華支睪吸蟲分泌型磷脂酶a2蛋白在制備腫瘤治療藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白在制備腫瘤 治療藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有針對華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白（亦即，CssPLA2蛋白，GenBank登錄號： ABL07371.1)的表達技術(shù)只能以包涵體形式表達出無生物活性的華支睪吸蟲分泌型磷脂酶 A2蛋白，由于所表達出的華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白不具有生物活性，而不能用于進 行該蛋白的功能研究。即使進行復(fù)雜的蛋白復(fù)性技術(shù)處理后，所得蛋白的生物性活性仍然 相當?shù)汀?br>[0003] 例如：現(xiàn)有文獻F·Hu et al ·/Molecular & Biochemical Parasitology 167 (2009)127-134以華支睪吸蟲cDNA文庫編號為Cs4e05的質(zhì)粒為模板，應(yīng)用設(shè)計的特異引物， 進行PCR擴增目的基因。將目的基因和原核表達質(zhì)粒pET-28a酶切、回收、連接及轉(zhuǎn)化，構(gòu)建 重組質(zhì)粒pET-28a-CssPLA2.將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將CssPLA2重 組工程菌液大量培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)表達后，重組蛋白以包涵體形式表達，12%SDS-PAGE電泳顯 示在分子量約34kDa處出現(xiàn)一明顯條帶。由于重組蛋白以包涵體形式表達，破菌得到的包涵 體經(jīng)6M尿素變性、稀釋和透析復(fù)性后，經(jīng)過金屬離子親和層析柱，在不同低濃度咪唑梯度漂 洗后，用200mmol/L咪唑洗脫，獲得分子量約34kDa的單一蛋白。MTT法和流式細胞儀檢測了 CssPLA2蛋白刺激人肝星狀細胞LX-2增殖，半定量RT-PCR檢測了 CssPLA2蛋白可促進人肝星 狀細胞LX-2ΙΠ 型膠原的mRNA表達上調(diào)，從而導(dǎo)致肝纖維化。
[0004] 至今，現(xiàn)有技術(shù)中尚未見實現(xiàn)華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白（CssPLA2蛋白）在 腫瘤治療領(lǐng)域中的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供華支睪吸蟲分泌型磷 脂酶A2蛋白（亦即，CssPLA2蛋白）在制備腫瘤治療藥物中的用途。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供了 CssPLA2蛋白在制備腫瘤治療藥物中的用途。
[0008] CssPLA2 蛋白，GenBank 登錄號：ABL07371.1。
[0009] 優(yōu)選地，CssPLA2蛋白單獨作為有效成分在制備腫瘤治療藥物中的用途。
[0010]優(yōu)選地，所述腫瘤選自膽管癌。
[0011] 進一步優(yōu)選地，所述腫瘤選自肝門部膽管癌。
[0012] 優(yōu)選地，所述CSSPLA2蛋白為重組CSSPLA2蛋白。
[0013] 進一步優(yōu)選地，所述重組CssPLA2蛋白，含有CssPLA2蛋白和MBP標簽蛋白。
[0014] 優(yōu)選地，所述CssPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為：
[0015] KPRSISRDKPHAELEffSGKLSDNQTIHIffTVASKGLFGEISKPAffIQVDIRGSNSSQDAIRLIFDQEHRLRYCVFGT DTVETSVSLDDADLLTRNPIYLEHFFFTSANEFLRACKELRRASEEPAKLVRRPRTAYRANPMIMPGTLWCGKGNAA TRERTFGDEIETDMCCRTHDRCFENIQSLTSKFGYYNPSPVTISNCECDDEFLSCLENAGTEAATRVGNLYFNVFKI PCFLRRTERICTHNDESGACGQFENREDIELFRPQRFVAPYITV〇
[0016] 優(yōu)選地，所述MBP標簽蛋白的氨基酸序列為pMAL-c2X質(zhì)粒上MBP標簽蛋白編碼序列 所對應(yīng)的氨基酸序列。
[0017] 優(yōu)選地，CSSPLA2蛋白的N端與MBP標簽蛋白的C端連接。
[0018] 優(yōu)選地，所述CssPLA2蛋白和MBP標簽蛋白之間通過連接肽連接。
[0019]進一步優(yōu)選地，所述連接肽的氨基酸序列是pMAL-c2x質(zhì)粒上MBP標簽蛋白編碼序 列之后到Xbal酶切位點之前的核苷酸序列所對應(yīng)的氨基酸序列。
[0020] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種腫瘤治療藥物制劑，含有前述CSSPLA2蛋白和藥學(xué) 上可接受的載體。
[0021] "藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激 和變態(tài)反應(yīng)）即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。"藥學(xué)上可接受的載體"是用于將本發(fā)明的 CssPLA2蛋白傳送給動物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以 是液體或固體。
