況下，20％的甘油是相對于所述制劑的總體積而言。
本發(fā)明中使用的油類為低酸度的生物相容性并且基本沒有酸敗。這類油可選自如芝麻籽、cannola、藏紅花、海貍、棉籽、橄欖、花生、向日葵籽、油酸乙酯、包括α-生育酚在內(nèi)的維生素E及其衍生物以及Miglyol 812。
所述甘油/油懸浮液還將包含“增稠劑”或“膠凝劑”，它們用于阻止所述懸浮液發(fā)生水合作用，賦予油基更強的粘度或粘彈性，并因此降低給予懸浮液后BAA從懸浮液的釋放速率，而且還增加BAA的穩(wěn)定性，以及增加所述懸浮液作為一個整體的物理穩(wěn)定性(即阻止相分離)。這類物質(zhì)包括有機酸的多價金屬鹽，如月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸等的鋁鹽、鋅鹽、鎂鹽或鈣鹽，及諸如蠟和高粘度油的油質(zhì)物質(zhì)、以及諸如聚合物和鹽類的有機或無機填充劑。單硬脂酸鋁、二硬脂酸鋁及白蠟為特別優(yōu)選的物質(zhì)。通常所述物質(zhì)的濃度(基于油的重量)為約0.1％-99％，更典型約0.5％-90％，對金屬鹽甚至更典型為0.5％-20％。這種比率對于保證所述物質(zhì)不使懸浮劑的粘度增加到使之不再適用于注射器注射的粘度值具有重要意義。對于高粘度制劑，也可考慮植入。
所述甘油/油懸浮劑還可包括表面活性劑或乳化劑以穩(wěn)定該甘油/油懸浮劑并阻止其分離。這種表面活性劑或乳化劑可以是離子表面活性劑或非離子表面活性劑，可選自例如Span 40、Span 80、Pluronics和蛋卵磷脂或它們的混合物，優(yōu)選其HLB(親水-親脂平衡)為1-10，更優(yōu)選HLB為2-8，甚至更優(yōu)選HLB為4-8。所述表面活性劑還能有助于使油消散在生物環(huán)境中。所述表面活性劑按油的重量通常為0.1％-50％，優(yōu)選0.2％-20％，更優(yōu)選0.5％-10％。某些物質(zhì)如氫化的植物油能既能用作所述甘油懸浮劑的增稠劑又能用作穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的BAA/甘油/油懸浮劑可如下制備將生物活性劑(粉形式)懸浮于基本純的甘油溶液中形成BAA/甘油懸浮液，然后將所述BAA/甘油懸浮液懸浮于只包含油的溶液或包含含有“膠凝劑”的油溶液中，所述“膠凝劑”懸浮或溶解于所述油中。首先需要將所述油(包含膠凝劑)加熱(同時混合)以保證膠凝劑完全溶解于油中。所述BAA制劑還可通過如下過程制備將BAA溶解或懸浮于水性甘油溶液(最好包含表面活性劑)中，并將該溶液混合入油(最好含有表面活性劑)中，其中水性甘油最好緩沖在穩(wěn)定pH(例如G-CSF的酸度)下。水相最好含中至高的HLB表面活性劑，而油相最好含低HLB的表面活性劑。在本發(fā)明中，中至高HLB為約8以上，低HLB為約8以下。
通常，本發(fā)明包括包含有效量生物活性劑或衍生產(chǎn)物(如沉淀物)及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑(如抗壞血酸和維生素E)、給藥所需的輔助劑和/或載體(見通過引用結(jié)合到本文的PCT 97/01331)的藥用組合物。所需生物活性劑的最佳藥用制劑將由本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)給藥途徑、所需劑量及釋放時間而決定。典型藥用組合物公開于Remington’s Pharmaceutical Science(Mack出版公司，第18版，Easton，PA，第1435-1712頁(1990))。本發(fā)明的藥用組合物特別優(yōu)選胃腸外給藥，例如肌肉注射、皮下注射或腹膜注射。
