用于治療膿毒癥的MicroRNA抑制的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及miRNA。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)使用miRNA抑制劑來(lái)治療膿毒癥和 其他疾病的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNA(miRNA)是小的非編碼RNA分子，平均22個(gè)核苷酸長(zhǎng)，其在基因表達(dá)的轉(zhuǎn) 錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。由真核生物的核DNA編碼，miRNA通過(guò)在mRNA分子內(nèi)與互補(bǔ)序 列的堿基配對(duì)發(fā)揮作用，一般通過(guò)翻譯抑制或靶向降解造成基因沉默。人基因組可編碼超 過(guò)1000個(gè)miRNA，其可靶向約60%的哺乳動(dòng)物基因，且在很多人細(xì)胞類型中含量很高。各種 疾病狀態(tài)已經(jīng)涉及miRNA的異常表達(dá)，基于miRNA的治療正在研究中。
[0003] 例如，Zhu等（Cardiovascular Research，2011，92 : 75-84)發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中 microRNA-195(miR-195)通過(guò)下調(diào)Sirtl促進(jìn)棕櫚酸酯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
[0004] Wang等(PLoS 0NE，2012,7(6):e38885)發(fā)現(xiàn)血清miRNA特征可以預(yù)測(cè)膿毒癥患者 的死亡率。
[0005] 仍然需要鑒定能夠特異性靶向治療或預(yù)防各種疾病狀態(tài)的一個(gè)miRNA或miRNA的 組合。
[0006] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0007] 一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)使用靶向和/或抑制miR-15家族的miRNA活性的miRNA 抑制劑來(lái)治療膿毒癥或其他相關(guān)疾病的方法。以這種方式，在一個(gè)方面，miRNA抑制劑有助 于治療涉及miR-15家族成員上調(diào)的疾病、紊亂或病癥，例如膿毒癥。
[0008] 在一個(gè)方面，提供用于治療膿毒癥的方法，包括施用抑制在膿毒癥中上調(diào)的miRNA 的活性的試劑。
[0009] 在一個(gè)方面，miRNA是miRNA-15家族的成員。
[0010] 在一個(gè)方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0011] 在一個(gè)方面，miRNA 是 miR-195。
[0012]在一個(gè)方面，試劑保護(hù)器官功能。
[0013] 在一個(gè)方面，器官功能是肝功能、肺功能、腎功能和微血管功能中的至少一個(gè)。
[0014] 在一個(gè)方面，試劑降低細(xì)胞凋亡。
[0015] 在一個(gè)方面，試劑降低內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和免疫細(xì)胞中至少一種的細(xì)胞凋 亡。
[0016] 在一個(gè)方面，免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
[0017] 在一個(gè)方面，試劑降低炎性反應(yīng)。
[0018] 在一個(gè)方面，炎性反應(yīng)是在肝、肺、腎和微血管的至少一個(gè)中。
[0019] 在一個(gè)方面，膿毒癥是脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥或糞便誘導(dǎo)的膿毒癥。
[0020] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供保護(hù)器官功能的方法，包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA 活性的試劑。
[0021] 在一個(gè)方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0022] 在一個(gè)方面，器官功能是肝功能、肺功能、腎功能和微血管功能中的至少一個(gè)。
[0023] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供降低細(xì)胞凋亡的方法，包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA 活性的試劑。
[0024] 在一個(gè)方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0025] 在一個(gè)方面，試劑降低內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和免疫細(xì)胞中至少一種的細(xì)胞凋 亡。
[0026]在一個(gè)方面，免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
[0027] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供降低炎性反應(yīng)的方法，包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA 活性的試劑。