[0022] 藥學(xué)上可接受的載體為各種藥學(xué)上常用的輔料和/或賦形劑，包括(但不限于)糖 類(如乳糖、葡萄糖和蔗糖），淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉），纖維素及其衍生物(如羧甲基 纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素），黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤滑劑(如硬脂 酸和硬脂酸鎂），硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油，多元 醇（如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇），海藻酸，乳化劑(如Tween、聚氧乙烯 蓖麻油），潤濕劑(如月桂基硫酸鈉），著色劑，調(diào)味劑，壓片劑、穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防腐劑， 無熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等;該載體可根據(jù)需要提高配方的穩(wěn)定性、活性及生 物有效性等。
[0023]本發(fā)明藥物制劑使用時，所述CssPLA2蛋白作為唯一有效成分，或者所述CssPLA2 蛋白作為有效成分之一，可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥 途徑的藥物劑型。
[0024] 優(yōu)選地，所述藥物制劑的形式為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服 液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末，或者栓劑。上述制劑類型可以按 照藥劑學(xué)(第六版，人民衛(wèi)生出版社，崔福德）中的相關(guān)定義理解，上述制劑的制備可以按照 藥劑學(xué)(第六版，人民衛(wèi)生出版社，崔福德）中的相關(guān)制劑的方法配制。
[0025] 優(yōu)選地，所述藥物組合物的制劑形式為片劑或口服液。
[0026] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述藥物制劑可經(jīng)過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
[0027] 優(yōu)選的，本發(fā)明的藥物制劑生產(chǎn)時可以通過濾膜過濾除菌，或者進行高壓滅菌。 [0028]本發(fā)明的第三方面，提供了一種治療膽管癌的方法，包括步驟:將含有CssPLA2蛋 白的腫瘤治療藥物制劑施用于患者。
[0029] 所施用的劑量可由醫(yī)師根據(jù)病情決定。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0031]本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)了華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白 (CssPLA2蛋白）對膽管癌細胞的生長有顯著抑制作用，抑制率高達86%以上。亦即，本發(fā)明 首次發(fā)現(xiàn)了 CssPLA2蛋白在制備膽管癌治療藥物中的新用途。
【附圖說明】
[0032]圖I :CssPLA2目的基因 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖，其中M:DNA標準分子量；1: ddH20陰性對照;2: CssPLA2目的基因 PCR產(chǎn)物。
[0033] 圖2:重組質(zhì)粒pMAL-c2X/CssPLA2的雙酶切鑒定圖，M1，M2:DNA標準分子量；1:空質(zhì) 粒XbaI和HindIII雙酶切;2:重組質(zhì)粒XbaI和HindIII雙酶切;3:CssPLA2目的基因 PCR產(chǎn)物。
[0034] 圖3:重組質(zhì)粒?]\仏1^-〇2乂/^88?1^2在大腸埃希菌此21/^^3的表達產(chǎn)物的12%303- PAGE電泳分析圖，M:蛋白標準分子量；1:重組質(zhì)粒pMAL-c2X/CssPLA2IPTG誘導(dǎo)前;2:重組質(zhì) 粒 pMAL-c2X/CssPLA2IPTG 誘導(dǎo)后上清；3:重組質(zhì)粒 pMAL-c2X/CssPLA2IPTG 誘導(dǎo)后沉淀；4: 樹脂親和純化后重組CssPLA2蛋白。
[0035]圖4:陰離子交換層析法純化重組CssPLA2蛋白（即MBP-CssPLA2融合蛋白）。
[0036] 圖5:12 % SDS-PAGE分析純化重組CssPLA2蛋白的純度。
[0037] 圖6:Western blotting鑒定重組CssPLA2蛋白。
[0038] 圖7:質(zhì)譜(Mass spectrum)鑒定重組CssPLA2蛋白。
[0039] 圖8:重組CssPLA2蛋白酶活性測定圖，sPLA2(分泌型磷脂酶A2)酶活檢測試劑盒檢 測出實施例1中所得重組CssPLA2蛋白（MBP-CssPLA2融合蛋白）具有酶活性。
[0040] 圖9:溫度對重組CssPLA2蛋白酶活性的影響。
[0041 ] 圖10:酶濃度對重組CssPLA2蛋白酶活性的影響。
[0042]圖11:底物濃度對重組CssPLA2蛋白酶活性的影響。
[0043] 圖12:CCK8檢測MBP-CssPLA2對人膽管癌FRH細胞的生長抑制作用;ESP(華支睪吸 蟲分泌排泄蛋白）、MBP蛋白（麥芽糖結(jié)合蛋白，作為對照）、重組CssPLA2蛋白和PBS(陰性對 照組)分別孵育膽管癌FRH細胞，24小時(A)、48小時(B)、72小時(C)后分別用CCK8試劑檢測 細胞450nm吸光度；由圖可見，72小時后，25ug/ml的MBP-CssPLA2明顯抑制了人膽管癌FRH細 胞的生長，抑制率大約在86%以上。
[0044] 圖13:其中，圖13A:25ug/ml ESP(華支睪吸蟲分泌排泄蛋白）、圖13B:25ug/ml MBP 蛋白（麥芽糖結(jié)合蛋白，作為對照）、圖13C: 25ug/ml重組CssPLA2蛋白、圖13D:促凋亡劑（陽 性對照）、圖13E: PBS (陰性對照)分