專利名稱：：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒疫苗株及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種弱毒疫苗株，尤其涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒疫苗株及其應用，屬于生物
技術領域：
。
背景技術：
：豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS)是由PRRSV引起的，以繁殖障礙、呼吸道癥狀為特點的，具有高度傳染性的病毒病。1987年美國首先發(fā)現該病，Wensvoort等于1991年分離并鑒定了該病病原，PRRSV歸屬于動脈炎病毒科(Arteriviridae)的動脈炎病毒屬，是一種有囊膜的正鏈單股RNA病毒，由于PRRSV具有抗原漂移和變異的特性，并且它的主要靶細胞是具有重要免疫作用的肺泡巨噬細胞(PAM)，因此PRRSV的感染常伴有各種病原的繼發(fā)感染，尤其是呼吸道病原。目前已給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失，引起了國際上的廣泛關注。為了控制該病的發(fā)生和蔓延，開展PRRS的疫苗的研究顯得尤為重要。國外先后研制出了預防PRRS的滅活苗和弱毒苗，并在預防和防制PRRS的發(fā)生和蔓延上發(fā)揮了巨大的作用。近年來PRRS已在我國蔓延開來，嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，引起了我國有關部門的重視。1996年中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所首次在國內分離和鑒定了該病病原，同時建立了IFA檢測方法，經普查PRRS已遍布我國大部分的省市自治區(qū)，因此針對國內流行毒株的疫苗的研究顯得十分迫切。雖然國外已經研制出了商品化的滅活苗和弱毒苗，但由于該病毒具有抗原變異和漂移的特性，因此國外疫苗的針對性相對較差，往往免疫效果并不理想，且國外已有報道，因使用PRRS弱毒苗而引起該病的爆發(fā)。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一株新的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒疫苗株，該弱毒疫苗株遺傳穩(wěn)定、安全性好，對于豬繁殖與呼吸綜合癥病毒具有良好的免疫原性。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的本發(fā)明選用國內分離毒株PRRSVCH-la株，在Marc-145細胞上低溫傳代后，再在37TM專到第110170代時，進行全面鑒定，檢測其純凈性TCID5Q、毒力和免疫原性測定，并通過RT-PCR試驗和對各代次的病毒的0RF5進行RFLP分析，證明110170代PRRSVCH-la種毒除其在Marc-145細胞上的病毒滴度有很大提高和致病性明顯降低外，其它特性基本與低代次PRRSVCH-la毒株特性相一致，將110170代PRRSVCH-la致弱毒株種毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus)命名為PRRSVCH-1R株，其微生物保藏號是CGMCCN0.1883;保藏時間是2006年12月11日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市海淀區(qū)中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所。把110代PRRSVCH-la株定義為PRRSVCH-1R株1代，把PRRS活疫苗(CH-1R株)原始種子代次定義為PRRSVCH-1R株2535代(PRRSVCH-la株135145代)；基礎種子代次為3645代(PRRSVCH-la株146155代)；生產種子代次為4655代(PRRSVCH-la株156165代)。免疫原性試驗表明，用本發(fā)明弱毒株免疫仔豬后，所免疫仔豬均能抵抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒強毒的攻擊。本發(fā)明弱毒株的安全性好，毒力測定試驗結果表明，本發(fā)明弱毒株對妊娠母豬、仔豬等各年齡豬只均安全，無致病力。通過RFLP的分析表明，PRRSVCH-la株通過低溫連續(xù)傳代和多次克隆，當傳至l10代在PRRSVORF5發(fā)生穩(wěn)定的點突變，該突變穩(wěn)定保持到170代，說明本發(fā)明弱毒株是一株具有穩(wěn)定遺傳變異的致弱毒株。