[0028] 在一個(gè)方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0029] 在一個(gè)方面，炎性反應(yīng)是在肝、肺、腎和微血管的至少一個(gè)中。
[0030] 在一個(gè)方面，試劑是鎖核酸(LNA)寡聚物、嗎啉基寡聚物、2'-0_甲基RNA寡聚物、 an t agomi r、抑制m i RNA成熟的空間阻斷的寡聚物、或阻斷mRNA轉(zhuǎn)錄體的m i RNA祀標(biāo)位點(diǎn)的空 間阻斷的寡聚物。
[0031] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供用于治療膿毒癥的方法，包括施用增強(qiáng)在膿毒癥中上調(diào)的 miRNA的靶基因活性的試劑。
[0032] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供抑制在膿毒癥中上調(diào)的miRNA活性的試劑用于治療膿毒癥 的用途。
[0033] 在一個(gè)方面，miRNA是miRNA-15家族的成員。
[0034] 在一個(gè)方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0035] 在一個(gè)方面，miRNA 是 miR-195。
[0036]在一個(gè)方面，用途是保護(hù)器官功能。
[0037]在一個(gè)方面，器官功能是肝功能、肺功能、腎功能和微血管功能中的至少一個(gè)。 [0038]在一個(gè)方面，用途是降低細(xì)胞凋亡。
[0039] 在一個(gè)方面，用途是降低內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和免疫細(xì)胞中至少一種的細(xì)胞 凋亡。
[0040] 在一個(gè)方面，免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
[0041] 在一個(gè)方面，用途是降低炎性反應(yīng)。
[0042] 在一個(gè)方面，炎性反應(yīng)是在肝、肺、腎和微血管的至少一個(gè)中。
[0043] 在一個(gè)方面，膿毒癥是脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥或糞便誘導(dǎo)的膿毒癥。
[0044]根據(jù)另一個(gè)方面，提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的試劑用于保護(hù)器官功能 的用途。
[0045]在一個(gè)方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0046]在一個(gè)方面，器官功能是肝功能、肺功能、腎功能和微血管功能中的至少一個(gè)。 [0047]根據(jù)另一個(gè)方面，提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的試劑用于降低細(xì)胞凋亡 的用途。
[0048] 在一個(gè)方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0049] 在一個(gè)方面，用途是降低內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和免疫細(xì)胞中至少一種的細(xì)胞 凋亡。
[0050] 在一個(gè)方面，免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
[0051] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的試劑用于降低炎性反應(yīng) 的用途。
[0052] 在一個(gè)方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0053]在一個(gè)方面，炎性反應(yīng)是在肝、肺、腎和微血管的至少一個(gè)中。
[0054]在一個(gè)方面，試劑是鎖核酸（LNA)寡聚物、嗎啉基寡聚物、2'-0_甲基RNA寡聚物、 an t agomi r、抑制m i RNA成熟的空間阻斷的寡聚物、或阻斷mRNA轉(zhuǎn)錄體的m i RNA祀標(biāo)位點(diǎn)的空 間阻斷的寡聚物。
[0055] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供增強(qiáng)在膿毒癥中上調(diào)的miRNA的靶基因活性的試劑用于治 療膿毒癥的用途。
[0056] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供用于治療膿毒癥的組合物，其包含抑制在膿毒癥中上調(diào)的 miRNA活性的試劑。
[0057] 在一個(gè)方面，miRNA是miRNA-15家族的成員。
[0058] 在一個(gè)方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0059] 在一個(gè)方面，miRNA 是 miR-195。
[0060] 在一個(gè)方面，試劑用于保護(hù)器官功能。
[0061 ]在一個(gè)方面，器官功能是肝功能、肺功能、腎功能和微血管功能中的至少一個(gè)。
[0062] 在一個(gè)方面，試劑用于降低細(xì)胞凋亡。
[0063] 在一個(gè)方面，試劑用于降低內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和免疫細(xì)胞中至少一種的細(xì) 胞凋亡。
[0064]在一個(gè)方面，免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
