鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物及其脂質(zhì)納米粒和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物及其脂質(zhì)納米粒和制備方法，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物及其脂質(zhì)納米粒具有改善藥物脂溶性，并使其具有一定的腸黏附性而易于透過腸粘膜吸收，且能保護(hù)藥物免受胃腸道蛋白酶降解的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒組分為鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物、脂質(zhì)材料、表面活性劑和水，通過薄膜分散法等方法制備而成。本發(fā)明方法制備的水溶性藥物納米粒中，藥物油水分配系數(shù)高，透膜性好，可改善其口服生物利用度，制備方法工藝過程簡(jiǎn)單。
【專利說明】
結(jié)魚降巧素磯脂復(fù)合物及其脂質(zhì)納米粒和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及娃魚降巧素憐脂復(fù)合物及其脂質(zhì)納米粒和制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 降巧素(calcitonin)是甲狀腺內(nèi)的濾泡旁細(xì)胞分泌的一種激素，是由32個(gè)氨基酸 組成的多膚，由化rsh首次發(fā)現(xiàn)并證明它具有巧、憐代謝調(diào)節(jié)功能。降巧素 W骨為祀細(xì)胞，它 與破骨細(xì)胞表面受體結(jié)合后可抑制破骨細(xì)胞增殖，阻止骨溶解。根據(jù)來源不同，降巧素分為 人、豬、娃魚和媛魚降巧素，其中娃魚降巧素 （salmon calcitonin)的比活性最高，約是人降 巧素的30倍，作用時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定性好，半衰期長(zhǎng)，副作用小，因此娃魚降巧素在臨床的應(yīng)用最 為廣泛。娃魚降巧素為易溶于水的白色粉末，分子式為Cl45也4〇N44〇48S2。分子量3432道爾頓， 結(jié)構(gòu)式如下：
[0003]
[0004] 娃魚降巧素最早由諾華公司于二十世紀(jì)60年代研制，先后上市了注射液和鼻噴 劑，90年代開始進(jìn)入我國(guó)，目前國(guó)內(nèi)已有十余家企業(yè)生產(chǎn)原料藥和注射劑、鼻噴劑。
[0005] 娃魚降巧素臨床上主要治療各種原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松癥和高巧血癥，此外還適用 于變形性骨炎、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)癥、維生素 D中毒W(wǎng)及痛性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良癥或Sudeck氏 病。
[0006] 中國(guó)正在進(jìn)入一個(gè)老年化社會(huì)，老年人易患骨質(zhì)疏松癥，該疾病也是世界性公眾 健康問題，每年約有130萬(wàn)人患骨質(zhì)疏松癥而引起的骨折。
[0007] 目前國(guó)內(nèi)外娃魚降巧素上市制劑包括娃魚降巧素注射液和鼻腔噴劑，注射劑對(duì)于 需長(zhǎng)期給藥的患者而言，給藥方便性及適應(yīng)性均較差;鼻腔噴劑的給藥劑量不易控制，若將 娃魚降巧素制成口服制劑，則可W提高患者的臨床適應(yīng)性和耐受性，從而更好的發(fā)揮娃魚 降巧素的臨床作用。近年來國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道，將娃魚降巧素制備成腸溶微粒和納米粒 等口服制劑，如CN101569608A公開了一種降巧素的口服固體脂質(zhì)納米粒制劑及其制備方 法，其將娃魚降巧素直接與脂質(zhì)材料制備成納米粒分散液。但由于娃魚降巧素易溶于水，月旨 溶性差，在細(xì)胞膜上的透過率低，且在直接制備成納米粒時(shí)包封率低。
