一種載microRNA的石墨烯-金納米復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種靶向誘導(dǎo)耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡的納米藥物遞送系統(tǒng)及其制備方法。該藥物遞送系統(tǒng)通過(guò)負(fù)載非化療藥物而降低毒副作用、避免多藥耐藥，并以靶向、控釋、聯(lián)合療法的方式提高對(duì)耐藥卵巢癌的治療效果。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康和生活質(zhì)量的常見(jiàn)病。其中卵巢癌的全球病死率在婦科腫瘤中列居首位，是女性健康的殺手之一。中國(guó)腫瘤登記年報(bào)最新數(shù)據(jù)也顯示，我國(guó)卵巢癌目前發(fā)病率為4.54/10萬(wàn)，同期死亡率高達(dá)3.44/10萬(wàn)，嚴(yán)重威脅我國(guó)廣大女性的生命安全與生活質(zhì)量。
[0003]癌癥的治療方法主要包括化學(xué)治療、手術(shù)治療和放射治療。與手術(shù)治療和放射治療相比，化學(xué)治療是一種全身性治療手段，對(duì)原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和亞臨床轉(zhuǎn)移灶均有治療作用，適于中、晚期腫瘤，轉(zhuǎn)移性腫瘤和亞臨床轉(zhuǎn)移灶。目前卵巢癌臨床治療以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以聯(lián)合化療方案為主，即便是晚期患者，首次治療通常也能有效緩解，但患者五年存活率仍徘徊在20-30%，究其原因多藥耐藥是導(dǎo)致卵巢癌治療失敗的關(guān)鍵原因。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞接觸某種抗癌藥產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，也會(huì)對(duì)其它結(jié)構(gòu)和功能不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥，多藥耐藥基因(MDR1)及其所編碼的細(xì)胞膜P糖蛋白(P-gp)表達(dá)增加、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性增強(qiáng)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性降低、多藥耐藥相關(guān)蛋白增加等是其重要特征。因此，尋求針對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞具有高效殺傷作用的治療手段十分迫切。
[0004]抗癌藥物在全身給藥時(shí)存在著兩個(gè)問(wèn)題:第一，有些藥物難于到達(dá)患部，為了提高藥物在患部的濃度，就必須提高給藥量，這樣便會(huì)造成藥物浪費(fèi)和嚴(yán)重的毒副作用。第二，化學(xué)治療藥物毒性很強(qiáng)，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也有強(qiáng)烈的殺傷作用，有時(shí)還可能破壞患者的免疫功能，使癌癥患者往往由于其免疫功能遭受破壞，受病菌感染致死。所以有必要開(kāi)發(fā)出具有腫瘤靶向功能的藥物遞送載體，負(fù)載非化療藥物，降低毒副作用、避免多藥耐藥，從而提高治療效果。
[0005]靶向型藥物輸送是指運(yùn)用特殊的藥物輸送載體或者給藥技術(shù)，將藥物有目的地濃集于特定的組織或器官的給藥系統(tǒng)。靶向型藥物輸送載體最顯著的特點(diǎn)是能使藥物具有藥理活性的專(zhuān)一性，并增加藥物對(duì)靶組織的指向性和滯留性，減低藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，劑量少，提高藥物制劑的生物利用度，提高藥品的安全性、有效性、可靠性和順從性。到目前為止，納米材料是公認(rèn)最有希望的靶向型藥物輸送載體，具有尺寸小、比表面積大、表面反應(yīng)活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力強(qiáng)等特性，當(dāng)其作為藥物遞送系統(tǒng)時(shí)，有望實(shí)現(xiàn)器官靶向、高效和低毒等革命性的突破。
[0006]目前，用于負(fù)載藥物的納米材料一般包括脂質(zhì)體、金屬納米載體和高分子聚合物等，繼而通過(guò)在這些納米材料表面連接上革E向性分子(如腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體或特異性小分子)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物的靶向遞送作用。尤其是智能納米材料應(yīng)用于腫瘤藥物遞送系統(tǒng)，將具有其獨(dú)特功能，能夠隨局部環(huán)境的變化或刺激而產(chǎn)生反應(yīng)，發(fā)生結(jié)構(gòu)或功能的改變，使所載藥物順利在體內(nèi)的特定病灶部位釋放，從而實(shí)現(xiàn)靶向給藥，提高藥物的治療效果Ο
[0007]石墨烯是近年發(fā)現(xiàn)的一種二維碳納米材料。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，使其在生物醫(yī)學(xué)、復(fù)合材料、傳感器、能源等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。由于石墨烯具有單原子層結(jié)構(gòu)，其理論比表面積高達(dá)2600m2/g，非常適合做藥物載體。同時(shí)其兩個(gè)基面都可以吸附藥物，所以具有其他納米材料無(wú)可比擬的超高載藥率。并由于其大η共軛結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)J1-Ji相互作用固定治療腫瘤所需的疏水性藥物分子，這就使其在藥物傳遞系統(tǒng)方面具有良好的應(yīng)用前景。