本發(fā)明組合物的治療用途取決于所用的生物活性劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能容易地使所需的生物活性劑適合于本發(fā)明而使其作所需的治療之用。這類物質(zhì)的治療用途在包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文的以下專利公布中作了更為詳盡的闡述。治療用途包括但不限于用于以下蛋白質(zhì)的用途如粒細胞集落刺激因子(見美國專利第4,999,291、5,581,476、5,582,823、4,810,643號及PCT公布第94/17185號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、干擾素(見美國專利第5,372,808、5,541,293號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、白介素(見美國專利第5,075,222號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、紅細胞生成素(見美國專利第4,703,008、5,441,868、5,618,698、5,547,933以及5,621,080號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、干細胞因子(PCT公布第91/05795、92/17505及95/17206號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、OB蛋白(見PCT公布第96/40912、96/05309、97/01285、97/01010以及97/06816號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)、新型紅細胞生成刺激蛋白(PCT公布第94/09257號，包括附圖在內(nèi)通過引用結(jié)合到本文中)以及小分子藥物。另外，本發(fā)明組合物還可用于生產(chǎn)一種或多種治療或改善所述生物活性劑可治療病癥的藥物。
尤其是關(guān)于G-CSF，已證明它是治療炎性腸道疾病的有效治療藥物。例如，據(jù)報告患有Crohn氏病和腸皮瘺的青年男孩在所有標準療法失敗后，對使用G-CSF(filgrastim)治療有反應(yīng)；Vaughm和Drumm，New England Journal of Medicine，340(3)239-240(1999)。還有報告，用G-CSF進行長期高劑量治療對結(jié)腸炎具有抗炎作用；Hommes等，Clin Exp.Immunol.，106529-533(1996)。由此預(yù)見本發(fā)明包含G-CSF的懸浮劑也將對治療炎性腸道疾病有效。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能通過給藥并觀察所需的治療效果確定有效劑量。對于G-CSF，所述懸浮液的制劑最好是在約0.01μg G-CSF部分/kg體重/天至10mg G-CSF部分/kg體重/天時獲得理想的治療效果。不同時間可使用診斷手段確定有效劑量。例如，測量血(或血漿或血清)中G-CSF含量的診斷法可首先用來測定內(nèi)源性G-CSF蛋白水平。這類診斷手段可以為諸如抗體夾心檢測法的抗體檢測形式。開始定量測量內(nèi)源性G-CSF蛋白的量，并確定一個基線。根據(jù)治療過程中連續(xù)定量的內(nèi)源性和外源性G-CSF蛋白部分(即機體自身產(chǎn)生或者外部給予的體內(nèi)蛋白質(zhì)、類似物或衍生物)，確定治療劑量。因此藥物劑量隨治療過程而變化，例如開始在觀察到治療效果之前使用高劑量，然后使用低劑量保持治療效果?；蛘撸瑴y定嗜中性白細胞水平并在治療過程中進行監(jiān)測。調(diào)節(jié)給藥劑量，以用最低的注射頻率保持所需的嗜中性白細胞數(shù)水平。
提供以下實施例是為了更全面地闡明本發(fā)明，但不能解釋為用其限制本發(fā)明的范圍。
實施例1本實施例描述通過噴霧-干燥法制備G-CSF粉。
將G-CSF溶液(～2.75mg/mL，含5％的山梨醇，溶于0.58mM HCl)置于透析管(Spectrum Lab Inc.，平寬(flat width)18±2mm，直徑11.5mm，1.0mL/cm)中，于4℃下在水中(pH 3.25)透析24小時。在透析期間，換水四次。然后將透析的G-CSF溶液(～1100mL)置于超濾室中，并對該溶液施加氣壓。2小時后，收集約300mL濃縮的G-CSF溶液，并經(jīng)0.2mm過濾器過濾。G-CSF溶液的終濃度為9.134mg/mL。在BUCHI 190微型噴霧干燥器(Brinkmann Institute)上進行所述噴霧干燥，所述噴霧干燥器的所有玻璃器皿首先用去離子水洗滌，接著用無菌水洗滌，然后用乙醇洗滌。以進氣量450常規(guī)升/小時(normal liters/hour)的空氣流和G-CSF溶液的注入速率1.0mL/min進行噴霧干燥。從290mL初始G-CSF溶液中獲得G-CSF粉(2.640g，82.7％G-CSF)。