[000引本發(fā)明是將娃魚降巧素制備成憐脂復(fù)合物后再制備成脂質(zhì)納米粒，通過提高娃魚 降巧素口服后在腸道黏膜的吸收率，來提高其口服生物利用度，并提高納米的包封率。目前 尚未見有將娃魚降巧素制成憐脂復(fù)合物后再制成脂質(zhì)納米粒，用W提高娃魚降巧素口服生 物利用度的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種改善藥物脂溶性的娃魚降巧素憐脂 復(fù)合物。發(fā)明人采用憐脂復(fù)合物技術(shù)用于提高娃魚降巧素的脂溶性，并結(jié)合脂質(zhì)納米粒増 溶祀向技術(shù)，將水溶性藥物娃魚降巧素制成了娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒，增加了 藥物的脂溶性，從而促進(jìn)藥物的透膜吸收，提高藥物的生物利用度;而且還能保護(hù)娃魚降巧 素免受胃腸道蛋白酶降解。
[0010]本發(fā)明娃魚降巧素憐脂復(fù)合物，包括下述重量配比的組分：
[00川娃魚降巧素 1份
[001 ^ 憐脂 5-20 份；
[0013] 優(yōu)選的，包括下述重量配比的組分：
[0014] 娃魚降巧素 1份
[00巧]憐脂 10份；
[0016] 其中，娃魚降巧素憐脂復(fù)合物是由娃魚降巧素與憐脂采用溶劑揮發(fā)法制備。憐脂 為蛋黃卵憐脂、大豆憐脂中的至少一種。
[0017] 本發(fā)明解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供上述娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的制備方法，包 括W下步驟：
[0018] (a)將娃魚降巧素和憐脂溶解于溶劑I;
[0019] (b)在適當(dāng)溫度下恒溫?cái)埌杌亓鞣磻?yīng)后減壓旋蒸除去溶劑I;
[0020] (C)加入乙酸，溶解憐脂復(fù)合物后過濾，將濾液減壓旋蒸至干，除去未反應(yīng)的娃魚 降巧素，得到淡黃色的粘稠狀娃魚降巧素憐脂復(fù)合物。
[0021] 其中，步驟(a)所述溶劑I為弱極性溶劑;所述弱極性溶劑為乙酸、乙酸乙醋、二氯 甲燒、Ξ氯甲燒中的一種或兩種的混合溶劑，其中步驟(a)所述溶劑I為二氯甲燒與乙酸按 體積比7:3-9:1混合所得試劑；當(dāng)二氯甲燒與乙酸按體積比6:4~7:3混合時(shí)，得到的娃魚降 巧素憐脂復(fù)合物復(fù)合率最高。
[0022] 其中步驟(b)所述溫度為40°CW下。
[0023] 本發(fā)明解決的第Ξ個(gè)技術(shù)問題是將提供一種改善藥物脂溶性，易于透過腸粘膜吸 收，提高藥物的生物利用度的娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒，包括下述重量配比的組 分： 娃魚降巧素憐脂復(fù)合物^ 6-21份 脂質(zhì)材料 1-8份
[0024] 表面活性劑 1 20份 氷 1OO0-斗卵燈化。
[0025] 優(yōu)選包括下述重量配比的組分： 猶魚除巧素憐脂復(fù)合物 1.1汾 脂質(zhì)材料 1-8份
[0026] 表面活性劑 1-20份 水 1000-4000 份。
[0027] 進(jìn)一步優(yōu)選包括下述重量配比的組分： 蛙魚降鉤素憐脂復(fù)合物 Π 份 脂質(zhì)材料 2.98份
[002引 表面活性劑 么傲 水 2000份。
[0029] 其中娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒是由娃魚降巧素憐脂復(fù)合物與脂質(zhì)材料、 表面活性劑、水，采用薄膜分散法來制備的。其中脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油醋、硬脂酸、棟桐 酸、Ξ棟桐酸甘油醋中的至少一種;表面活性劑為泊洛沙姆188、吐溫80中的至少一種;本發(fā) 明娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒W混懸液形式存在，或者將混懸液制成凍干粉形式， 然后進(jìn)一步將混懸液或凍干粉加工成固體制劑，如片劑、膠囊劑等，制成的固體制劑具有良 好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，且有利于藥物的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸。
[0030] 本發(fā)明解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供上述娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒的 制備方法，包括W下步驟：（i)表面活性劑加水制成表面活性劑水溶液;娃魚降巧素憐脂復(fù) 合物加入脂質(zhì)材料，用溶劑Π 溶解后減壓旋蒸去除溶劑Π ，加入適量表面活性劑水溶液浸 泡過夜；（ii)將（i)溶液采用細(xì)胞破碎儀超聲或高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，得娃魚降巧素憐脂復(fù)合物 脂質(zhì)納米粒混懸液。其中，步驟(i)所述表面活性劑水溶液的濃度為0.1%-0.5%。
