一種豬細小病毒亞單位疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種豬細小病毒亞單位疫苗，從而克服由于現(xiàn)有疫苗免疫效果不好的問題。本發(fā)明疫苗所用的抗原為重組畢赤酵母菌X33?VP2表達的豬細小病毒VP2蛋白，該菌株已于2016年3月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2016098。本發(fā)明將重組畢赤酵母菌X33?VP2接種培養(yǎng)基后誘導表達，經提取純化、甲醛溶液滅活后加油佐劑混合乳化制成疫苗。本發(fā)明制備的亞單位疫苗能提高免疫后抗體的整齊度，保證了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點。CCTCC NO: M 201609820160309
【專利說明】
-種豬細小病毒亞單位疫苗
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物獸藥技術領域，具體設及一種包含豬細小病毒VP2蛋白的豬細小 病毒亞單位疫苗。
【背景技術】
[0002] 豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，可 導致母豬流產、早產、產死胎、木乃伊胎、弱仔及母豬不育和新生仔豬大量死亡。我國自20世 紀80年代后相繼從各地分離到PPV，經調查發(fā)現(xiàn)一些豬群中該病的血清學陽性率可達85% W上。PPV常呈隱性感染存在，尤其是低劑量持續(xù)感染的現(xiàn)象經常發(fā)生。該病毒除引起母豬 的繁殖障礙，還可與其他病原體協(xié)同作用引起多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經濟損失。豬 細小病毒血清型單一、具有較高的免疫原性，疫苗接種是控制PPV感染的有效措施。
[0003] 完整的病原體含有許多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主產生保護性應答。其 中某些抗原還能引起過敏，免疫抑制和其他副作用，運是使用完整的病原體做疫苗的缺陷。 并且目前國內應用的滅活苗生產制備抗原過程繁瑣，而弱毒疫苗現(xiàn)也有接種疫苗發(fā)病情況 存在。而用亞單位疫苗則可W解決運個問題，尤其是運種疫苗除了具有抗原穩(wěn)定性高，純度 高，特異性強，敏感性高，不產生其他不相關抗體，免疫效果檢測方法方便準確外，還十分易 于生產。不用動物體或是胚體生產，不會帶有組織殘留物，但安全性高。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種包含豬細小病毒VP2蛋白的亞單位疫苗。所提供的疫苗 具有高效、安全性好、抗體整齊度高、保護率高的優(yōu)點，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0005] 本發(fā)明的豬細小病毒亞單位疫苗，包括抗原和疫苗佐劑，其所用的抗原為滅活的 豬細小病毒VP2蛋白，
[0006] 其中的豬細小病毒VP2蛋白經過甲醒溶液滅活；
[0007] 所述的豬細小病毒VP2蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1;
[0008] 上述的疫苗中豬細小病毒VP2蛋白的含量不低于為50yg/0.3ml。
[0009] 其中生產豬細小病毒VP2蛋白的己斯德畢赤酵母X33-VP2(Pichia pastoris X33- VP2)，已經于2016年3月9日保藏于位于武漢、武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編 號為CCTCC N0:M 2016098。
[0010]本發(fā)明將表達豬細小病毒VP2蛋白的基因工程畢赤酵母菌X33-VP2,接種培養(yǎng)基， 在甲醇的作用下，豬細小病毒VP2蛋白獲得高效表達，經提取純化，加入甲醒溶液滅活后，加 油佐劑混合乳化制成疫苗。本發(fā)明制備的疫苗能提高免疫后的抗體水平，提高免疫后抗體 的整齊度，保證了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點。
【附圖說明】
[00川圖1是本發(fā)明實施例豬細小病毒VP2蛋白基因 PCR的擴增鑒定圖，
[0012] 圖2是本發(fā)明的VP2蛋白的blast比較圖；
[0013] 圖3是本發(fā)明實施例重組菌發(fā)酵誘導表達產物SDS-PAGE電泳檢定圖。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合附圖對本發(fā)明的實施例進行具體說明。
[001引實施例1:豬細小病毒(PPV)VP2基因的篩選
[0016] 2010年在山東省多個養(yǎng)殖場出現(xiàn)了豬細小病毒病的癥狀，而發(fā)病個體豬之前已經 注射了已有的細小病毒疫苗，推測感染的病毒發(fā)生了變異；因此從發(fā)病個體中進行豬細小 病毒的篩選;最終篩選出了豬細小病毒PPV1。