實施例2本實施例描述G-CSF/甘油懸浮液的制備及使用G-CSF/甘油懸浮液制備G-CSF/甘油/油制劑。
步驟1.首先制備G-CSF/甘油懸浮液將105.4mg G-CSF噴霧干燥粉(按實施例1中所述制備)和2.401mL甘油置于研缽中并研磨該混合物，直到未見粗糙顆粒。
步驟2.然后通過以下的過程制備增稠的油懸浮液將45.67g芝麻油(Croda，Inc.)和1.91g單硬脂酸鋁(AIMS)(Fluka)置于125mL錐形瓶中，在室溫下用磁力攪拌器混合20分鐘，接著于165℃-170℃下在氮氣中邊攪拌邊加熱。攪拌持續(xù)2小時，然后將混合物冷卻至室溫，得到乳白色凝膠樣增稠油(3％AIMS)。
步驟3.將1mL G-CSF/甘油懸浮液和4mL增稠油置于研缽中并一起研磨直到充分混合。所述懸浮液(G-CSF/20％甘油/3％AIMS/油)在4℃下貯存于無菌樣品小瓶中備用。
實施例3本實施例描述還含L-抗壞血酸和表面活性劑的包含G-CSF/甘油的粘性油懸浮液的制備。
通過加熱并攪拌該混合物將L-抗壞血酸(50mg)溶解于1mL甘油溶液中。冷卻至室溫之后，將抗壞血酸/甘油溶液與G-CSF粉(45.3mg)和Span 80(250mL)混合。
將如上所述制備的3.75mL增稠油(3％AIMS)加入到G-CSF/抗壞血酸/甘油混合物中，并一起研磨得到粘性油懸浮液(G-CSF/20％甘油＋抗壞血酸/Span 80/3％AIMS/油)。
實施例4本實施例說明制備用7％白蠟增稠的油。
(使用實施例2中步驟2所述的方法)通過在160℃下、氮氣中加熱白蠟(4.49g)和芝麻油(59.65g)的混合物2小時，獲得增稠的7％蠟/油。
實施例5本實施例說明使用7％的蠟作為增稠劑制備具有不同甘油水平的各種包含G-CSF的油制劑。
制備1在研缽中將G-CSF粉(27.6mg)和甘油(600μl)相混合并研磨至觀察不到粗糙顆粒。然后將2.4mL按照實施例4中所述制備的增稠的7％蠟/油加入到G-CSF/甘油懸浮液中。用研缽和研棒一起研磨該混合物，得到粘性油制劑(G-CSF/20％甘油/7％蠟)。
制備2將G-CSF粉(45.3mg)與1.00mL抗環(huán)血酸/甘油溶液(按實施例3所述制備)混合，然后加入4.0mL增稠的7％蠟/油。將所得混合物一起研磨得到一種粘性油制劑(G-CSF/20％甘油＋抗壞血酸/7％蠟)。
制備3在研缽中將G-CSF粉(27.3mg)與甘油(450μl)混合并研磨至觀察不到粗糙顆粒。然后將按實施例4制備的2.55mL增稠的7％蠟/油加入到G-CSF/甘油懸浮液中。用研缽和研棒一起研磨所述混合物，得到粘性油制劑(G-CSF/15％甘油/7％蠟)。
制備4在研缽中混合G-CSF粉(27.5mg)和甘油(750μl)混合并研磨至觀察不到粗糙顆粒。然后將2.25mL按實施例4所述制備的增稠的7％蠟/油加入到G-CSF/甘油懸浮液中。用研缽和研棒一起研磨所述混合物，得到粘性油制劑(G-CSF/25％甘油/7％蠟)。
實施例6本實施例說明制備用10％白蠟增稠的G-CSF/甘油油。
(使用實施例2中步驟2所述的方法)通過在160℃、氮氣下加熱白蠟(6.5g)和芝麻油(58.5g)的混合物2小時獲得增稠的10％蠟/油。
將G-CSF粉(27.4mg)和甘油(600μl)一起混合，然后將2.40mL增稠油(10％蠟)加入到G-CSF/甘油懸浮液中。研磨該混合物得到粘性油制劑(G-CSF/20％甘油/10％蠟)。
實施例7本實施例描述體內(nèi)檢測實施例2-6制備的懸浮液。
以30mg/kg含G-CSF的各種懸浮液及各種對照物注射脾切除小鼠(BDF1)一次。在幾天之內(nèi)從小鼠取血進行分析。G-CSF粉(-甘油)的3％AIMS油(30mg/kg)；G-CSF粉的甘油(30mg/kg)；G-CSF粉的水溶液(30mg/kg)；以及1X PBS用作對照。所述數(shù)據(jù)總結(jié)于下表1中。