[0031] 本發(fā)明娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒的粒徑為102~22化m，多分散指數(shù)為 0.2~0.4，Ze化電勢(shì)為-20~-30mV。
[0032] 進(jìn)一步的，為了提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和便于膽存，還可W將步驟（ii)制得的納米混 懸液制成凍干粉。即向步驟(ii)制得的納米混懸液中加入凍干保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥，得到 娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒凍干粉。其中，凍干保護(hù)劑為甘露醇、海藻糖、中的一種 或兩種的混合物。
[0033] 其中，步驟(i)所述脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油醋、硬脂酸、棟桐酸、Ξ棟桐酸甘油醋 中的至少一種。
[0034] 進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(i)所述脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油醋與硬脂酸的混合物，其重量 比為:單硬脂酸甘油醋1-4份、硬脂酸1-4份。
[0035] 最優(yōu)選，步驟（i)所述脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油醋與硬脂酸的混合物，其重量比 為:單硬脂酸甘油醋1份、硬脂酸3.125份。
[0036] 其中，步驟(i)所述溶劑Π 為脂溶性溶劑，所述脂溶性溶劑為乙酸、乙酸乙醋、二氯 甲燒、Ξ氯甲燒中的一種或兩種的混合溶劑，其中乙酸的溶解效率最高。
[0037] 其中，步驟(i)所述表面活性劑為泊洛沙姆188、吐溫80中的至少一種;優(yōu)選泊洛沙 姆188。表面活性劑也稱為乳化劑，其作用是降低表面張力，促進(jìn)粒子分離，減少粒子聚集而 達(dá)到穩(wěn)定脂質(zhì)納米粒的作用。表面活性劑采用濃度為〇.〇5%-〇.5%的泊洛沙姆188;進(jìn)一步 優(yōu)選濃度為0.1 %的泊洛沙姆188。
[0038] 本發(fā)明的納米?；鞈乙嚎蒞直接作為滴鼻劑或凍干后進(jìn)一步加工成固體制劑，如 片劑、膠囊劑等，制成的固體制劑具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，且有利于藥物的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn) 輸。
[0039] 測(cè)定本發(fā)明娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒的粒徑大小、分布及其zeta電位： 將本發(fā)明制得的娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米?；鞈乙河眉兓m當(dāng)稀釋，用馬爾文激 光粒度儀測(cè)定器粒徑大小及其分布，結(jié)果如下：粒徑范圍為102~22化m，Zeta電勢(shì)-20~- 30mV，多分散指數(shù)(PDI)O. 2~0.4。經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒包封 率更高，應(yīng)用時(shí)在腸道的吸收更好，優(yōu)于普通娃魚降巧素脂質(zhì)納米粒。
【附圖說明】
[0040]圖1紅外光譜圖：其中A-D分別表示:A-娃魚降巧素;B-娃魚降巧素和憐脂物理混合 物;C-憐脂;D-娃魚降巧素憐脂復(fù)合物。
[0041 ] 圖2 X畑圖：其中圖2A-圖2D分別表示：圖2A-娃魚降巧素 XRD圖；圖2B-娃魚降巧素 和憐脂物理混合物X畑圖；圖2C-憐脂X畑圖；圖2D-娃魚降巧素憐脂復(fù)合物X畑圖。
[0042] 圖3 DSC圖：其中圖3A-圖3D分別表示：圖3A-娃魚降巧素 DSC圖；圖3B-娃魚降巧素 和憐脂物理混合物DSC圖；圖3C-憐脂DSC圖；圖3D-娃魚降巧素憐脂復(fù)合物DSC圖。
