PTSS+6-0HDA(200ymol/L)組；
[0037] 圖16免疫組化觀察caspase-3、TNF-a、COX-2指標(biāo)的變化。
[0038]其中，A:對(duì)照組；B:6-0皿A組；C:PTSS組；1 :Caspase-3, 2 :TNF-a，3 :C0X-2,Bar =100ym〇
【具體實(shí)施方式】
[0039] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0040] 本發(fā)明提供了一種香椿子多酪的提取方法，包括W下步驟：步驟A:將香椿子破碎 處理，過(guò)藥篩得到香椿子藥粉；步驟B:將得到的香椿子藥粉加入石油酸，常壓水浴回流提 取得到藥渣，將藥渣中的溶劑揮發(fā)掉后進(jìn)行低溫烘干處理，使所述藥渣含水量控制在3%; 步驟C:將步驟B得到的香椿子藥渣放入超聲波細(xì)胞破碎機(jī)處理，加入乙醇，提取香椿子多 酪。其中，用到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備有UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、真空累、SCIENTZ-IID超聲波 細(xì)胞破碎機(jī)和AL104電子分析天平。
[0041] 在實(shí)施本發(fā)明所提供的香椿子多酪的具體提取方法之前首先建立和制備標(biāo)準(zhǔn)曲 線：
[0042]精密量取 0. 2mg/ml沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0y1、20y1、50y1、100y1、150y1、 200y1、250y1，加蒸饋水補(bǔ)足至250y1。加入福林酪試劑0. 4ml，搖勻，靜置Imin,再加入 10 %碳酸鋼試液0. 4ml，蒸饋水4.Oml,搖勻，顯色20min，在波長(zhǎng)760皿處測(cè)定各管吸光度。 W沒(méi)食子酸對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0043] 再次，按W下步驟對(duì)香椿子多酪進(jìn)行提取，步驟A:將香椿子破碎處理，過(guò)藥篩得 到香椿子藥粉；步驟B:將得到的香椿子藥粉加入石油酸，常壓水浴回流提取得到藥渣，將 藥渣中的溶劑揮發(fā)掉后進(jìn)行低溫烘干處理，使所述藥渣含水量控制在3%;步驟C:將步驟B 得到的香椿子藥渣放入超聲波細(xì)胞破碎機(jī)處理，加入乙醇，提取得到香椿子多酪。
[0044] 具體的，稱取適量干燥香椿子，使用萬(wàn)能粉碎機(jī)破碎5min，過(guò)100目藥篩；取香椿 子藥粉，將得到的香椿子藥粉加入石油酸，水浴常壓回流提取兩次得到藥渣，分別為1.化， Ih;將藥渣中的溶劑揮發(fā)掉后進(jìn)行低溫烘干處理，具體為40°C低溫烘干化，使含水量為 3%，密閉保存?zhèn)溆谩?br>[0045] 精確稱取2g香椿子藥渣，將藥渣放入超聲波細(xì)胞破碎機(jī)處理，加入乙醇，分別設(shè) 置乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70% )，液料比（10:1 血/g、20:l血/g、30:l血/邑、 40:1血/邑、50:1血/邑），提取時(shí)間巧111；[]1、1〇111；[]1、15111；[]1、2〇111；[]1、25111；[]1)^及提取功率（100訊、 150w、200w、250w、300w)對(duì)多酪進(jìn)行多次提取操作。
[0046] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還可采用響應(yīng)面法對(duì)多酪超聲提取工藝的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在單 因素基礎(chǔ)上，選用Box-BenhnkenDesign設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素各取S個(gè)水平，W香椿子多 酪提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Design-Exped軟件建模，進(jìn)行工藝優(yōu)化研究。
[0047] 本發(fā)明進(jìn)行多酪提取工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
[0048]W吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y= 0. 513X+0. 0031，r= 0. 9996,說(shuō)明沒(méi)食子酸在0~2.Omg/mL范圍線性關(guān)系良好，見(jiàn)圖1。
[0049] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理結(jié)果，如實(shí)施例1~實(shí)施例20所示。
[0050] 其中實(shí)施例1~實(shí)施例5是乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)香椿子多酪提取量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0051]在其他條件不變的情況下，分別設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、 70%，作為實(shí)施例1~實(shí)施例5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)香椿子多酪提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化作 圖，如圖2。
[005引由圖2可知：多酪提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大先增加后減小，在50%時(shí)達(dá)到最大 值?；诖?，暫定50%乙醇作為提取溶劑。
[0053] 其中實(shí)施例6~實(shí)施例10為液料比對(duì)香椿子多酪提取量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0054] 在其他條件不變的情況下，分別設(shè)置液料比為10:1血/g、20:l血/g、30:l血/邑、 40:ImL/g、50:ImL/g，作為實(shí)施例6~實(shí)施例10進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)香椿子多酪提取率隨液料比的 變化作圖，如圖3。
[00巧]由圖3可知：多酪提取量隨液料比增加先提高后降低，在20:ImL/g時(shí)達(dá)最大值，為 9. 84mg?；诖耍瑫憾ㄒ毫媳葹?0:1血/邑。