[0065] 在一個(gè)方面，試劑用于降低炎性反應(yīng)。
[0066] 在一個(gè)方面，炎性反應(yīng)是在肝、肺、腎和微血管的至少一個(gè)中。
[0067] 在一個(gè)方面，膿毒癥是脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥或糞便誘導(dǎo)的膿毒痖。
[0068] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供用于保護(hù)器官功能的組合物，其包含抑制miRNA-15家族的 miRNA活性的試劑。
[0069] 在一個(gè)方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0070] 在一個(gè)方面，器官功能是肝功能、肺功能、腎功能和微血管功能中的至少一個(gè)。
[0071] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供用于降低細(xì)胞凋亡的組合物，其包含抑制miRNA-15家族的 miRNA活性的試劑。
[0072] 在一個(gè)方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0073] 在一個(gè)方面，組合物用于降低內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和免疫細(xì)胞中至少一種的 細(xì)胞凋亡。
[0074]在一個(gè)方面，免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
[0075] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供用于降低炎性反應(yīng)的組合物，其包含抑制miRNA-15家族的 miRNA活性的試劑。
[0076] 在一個(gè)方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一個(gè)。
[0077] 在一個(gè)方面，炎性反應(yīng)是在肝、肺、腎和微血管的至少一個(gè)中。
[0078]在一個(gè)方面，試劑是鎖核酸（LNA)寡聚物、嗎啉基寡聚物、2'-0_甲基RNA寡聚物、 an t agomi r、抑制m i RNA成熟的空間阻斷的寡聚物、或阻斷mRNA轉(zhuǎn)錄體的m i RNA祀標(biāo)位點(diǎn)的空 間阻斷的寡聚物。
[0079] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供用于治療膿毒癥的組合物，其包含增強(qiáng)在膿毒癥中上調(diào)的 miRNA的靶基因活性的試劑。
[0080] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)將在以下詳細(xì)描述中變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)顯示 本發(fā)明的方面時(shí)，詳細(xì)描述和具體的實(shí)施例僅以說(shuō)明性的方式給出，因?yàn)閺乃鲈敿?xì)描述 中，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。
【附圖說(shuō)明】
[0081 ]將參照附圖從以下描述中進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中：
[0082] 圖IA和IB顯示上調(diào)miR-195足以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。
[0083]圖2A和2B顯示抑制miR-195降低了內(nèi)皮細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
[0084] 圖3A、3B和3C顯示miR-195抑制對(duì)LPS-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的肝組織中的細(xì)胞 凋亡的影響。
[0085]圖4顯示miR-195抑制對(duì)LPS-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的肺組織中的細(xì)胞凋亡的影 響。
[0086] 圖5A、5B和5C顯示miR-195抑制對(duì)LPS-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的肝組織中的炎性 反應(yīng)的影響。
[0087]圖6顯示miR-195抑制對(duì)LPS-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的腎組織中的炎性反應(yīng)的影 響。
[0088]圖7A、7B和7C顯示miR-195抑制對(duì)LPS-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的器官功能障礙的 影響。
[0089]圖8A、8B、8C和8D顯示mi R-19 5抑制對(duì)腹膜中的糞便-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的肝 臟的細(xì)胞凋亡和炎癥的影響。
[0090] 圖9A、9B、9C、9D和9E顯示miR-195抑制對(duì)腹膜中的糞便-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的 肺的細(xì)胞凋亡和炎癥的影響。
[0091] 圖10顯示miR-195抑制對(duì)腹膜中的糞便-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的存活率的影響。
