一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于涉及一種基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異 性CTL的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤已成為人類第一號(hào)"殺手"，在人類抗癌歷史上，與癌癥抗?fàn)幱羞^(guò)三大利 器：外科手術(shù)，化療，與放射治療。但這三種方法雖然能在短期內(nèi)有效的減輕腫瘤負(fù)荷，但仍 不能有效清除腫瘤細(xì)胞。微小殘留病灶、對(duì)放療、化療的部分敏感和耐藥是腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移 的根源，而復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移正是腫瘤患者死亡的主要原因。常規(guī)治療方法已力不從心，開(kāi)發(fā)新型 的腫瘤治療技術(shù)與產(chǎn)品迫在眉睫。
[0003] 至此，免疫科學(xué)家斯坦曼利用先前發(fā)現(xiàn)的樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC)，激 發(fā)自身的免疫力清除腫瘤，利用自己的研究成果，將生命由預(yù)期的數(shù)月延長(zhǎng)到四年。由于 他對(duì)免疫領(lǐng)域的貢獻(xiàn)在2011年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，在腫瘤領(lǐng)域并開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)新的天 地一腫瘤免疫細(xì)胞治療。他的研究成果現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，已經(jīng)成為繼手術(shù)、放、化 療后的第四種癌癥治療方式。由于腫瘤免疫細(xì)胞治療能夠聯(lián)合手術(shù)、化療、放療精準(zhǔn)清除殘 余腫瘤細(xì)胞，防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，加強(qiáng)免疫監(jiān)視作用，提升患者生存質(zhì)量和時(shí)間，并且沒(méi)有放 化療的毒副作用和手術(shù)的巨大傷害。近年來(lái)，在臨床應(yīng)用中受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，是國(guó)內(nèi) 外研究的熱點(diǎn)，已被公認(rèn)為是最具前景的腫瘤治療方法。
[0004] 1992年Stanford醫(yī)學(xué)院的2位教授成立了世界上第一家以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗 公司（Dendreon，CA)，該公司的產(chǎn)品Provenge已于2010年4月29日獲得FDA批準(zhǔn)上市。 但是DC在體內(nèi)的功能受到患者本身免疫狀態(tài)，腫瘤微環(huán)境的影響，而腫瘤患者體內(nèi)存在大 量抑制因子，因此DC的體內(nèi)效果并不如體外效果理想。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)構(gòu)建是 近期興起的免疫治療技術(shù)，因其具有特異、直接殺傷腫瘤靶細(xì)胞的能力，因此成為研究的熱 點(diǎn)。
[0005] 目前腫瘤的細(xì)胞免疫治療效果仍不理想，主要原因包括如下兩方面：
[0006] 1)腫瘤患存在免疫抑制的微環(huán)境，一方面，腫瘤組織的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受， 另一方面，腫瘤細(xì)胞能夠分泌多種免疫抑制因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞或抑制DCs功 能。
[0007] 2)腫瘤免疫治療中應(yīng)用的抗原大多表達(dá)在已分化的腫瘤細(xì)胞上，而腫瘤干細(xì)胞并 不表達(dá)這些抗原，所誘發(fā)的免疫殺傷反應(yīng)并不針對(duì)腫瘤干細(xì)胞。加上目前常規(guī)DC加入患者 腫瘤細(xì)胞裂解得到的腫瘤抗原，使DC負(fù)載腫瘤抗原，雖然這種方法能使得DC攝取到患者的 腫瘤抗原，但由于腫瘤抗原的抗原性較弱，DC對(duì)腫瘤抗原攝取量較少，其遞呈抗原能力也就 較低，使其產(chǎn)生的CTL細(xì)胞的殺傷活性不足，并且利用單純的細(xì)胞因子放大擴(kuò)增CTL細(xì)胞數(shù) 量有限，產(chǎn)生的Tcm比例小，進(jìn)而影響抗腫瘤治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中腫瘤免疫治療抗原攝取量 少，產(chǎn)生的CTL細(xì)胞殺傷活性不足，抗腫瘤治療效果不佳的局限性，從而提出一種殺傷能力 強(qiáng)，抗原性特異性強(qiáng)，縮短患者治療時(shí)間且穩(wěn)定性良好，便于操作和臨床腫瘤過(guò)繼性免疫細(xì) 胞治療應(yīng)用推廣的HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法及其應(yīng)用。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的公開(kāi)了一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL 的制備方法，所述方法為：
[0010] 采用樹(shù)突狀細(xì)胞上的C-型凝集素類型的糖修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為抗原載體， 包裹腫瘤干細(xì)胞抗原，制備抗原特異性T淋巴細(xì)胞。
[0011] 所述的一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體 包括磷脂酰乙醇胺雙分子層、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖。
[0012] 所述的一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法，所述的C-型凝集 素類型的糖為甘露糖或甘露糖苷。
[0013] 所述的一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法，所述樹(shù)突狀細(xì)胞為 72小時(shí)快速成熟的負(fù)載腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2的樹(shù)突狀細(xì)胞。
[0014] 所述的一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法，所述抗原是 HLA-A0201限制性腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2表位肽9肽，包涵表位肽15肽及包涵表位肽30肽 及人工合成和基因改造的或突變的Sox2抗原肽。
[0015] 所述的一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法，所述的樹(shù)突狀細(xì)胞 包括外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞，造血干細(xì)胞和臍血干細(xì)胞誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞DC。
[0016] 所述的一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體 通過(guò)在磷脂分子的極性基團(tuán)上連接甘露糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。
[0017] 所述的一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法，所述甘露糖在所述 聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺一端形成甘露糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。
[0018] 所述的一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法，所述的工程細(xì)胞跨 膜表達(dá)人4-1BBL、IL-21的K562細(xì)胞株的人工抗原提呈細(xì)胞。
