提供組織修復(fù)的含微顆粒的具有協(xié)同作用的真皮基質(zhì)及其生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于治療慢性創(chuàng)傷的真皮基質(zhì)及其生產(chǎn)方法，所述真皮基質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)真皮組織的快速修復(fù)，并且在其結(jié)構(gòu)中包括具備協(xié)同作用的含抗氧化劑的微顆粒。
【背景技術(shù)】
[0002]在當(dāng)今的慢性創(chuàng)傷治療中，使用了諸如乳劑、凝膠、洗液和軟膏等常規(guī)產(chǎn)品。為了使所述產(chǎn)品在治療中有效，它們需要頻繁施用。此外，施用劑量也必須被標(biāo)準(zhǔn)化。
[0003]然而現(xiàn)有治療可以消除這些問題，其是常規(guī)方法的一部分。在這樣的治療應(yīng)用中，使用異種移植和移植物轉(zhuǎn)移(graft transfer)方法，以便在大規(guī)模組織損失的區(qū)域上更換新組織。這些方法均是疼痛的，且同時(shí)可能具有基于供體的缺點(diǎn)。
[0004]慢性創(chuàng)傷治療中已知的最新的最終階段包括創(chuàng)新制劑。與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，微顆粒系統(tǒng)和基質(zhì)系統(tǒng)提供了有利的治療方法。作為進(jìn)行文獻(xiàn)研究的結(jié)果，觀察到已開發(fā)出了包含協(xié)助區(qū)域愈合的試劑的基質(zhì)，其提供了必要的機(jī)械支持，從而通過閉塞效應(yīng)對因各種損傷而損失的組織區(qū)域進(jìn)行補(bǔ)償。已制備了真皮基質(zhì)，其特別地包括膠原蛋白-殼聚糖、膠原蛋白-明膠，膠原蛋白-糖胺聚糖以及膠原蛋白-透明質(zhì)酸組合物，并通過向它們孵育成纖維細(xì)胞來制備，并且已觀察到了創(chuàng)傷組織的愈合。
[0005]真皮基質(zhì)是為了有效支持細(xì)胞生長和發(fā)育而用天然或合成的聚合物制備的系統(tǒng)，并且這些真皮基質(zhì)在創(chuàng)傷治療中的使用開辟了一個(gè)新的視野。這些結(jié)構(gòu)的主要目的是使受損的組織重建，并將不同的生物材料和生物活性分子運(yùn)載到該區(qū)域。
[0006]現(xiàn)今存在具有不同特點(diǎn)的使上皮愈合的商購產(chǎn)品。在所述產(chǎn)品中，使用了用殼聚糖(其是天然聚合物)制備的創(chuàng)傷貼片，或者使用諸如合成聚氨酯和PLGA等聚合物，并且提供了其中角質(zhì)形成細(xì)胞在上皮中形成小集落的介質(zhì)，從而獲得了更快的上皮形成。在替換上皮的所述產(chǎn)品中，提供了二維結(jié)構(gòu)。然而，此種在上皮形成中優(yōu)選的維度在需要三維結(jié)構(gòu)的替代治療中是不足的。
[0007]創(chuàng)傷區(qū)域易患感染和類似的并發(fā)癥，并且防止感染的最有效方法是盡快提供有效治療。受傷后的頭六小時(shí)對細(xì)菌拓殖而言是更重要的時(shí)間段。防止感染的最有效方法是通過以下方式封閉創(chuàng)傷:在創(chuàng)傷上使用無菌貼片，并且在用無菌貼片封閉創(chuàng)傷前在無菌條件下清理創(chuàng)傷，這些條件甚至比抗生素治療更有效。出于此原因，立即覆蓋創(chuàng)傷、增加真皮層的自我修復(fù)并且發(fā)育出完全分層的組織(其會替換組織區(qū)域)是當(dāng)前研究中需要解決的一些重要課題。
[0008]用于治療創(chuàng)傷的常規(guī)方法(軟膏、乳劑、凝膠、洗液)不能克服一些基本問題，例如創(chuàng)傷感染，脫水，熱損失，活組織仍未受保護(hù)，蛋白質(zhì)、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、免疫因子和微量元素的損失。
[0009]常規(guī)制劑的最重要的缺點(diǎn)之一是施用的量可能變化或改變，因此施用的劑量不能被標(biāo)準(zhǔn)化，并且需要頻繁進(jìn)行施用。每次進(jìn)行施用時(shí)，病人都會感覺疼痛，這使得治療過程更加困難。此外，由于表面活性劑或者這些制劑中所用的諸如防腐劑和香料等成分，也會出現(xiàn)過敏反應(yīng)。除了常規(guī)療法，作為在大規(guī)模組織損失的情況下進(jìn)行的另一種療法，移植物轉(zhuǎn)移也具有許多缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)可以是由供體傳播的疾病，或者是在取走移植物的供體區(qū)域形成新創(chuàng)傷。盡管自體移植為優(yōu)選的材料，但在某些情況下在患者中可能不會有任何適合的可轉(zhuǎn)移組織。除此之外，在取走移植組織的區(qū)域會出現(xiàn)新的創(chuàng)傷。另一個(gè)缺點(diǎn)是這些過程可能需要外科手術(shù)。為了防止諸如感染等并發(fā)癥并克服所述缺點(diǎn)，認(rèn)為創(chuàng)新方法對于縮短治療時(shí)間是必要的。
[0010]為了達(dá)到這些目的而制備的具有膠原蛋白、殼聚糖和明膠的制劑是二維系統(tǒng)，并且所述二維系統(tǒng)不足以提供物理支持。為了解決此問題，用于確保用膠原蛋白制備的真皮基質(zhì)是包含化學(xué)材料的三維系統(tǒng)的方法會破壞細(xì)胞生長所需的條件。在現(xiàn)有技術(shù)中，為達(dá)到所述目的而開發(fā)的產(chǎn)品不包含微顆粒，并且其作用類似于使細(xì)胞可略微更快生長的創(chuàng)傷貼片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種真皮基質(zhì)，其提高慢性創(chuàng)傷治療的效率、縮短愈合時(shí)間并確保組織修復(fù)。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供一種真皮基質(zhì)，其不僅包含膠原蛋白和層粘連蛋白，而且還包含攜帶抗氧化劑的微顆粒，所述抗氧化劑有助于通過展現(xiàn)協(xié)同作用而加快組織修復(fù)速度。
