卵泡發(fā)育和卵細(xì)胞成熟的刺激的制作方法
【專利說明】卵泡發(fā)育和卵細(xì)胞成熟的刺激
[0001 ] 聯(lián)邦政府資助的研究和開發(fā)
[0002]本發(fā)明是在政府支持下根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的許可HD068158進(jìn)行。政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0003]哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟被包括由垂體前葉分泌的促性腺激素和局部旁分泌因子的激素復(fù)雜地控制。在成人卵巢內(nèi)的大多數(shù)卵細(xì)胞(或卵母細(xì)胞)維持處于第一減數(shù)分裂前期的延長(zhǎng)階段,由周圍卵泡體細(xì)胞被膜。周期性地,一組原始卵泡進(jìn)入卵泡生長(zhǎng)階段。在此期間,卵細(xì)胞經(jīng)歷大體積增加,且卵泡顆粒細(xì)胞的數(shù)目增加。成熟卵細(xì)胞合成允許卵泡細(xì)胞增殖的旁分泌因子,且卵泡細(xì)胞分泌增強(qiáng)血管形成并允許卵細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)和分化因子。在進(jìn)行到某一階段之后,卵細(xì)胞和它們的卵泡死亡,除非將它們暴露于防止體細(xì)胞凋亡的促性腺激素。
[0004]哺乳動(dòng)物卵巢由作為基礎(chǔ)功能單元的卵泡組成。卵泡的總數(shù)在年輕時(shí)確定,且該池的消耗導(dǎo)致生殖衰老(reproductive senescence)。每個(gè)卵泡發(fā)育,從而排卵或經(jīng)歷變性。單獨(dú)的卵泡由最里面的卵細(xì)胞、周圍的顆粒細(xì)胞和外層的卵泡膜細(xì)胞組成。每個(gè)卵泡的命運(yùn)由內(nèi)分泌因子以及旁分泌因子控制。在獲取竇腔之前,卵泡發(fā)育經(jīng)過原始階段、初級(jí)階段和次級(jí)階段。在竇階段,少數(shù)卵泡在青春期之后出現(xiàn)的周期促性腺激素刺激下達(dá)到排卵前階段,并成為生殖年齡婦女的卵巢雌激素的周期分泌的主要來(lái)源。響應(yīng)在每個(gè)生殖周期期間的排卵前促性腺激素激增,優(yōu)勢(shì)格拉夫卵泡(Graafian follicle)排卵以釋放成熟的卵細(xì)胞以便受精,而剩下的卵泡膜和顆粒細(xì)胞經(jīng)歷轉(zhuǎn)化以變成黃體。
[0005]—旦進(jìn)入生長(zhǎng)池,卵泡則在最低程度的損失下繼續(xù)發(fā)展到初級(jí)階段、次級(jí)階段和早期竇階段。盡管FSH治療主要通過抑制早期竇卵泡的細(xì)胞凋亡而廣泛用以在不孕患者中產(chǎn)生排卵前卵泡,但一些患者是對(duì)FSH治療的低應(yīng)答者,因?yàn)樗齻兊穆殉埠泻苌俚脑缙诟]卵泡,如通過在月經(jīng)周期的第三天她們升高的血清FSH和較低AMH水平所反映。
[0006]在整個(gè)生殖期中,原始卵泡經(jīng)歷初始募集以進(jìn)入初級(jí)卵泡的生長(zhǎng)池。在人類卵巢中,據(jù)估計(jì)初級(jí)卵泡達(dá)到次級(jí)卵泡階段需要大于120天,而據(jù)估計(jì)從次級(jí)卵泡階段生長(zhǎng)到早期竇階段需要71天。一旦開始進(jìn)入生長(zhǎng)池,卵泡就會(huì)發(fā)展達(dá)到竇階段,并且直至早期竇階段,都見到最低程度的卵泡損失。在周期募集期間,循環(huán)FSH的增加允許一群竇卵泡逃脫細(xì)胞凋亡性死亡。在該群體之中,主導(dǎo)卵泡通過分泌高水平的雌激素和抑制素以抑制垂體FSH釋放而占優(yōu)勢(shì)地形成。結(jié)果是負(fù)向選擇剩余的群體,導(dǎo)致其最后死亡。附隨地,局部生長(zhǎng)因子和脈管系統(tǒng)的增加允許正向選擇優(yōu)勢(shì)卵泡,因此確保其最終生長(zhǎng)和最后排卵及黃體形成。在周期募集之后,竇卵泡僅用2周就變成優(yōu)勢(shì)格拉夫卵泡。人類卵泡從原始階段到排卵前階段的總體發(fā)育需要超過6個(gè)月。