[0008]而已知的金納米顆粒主要通過(guò)四種方式應(yīng)用于癌癥治療:①金納米顆粒自身的作用；②金納米顆粒攜帶抗癌藥物；③金納米顆粒的光熱療作用；④金納米顆粒攜帶抗癌藥物和光熱療的聯(lián)合作用。通過(guò)對(duì)其表面的修飾，金納米顆粒容易吸附小分子、寡肽、核酸等材料，實(shí)現(xiàn)攜帶抗癌藥物特異性靶向腫瘤細(xì)胞/腫瘤組織的功能；也可通過(guò)各種方式使所攜帶的抗癌藥物在特定部位、特定條件下緩控釋放，實(shí)現(xiàn)高效可控殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。而金納米顆粒作為抗癌藥物或藥物載體的獨(dú)特優(yōu)越性還在于，其顏色隨粒徑從小到大依次呈現(xiàn)出紅色到紫色的不同變化，可吸收不同波長(zhǎng)的光，產(chǎn)生熱效應(yīng)，進(jìn)而局部升溫殺傷腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)聯(lián)合療法。
[0009]在生物治療領(lǐng)域，除了傳統(tǒng)的核酸制劑、蛋白制劑，mi croRNA的作用日益受到關(guān)注。microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，主要通過(guò)與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)完全或部分互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。microRNA廣泛參與了生物體多種生理及病理過(guò)程，如個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡和分化、代謝、免疫與應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、腫瘤形成等。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNA參與了多種與卵巢癌密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，如癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲、凋亡等。其中，miR-193a在多種卵巢癌細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，以經(jīng)典的抑制凋亡的BCL-2家族之MCL1基因?yàn)槠渲苯幼饔冒袠?biāo)，激活caSpaSe3/7信號(hào)途徑，發(fā)揮抑癌基因的作用，且其表達(dá)量的變化與卵巢癌細(xì)胞耐藥相關(guān)。
[0010]然而，miR-193a不穩(wěn)定，極易被廣泛存在的核酸酶降解。開(kāi)發(fā)miR_193a分子藥物的主要障礙在于如何使miR-193a通過(guò)細(xì)胞膜，并且傳遞到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮降解靶基因mRNA的作用。目前，病毒型miR-193a載體雖然傳遞效率高，但是生物安全性限制了它的應(yīng)用。非病毒miR-193a載體，包括合成納米顆粒聚合體和脂質(zhì)體載體來(lái)進(jìn)行運(yùn)輸?shù)确椒ㄔ谝欢ǔ潭壬夏芨纳苖iR-193a的效果。因此，如何選擇合適的載體提高目標(biāo)miR_193a攜帶進(jìn)入相關(guān)組織細(xì)胞的效率，并且保護(hù)miR-193a不被降解，是實(shí)現(xiàn)miR_193a治療的難題。因此，相較于傳統(tǒng)的廣譜型的抗癌化學(xué)藥物，選擇生物學(xué)藥物miR-193a，來(lái)控制耐藥卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，不僅相對(duì)毒性較小，結(jié)合納米藥物遞送載體后更具有高效、靶向、可控的優(yōu)點(diǎn)，將有望開(kāi)發(fā)出針對(duì)耐藥卵巢癌的藥物制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了一種載microRNA的石墨烯-金納米復(fù)合物。
[0012]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了一種載microRNA的石墨稀-金納米復(fù)合物的制備方法。
[0013]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了一種載microRNA的石墨稀-金納米復(fù)合物在制備靶向誘導(dǎo)耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡的納米藥物遞送系統(tǒng)方面的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了一種靶向誘導(dǎo)耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡的納米藥物遞送系統(tǒng)。
[0015]技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種載microRNA的石墨稀-金納米復(fù)合物，該復(fù)合物由里而外由三部分有機(jī)組成:金納米顆粒、microRNA和石墨稀。
[0016]進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的microRNA為miR_193a。
[0017]上述的一種載microRNA的石墨稀-金納米復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0018]1)載microRNA金納米顆粒的制備:滴加新鮮配制的硼氫化鈉、十六烷基三甲基溴化銨和氯金酸到20-100mL水中，在室溫下保持20分鐘磁力攪拌，得到粒徑約3_10nm的金納米顆粒，用microRNA和金納米顆?；旌喜嚢?0分鐘，離心回收上述金納米顆粒，上清液測(cè)0D值，定量microRNA的負(fù)載量；
[0019]2)載P-gP抗體的氧化石墨稀的制備:將石墨稀和氯化鈉以質(zhì)量比1:50 —起碾磨十分鐘，將研磨物在水中溶解并過(guò)濾，將過(guò)濾物用H2S04氧化并攪拌8小時(shí)得到混合物1，將lg/mL ΚΜη04溶液逐滴加入到上述混合物1中，期間保持反