[0013]本發(fā)明的另一目的是獲得一種能夠?qū)崿F(xiàn)組織修復(fù)的真皮基質(zhì)生產(chǎn)方法，其中使用由位于真皮天然結(jié)構(gòu)內(nèi)的蛋白質(zhì)形成的試劑及其它組分。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供一種真皮基質(zhì)生產(chǎn)方法，其通過采用并非化學(xué)方法的交聯(lián)方法而支持細(xì)胞生長和組織修復(fù)。
[0015]本發(fā)明的另一目的是提供一種真皮基質(zhì)生產(chǎn)方法，其能夠?qū)崿F(xiàn)組織修復(fù)，并且通過實(shí)施凍干工序而防止熱敏性生物材料降解。
【具體實(shí)施方式】
[0016]附圖中示出了為了達(dá)到本發(fā)明的目的而產(chǎn)生的真皮基質(zhì)生產(chǎn)方法，其提供組織修復(fù)，其中所述附圖圖示了以下內(nèi)容；
[0017]表1是本發(fā)明的方法的流程圖。
[0018]具有協(xié)同作用并提供組織修復(fù)的真皮基質(zhì)生產(chǎn)方法(10)，其特征在于，其包括以下步驟:
[0019]制備真皮基質(zhì)系統(tǒng)(11)，
[0020]制備膠原蛋白溶液系統(tǒng)(111)，
[0021 ]將層粘連蛋白添加到膠原蛋白溶液上并混合(112)，
[0022]冷凍并儲存混合物(113)，
[0023]將儲存的混合物凍干(114)，
[0024]使凍干物交聯(lián)(115)，
[0025]形成微顆粒(12)，
[0026]制備聚合物的水溶液(121)，
[0027]制備磷脂、抗氧化劑和醇混合物(122)，
[0028]將水溶液添加到醇混合物上并且混合(123)，
[0029]噴霧干燥所得到的全部混合物(124)，
[0030]將微顆粒與真皮基質(zhì)系統(tǒng)組合(13)。
[0031]本發(fā)明的方法(10)主要基于:分別制備真皮基質(zhì)系統(tǒng)和微顆粒系統(tǒng)，其后將微顆粒噴灑到真皮基質(zhì)上，從而將這兩個(gè)系統(tǒng)物理組合。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的方法(10)，首先通過將膠原蛋白添加到酸性酸溶液中制備膠原蛋白溶液(111)，從而制成真皮基質(zhì)系統(tǒng)(11)。在本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用中，將牛膠原蛋白以0.1%的濃度添加至0.1M的酸性酸溶液中(111)。
[0033]接下來，將層粘連蛋白添加到膠原蛋白溶液上(112)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，取2.5ml已制備的膠原蛋白溶液，添加20μ1層粘連蛋白，并且將其全部在冰浴中混合
(112)。當(dāng)使用冰浴時(shí)，其目的在于防止存在于混合物內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)劣化。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，用10-G探針以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度進(jìn)行混合1分鐘。
[0034]將包含膠原蛋白和層粘連蛋白的混合物在-20±1°C的溫度下擱置12小時(shí)并冷凍
(113)。在此之后，對已冷凍的所述混合物進(jìn)行24小時(shí)的凍干(114)。由此確保防止所述混合物內(nèi)的熱敏性生物材料劣化。
[0035]利用紫外交聯(lián)儀(UV交聯(lián)儀)設(shè)備在254nm波長下對已獲得的包含膠原蛋白和層粘連蛋白的凍干結(jié)構(gòu)物進(jìn)行交聯(lián)(115)。在另一處，為了提供微顆粒的形成(12)，制備聚合物水溶液(121)。為了確保這一點(diǎn)，使用0.2g透明質(zhì)酸鈉鹽(HA)并將其溶于150ml純水中。在此期間，將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和白藜蘆醇混合在醇中并溶解(122)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，將0.7g?0.75g的DPPC和0.05g?0.lg白藜蘆醇350ml添加到乙醇中并混合(122)。使用白藜蘆醇(抗氧化劑)顯示出與形成蛋白結(jié)構(gòu)物的膠原蛋白和層粘連蛋白的協(xié)同作用，并因此提高了最終產(chǎn)物對于組織修復(fù)的效率。此外，確保了長時(shí)間保持最終產(chǎn)物的基質(zhì)完整性。
[0036 ] 將已制備的HA溶液(121)添加到DPPC和白藜蘆醇的醇溶液(122)上并在40 ± 1°C混合(123)。將已制備的全部混合物置于噴霧干燥器中，并且通過噴霧獲得微顆粒(124)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，已調(diào)節(jié)噴霧干燥器以使初始溫度為180°C，且噴霧速度為400L/h。
[0037]將用噴霧干燥器制備的負(fù)載有白藜蘆醇的HA微顆粒作為干粉噴到預(yù)先制備的真皮基質(zhì)(11)上，并且將所述兩個(gè)系統(tǒng)組合(13)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式，噴灑的微顆粒包括50μΜ白藜蘆醇。已獲得的這些基質(zhì)特別用于慢性創(chuàng)傷治療，并且其