Drb在制備治療細(xì)粒棘球蚴病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及DRB的藥學(xué)效果和生物效果，屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]棘球蝴病(echinococcosis)，又稱做包蟲病(hydatid disease)，發(fā)生在棘球蝴絳蟲的中絳期幼蟲，常寄生于人體器官及其他動物體內(nèi)，從而造成對人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展危害性極大的寄生蟲病，且該寄生蟲病是人和牲畜共同患有。
[0003]據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)，棘球蝴絳蟲存在許多種類。發(fā)生在我國多數(shù)為細(xì)粒棘球蝴病，又稱為囊型包蟲病(cystic echinococcosis，CE)，以及多房棘球蝴病，又稱為泡型包蟲病(alveolar echinococcosis，AE)。這兩種分型疾病分別由多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis,E.m)和細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus,E.g)寄生在人體內(nèi)部器官或者動物體內(nèi)致病。
[0004]細(xì)粒棘球蝴可寄生在人體多個器官，以肝臟最為常見(占50-70% )，其次為肺臟(占20%?30% )?，F(xiàn)在的肝細(xì)粒棘球蝴病治療方案中，手術(shù)治療是首選，在術(shù)后予以藥物輔助治療。臨床上手術(shù)采用的術(shù)式是閉合式肝包蟲外膜內(nèi)外囊完整摘除術(shù)，這種手術(shù)方法的優(yōu)點在于手術(shù)創(chuàng)傷小、術(shù)后的并發(fā)癥少和可根治性等，可降低肝包蟲病的術(shù)后復(fù)發(fā)率。但是，手術(shù)過程中，還是存在頭節(jié)泄露以及切除不完全等問題，手術(shù)后的復(fù)發(fā)率也由此而升高。鑒于這種情況，手術(shù)后的藥物輔助治療成為關(guān)鍵。
[0005]近年來，許多學(xué)者在抗包蟲藥物方面做了大量研究，例如吡喹酮、阿苯達(dá)唑、甲苯達(dá)唑等藥物的作用進(jìn)行了詳細(xì)研究及臨床效果觀測。上述藥物作為患者在術(shù)后使用的輔助治療手段，其結(jié)果并不令人滿意。更嚴(yán)重的是，有研究表明，在病人服用上述藥物過程中，會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，甚至對病人生命造成危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]申請人在Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子研究過程中，發(fā)現(xiàn)Nrf2的抑制劑DRB可以有效抑制和殺滅原頭節(jié)的生長，可用于細(xì)粒棘球蝴病的臨床治療。
[0007]在本發(fā)明中，DRB為 5，6-Dichlorobenzimidazole 1- β -D-ribofuranoside, 5,6- 二氯苯并咪唑l-β -D-次黃嘌呤，CAS號53-85-0。
[0008]首先，本發(fā)明公開了 DRB在制備治療細(xì)粒棘球蝴病藥物中的應(yīng)用。
[0009]上述的藥物，既可以是將DRB作為活性成分，還可以是將DRB作為活性成分與其他輔料做成的各種制劑，例如常見的片劑、膠囊、滴丸、輸液、凍干粉針等，對于藥物劑型及其相應(yīng)輔料的選擇，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。
[0010]上述的細(xì)粒棘球蝴病，既可以是動物體上的，也可以是人體上的，根據(jù)該癥的臨床發(fā)病部位，通常指的是囊性肝包蟲病。
[0011]因此，本發(fā)明還公開了 DRB在制備治療囊性肝包蟲病藥物中的應(yīng)用。
[0012]根據(jù)需要，可使用不同濃度的DRB，一般來說，為了有效的殺滅病原，DRB的濃度不低于25g/Lo
[0013]針對常見的原頭節(jié)生長密度，優(yōu)選的，DRB的濃度為50-75g/L。
[0014]根據(jù)實際情況可以確定合理的用藥時間，通常為連續(xù)用藥三天及其以上。
[0015]在上述濃度下，對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)具有比較理想的抑制和殺滅效果。
[0016]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還公開了 DRB作為細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)抑制劑的應(yīng)用。
[0017]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在多種實驗環(huán)境下，尤其是動物離體實驗情況下，為了防止由于動物體內(nèi)的細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)在體外的生長和頭節(jié)外溢，需要加入必要的抑制劑，例如20%高滲鹽水等。
[0018]與上述類似，DRB的濃度不低于25g/L，優(yōu)選的，DRB的濃度為50_75g/L。
