溶瘤病毒的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明要求2013年3月5日提交的美國臨時專利申請第61/772, 803號的優(yōu)先權(quán)， 其通過引用全文納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明的領(lǐng)域至少包括免疫學、病毒學、細胞生物學、分子生物學和醫(yī)藥，包括癌 癥醫(yī)藥。
【背景技術(shù)】
[0003] 雖然若干惡性腫瘤的治愈率已得到顯著改善，但在過去的數(shù)十年中晚期實體瘤患 者的結(jié)果仍殘酷地維持不變，這強調(diào)需要新療法。溶瘤痘苗病毒是現(xiàn)有實體瘤治療選項的 有用補充，因為其具有安全性和能夠感染腫瘤細胞、在腫瘤細胞中復制并裂解腫瘤細胞。雖 然臨床研究已顯示瘤內(nèi)或靜脈內(nèi)注射溶瘤痘苗病毒是安全的并可誘導腫瘤裂解，但溶瘤痘 苗病毒的抗腫瘤效力未達到最佳且大多數(shù)腫瘤發(fā)生，這強調(diào)需要對溶瘤痘苗病毒療法進行 進一步改進。
[0004] 概述
[0005] 本發(fā)明涉及用于針對個體的免疫治療的方法和/或組合物。在【具體實施方式】中， 所述個體是患有癌癥且需要癌癥治療的哺乳動物。該癌癥可以是任何類型，包括肺癌、乳腺 癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、脾癌、皮膚癌、腦癌、血液癌、腎癌、甲狀腺癌等。 該癌癥可以是實體瘤。在特定情況下，該癌癥具有一種或多種腫瘤標志物，包括腫瘤抗原。 在本發(fā)明的特定方面中，一種或多種腫瘤抗原可存在于至少一些癌細胞中，且一種或多種 腫瘤抗原可以是免疫治療的靶標。
[0006] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，提供了涉及適應于免疫治療的重組溶瘤病毒（例如 具有T細胞接合物臂的溶瘤病毒（TEA-0V))載體的方法和組合物。本發(fā)明提供的TEA-0V提 供的益處超過單獨的溶瘤病毒和單獨的T細胞，益處在于重組溶瘤病毒在直接殺傷腫瘤細 胞外，還通過刺激被病毒感染的腫瘤附近的T細胞來殺傷腫瘤細胞。在具體的實施方式中， 這些載體經(jīng)瘤內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射，但本發(fā)明也涵蓋其他遞送方式。在某些實施方式中，該 載體包含雙特異性活性，且在【具體實施方式】中其涉及存在激活結(jié)構(gòu)域和抗原識別結(jié)構(gòu)域。 在具體方面中，該溶瘤病毒載體是具有T細胞接合物臂的痘苗病毒，稱作TEA-VV。
[0007] 在第一方面中，提供了重組溶瘤病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其經(jīng)工程改造以包含具 有啟動子的表達區(qū)域，該啟動子引導編碼雙特異性T細胞接合物多肽（例如靶向EphA2、 HER2、GD2或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的接合物）的核酸表達。在【具體實施方式】中，該雙特異 性T細胞接合物多肽包含激活結(jié)構(gòu)域和抗原識別結(jié)構(gòu)域。在某些實施方式中，該激活結(jié)構(gòu) 域是T細胞受體多肽的受體或配體，例如結(jié)合CD3以激活T細胞的多肽。在某些實施方式 中，該抗原識別結(jié)構(gòu)域是針對目標細胞（如癌細胞）上細胞表面蛋白質(zhì)的受體或配體。在 更具體的實施方式中，激活結(jié)構(gòu)域和/或抗原識別結(jié)構(gòu)域之一或兩者都是抗體，例如單鏈 抗體，例如單鏈可變區(qū)片段（scFv)。在具體的實施方式中，該抗原識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合目標細 胞上存在的分子，且該抗原識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合的細胞受體引發(fā)最終對受體目標分子具有毒性 的過程。