[0092] 圖11六、118、11(：、110、1^和11?顯示1^1?-195抑制對(duì)1^5-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的 細(xì)胞凋亡、炎癥和器官功能障礙的治療性作用。
[0093]圖12顯示miR-195抑制對(duì)LPS-誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的微血管功能障礙的治療性 作用。
[0094] 發(fā)明詳述
[0095] 本發(fā)明涉及與在膿毒癥或其他病癥中上調(diào)（與不存在這些疾病的正常水平相比） 的miRNA序列結(jié)合和/或相互作用的試劑。因此，這些試劑可用于治療病癥例如膿毒癥、用于 保護(hù)器官功能、降低細(xì)胞凋亡和降低炎性反應(yīng)。由本文所述的試劑靶向的特定miRNA屬于， 例如 miRNA-15 家族，例如 111化-153、111化-1513、111丨1?-16-1、111丨1?-16-2、111丨1?-195、111化-322/424和 miR-497。
[0096] 除非另有定義，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員通常理解的相同含義。參見(jiàn)例如Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994);Sambrook等， Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harb〇r，NY 1989)，其各自通過(guò)引用并入本文。為本發(fā)明的目的，下面定義以下術(shù)語(yǔ)。
[0097] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"miRNA"是指microRNA分子，其是小的（大約22個(gè)核苷酸)非編碼 RNA分子，通過(guò)結(jié)合mRNA序列并靶向它們用于降解來(lái)轉(zhuǎn)錄后調(diào)芐基因表達(dá)。特定miRNA用前 綴"mir"加破折號(hào)和數(shù)字來(lái)命名。例如，miRNA-15家族的成員包括mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/424^PmiR-497。
[0098] 本文所述的序列的"變體"是生物活性的序列，其因?yàn)樵谔烊恍蛄兄幸粋€(gè)或多個(gè)核 苷酸的插入、缺失、修飾和/或替換具有與天然序列或野生型序列(或其補(bǔ)體)不同的核苷酸 序列。這種變體通常與天然序列或其補(bǔ)體的序列一致性小于1〇〇%。然而，生物活性的變體 通常與對(duì)應(yīng)的天然存在的序列或其補(bǔ)體具有至少約70%的序列一致性，通常至少約75%、 更通常至少約80%、甚至更通常至少約85%、甚至更通常至少約90%、且甚至更通常至少約 95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。任何長(zhǎng)度的變體核苷酸片段保留對(duì)應(yīng)天然序列 的生物活性。變體還包括其中在5'或3'端或在天然序列或其補(bǔ)體內(nèi)添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸 的序列。變體還包括其中一些核苷酸被刪除和任選地被一個(gè)或多個(gè)不同核苷酸替換的序 列。
[0099] 本文的"百分比序列一致性"定義為在比對(duì)序列并引入空位(如有必要）以獲得最 大百分比序列一致性之后，在候選序列中與目標(biāo)序列的核苷酸或氨基酸殘基相同的核苷酸 或殘基的百分比，且不考慮任何保守性替換作為序列一致性的部分。在候選序列中的5'、3' 或內(nèi)部延伸、缺失或插入均應(yīng)不被解釋為影響序列一致性或同源性。用于比對(duì)的方法和計(jì) 算機(jī)程序是本領(lǐng)域公知的，例如"BLAST"。
[0100]用于本文目的的"活性的"或"活性"是指天然或天然存在的miRNA、miRNA抑制劑或 miRNA靶序列的生物活性，其中"生物"活性是指由天然或天然存在的miRNA、miRNA抑制劑或 miRNA靶序列引起的生物功能(抑制或刺激）。
[0101] 因此，當(dāng)"生物學(xué)活性的"或"生物活性"與"miRNA"、"miRNA抑制劑"或"miRNA靶序 列"組合使用時(shí)，是指表現(xiàn)或共有天然miRNA、miRNA抑制劑或miRNA靶序列的效應(yīng)子功能的 核苷酸序列。例如，抑制miRNA活性的miRNA抑制劑或試劑的生物活性是抑制特定miRNA序列 的抑制性活性。同樣，mi RNA序列通常的生物活性是抑制特定mRNA序列的翻譯，從而抑制基 因表達(dá)。
[0102] 當(dāng)"生物學(xué)活性的"或"生物活性"與變體序列組合使用時(shí)，是指變體序列表現(xiàn)或共 有親本序列的效應(yīng)子功能。與親本序列相比，變體的生物活性可以增加、降低、或是相同水 平。
[0103] 術(shù)語(yǔ)"抑制"或"抑制性"是指miRNA的功能或活性被降低、限制、阻斷或中和。這些 術(shù)語(yǔ)涵蓋miRNA功能或活性的完全或部分抑制，包括特定miRNA與其祀mRNA的結(jié)合。
[0104] "miRNA靶序列"是特定miRNA結(jié)合和抑制的mRNA分子。例如，miRNA-15家族可以靶 向并抑制重要抗凋亡蛋白表達(dá)。這些蛋白包括但不限于BCL-2、Sirtl、Pim-l等?？沟蛲龅鞍?的下調(diào)將促進(jìn)凋亡性細(xì)胞死亡，這明顯促進(jìn)導(dǎo)致死亡的膿毒癥相關(guān)的器官功能障礙。因此， 抑制miR-15家族的成員可以預(yù)防膿毒