葡激酶衍生體在制備降血脂藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及葡激酶衍生體(SAK-HV)在制備降血脂藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]葡激酶(staphylokinase SAK)是由金黃色葡萄球菌分泌的一種含有136個氨基酸殘基的胞外蛋白質(zhì)。葡激酶在本世紀四十年代末被發(fā)現(xiàn)，并在五十年代至六十年代發(fā)現(xiàn)其具有纖溶作用。
[0003]中國專利文獻(CN1850976B)中公開了一種葡激酶衍生體(SAK-HV)(其氨基酸序列在文獻中權(quán)利要求1中所示)并且在文獻(Min Wang, Yuanyuan Wang, etal.Construct1n and characterizat1n of a novel staphylokinase variant withthrombin-1nhibitory activity.B1technol Lett (2009) 31:1923 - 1927)中也進行了公開。上述公開的葡激酶衍生體(SAK-HV)是具有多功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
[0004]目前降脂類藥物主要包括HMG-CoA還原酶抑制劑，膽酸螯合劑，纖維酸類，煙酸及其衍生物，中藥成分如枸杞多糖、茶葉多糖、黃連素等。目前臨床應(yīng)用最廣泛的降脂藥物為他汀類藥物，其作用機理為抑制HMG-CoA還原酶，他汀藥物的治療周期一般為6-8周。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供葡激酶衍生體(SAK-HV)在制備降血脂藥物中的應(yīng)用。
[0006]所述葡激酶衍生體，其氨基酸序列為中國專利文獻(CN1850976B)中權(quán)利要求1所述的氨基酸序列。
[0007]一種降血脂組合物，包含權(quán)利上述葡激酶衍生體。
[0008]所述葡激酶衍生體的制備方法為:培養(yǎng)含有葡激酶衍生體基因序列重組表達載體的工程菌，通過破碎菌體分離上清經(jīng)過純化后獲得葡激酶衍生體蛋白液，將純化的葡激酶衍生體中加入賦形劑，4°C保存；再加入凍干保護劑，冷凍干燥。
[0009]所述賦形劑為海藻糖。
[0010]所述保護劑為甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、乳糖、氯化鈉、甘氨酸中的一種以上。
[0011]其中，將SAK-HV的基因序列重組構(gòu)建到表達載體中，轉(zhuǎn)化宿主菌。所用重組表達載體可為pBV220、pET17b、pET15a或pET28a?？墒褂玫谋磉_宿主菌為coliBL21、E.coliDH5a、E.coliHBlOUE.coliJM109 或 E.coliJM103
[0012]具體的，SAK-HV粉劑的制備方法為:
[0013]利用基因重組技術(shù)將SAK-HV蛋白的基因序列構(gòu)建到表達載體中，進一步轉(zhuǎn)化宿主菌。通過篩選獲得高表達，高活性的工程菌株。從轉(zhuǎn)化好的菌種平板上挑取單菌落在無菌環(huán)境下接種于3ml含氨卞青霉素(25yg/ml)的LB培養(yǎng)基的試管中，25?30°C振蕩培養(yǎng)過夜制成一級種子液。一級種子液于無菌環(huán)境下按0.1:1000的比例接種于2000ml含氨卞青霉素(25 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，25?30 °C振蕩培養(yǎng)過夜制成二級種子液。二級種子液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)，富集菌體，通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)過程中的不同PH值，溶氧量，誘導(dǎo)溫度等條件選擇最佳的發(fā)酵條件，發(fā)酵結(jié)束后，離心收菌，稱重并取菌體破碎進行SDS-PAGE檢測SAK-HV表達水平。經(jīng)過發(fā)酵后富集工程菌，獲得的SAK-HV表達水平可達45%以上。菌體在冰浴中超聲破碎，離心，收集上清進行離子交換層析分離及凝膠過濾分離通過SDS-PAGE，HPLC檢測蛋白純度，純度可達95 %以上。選擇不同濃度的凍干保護劑，包括甘露醇、右旋糖酐、蔗糖和甘氨酸等組成不同濃度的單一和復(fù)合配方，冷凍干燥后檢測凍干樣品的活性和成型的變化，經(jīng)過37°C加速實驗后，檢測其活性和成型狀況的改變，確定SAK-HV蛋白粉劑制備的主要成分。