在【具體實施方式】中，雙特異性涉及兩個抗體片段或抗原結(jié)合片段或其衍生物，如單 鏈可變區(qū)片段（scFv)。雖然在某些實施方式中一個scFv特異性針對CD3,但在替代性實施 方式中，該scFv特異性針對TCR復合物的另一組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，TCR復合物 是可變TCRa和β鏈的八聚體復合物，其具有三個二聚體信號轉(zhuǎn)導模塊⑶3δ/ε、⑶3 γ/ ε和⑶3 ζ / ζ或ζ/η。雖然在一些情況下本發(fā)明公開的組合物使用scFv靶向⑶3ε，但 本發(fā)明也涵蓋使用特定scFv靶向其他⑶3分子（特別是⑶3ζ)或TCRa和β鏈。在具 體實施方式中，本發(fā)明涵蓋的靶向分子不是TCR復合物的一部分（⑶27、⑶28、⑶40、⑶134、 ⑶137和⑶278)。在具體的實施方式中，一個scFv特異性針對Τ淋巴細胞上的⑶3分子且 另一scFv特異性針對選擇的具體腫瘤抗原。
[0008] 在某些實施方式中，且不受理論的限制，帶T細胞接合分子臂的溶瘤病毒（例如帶 T細胞接合物臂的溶瘤痘苗病毒）促進腫瘤中的T細胞浸潤并通過病毒表達的T細胞接合 分子誘導未受病毒感染的腫瘤細胞的周邊殺傷（bystanderkilling)，導致增強的抗腫瘤 作用。
[0009] 可選擇或調(diào)節(jié)針對腫瘤抗原的特定scFv以識別相應癌細胞，該癌細胞包含（例如 在其細胞表面上顯示的）特定腫瘤抗原。在【具體實施方式】中，該腫瘤抗原是：EphA2、HER2、 ⑶2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5Τ4、8Η9、α νβ6整聯(lián)蛋白、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、 CD20、CD22、κ輕鏈、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD 123、CD 138、CD 171、 CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎 兒AchR、葉酸受體a、⑶2、⑶3、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2、ILllRa、IL13Ra2、KDR、Lambda、 Lewis-Y、MCSP、間皮素、]?11。1、]\111。16、從^1、疆620配體、附450-1、？狀1^、？5〇厶、？5(：1、？5嫩、 R0R1、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF受體，以及其他在腫 瘤的胞外基質(zhì)或腫瘤的壞死區(qū)中存在的示例性抗原，如生腱蛋白、纖連蛋白的癌胚變體。
[0010] 在【具體實施方式】中，本發(fā)明提供了一種溶瘤痘苗病毒，其包含編碼雙特異性T細 胞接合分子的多核苷酸，所述雙特異性T細胞接合分子靶向EphA2并能比未改良的痘苗 病毒更有效地誘導表達EphA2的腫瘤的裂解。在【具體實施方式】中，該病毒載體編碼雙特異 性T細胞接合分子且還編碼表達共刺激分子的一個或多個多核苷酸，所述共刺激分子包括 CD70、CD80、CD83、CD86、CD134L(0X40L)和CD137L(41BBL)。在一些實施方式中，該病毒載體 編碼至少一個二聚化結(jié)構(gòu)域或至少一個三聚化結(jié)構(gòu)域。該二聚化或三聚化結(jié)構(gòu)域可以某些 構(gòu)型位于病毒載體上。在【具體實施方式】中，編碼二聚化或三聚化結(jié)構(gòu)域的核酸序列位于編 碼激活結(jié)構(gòu)域和抗原識別結(jié)構(gòu)域的核酸之間。具體的示例性本發(fā)明組合物包含例如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 的序列。