[0007]卵泡從最小的原始和初級(jí)卵泡發(fā)育到最大的排卵前卵泡需要不同的階段依賴性刺激和存活因子。卵泡從初級(jí)階段有效成熟到次級(jí)階段、竇階段和排卵前階段的方法具有重大意義,包括用于體外和體內(nèi)卵泡成熟的方法。本發(fā)明解決了該問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]提供通過以下促進(jìn)哺乳動(dòng)物卵泡生長(zhǎng)到排卵前階段的組合物和方法:使哺乳動(dòng)物卵泡與有效劑量的破壞Hippo途徑中信號(hào)傳導(dǎo)的試劑或在被破壞的Hippo信號(hào)傳導(dǎo)的下游起作用的試劑中的至少一種接觸足以使所述卵泡生長(zhǎng)到排卵前階段的時(shí)間。所述接觸可在不存在卵巢的實(shí)體破壞,即卵巢完整的情況下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中,所述卵泡在離體培養(yǎng)物中接觸所述試劑。在其它實(shí)施方案中,所述卵泡在體內(nèi)與所述試劑接觸。在所述接觸在體內(nèi)進(jìn)行的情況下,所述試劑可局部地施用至所述卵巢,例如施用至遭受卵巢功能早衰的婦女、遭受多囊性卵巢綜合征的婦女、中年不孕婦女等。所述有效劑量為允許卵泡經(jīng)歷充分生長(zhǎng)以達(dá)到排卵前階段的劑量。
[0009]破壞所述Hippo途徑中信號(hào)傳導(dǎo)的試劑包括聚合或穩(wěn)定聚合肌動(dòng)蛋白的試劑。這類試劑包括已知的藥物,包括而不限于環(huán)肽jasplakinolide (JASP);和鞘氨醇1-磷酸(S1P,或1-磷酸鞘氨醇)受體調(diào)節(jié)劑,例如S1P、FTY720、溶血磷脂酸(LPA)等。在被破壞的Hippo信號(hào)傳導(dǎo)的下游起作用的試劑包括CCN生長(zhǎng)因子蛋白,例如CCN 2、3、5或6。
[0010]本發(fā)明的方法可與使所述卵泡與活化卵泡生長(zhǎng)的另外試劑接觸的步驟進(jìn)一步組合,所述步驟包括而不限于使所述卵泡與磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)抑制劑和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)活化劑中的至少一種接觸,其提供相加效果。
[0011]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,所述暴露在體外,例如在器官或組織培養(yǎng)物中進(jìn)行,其中將至少一個(gè)卵泡暴露于有效劑量的破壞所述Hippo途徑中信號(hào)傳導(dǎo)的試劑或在被破壞的Hippo信號(hào)傳導(dǎo)的下游起作用的試劑中的至少一種。處理過的卵泡可用于體外目的,例如用于體外受精,產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞等,或可移植以提供體內(nèi)用途。目標(biāo)移植模式包括而不限于將一個(gè)或多個(gè)包括在未被實(shí)體破壞的卵巢中存在的卵泡的卵泡移植到腎囊、靠近輸卵管的皮下部位、卵巢部位,例如,在保留一個(gè)卵巢,而另一卵巢已被移出用于離體處理的情況下,所述一個(gè)或多個(gè)處理過的卵泡可移植到所述剩余卵巢的部位。
[0012]在一些實(shí)施方案中,體外處理后面是卵巢移植,從而活化卵泡以產(chǎn)生排卵前卵細(xì)胞,其后面可為體外或體內(nèi)受精。
[0013]目標(biāo)個(gè)體包括瀕危物種、經(jīng)濟(jì)上重要的動(dòng)物、遭受卵巢功能早衰的婦女、遭受多囊性卵巢綜合征的婦女、中年不孕婦女、來(lái)源于人類胚胎干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的卵泡等。在其它實(shí)施方案中,所述暴露在體內(nèi)局部地,例如通過卵巢內(nèi)注射,或全身地施用至個(gè)體來(lái)進(jìn)行。
[0014]在個(gè)體暴露于有效劑量的破壞所述Hippo途徑中信號(hào)傳導(dǎo)的試劑或在被破壞的Hippo信號(hào)傳導(dǎo)的下游起作用的試劑中的至少一種之后,可將所述個(gè)體用在有效開始卵泡生長(zhǎng)的濃度下的卵泡刺激激素(FSH)或FSH類似物處理,所述卵泡刺激激素(FSH)或FSH類似物包括重組FSH,在體內(nèi)宿主動(dòng)物中天然存在的FSH、FSH類似物如FSH-CTP、聚乙二醇化FSH等。