本發(fā)明弱毒株濕毒在-2(TC的保存期為12個月，在-7(TC的保存期為24個月；本發(fā)明弱毒株凍干毒在-2(TC和-7(TC的保存期為24個月。本發(fā)明疫苗的使用方法(1)接種途徑頸部肌肉注射。(2)接種劑量仔豬在34周齡免疫，每頭頸部肌肉注射疫苗1頭份；母豬于配種前1周免疫，每頭頸部肌肉注射疫苗2頭份。本發(fā)明弱毒株應用范圍較寬，例如，可應用于制備成診斷繁殖與呼吸綜合癥病毒的診斷試劑，還可應用于制備成單苗或聯苗(活或滅活疫苗)疫苗等。圖1PRRSVCH-la株傳代次數與病毒滴度關系。圖2ORF5基因片段的RFLP分析結果。圖3用TspEI酶切ORF5的電泳圖。M:MarkerDL20001:MLV;2、3:CH-la株;4:VR2332株;5:GD-3株;6:CH-la70代;7:CH-la90代;8:CH-la110代;9:CH-la130代；IOCH-lal50代；ll:CH-la155代;12:CH-la160代;13:CH-la170代。為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制。具體實施方式1.1試驗用豬購自非疫區(qū)的PRRS血清抗體陰性豬場。1.2病毒細胞培養(yǎng)及克隆化1.2.1細胞培養(yǎng)Marc-145細胞系用DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中含4%滅活犢牛血清、100U/ml的青霉素、80嗎/ml的鏈霉素，并用NaHC03調整pH值至7.2左右，過濾除菌。用此細胞培養(yǎng)液復蘇或傳代細胞系Marc-145至容量為100ml的滅菌小扁瓶里，待長成良好細胞單層后用于接種病毒。1.2.2種毒的克隆化從國內分離的PRRSVCH-la株在Marc-145細胞上傳代，分別在傳至30、50、70、90、110、130代時進行了病毒克隆，除30代種毒克隆挑選2mm蝕斑外，隨后克隆均選擇lmm蝕斑。30、50代種毒選取群體蝕斑(37個單蝕斑混合培養(yǎng))，從70代種毒開始選取lmm以內單一蝕斑傳代培養(yǎng)，經過90、110、130代獲得了比較單一的蝕斑直徑在lmm以內的疫苗用種毒，每傳5代進行l(wèi)次蝕斑大小檢查，如出現5y。以上大于2mm的蝕斑，則進行再次克隆純化。1.2.3種毒的低溫培育將30代進行了克隆的PRRSVCH-la株，置于36"C下繼代10代，然后置于35i:下繼代20代，隨后置于34i:下繼代30代，傳至90代，恢復37"C下繼續(xù)培養(yǎng)傳代至170代，選取不同代次測定TCID5Q。選取10、30、50、70、90、110、130、150、155、160、170代次的病毒，做病毒滴度測定。試驗結果當PRRSVCH-la在Marc-145細胞系傳至30代時，其病毒滴度在105GTCID5()/ml左右，在低于37'C的條件下培養(yǎng)時，病毒滴度提高不明顯，直到傳至90代病毒滴度才達到1063TCID5。/ml。經測定PRRSVCH-la在Marc-145細胞上傳至110170代時，病毒滴度達到107GTCID5()/ml以上；傳至170代時，仍穩(wěn)定維持在107QTCID5()/ml以上。結果見表l、圖l。表l傳代次數與病毒滴毒的關系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.3理化特性試驗取分離毒株的90、110、130、150、155、160、170代細胞毒懸液(10711075TCID5。/ml)5ml，平均分裝于5試管中，試管1于56。C水浴作用45min;試管2加20%的乙醚震蕩10min后，4。C過夜，無菌揮去乙醚；試管3先用O.lMHCl調pH至3.0，于4'C作用2h后用O.lNaOH調pH至7.2;試管4加5-碘脫氧尿核苷(5-IUDR)50/d，4'C作用12h;測定經過處理和未經處理的細胞毒懸液的TCID5c，試驗結果見表2表2理化特性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.4紅細胞凝集試驗采用微量板法，分別用0.5%的雞、豚鼠、大鼠、兔和綿羊的紅細胞懸液測定110、130、150、155、160、170代細胞毒懸液(10711075TCID50/ml)的HA滴度，以50%紅細胞凝集的最高稀釋度作為判定終點。試驗結果表明110、130、150、155、160、170代細胞毒懸液對0.5%的雞、豚鼠、大鼠、兔和綿羊的紅細胞均無凝集作用。1.5毒力測定選用26頭懷孕8593天的母豬，用10、30、50、70、90、110、130、150、170代PRRSVCH-la(4xl()72TCID5。)滴鼻，觀察發(fā)病情況。試驗結果見表3。