[0011] 在某些實施方式中，該痘苗病毒可以是惠氏（Wyeth)、改良痘苗安卡拉（MVA)、李 斯特（Lister)或西部保留地（WR)毒株。該啟動子可以是痘苗病毒啟動子、合成的啟動子、 至少在至少感染早期期間引導轉(zhuǎn)錄的啟動子，或至少在感染晚期期間引導轉(zhuǎn)錄的啟動子。
[0012] 本發(fā)明的一種示例性TEA-VV在體外和體內(nèi)表達功能性雙特異性接合分子；顯示 的病毒/復制/腫瘤裂解效力與未改良的痘苗病毒相似；與未改良的痘苗病毒相比在人T 細胞存在時更有效地誘導腫瘤殺傷；和/或有效地誘導未感染病毒的細胞的周邊殺傷；該 組合物還在體內(nèi)抑制腫瘤進展。僅作為說明性示例，使用本發(fā)明的方法殺傷了A549腺癌性 人齒槽基底上皮細胞。
[0013] 在另一個實施方式中，可以使用除溶瘤痘苗病毒以外的任何類型的合適的溶瘤病 毒載體以表達用于癌癥治療的雙特異性T細胞接合分子。在具體的實施方式中，該載體是 溶瘤腺病毒載體（AdV)、單純皰疹病毒（HSV)、呼腸孤病毒、黏液瘤病毒（MYXV)、脊髓灰質(zhì)炎 病毒、水泡性口炎病毒（VSV)、麻疹病毒（MV)和新城疫病毒（NDV)等。在某些實施方式中， 該病毒多核苷酸編碼包含激活結(jié)構(gòu)域和抗原識別結(jié)構(gòu)域的融合分子，且在【具體實施方式】中 各結(jié)構(gòu)域是scFv。該激活結(jié)構(gòu)域的位置可相對抗原識別結(jié)構(gòu)域位于多肽的N端，或該激活 結(jié)構(gòu)域的位置可相對抗原識別結(jié)構(gòu)域位于多肽的C端。
[0014] 可通過本領(lǐng)域中任何合適的遺傳重組方法生成重組溶瘤病毒。
[0015] 在另一個方面中，提供了一種治療患有癌癥的個體的方法，包括給予該個體治療 有效量的TEA-0V，例如，所述TEA-0V表達的T細胞接合物包含抗原識別結(jié)構(gòu)域，該抗原識別 結(jié)構(gòu)域結(jié)合所述癌癥顯示的TAA或TSA。在【具體實施方式】中，向個體給予重組帶T細胞接 合物臂的溶瘤病毒（TEA-VV)。在【具體實施方式】中，該TEA-VV通過瘤內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈 內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)或鼻內(nèi)給予。
[0016] 在某些實施方式中，提供了一種治療個體中癌癥的方法，包括以下步驟：向該個體 遞送治療有效量的本發(fā)明所述病毒，包括編碼雙特異性分子的溶瘤病毒，所述雙特異性分 子包含特異性針對細胞表面分子的scFv和特異性針對腫瘤抗原的scFv。在【具體實施方式】 中，給予個體的病毒量（如治療有效量）包含l〇5-l〇13pfu的病毒。本發(fā)明的方法可包括向 個體遞送其他癌癥治療的步驟，如手術(shù)、放療、化療、免疫治療、激素治療或其組合。本發(fā)明 的方法可包括鑒定個體需要癌癥治療的步驟。
[0017] 在一個實施方式中，存在一種遺傳工程改造的溶瘤病毒，其包含的核酸序列編碼 的分子包含激活結(jié)構(gòu)域和抗原識別結(jié)構(gòu)域，激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合免疫細胞上靶標，抗原識別結(jié) 構(gòu)域結(jié)合由目標細胞生成或呈遞的一種或多種分子。在【具體實施方式】中，所述激活結(jié)構(gòu)域 和所述激活結(jié)構(gòu)域由接頭連接。在一些實施方式中，該病毒還包含編碼一種或多種共刺激 分子的核酸。在某些實施方式中，該病毒還包含編碼二聚化結(jié)構(gòu)域的核酸。在具體實施方 式中，該病毒還包含編碼三聚化結(jié)構(gòu)域的核酸。在一些實施方式中，該激活結(jié)構(gòu)域包含抗 體、配體、受體或肽。