[0043] 圖4娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒透射電鏡圖。
[0044] 圖5娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒的釋放曲線。
[0045] 圖6血巧百分率-時(shí)間曲線：其中A-D分別表示:A-娃魚降巧素注射液皮下給藥;B- 空白納米粒結(jié)腸給藥;C-娃魚降巧素水溶液結(jié)腸給藥;D-娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米 粒結(jié)腸給藥;E-娃魚降巧素脂質(zhì)納米粒結(jié)腸給藥。
【具體實(shí)施方式】
[0046] W下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明，說明但不限制本發(fā)明。
[0047] 鑒于娃魚降巧素的脂溶性差、透膜吸收差、易被胃腸道蛋白水解酶降解、對(duì)胃腸道 抑敏感，口服生物利用度低。發(fā)明人采用了將娃魚降巧素制成憐脂復(fù)合物后，W娃魚降巧素 憐脂復(fù)合物、脂質(zhì)材料、表面活性劑和水為原料，通過薄膜分散法制成脂質(zhì)納米粒的方式克 服了上述缺陷，得到了具有藥物油水分配系數(shù)高，粘膜透過率高、穩(wěn)定性好、免受蛋白酶降 解等優(yōu)點(diǎn)的娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒的，可達(dá)到提高口服生物利用度和臨床療效 的目的。
[004引憐脂復(fù)合物(phospholipid complex)是一種在非質(zhì)子傳遞體系溶劑中，藥物與憐 脂W-定配比關(guān)系結(jié)合而形成的復(fù)合物。娃魚降巧素易溶于水，而脂溶性很差，鑒于生物膜 脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，脂溶性小的藥物不易透膜吸收。將娃魚降巧素制備成憐脂復(fù)合物后增 加其油水分配系數(shù)，使其具有一定的親脂性，在不改變娃魚降巧素和憐脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥 理作用的同時(shí)，促進(jìn)其透膜吸收。
[0049] 脂質(zhì)納米粒（lipid nanoparticles，LN)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新型膠體 給藥系統(tǒng)。它是W具有生理相容性和生物可降解性的、高烙點(diǎn)的天然或合成脂質(zhì)為骨架材 料所制成的納米尺度的載藥系統(tǒng)，其主要優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：（a)具有良好的生理相容性；（b)保護(hù) 藥物免受胃腸道蛋白酶的降解，增加蛋白、多膚類藥物的口服吸收；（C)具有緩控釋、祀向、 長(zhǎng)效的作用；（d)對(duì)親脂性藥物具有較高的包封率；（e)對(duì)體內(nèi)的粘膜組織具有粘附性，延長(zhǎng) 藥物的體內(nèi)滯留時(shí)間，提高藥物的生物利用度；（f)有適合于工業(yè)大生產(chǎn)的生產(chǎn)方式?？捎?效解決娃魚降巧素易被體內(nèi)蛋白水解酶水解、透膜性差等問題。
[0050] W下，娃魚降巧素簡(jiǎn)稱sCT，憐脂簡(jiǎn)稱SPC，娃魚降巧素憐脂復(fù)合物簡(jiǎn)稱sCT-SPC，二 甲基亞諷簡(jiǎn)稱DMSO,娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒簡(jiǎn)稱sCT-PC-LN。
[0051]( - )娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的制備工藝選擇及優(yōu)化
[0052] 1.凍干法制備sCT-SPC:稱取lOmg sCT、100mg SPC，分別加入反應(yīng)溶劑10ml，在25 °(：條件下磁力攬拌反應(yīng)化，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至稱量瓶，凍干。按照sCT-SPC復(fù)合率測(cè)定法測(cè)定 其復(fù)合率。
[0053 ] 實(shí)驗(yàn)分別考察了 DMS0、含1 %冰乙酸的DMS0、3 %冰乙酸的DMS0、5 %冰乙酸的DMS0、 8 %冰乙酸的DMS0運(yùn)幾種反應(yīng)溶劑對(duì)復(fù)合率的影響。結(jié)果見表1.