表1嗜中性白細胞數(shù)(106/mL)制劑第3天第5天第7天1XPBS2.0 2.0 2.0溶于pH3.25水中的 2.0 2.0 2.0G-CSF(+5％山梨醇)溶于甘油中的G-CSF3.5 2.0 2.0溶于3％AIMS/油中 1.5 1.5 1.5的G-CSF(-甘油)G-CSF/20％甘油24 33 193％AIMS/油G-CSF/20％甘油18.123.88.7抗壞血酸/Span 803％AIMS/油G-CSF/20％甘油27 40.210.37％蠟/油G-CSF/15％甘油32.436 8.17％蠟/油G-CSF/25％甘油24.638.213.97％蠟/油G-CSF/20％甘油33.656.925.610％蠟/油如表1中數(shù)據(jù)所證實，多元醇/增稠油懸浮液能夠提供至少持續(xù)一周的緩釋G-CSF。重要的是，需要注意未加入多元醇，不能以油類傳送G-CSF。
實施例8本實施例說明制備用硬脂酸甘油酯增稠的油類。
制備1將甘油三硬脂酸酯(1.00g)、甘油單硬脂酸酯(4.00g)和芝麻油(45.00g)置于瓶中并在160℃、氮氣下加熱2小時。然后將混合物渦旋的同時冷卻至室溫。獲得白色增稠油。
制備2將甘油單硬脂酸酯(0.80g)和芝麻油(9.20g)置于瓶中并在160℃、氮氣下加熱2小時。然后將混合物渦旋的同時冷卻至室溫。獲得白色增稠油。
實施例9本實施例描述使用芝麻油和更粘的氫化植物油的混合物制備粘稠油。
將芝麻油(6.00mL)和氫化植物油(34.00mL)置于瓶中，并在氮氣下于160℃、將該混合物加熱2小時。然后將所述混合物冷卻至室溫，獲得增稠油。
實施例10本實施例說明制備G-CSF/甘油的油懸浮液，其中所述油包含芝麻油和氫化植物油的混合物，并且其中所述氫化植物油稠化所述混合物。
制備1混合G-CSF粉(10.0mg)和甘油(0.20mL)，然后加入油混合物(氫化油/芝麻油＝5/3，0.80mL)。用研缽和研棒一起研磨該混合物，得到粘性懸浮液制劑。將此制劑充填入注射器中，使之可注射。
制備2混合G-CSF粉(10.3mg)和甘油(0.20mL)，然后加入油混合物(氫化油/芝麻油＝3/17，0.8mL)。用研缽和研棒研磨該混合物，獲得粘性懸浮液制劑。將此制劑充填入注射器中，使之可注射。
實施例11本實施例說明使用硬脂酸、硬脂醇及它們的組合物，制備為增稠劑±G-CSF/甘油的增稠油。
制備1將硬脂酸(1.00g)和芝麻油(9.00g)置于瓶中，并在160℃下于氮氣中加熱2小時。振搖下冷卻至室溫后，該混合物成為粘性增稠油。
制備2將硬脂醇(1.00g)和芝麻油(9.00g)置于瓶中，并在160℃下于氮氣中加熱2小時。振搖下冷卻至室溫后，該混合物成為粘性增稠油。
制備3將硬脂醇(0.50g)、硬脂酸(0.50g)及芝麻油(9.00g)置于瓶中，并在160℃下將該混合物于氮氣中加熱2小時。振搖下冷卻至室溫后，該混合物成為粘性增稠油。
制備4混合G-CSF粉(9.8mg)和甘油(0.20mL)，然后加入0.80mL增稠油(10％硬脂醇)。將該混合物研磨10分鐘，得到油制劑，將其充填入1mL注射器中，使之可注射。
制備5混合G-CSF粉(10.3mg)和甘油(0.20mL)，然后加入0.8mL增稠油(10％增稠劑，硬脂醇/硬脂酸＝3/1)。將該混合物研磨10分鐘，得到油制劑，將其充填入1mL注射器中，使之可注射。
實施例12本實施例說明制備含G-CSF的水性甘油的油乳化制劑，其中所述G-CSF混合于水性甘油相中。
所述水相包含12.7mg/mL G-CSF、50％甘油、1％(w/v)PluronicF68、10mM醋酸鹽(pH4.0)及0.44mM HCl。1％ Pluronic L101的玉米油混合物構(gòu)成油相。用Virtis Handishcar勻漿器將這兩相的混合物(50∶50和70∶30)勻化45秒以形成相應(yīng)的乳化制劑。
實施例13除G-CSF劑量約為10mg/kg之外，以類似于實施例2的方法制備本實施例。注射一次之后，所述嗜中性粒細胞水平升高至少持續(xù)一周。