在某些實施方式中，該免疫細胞是T細胞且該激活結(jié)構(gòu)域是識別CD3 的抗體，且在一些實施方式中，該免疫細胞是NK細胞且該激活結(jié)構(gòu)域是識別CD16、NKG2D或 NKp30的抗體。在一些實施方式中，該抗體是單鏈可變區(qū)片段（scFv)抗體。在某些實施方 式中，該抗原識別結(jié)構(gòu)域是識別目標細胞所生成抗原的抗體。在特定情況中，該抗體是scFv 抗體。在一些實施方式中，該抗原識別結(jié)構(gòu)域是配體、肽或可溶性TCR。在【具體實施方式】中， 該病毒編碼的多肽包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQID N0:5、SEQIDN0:6或SEQIDN0:7的序列。各實施方式還包含一種病毒，其中抗原是腫瘤抗 原，例如選自：EphA2、HER2、⑶2、磷脂?；嫉鞍拙厶?3、5了4、8!19、€[36整聯(lián)蛋白、87-!13、 B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、 CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、FAP、FAR、FBP、胎兒 AchR、FRa、⑶3、HLA-A1+MAGE1、ILllRa、IL13Ra2、κ、KDR、λ、Lewis-Y、MCSP、間皮素、 Mucl、Mucl6、NCAM、NKG2D配體、NY-ES0-1、PRAME、PSCA、PSMA、R0R1、SURVIVIN、TAG72、TEM1、 TEM8和VEGRR2。在某些實施方式中，免疫細胞上的靶標選自⑶3、⑶16、NKG2D、NKp30和非 變異TCR。免疫細胞上的靶標可以是CD3。在一些情況下，該溶瘤病毒是痘苗病毒，但在一 些實施方式中該溶瘤病毒是腺病毒、單純皰疹病毒（HSV)、黏液瘤病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰 質(zhì)炎病毒、水泡性口炎病毒（VSV)、麻疹病毒（MV)或新城疫病毒（NDV)。在具體的實施方式 中，一種或多種共刺激分子選自4-1BBL、⑶80、⑶86、⑶83和0X40L。在一些實施方式中，該 二聚化結(jié)構(gòu)域是IgGlCH2CH3結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈、螺旋-環(huán)-螺旋、錨蛋白或PAS結(jié)構(gòu)域。 在【具體實施方式】中，該三聚化結(jié)構(gòu)域來自XVNCI型人膠原、I型膠原、II型膠原、III型膠 原、IV型膠原、V型膠原、XI型膠原、T4噬菌體次要纖維蛋白（fibritin)的C端結(jié)構(gòu)域或 Nemo三聚化結(jié)構(gòu)域。
[0018] 在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了一種治療個體癌癥的方法，包括向個體遞送 治療有效量的本發(fā)明的病毒的步驟。在一些實施方式中，病毒量包含l〇5_l〇13pfu的病毒。在 一些實施方式中，該方法還包括以下步驟：向個體遞送其他癌癥治療，如手術(shù)、放療、化療、 免疫治療、激素治療或其組合。在一些實施方式中，該方法還包括鑒定該個體是否需要進行 癌癥治療的步驟。
[0019] 前述內(nèi)容相當寬泛地描述了本
【發(fā)明內(nèi)容】
的特征和技術(shù)優(yōu)點，使得能夠更好地理解 以下的詳細說明。以下描述的本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點構(gòu)成本發(fā)明要求保護的主題。本領(lǐng) 域的技術(shù)人員應理解，所揭示的觀念和【具體實施方式】可以方便地被用作改進或設(shè)計實現(xiàn)本 發(fā)明的同樣目的的其他構(gòu)思的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應認識到這些等價構(gòu)思沒有偏離 所附權(quán)利要求書中提出的本發(fā)明的精神和范圍。被認為是本發(fā)明的特征的新特征，對于其 構(gòu)建和方法的操作，還有其他對象和優(yōu)點等，可以結(jié)合以下詳細的說明和附圖一起，得到更 好的理解。但應理解，各附圖僅僅是為了示意和說明，并不旨在對本發(fā)明進行限定。