[0056] 其中，實(shí)施例11~實(shí)施例15為提取時(shí)間對(duì)香椿子多酪提取量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0057] 在其他條件不變的情況下，分別設(shè)置提取時(shí)間為5min、10min、15min、20min、 25min，作為實(shí)施例11~實(shí)施例15進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)香椿子多酪提取率隨提取時(shí)間的變化作圖， 如圖4。
[0058] 由圖4可知：多酪提取量提取時(shí)間延長(zhǎng)先增大再減小，在15min時(shí)達(dá)最大值?；?此，暫定提取時(shí)間為15min。
[0059] 其中，實(shí)施例16~實(shí)施例20為超聲提取功率對(duì)香椿子多酪提取量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0060] 在其他條件不變的情況下，分別設(shè)置超聲功率為100*、150*、200*、250*、300巧，作 為實(shí)施例16~實(shí)施例20進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)香椿子多酪提取率隨超聲功率的變化作圖，如圖5。
[0061] 由圖5可知：多酪提取量隨超聲功率增加先變大再減小，在200W時(shí)達(dá)最大值?；?于此，暫定提取功率為200W。
[0062] 本發(fā)明提供的響應(yīng)面法對(duì)香椿子多酪的提取工藝優(yōu)化結(jié)果如下：
[0063] 1、Box - Benhnken設(shè)計(jì)方案
[0064] 選取體積分?jǐn)?shù)（A)、液料比度)、提取時(shí)間（C)、提取功率值）為考察變量，W多酪提 取量為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素=水平實(shí)驗(yàn)，Design-Exped軟件優(yōu)化超聲輔助提取參數(shù)，因 素和水平見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。
[0065] 表1試驗(yàn)因素水平表
[0067] 表2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果
[0068]
[0069] 2、模型方程構(gòu)建
[0070] 應(yīng)用Design-Expert軟件進(jìn)行二多元回歸擬合及回歸模型方差分析，見(jiàn)表3,所 得二次多項(xiàng)回歸方程為：Y= 2. 59-0. 12A+0. 095B+0. 009C+0. 17D+0. 015AB+0. 21AC+0. 013A D+0.12BC+0. 2BD-0. 29CD-0. 15A2-0. 35B2-0. 27C2-0. 46D2。
[0071] 表3方差分析的回歸方程
[0072]
[0073] *P< 0. 05
[0074]叮 < 0.Ol [00巧]***P< 0.OOOl
[0076] 回歸方程F值為152.55,P<0.0001，表明回歸模型具有顯著性；相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 9935,說(shuō)明模型擬合程度較好；校正復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj= 0. 9870,說(shuō)明該模型可解釋 98. 70%響應(yīng)值變化，但不能解釋總變異的1. 30%。體積分?jǐn)?shù)、液料比、時(shí)間、功率對(duì)香椿子 多酪提取量影響順序?yàn)椋禾崛」β省刁w積分?jǐn)?shù)〉液料比〉提取時(shí)間。
[0077] 3、響應(yīng)曲面分析
[0078] 根據(jù)回歸方程繪制等高線及響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖6。在一定濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)值隨因素 的不斷增大而增加，當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到極大值時(shí)，響應(yīng)值隨因素的增大而減小。由圖6的B、D、 E、G、H、I、J、K、L可知，AC、BC、BD、CD四者交互作用的等高線呈楠圓形，且響應(yīng)面圖中曲面 睹峭，表明其對(duì)多酪的提取量有顯著影響。
[0079] 4、工藝優(yōu)化
[0080] 通過(guò)響應(yīng)曲面圖及Design-Expert分析，超聲輔助提取香椿子多酪工藝條 件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為43. 12 %，液料比為19. 03 :1血/g,提取時(shí)間為12. 55min，提取功率為 211. 35w，理論提取率為2. 64mg/g?？紤]實(shí)驗(yàn)可操作性，采取如下條件，即實(shí)施例21 :乙醇體 積分?jǐn)?shù)為43%，提取功率211W，提取13min，液料比為19:1血/邑。
[0081] 5、工藝驗(yàn)證
[0082] 精密稱量同一批香椿子5份，按優(yōu)化條件提取香椿子多酪，平均提取率為2. 63mg/ g，相對(duì)于預(yù)測(cè)值誤差為-0. 38%，表明響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取香椿子多酪工藝穩(wěn)定可靠， 具有一定應(yīng)用價(jià)值。
[0083] 本發(fā)明在香椿子多酪提取方法的基礎(chǔ)上，對(duì)其用途特別是在帕金森病的治療上有 一定的作用，香椿子及其香椿子多酪具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗高血壓及糖尿 病等多種生物學(xué)功能，通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證香椿子多酪在治療帕金森病上的用途。
[0084] 本實(shí)驗(yàn)在建立神經(jīng)毒素6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞PD模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用MT法、流 式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色等實(shí)驗(yàn)方法研究香椿子多酪提取物（polyphenols 化om T.sinensisseeds,PTS巧對(duì)6-OHDA損傷PC12細(xì)胞的抗炎及抗調(diào)亡作用，為中藥治療 PD提供新思路。
[00財(cái)本實(shí)驗(yàn)用到的材料為試劑PTSS、PC12細(xì)胞株、改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、膜蛋白 酶、胎牛血清、MTT、D