[0017] 為驗證篩選的病毒的抗原性，使用了包含篩選的PPV1毒株在內的5個不同來源的 病毒株作為抗原制備疫苗，免疫SPF豬后用篩選的病毒液進行攻毒實驗，結果表明相比于其 它豬細小病毒疫苗，其本身制備的疫苗具有更好的免疫效果(P<〇.05)，因此確定其發(fā)生了 遺傳上的變異。
[0018] 根據豬細小病毒VP2蛋白的抗原特性和氨基酸序列，設計合成一對引物，
[0019] primer 1:5 ' -GCGGTACCATGTCTGAAAATGTTGAAGAAC-3 '，含ΚρηΙ位點；
[0020] primer 2:5'-GCGGCCGCCTAATATAATTTTCTTGGAAT-3'，含Notl位點。
[0021] 取PPV株病毒基因作為模板，PCR擴增目的片段，產物回收連接PMD18-T載體，轉化 和篩選陽性克隆PMD18-T-VP2,經序列測定（圖1為豬細小病毒VP2基因 PCR的擴增鑒定圖）； 其核巧酸序列為SEQ ID NO:2,編碼的蛋白的序列為SEQ ID NO: 1。與NCBI中公開的豬細小 病毒VP2基因相比，最高的同源性為96%;在存在579氨基酸的情況下，表明本發(fā)明的豬細小 病毒VP2蛋白與已公開的蛋白存在不少于23個氨基酸的差異（圖2)。
[0022] 實施例2:重組豬細小病毒VP2蛋白的制備
[0023] 包括W下步驟:a.構建表達載體;b.構建表達菌株;C.重組VP2蛋白的誘導和提取 純化。具體如下：將陽性克隆質粒PMD18-T-VP2和表達載體pPICZa載體分別用ΚρηΙ和Notl 雙酶切產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用DM凝膠回收試劑盒回收，分別獲得約1.化b和 3.3化片段，在16°C定向連接構建pPICZa-VP2表達載體，經酶切鑒定正確后;將質粒線性化 后，電轉化入畢赤酵母感受態(tài)細胞，構建畢赤酵母表達菌株X33-VP2，并提取表達菌株X33- VP2基因組，使用引物primer 1和primer 2進行PCR鑒定正確，于2016年3月9日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號為CCTCC Μ 2016098;進行誘導表達，挑取含X33-VP2的單克 隆菌落接種于BMGY液體培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)過夜，離屯、收集菌體，用適量的ΒΜΜΥ懸浮后， 加入0.55%甲醇，30°C誘導96小時。4°C，9000rpm離屯、5min，保留上清液，加入40%的硫酸錠 沉淀后，12000rpm離屯、5min收集蛋白沉淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白電泳上樣緩沖液，沸水 煮8分鐘后，用12%的分離膠進行SDS-PAGE鑒定（圖3是重組菌發(fā)酵誘導表達產物的SDS- PAGE電泳檢定圖，圖中1、2、為VP2蛋白表達產物沉淀，Μ為分子量標準蛋白質）。
[0024] 實施例3:疫苗的制備
[0025] 將生產豬細小病毒VP2蛋白的畢赤酵母表達菌株X33-VP2株保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中屯、，保藏編號為CCTCC Μ 2016098。
[0026] 1.制苗用菌液的制備將X33-VP2菌種接種于含博萊霉素的YTO液體培養(yǎng)基中，30°C 振蕩培養(yǎng)16~18小時。然后劃線接種于加有博萊霉素的YTO固體培養(yǎng)基，選取典型菌落2~3 個混合于少量YTO液體培養(yǎng)基中，置3(TC搖床中振蕩培養(yǎng)18小時，定量分裝，經純粹檢驗后， 作為一級種子。取一級種子接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)16~18小時，經鏡檢 后，置2~8°C保存，作為二級種子。
[0027] 2.制苗用蛋白的制備按發(fā)酵罐容積60% (V/V)加入BMGY不完全液體培養(yǎng)基，同時 按培養(yǎng)基0.1 % (V/V)加入消泡劑，通入高溫蒸汽滅菌30分鐘，待培養(yǎng)基溫度降至32°C，加入 YNB和生物素，接種豬細小病毒VP2蛋白生產用畢赤酵母X33-VP2二級種子液，發(fā)酵罐參數(shù)設 置分別為攬拌速度8(K)r/min，溫度30°C，維持DO值(溶氧量)在20%。培養(yǎng)24小時后的菌液補 加甲醇，甲醇的補加速度為2ml/h/L誘導表達培養(yǎng)，按照W上發(fā)酵控制參數(shù)及工藝誘導表達 120小時;發(fā)酵培養(yǎng)菌液經管式離屯、機100(K)r/min離屯、30分鐘，收獲的上清，加入硫酸錠沉 淀蛋白后，按120(K)r/min離屯、30分鐘收獲沉淀，加入適量的生理鹽水溶解蛋白沉淀。
[00%] 3.滅活將蛋白液置于滅活瓶內，計量加入10%甲醒溶液，隨加隨搖，使其充分混 合，甲醒溶液的最終濃度為0.1 %。加甲醒溶液后倒入另一滅活瓶中，W避免瓶口附近粘附 的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時后取出，置2~8°C保存。
[00巧]4.半成品檢驗