[0020] 附圖簡要說明
[0021] 為了更完整地理解本發(fā)明，下文結(jié)合附圖提供說明，附圖中：
[0022] 圖1顯示TEA-VV的示例性原理；
[0023]圖 2 提供 了編碼EphA2-scFv-CD3-scFv(EphA2-TEA-VV)或GFP(GFP-VV)的表達盒 的示例性示意圖；
[0024] 圖3顯示在F17R晚期啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，病毒復制是GFP表達所需的；
[0025] 圖4顯示EphA2-TEA-VV表達分泌性雙特異性EphA2-scFv-CD3-scFv，其具有結(jié)合 人T細胞和腫瘤抗原EphA2的能力。以Μ0Ι5使用EphA2-TEA-VV或GFP-VV感染A549腫瘤 細胞（6孔板中l(wèi)xl06/2ml/孔）。孵育24小時后收集培養(yǎng)基并添加至lxlO6未刺激的PBMC， 隨后進行EphA2-FITC、⑶8-PE和⑶4-APC的染色。插入的數(shù)目是來自門選的⑶8+或⑶4+ 細胞的EphA2陽性細胞群體百分比；
[0026] 圖5A和5B表明，與母體VV相比，EphA2-TEA-VV在CV-1細胞和正常人細胞中顯示 類似的病毒復制能力。顯示了CV-l(A)和正常人成纖維細胞（B)中EphA2-TEA-VV、GFP-W 和vSC20的復制。以0. 1的Μ0Ι感染細胞并在1、2或3天后通過CV-1細胞中的菌斑試驗 測定病毒效價；
[0027] 圖6表明，在人T細胞不存在的情況下，EphA2-TEA-VV顯示的針對EphA2+A549 腫瘤細胞的腫瘤裂解能力與GFP-VV相思。使用遞增劑量（MOI0.01、0. 1、1或5)的 EphA2-TEA-VV(EphA2-VV)或GFP-VV感染A549腫瘤細胞。通過MTS試驗測定感染后48小 時的細胞活力。結(jié)果表明，在人T細胞不存在的情況下，EphA2-TEA-VV或GFP-VV顯示類似 的針對A549腫瘤細胞的腫瘤裂解活性。
[0028] 圖7表明，在人T細胞存在的情況下，EphA2-TEA-VV顯示的針對EphA2+A549腫瘤 細胞的腫瘤裂解能力比GFP-VV有增強。以Μ0Ι0. 1使用EphA2-TEA-VV或GFP-VV感染A549 腫瘤細胞。在一些實驗中，將人T細胞與A549細胞共培養(yǎng)（T:A549 = 5:1)。通過MTS試驗 測定感染后多個時間點的細胞活力；
[0029] 圖8A和8B表明，在人T細胞存在的情況下，EphA2-TEA-VV針對EphA2+A549腫瘤 細胞的腫瘤裂解能力是病毒劑量依賴的。使用遞增劑量（Μ0Ι0. 001、0. 01、0. 1或1)使用 EphA2-TEA-VV感染A549腫瘤細胞。在一些實驗中，將人T細胞與A549細胞共培養(yǎng)（T:A549 =5:1)。通過MTS試驗測定感染后24或48小時的細胞活力；
[0030] 圖 9A-9D表明EphA2-TEA-VV激活人T細胞。以Μ0Ι0· 1 或 1 使用EphA2-TEA-VV 或GFP-VV感染A549細胞。在人T細胞存在的情況下培養(yǎng)感染的A549細胞（T細胞：A549 比例=5:1)。24、48或72小時后，收集上清液并通過ELISA測定IFN-γ(A和B)和IL-2(C 和D)生產(chǎn)；
[0031] 圖10表明EphA2-TEA-VV誘導腫瘤細胞的周邊殺傷。以多種Μ0Ι使用 EphA2-TEA-VV或GFP-VV感染A549并在24小時后收集上清液并用于PBMC和A549細胞的 共培養(yǎng)試驗（PBMC:腫瘤細胞=5:1)。48小時后，通過MTS試驗測量腫瘤細胞殺傷；