表3毒力測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表3中發(fā)現在Marc-145細胞上傳至110170代PRRSV的致病力明顯降低，而病毒滴度維持在較高的水平。1.6PRRSV0RF5基因的擴增分別對90、110、130、150、155、160、170代次病毒的0RF5基因進行擴增，使用引物見表4，反應條件見表5。表4ORF5基因進行擴增所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表5ORF5基因進行擴增PCR反應條件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結果，結果均擴增到特異目的條帶(見圖2)。1.7ORF5基因片段的RFLP分析采用TspEI限制性內切酶對已經純化各代次的ORF5進行酶切，按TspEI限制性內切酶使用說明進行。以上反應均在37°CF，反應2小時，然后取10pl反應產物，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，具體瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3。1.8免疫原性試驗將25頭2835日齡PRRSV抗體陰性仔豬，隨機分為5組(5頭/組)，第14組為試驗組，第5組為對照組。取150、155、160、170代細胞毒懸液(10711075TCID5Q/ml)各免疫5頭仔豬，2ml/頭，第5組設為不注射疫苗的對照組。在免疫后28天經鼻內接種2xloS力TCID5oPRRSVCH-la株強毒，測量仔豬體溫并觀察仔豬臨床表現，共觀察14天。試驗結果將150、155、160、170代細胞病毒懸液(10711075TCID50/ml)接種仔豬后，均無不良臨床反應出現。在免疫后28天用豬繁殖與呼吸綜合癥強毒攻擊，免疫組仔豬體溫正常，也無其它異常反應，而對照組的豬均出現了體溫升高和呼吸困難的癥狀，說明這4代次細胞病毒懸液具有良好的免疫原性，均能完全保護仔豬抵抗強毒的攻擊，具體結果見表6。表6PRRS活疫苗(CH-1R株)對仔豬的主動免疫試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.9無菌檢驗取分離毒株的110、130、150、155、160、170代細胞毒懸液(lxl06('TCID5()/ml)按照按《中國獸藥典》進行，試驗結果表明無雜菌污染。1.10支原體檢驗取分離毒株的IIO、130、150、155、160、170代細胞毒懸液(lxl066TCID50/ml)按《中國獸藥典》進行，試驗結果表明無支原體污染。Ul外源病毒檢測按《中國獸藥典》進行。利用豬三價(HCV、PPV、BVDV)熒光抗體、豬偽狂犬病毒熒光抗體檢測，均未檢測到特異性熒光；采用細胞病變(CPE)方法檢測，未見Vero細胞出現CPE;采用紅細胞吸附法檢測，未見Vero細胞出現血細胞吸附現象出現。試驗證明，CH-1R株PRRS種毒未檢測到外源病毒污染。1.12毒種保存期試驗將凍干毒種和濕毒種分別在-2(TC和-7(TC保存6、12、24、30月定期檢査病毒滴度，并記錄結果，試驗結果見表7。表7毒種不同條件下的保存期試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表7可知，凍干毒種在—2(TC下，最長可達24月，在一70。C下，保存24個月病毒滴度無明顯變化。濕毒種在一20'C以下，最長可達12月，在一7(TC以下，保存24個月病毒含量無明顯變化。權利要求1.豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus)弱毒疫苗株，其微生物保藏號是CGMCCNO.1883。2、一種疫苗組合物，其特征在于由權利要求1的弱毒疫苗株、藥學上可接受的佐劑或載體所組成。3、權利要求1的弱毒疫苗株在制備防治豬繁殖與呼吸綜合癥病毒藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus)弱毒疫苗株，其微生物保藏號是CGMCCNO.1883。本發(fā)明弱毒疫苗株遺傳變異穩(wěn)定，安全性好，對妊娠母豬、仔豬等各年齡豬只均安全，無致病力。用本發(fā)明弱毒疫苗株免疫仔豬后，所免疫仔豬均能抵抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒強毒的攻擊。文檔編號C12N7/00GK101220348SQ20071000125公開日2008年7月16日申請日期2007年1月9日優(yōu)先權日2007年1月9日發(fā)明者劉永剛,柴文君,王洪峰,蔡雪輝,郭寶清申請人:中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所