[0015]在已經(jīng)刺激所述卵泡以達(dá)到所述排卵前階段階段的情況下,可將所述個(gè)體用排卵劑量的促黃體產(chǎn)生激素(LH)或其激動(dòng)劑處理,所述激動(dòng)劑特別地包括絨毛膜促性腺激素,例如馬絨毛膜促性腺激素(eCG)、人類絨毛膜促性腺激素(HCG)等。另外,可將所述卵泡體內(nèi)或體外暴露于c-kit配體、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-4、BMP7、白血病抑制因子、基礎(chǔ)FGF、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等中的一種或多種。
[0016]根據(jù)本發(fā)明用有效劑量的破壞所述Hippo途徑中信號(hào)傳導(dǎo)的試劑或在被破壞的Hippo信號(hào)傳導(dǎo)的下游起作用的試劑中的至少一種有效刺激的時(shí)間通常為至少約I小時(shí)且不超過約5天,并且可為至少約12小時(shí)且不超過約4天,例如2、3、4或5天。
【附圖說明】
[0017]圖1.卵巢碎裂和移植促進(jìn)在小鼠中的卵泡生長(zhǎng)。將來(lái)自未成年小鼠的配對(duì)卵巢移植到成年切除卵巢的小鼠的腎中(完整:IN;部分:PI)。在移植物收回之前對(duì)宿主每日注射FSH,歷時(shí)5天。A,有或沒有碎裂成三部分的配對(duì)卵巢移植物的形態(tài)。上圖:在腎囊內(nèi)的移植物;下圖:分離的配對(duì)移植物。B,在來(lái)自10天(DlO)小鼠的配對(duì)卵巢碎裂成2-4部分并在移植之前培育1-24小時(shí)之后配對(duì)卵巢的重量。將在移植之前(DlO)和在移植之后5天具有FSH處理(D15FSH)或沒有FSH處理(D15)的卵巢重量充當(dāng)對(duì)照。η = 8-22。C,在移植來(lái)自10天小鼠的完整卵巢和碎裂卵巢(3部分)前后的卵泡動(dòng)力學(xué)。左:總卵泡數(shù),右:卵泡動(dòng)力學(xué)。η = 5。Pmd =原始;Prm =初級(jí);Sec =次級(jí);P0 =排卵前。D,來(lái)自處于不同齡的小鼠的配對(duì)卵巢在碎裂成3-4部分并移植之后的重量。平均值土SEM;*p〈0.05。η=8-22。
[0018]圖2.鼠卵巢的碎裂增加肌動(dòng)蛋白聚合、破壞Hippo信號(hào)傳導(dǎo)并增加CCN生長(zhǎng)因子和細(xì)胞凋亡抑制劑。A,卵巢碎裂增加F-肌動(dòng)蛋白水平。在免疫印跡分析F-肌動(dòng)蛋白和G-肌動(dòng)蛋白水平(上圖)之前將來(lái)自10天小鼠的配對(duì)卵巢切割成3部分或保持完整。下圖:F-肌動(dòng)蛋白與G-肌動(dòng)蛋白的比率。N = 6-11。B,卵巢碎裂減小磷酸基-YAP(PYAP)水平和pYAP與總YAP的比率。將切割或沒有切割的配對(duì)卵巢培育I小時(shí),接著免疫印跡。左圖:代表性免疫印跡;右圖:不同抗原的比率。η = 8對(duì)。C,卵巢碎裂增加CCN生長(zhǎng)因子和BIRC細(xì)胞凋亡抑制劑的表達(dá)。在通過GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)分析轉(zhuǎn)錄體水平之前,將切割或沒有切割的配對(duì)卵巢培育I小時(shí),接著移植。完整卵巢:實(shí)線,匯合的3部分:虛線。η = 10-15。D,卵巢碎裂增加CCN2蛋白。在免疫印跡之前,將切割或沒有切割的配對(duì)卵巢培育3-5小時(shí)。上圖:代表性印跡;下圖:定量分析。N = 3-5ο Ε,用CCN2、3、5和6處理增加卵巢外植體重量。在稱重之前,將來(lái)自10天小鼠的外植體用不同的CCN生長(zhǎng)因子培養(yǎng)4天。η = 5-6。平均值土 SEM ;*ρ<0.05。IN =完整;PI =部分。