[0014]上述降血脂組合物，可通過靜脈、皮下或口服給藥。
[0015]將上述降血脂組合物復(fù)溶后使用生理鹽水稀釋至0.005?0.5mg/ml靜脈注射，注射周期為14天，每天注射一次連續(xù)注射14天；在小鼠上的用量為0.05mg/kg?5mg/kg，鶴鶴上的用量為0.01mg/kg?5mg/kg。
[0016]本發(fā)明的有益效果:通過本發(fā)明人的研宄顯示葡激酶衍生體可能通過stat3信號通路調(diào)控脂肪代謝相關(guān)基因表達。本發(fā)明中的葡激酶衍生體經(jīng)靜脈注射等方式作用于ApoE-/-小鼠和鵪鶉后可以顯著降低血漿總膽固醇(TG)，甘油三酯(TC)，低密度脂蛋白(LDL-c)水平，在同等時間內(nèi)其降脂效果優(yōu)于其療效優(yōu)于他汀類藥物。經(jīng)靜脈注射后2周即可顯示出明顯的降脂效果，同時還可以明顯抑制機體炎癥水平，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)。經(jīng)過基因芯片分析肝臟轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)SAK-HV蛋白可能通過stat3信號通路調(diào)控脂肪代謝相關(guān)基因表達。
【附圖說明】
[0017]圖1為SRH-HV工程菌發(fā)酵結(jié)果，1-分子量標準物，2-發(fā)酵全菌，3-破碎上清，4-破碎沉淀。
[0018]圖2為SRH-HV純化后SDS-PAGE及HPLC分析結(jié)果，(A)為SDS-PAGE結(jié)果:1-分子量標準物，2-4-純化產(chǎn)物收集；(B)為HPLC分析蛋白純度結(jié)果。
[0019]圖3為ApoE-/-小鼠血脂檢測結(jié)果。
[0020]圖4為高脂喂養(yǎng)鵪鶉血脂檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0021]以下實施例并不限定本發(fā)明，實施例中未詳細說明的操作步驟請參照《分子克隆實驗指南》第三版相應(yīng)部分(薩姆布魯克E.F.弗里奇等，科學(xué)出版社(J.Sambrook，Davidff.Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001 (I).J.))或參閱所用試劑盒的說明書。如無特別指明，下述實施例中所使用的試劑，試驗方法等皆為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0022]實施例1含有本發(fā)明SAK-HV蛋白基因的工程菌的制備
[0023](I)含有SAK-HV蛋白基因表達載體的構(gòu)建
[0024]將質(zhì)粒pBV220用EcoR I和BamH I雙酶切，將質(zhì)粒pET17b用Nde I和BamH I雙酶切，將SAK-HV全長片段分別用EcoR I和BamH I雙酶切，Nde I和BamH I雙酶切。使用T4DNA連接酶鏈接酶切后的SAK-HV片段及pET17b質(zhì)粒。SAK-HV酶切片段5 μ 1，載體I μ 1，1XLigand Buffer3 μ 1，T4Ligand I μ 1，ddH2015 μ 1，14_16°C過夜連接。
[0025](2)含有SAK-HV蛋白基因載體轉(zhuǎn)化工程菌
[0026]將過夜連接的產(chǎn)物全部加入200 μ I感受態(tài)細胞中，0°C冰浴30min。42°C熱休克90sec，迅速放入冰浴中冷卻I 一 2min。在每管中加入800 μ I LB (AmpO培養(yǎng)基，37°C搖床180 — 200rpm培養(yǎng)45 — 60min。將每管4000rpm離心5min。吸取800 μ I上清棄之，用剩余的200 μ I上清將沉淀懸起來。然后涂在LB固體平板(100 μ g/ml Amp+)上。待平板全部吸收后，倒置于37°C溫箱，培養(yǎng)12_16h。
[0027](3)含有SAK-HV蛋白的工程菌表達活性檢測
[0028]挑取單菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床220rpm過夜培養(yǎng)。將活化菌液以1:100比例接種于3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。30°C搖床220rpm培養(yǎng)。取約100 μ I