[0030] (1)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。
[0031] (2)蛋白含量測定按化a壯ord法檢測蛋白含量。
[0032] (3)滅活檢驗將滅活后的蛋白液取少量接種YPD固體培養(yǎng)基，置于置3(TC繼續(xù)培養(yǎng) 72小時。觀察無菌落生長，判滅活檢驗合格。
[0033] 實施例2:亞單位疫苗的制備
[0034] 經過檢驗合格后的半成品VP2蛋白抗原進行疫苗制備下配制中各液體成分按 體積比計）。
[0035] (1)油相制備取獸用白油95份，硬脂酸侶1份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再 加司本一80 5份，至溫度達到115°C時，維持30min，冷卻后備用。
[0036] (2)水相制備將豬細小病毒VP2蛋白使用生理鹽水稀釋成15化g/0.1ml。取滅菌后 的5份吐溫-80,加入配液罐中，同時加入制苗用蛋白液95份，攬拌20~30min，使吐溫-80完 全溶解。
[0037] (3)乳化取油相2份放于高速剪切機內，開動電機慢速轉動攬拌，同時徐徐加入水 相1份，W1000化/min，乳化5分鐘。乳化后，取10ml，W3000r/min離屯、15分鐘，管底析出的水 相應不超過0.5ml。
[0038] 實施例3、疫苗成品檢驗
[0039] (1)性狀
[0040] 外觀疫苗應為乳白色乳劑，無雜質并且外包裝應合格。
[0041] 劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均應不擴 散。
[0042] 穩(wěn)定性吸取疫苗10ml加入離屯、管中，W3000r/min離屯、15分鐘，管底析出的水相應 不超過0.5ml。
[0043] 黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。
[0044] (2)裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。
[0045] (3)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。
[0046] (4)安全檢驗用50日齡仔豬5只，每只頸部皮下注射疫苗1.0ml，同時設對照5只， 在相同的條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14日，記錄試驗豬采食、飲水及臨床情況。應不出現(xiàn)由疫苗 引起的任何局部和全身不良反應。
[0047] (5)效力檢驗初產母豬5只，每只頸部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日齡初 產母豬作為不免疫作對照。母豬配種后，懷孕至38-40天時攻毒，結果從接種亞單位疫苗的 母豬的血漿中沒有分離到病毒，而對照母豬的血漿中則分離到病毒。攻毒40天后宰殺，接種 母豬共懷65頭胎豬，從它們的臟器中均沒有分離到病毒，而對照母豬共懷60頭胎豬，其中有 31頭的臟器分離到病毒。結果表明，用豬細小病毒VP2蛋白亞單位疫苗免疫母豬能夠抵抗病 毒的攻擊，不出現(xiàn)臨床癥狀，胎豬病毒分離均為陰性。對照組，出現(xiàn)輕微的臨床癥狀，胎豬病 毒分離陽性率超過50%，表明豬細小病毒亞單位疫苗能夠提供有效的保護。
[0048] 對比實驗表明，用目前市場上出售的豬細小病疫苗進行免疫，再用本發(fā)明篩選的 PPV1株進行攻毒實驗;結果表明目前市場上出售的疫苗的免疫效果遠低于本發(fā)明的VP2蛋 白疫苗的效果;推測是由于PPV1株的VP2蛋白疫苗發(fā)生變異導致目前疫苗的免疫效果不好。
【主權項】
1. 一種豬細小病毒亞單位疫苗，其特征在于，所述的疫苗包包含有抗原和疫苗佐劑，其 所用的抗原為滅活的豬細小病毒VP2蛋白。2. 如權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的豬細小病毒VP2蛋白經過甲醛溶液滅 活。3. 如權利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述的豬細小病毒VP2蛋白，其氨基酸序 列為SEQ ID NO: 1。4. 如權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中豬細小病毒VP2蛋白的含量不 低于 50yg/0 · 3ml。5. 如權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的豬細小病毒VP2蛋白是由巴斯德畢赤 酵母菌X33-VP2表達的。6. 如權利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的巴斯德畢赤酵母菌X33-VP2的保藏編 號為CCTCC NO:M 2016098。
【文檔編號】A61K39/23GK105879024SQ201610369641
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月28日
【發(fā)明人】劉新文, 范根成, 胡瀟, 宮曉, 李陸梅, 劉蕾
【申請人】青島易邦生物工程有限公司