[0019]圖3.Hippo信號(hào)傳導(dǎo)破環(huán)和Akt刺激促進(jìn)次級(jí)卵泡生長(zhǎng)的相加效果。A)次級(jí)卵泡響應(yīng)IVA處理。將次級(jí)卵泡(直徑115 μπι)從10天齡的小鼠中分離并用標(biāo)準(zhǔn)IVA方案體外培養(yǎng)(第一天,用3mM的bPV(hopic)和15ug/ml的740YP培養(yǎng),接著再單獨(dú)用740YP培養(yǎng)一天),接著再每日用FSH(100ng/ml)處理兩天(IVA+FSH)。將對(duì)照組單獨(dú)用培養(yǎng)基處理4天,或者用IVA試劑處理兩天,接著單獨(dú)用培養(yǎng)基(單獨(dú)IVA)處理。B)卵巢碎裂和IVA處理對(duì)卵巢重量增加和次級(jí)卵泡生長(zhǎng)產(chǎn)生相加效果。將來(lái)自10天齡小鼠的配對(duì)卵巢碎裂成三部分。將來(lái)自一側(cè)的碎片用IVA方案處理(30uM bpV(hopic)和150ng/ml740YP處理I天,接著再僅用740YP處理一天),而將來(lái)自對(duì)側(cè)的碎片僅在培養(yǎng)基中培育。隨后將卵巢碎片異體移植到成年切除卵巢的小鼠的腎囊中,其中對(duì)宿主注射FSH (每日,IIU/動(dòng)物)。5天后,將卵巢移植物收回,固定并稱重。左圖:移植物重量;右圖:移植卵巢碎片的卵泡動(dòng)力學(xué)。處于不同階段的卵泡的百分?jǐn)?shù)基于移植物的連續(xù)切片測(cè)定。C,用或未用Akt刺激劑處理的完整和碎裂的鼠卵巢在移植前后的卵泡動(dòng)力學(xué)。左:總卵泡數(shù),右:卵泡動(dòng)力學(xué)。η =
4。上述字母符號(hào)指示顯著差異(ρ〈0.05)。D-F.將玻璃化人類皮層帶解凍并碎裂成立方體,之后用Akt刺激劑處理2天,接著移植到免疫缺陷小鼠中歷時(shí)4周。D.在移植之前的皮層帶。箭頭:次級(jí)卵泡,三角(arrowhead):原始/初級(jí)卵泡。標(biāo)度條,100 μπι。Ε.就地腎移植物(左)和在分離之后的腎移植物(右),顯示竇卵泡。F.兩個(gè)大竇卵泡的組織學(xué),其中一個(gè)的側(cè)視圖顯示處于胚泡階段的卵細(xì)胞(箭頭)。標(biāo)度條,1mm。平均值土SEM ;*p<0.05。
[0020]圖4.卵巢碎裂/移植產(chǎn)生有活力的幼崽。A,在有或沒有切割成三部分的情況下,接著移植5天,來(lái)自10天小鼠的卵巢移植物的代表性組織學(xué)。條形圖= 200 μπι。B,在移植來(lái)自10天齡小鼠的完整和碎裂(3部分)的卵巢前后的絕對(duì)卵泡數(shù)。左:總卵泡數(shù),右:卵泡動(dòng)力學(xué)。η = 5個(gè)卵巢。上述星號(hào)符號(hào)指示顯著差異(ρ〈0.05)。C,在切割/移植來(lái)自10天小鼠的卵巢之后取回卵細(xì)胞(左圖),以便受精和胚胎發(fā)育。顯示成熟卵細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(中圖)和發(fā)育到不同胚胎階段的受精卵細(xì)胞的分?jǐn)?shù)(右圖)。在右圖中的對(duì)照表示在用eCG處理23天小鼠、接著用hCG處理以誘發(fā)排卵(3)之后獲得的卵細(xì)胞。η = 8個(gè)卵巢。GVBD:胚泡分解。D.在轉(zhuǎn)移從在卵巢碎裂/移植之后獲得的成熟卵細(xì)胞得到的胚胎之后產(chǎn)出健康幼崽。將來(lái)自10天B6D2F1小鼠的卵巢碎裂成三部分,之后移植5天,其中每日FSH處理。隨后將動(dòng)物用eCG(48小時(shí))和hCG(12小時(shí))依次處理,之后取回成熟卵細(xì)胞以便受精和胚胎培養(yǎng)。將2-細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移到CDl品系的代孕母體,接著妊娠并生產(chǎn)。由卵巢碎裂得到的幼崽是健康并能生育的。E和F,卵巢碎裂和移植促進(jìn)大鼠的卵泡發(fā)育。來(lái)自10天大鼠的配對(duì)卵巢完整地或以三部分自體移植到相同動(dòng)物的腎中。在測(cè)定卵巢重量之前,將動(dòng)物用FSH處理5天。E,分離的卵巢的形態(tài)。F.卵巢重量。在括號(hào)中的數(shù)為所使用的卵巢的數(shù)。平均值+/-SEM,ρ〈0.05。
[0021]圖5.在卵巢碎裂之后Hippo途徑基因的卵巢表達(dá)并增加核YAP定位。Α,在10天小鼠卵巢中Hippo途徑基因的轉(zhuǎn)錄體的實(shí)時(shí)RT-PCR分析。η = 6。B,在10天齡(dlO)小鼠的卵巢中Hippo途徑蛋白的免疫印跡。來(lái)自3T3細(xì)胞的提取物充當(dāng)對(duì)照(3T3)。特殊信號(hào)用箭頭標(biāo)記。PYAP:磷酸基-YAP(Serl27)。C,在成年小鼠的卵巢中的Hippo信