[0019] 任意所述一種HLA-A0201限制性抗Sox2特異性CTL的制備方法在生物工程領(lǐng)域 中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的腫瘤免疫細(xì)胞抗腫瘤療效不佳等問(wèn)題，提出采用72小時(shí)快速 成熟DC技術(shù)和靶向樹(shù)突狀細(xì)胞上C-型凝集素受體的陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為抗原載體，包裹腫 瘤干細(xì)胞抗原Sox2,通過(guò)大大提高DC細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的攝取效率和抗原呈遞能力，增強(qiáng)其 抗腫瘤作用，結(jié)合工程細(xì)胞和細(xì)胞因子大量擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞和Tcm，從而增強(qiáng)抗腫瘤 免疫作用。
[0022] 此外，本發(fā)明以腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2制備的抗原特異性CTL創(chuàng)新之處在于：以腫 瘤干細(xì)胞為治療的靶目標(biāo)，能夠誘導(dǎo)更有效的靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性T淋 巴細(xì)胞，直接針對(duì)腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的根源，使腫瘤治療更具有"治本"性。
[0023] 本發(fā)明采用具有定向靶向的納米脂質(zhì)體負(fù)載腫瘤干細(xì)胞抗原制備抗原特異性T 淋巴細(xì)胞。與常規(guī)抗原特異性T淋巴細(xì)胞制備技術(shù)相比，本發(fā)明制備腫瘤干細(xì)胞抗原特異 性T淋巴細(xì)胞技術(shù)不僅采用新型納米脂質(zhì)體負(fù)載腫瘤干細(xì)胞抗原，以腫瘤干細(xì)胞為治療的 靶目標(biāo)，能夠誘導(dǎo)更有效的靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，直接針對(duì) 腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的根源，使腫瘤治療更具有"治本"性；而且采用72小時(shí)快速成熟樹(shù)突狀細(xì) 胞，比常規(guī)的7-8天收獲成熟的DC能大大縮短腫瘤患者最佳治療的時(shí)間窗口；同時(shí)采用工 程細(xì)胞放大擴(kuò)增抗原特異性T淋巴細(xì)胞，能產(chǎn)生高比例的殺傷能力更強(qiáng)的Tcm。
[0024] 本發(fā)明腫瘤干細(xì)胞抗原特異性T淋巴細(xì)胞制備方法簡(jiǎn)便易行，免疫靶點(diǎn)針對(duì)腫瘤 干細(xì)胞，抗原性強(qiáng)且穩(wěn)定性良好，便于操作和臨床腫瘤過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療應(yīng)用推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合 附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中：
[0026] 圖IA是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例2中72小時(shí)快速成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表型；
[0027] 圖IB是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例2中72小時(shí)快速成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表型；
[0028] 圖IC是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例2中72小時(shí)快速成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表型；
[0029] 圖2A是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0030] 圖2B是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0031] 圖2C是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0032] 圖2D是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0033] 圖2E是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0034] 圖2F是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0035] 圖3A是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0036] 圖3B是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0037] 圖3C是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0038] 圖3D是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0039] 圖3E是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0040] 圖3F是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例3中腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2 CTL細(xì)胞毒性因子IFN-r檢 測(cè)；
[0041] 圖4A是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例4采用工程細(xì)胞兩周擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞抗原SOX2CTL的 Tcm表型；
[0042] 圖4B是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例4采用工程細(xì)胞兩周擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2CTL的 Tcm表型；
[0043] 圖4C是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例4采用工程細(xì)胞兩周擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2CTL的 Tcm表型；
[0044] 圖5A是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例4采用工程細(xì)胞兩周擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2CTL的 Tcm表型；
[0045] 圖5B是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例4采用工程細(xì)胞兩周擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2CTL的 Tcm表型；
[0046] 圖5C是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例4采用工程細(xì)胞兩周擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞抗原Sox2CTL的 Tcm表型。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本 發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0048] 實(shí)施例1本實(shí)施例公開(kāi)了 C-型凝集素類型的糖修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗原載體制 作，具體操作如下：