【附圖說明】
[0019]圖1為不同濃度的DRB對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)形態(tài)的影響；
[0020]圖2為不同濃度的DRB對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)活力的影響；
[0021 ] 圖3為DRB對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)表面超微結(jié)構(gòu)的影響。
【具體實施方式】
[0022]為了說明DRB的應(yīng)用效果，申請人進(jìn)行了體外實驗說明DRB對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的殺滅效果。
[0023]實驗1:DRB體外作用于細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的效果
[0024]取新鮮的自然感染細(xì)粒棘球蝴的綿羊肝臟，清潔羊肝表面，用75%酒精消毒表面，無菌條件下抽取含原頭節(jié)的囊液，移入無菌瓶中。用PBS (PH = 7.2)清洗原頭節(jié)3次至澄清，用0.1%伊紅染液做染色排斥實驗，98%以上拒染。肉眼觀察原頭節(jié)呈細(xì)白沙樣均勻顆粒，活性好的原頭節(jié)沉降速率快，活性不好的或者死亡的原頭節(jié)沉降速率相對比較慢。
[0025]倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)蟲體呈內(nèi)陷型，蟲體結(jié)構(gòu)飽滿，呈橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰完整，鈣顆粒清亮而明顯。然后將原頭節(jié)分裝至含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中(青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL)，置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0026]實驗分組:RMP1-1640培養(yǎng)基空白對照組、25g/L DRB 組、50g/L DRB 組、75g/L DRB組，DMSO組。取六孔板，每孔設(shè)5mL體系，按以上分組，配好相應(yīng)的培養(yǎng)液。
[0027]將在體外培養(yǎng)5天后的細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)用PBS (pH = 7.2)清洗3遍，每組培養(yǎng)液中加入約2000個原頭節(jié)，置37°C，5% C0J?育箱內(nèi)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察TUDCA對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)形態(tài)和活力的影響。
[0028]數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法:加藥后24h開始，每組每天均勻抽取200 μ L培養(yǎng)液(平均含原頭節(jié)約90-120個)，用0.1 %伊紅染色15min，倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)的活力?；铑^節(jié)拒染、不著色，且有活動性；死亡或活力減弱的原頭節(jié)紅染著色，伴有結(jié)構(gòu)破壞。計算每組每天平均死亡率。每隔4d換液一次(每組體系和濃度同第一次加藥時)，連續(xù)觀察，直至最大作用濃度的原頭節(jié)全部死亡。實驗重復(fù)三次。
[0029]實驗2:DRB作用后原頭節(jié)表面結(jié)構(gòu)的變化
[0030]在測活力的同時，隨機(jī)取相對應(yīng)的原頭節(jié)做電鏡，觀察原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)的變化。PBS洗滌3次，每次5min ;置4%戊二醛固定24h。將原頭節(jié)放入濃度為50%、70%、80%、90%、100%的酒精內(nèi)逐級梯度脫水，脫水時間分別為5min、10min、30min、Ih至過夜，臨界點干燥，真空噴金LOOA，在LE01430VP掃描電子顯微鏡下觀察原頭節(jié)表層超微結(jié)構(gòu)變化。
[0031]實驗結(jié)果:
[0032]參考圖1，倒置顯微鏡下觀察，DMSO組和25g/l DRB處理組原頭節(jié)散在分布，可見原頭節(jié)活動。蟲體結(jié)構(gòu)飽滿，呈橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰完整，鈣顆粒清亮而明顯(圖1A-D)。50g/I DRB處理組作用原頭節(jié)3天后(圖1)，原頭節(jié)活動度較對照組減弱(圖1E)，6天后，頭節(jié)活動度較正常對照組明顯減弱，原頭節(jié)蟲體變小(圖1F)。75g/l DRB處理組原頭節(jié)3天后，出現(xiàn)蟲體邊緣不規(guī)整，空泡增多，鈣顆粒明顯減少(圖1G)，6天后，原頭節(jié)蟲體嚴(yán)重皺縮，頂突上的小鉤排列紊亂，部分脫落，吸盤變型，內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失(圖1H)。