說明書的核苷酸和氨基酸序列表序列表<110>AMGEN INC.<120>用于緩釋蛋白質(zhì)的多元醇/油懸浮劑<130>A-576<140>尚未指定<141>1998-12-23<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>174<212>PRT<223>粒細胞集落刺激因子<400>1Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170
權(quán)利要求
1.一種藥用組合物，該組合物包含有效量的生物活性劑(BAA)，所述生物活性劑加入于生物相容性多元醇/油懸浮液中，其中所述懸浮液包含一種增稠劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述生物相容性多元醇選自甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖、木糖、核糖、肌醇、果糖、半乳糖、麥芽糖以及蔗糖。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述增稠劑選自有機酸的多價金屬鹽、諸如蠟和高粘度油的油質(zhì)物質(zhì)以及諸如聚合物和鹽的有機或無機填充劑。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述增稠劑為單硬脂酸鋁。
5.權(quán)利要求3的組合物，其中所述增稠劑為白蠟。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述油選自芝麻、海貍、棉籽、cannola、藏紅花、橄欖、花生、向日葵籽、α-生育酚及油酸乙酯。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述生物活性劑為一種選自以下的蛋白質(zhì)干擾素共有序列(interferon consensus)、紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、干細胞因子(SCF)、leptin(OB蛋白)、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白(TNF-bp)、白介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)、腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)、osteoprotegerin(OPG)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨核細胞衍生的生長因子(MGDF)、角質(zhì)細胞生長因子(KGF)、血小板生成素及新型紅細胞生成刺激蛋白(NESP)。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述生物活性劑為小分子藥物。
9.一種制備BAA/多元醇/油緩釋懸浮液的藥用組合物的方法，該方法包括(a)將BAA懸浮于多元醇中形成BAA/多元醇混合物；(b)將所述BAA/多元醇混合物懸浮于包含增稠油的混合物中，形成BAA/多元醇/油懸浮液。
10.一種對溫血動物胃腸外給予BAA/多元醇/油懸浮劑的方法，其中所述懸浮劑通過皮下或肌肉內(nèi)給予，而且所述生物活性劑在長達一周或更長的時間內(nèi)從所述懸浮劑中以控制速率釋放。
11.一種預(yù)填充的注射器，它裝有權(quán)利要求1的藥用組合物。
12.一種包含有效量生物活性劑(BAA)的藥用組合物，所述生物活性劑加入到生物相容性多元醇/油懸浮液中，其中所述懸浮液包含一種增稠劑；所述組合物能夠緩慢釋放(sustained-release)所述生物活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備包含生物活性劑的多元醇/增稠油懸浮劑,以緩慢釋放所述生物活性劑。所述蛋白質(zhì)/甘油/油懸浮劑緩慢釋放蛋白質(zhì)例如G－CSF長達至少一周。
文檔編號A61K47/00GK1335765SQ99816271
公開日2002年2月13日 申請日期1999年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月23日
發(fā)明者M·S·戈爾登博格, D·尚, A·C·貝克曼 申請人:安姆根有限公司