[0033]參考圖2，不同濃度抑制劑DRB體外作用細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)后，對原頭節(jié)生長均有抑制作用。特別是高濃度DRB組對原頭節(jié)的殺傷作用顯著。DMSO組和25g/lDRB組對原頭節(jié)的殺傷作用不明顯。50g/l DRB組，從作用I天開始，原頭節(jié)活力即開始下降，隨著作用時間的延長，至作用第4天時，原頭節(jié)活力下降一半。75g/l DRB組對原頭節(jié)的殺傷作用更加顯著，在作用至第6天時，原頭節(jié)全部死亡。通過倒置顯微鏡觀察，制作原頭節(jié)活力曲線圖，由下表可得，隨著用藥時間的延長和藥物濃度的增加，DRB對原頭節(jié)活力的抑制效果增強(qiáng)(圖2)。
[0034]參考圖3，通過掃描電鏡觀察，DMSO空白對照組和25g/l DRB組中原頭節(jié)體態(tài)飽滿充實，呈橢圓形，并且形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，沒有觀察到原頭節(jié)結(jié)構(gòu)顯著變化(圖3A、B)。抑制劑DRB處理組50g/l體外作用原頭節(jié)3天后，原頭節(jié)蟲體表層出現(xiàn)輕微褶皺，但大體形態(tài)并未改變(圖3C);抑制劑DRB處理組50g/l體外作用原頭節(jié)6天后，原頭節(jié)表層發(fā)生明顯皺縮，蟲體表面結(jié)構(gòu)受到一定程度破壞，蟲體形態(tài)發(fā)生改變。抑制劑DRB處理組75g/l體外作用原頭節(jié)3天后，在電鏡下觀察到頭節(jié)吸盤變型，頭鉤排列紊亂，蟲體表層發(fā)生嚴(yán)重皺縮(圖3E)，抑制劑DRB 75g/L處理組作用6天，原頭節(jié)蟲體大部分凹陷，蟲體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，甚至蟲體潰解(圖3F)。
[0035]綜上可以看到，不同濃度DRB對體外細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)均有抑制作用，濃度為75g/L的DRB對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)殺傷作用最明顯，隨著時間的延長，抑制作用顯著增加(P< 0.01。在證實DRB對原頭節(jié)有抑制作用的基礎(chǔ)上，探索不同濃度的DRB對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)學(xué)影響。研究結(jié)果顯示，DRB作用后，可導(dǎo)致體外細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)發(fā)生不同程度的改變。內(nèi)陷型和外翻型原頭節(jié)是蟲體不同的存在形式。當(dāng)條件適適宜時，原頭節(jié)頂突內(nèi)凹，可保護(hù)頭鉤、吸盤、微毛不受損害；當(dāng)加入DRB后，外翻型的原頭節(jié)增多。正常培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)生發(fā)層的微毛發(fā)育良好，數(shù)量多，附著并延伸入角質(zhì)層內(nèi)，可增加生發(fā)層與角質(zhì)層的接觸面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，在棘球蝴無血液供應(yīng)的情況下仍可較快生長并不斷形成育囊。
[0036]總而言之，DRB對體外細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)有殺傷作用。
【主權(quán)項】
1.DRB在制備治療細(xì)粒棘球蝴病藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于DRB的濃度不低于25g/L。3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于DRB的濃度為50-75g/L。4.DRB在制備治療囊性肝包蟲病藥物中的應(yīng)用。5.DRB作為細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)抑制劑的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于DRB的濃度不低于25g/L。7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于DRB的濃度為50-75g/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了DRB在制備治療細(xì)粒棘球蚴病藥物中的應(yīng)用，以DRB殺滅細(xì)粒棘球蚴病的病原·細(xì)粒棘球蚴絳蟲，具有顯著的抑制和殺滅細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的效果，從而實現(xiàn)對細(xì)粒棘球蚴病的治療。
【IPC分類】A61P33/10, A61K31/7056
【公開號】CN104997799
【申請?zhí)枴緾N201510447688
【發(fā)明人】呂海龍, 姜玉峰, 黃珊珊
【申請人】呂海龍
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月27日