[0054] 表1:不同冰乙酸含量?jī)龈煞╯CT-SPC復(fù)合率
[0化5]
[0056]實(shí)驗(yàn)表明隨著冰乙酸含量的增加，凍干法sCT-SPC的復(fù)合率有減少的趨勢(shì)，所W冰 乙酸的量越少越好，但是DMS0顯堿性，而sCT在弱酸性條件下穩(wěn)定，經(jīng)穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)得sCT 在含1%冰乙酸DMS0的溶液中穩(wěn)定。所W選擇的反應(yīng)溶劑為含1%冰乙酸DMS0的溶液。
[0057] 2.溶劑揮發(fā)法制備sCT-SPC:稱取sCT5mg，溶于1 %冰乙酸甲醇溶液中，加入大豆憐 月旨50mg，再加入反應(yīng)溶劑10ml，使憐脂全部溶解。將上述溶液分別于25°C條件下磁力攬拌反 應(yīng)化，于30°C恒溫旋蒸，將有機(jī)溶劑蒸干，減壓干燥過夜，-20°C保存。照sCT-SPC復(fù)合率測(cè)定 法(直接法和間接法)測(cè)定其復(fù)合率。
[005引 2.1反應(yīng)溶劑的影響：首先考察了二氯甲燒、乙酸、Ξ氯甲燒、二氯甲燒：乙酸=5: 5、Ξ氯甲燒：乙酸=5:5、Ξ氯甲燒:二氯甲燒=5:5作為反應(yīng)溶劑對(duì)復(fù)合率的影響。結(jié)果如 表2。
[0059] 表2反應(yīng)溶劑對(duì)溶劑揮發(fā)法復(fù)合率的影響
[0060]
[0061] 據(jù)表2可知，混合溶劑的復(fù)合率明顯高于單一溶劑，混合溶劑的復(fù)合率均大于 50 %，且Ξ氯甲燒與其他溶劑混合時(shí)反應(yīng)更完全，但Ξ氯甲燒毒性較大，綜合考慮選擇二氯 甲燒與乙酸的混合溶劑作為反應(yīng)溶劑。
[0062] 小結(jié)：由表1和表2可W看出凍干法制備的sCT-SPC的復(fù)合率低于溶劑揮發(fā)法，同時(shí) 凍干法耗時(shí)長(zhǎng)，操作麻煩，綜合考慮采用溶劑揮發(fā)法制備sCT-SPC。
[0063] 2.2反應(yīng)溶劑比例的影響
[0064] 選擇反應(yīng)溶劑為二氯甲燒與乙酸的混合溶劑，分別考察二氯甲燒與乙酸的混合比 例按體積比分別為1:9、3:7、5:5、6:4、7:3、9:1對(duì)復(fù)合率的影響。結(jié)果見表3。
[0065] 表3反應(yīng)溶劑對(duì)溶劑揮發(fā)法復(fù)合率的影響
[0066]
[0067] 小結(jié)：由表3可W看出，反應(yīng)溶劑比例對(duì)復(fù)合率有較大的影響，隨著二氯甲燒的比 例增加，復(fù)合率具有先增加后減小的趨勢(shì)，故優(yōu)選二氯甲燒與乙酸按體積比7: 3-9:1的范 圍，最優(yōu)選二氯甲燒與乙酸按體積比為6:4~7:3。
[0068] 2.3反應(yīng)溫度的影響
[0069] 選擇反應(yīng)溶劑的比例為二氯甲燒與乙酸按體積比7:3，分別考察-25°(：、0°(：、251： 時(shí)的復(fù)合率。結(jié)果見表4。
[0070] 表4反應(yīng)溫度對(duì)復(fù)合率的影響
[0071]
[0072] 小結(jié)：由表4可見，反應(yīng)溫度對(duì)復(fù)合率的影響較小，在常溫下即可進(jìn)行，為了便于控 審IJ，選擇25 °C作為反應(yīng)溫度。
[0073] 2.4反應(yīng)時(shí)間的影響
[0074] 選擇反應(yīng)溫度為25°C考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率的影響，結(jié)果見表5。
[0075] 表5反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率的影響。
[0076]
[0077] 小結(jié)：由表5可W看出，藥物與憐脂的復(fù)合率隨時(shí)間增加，先增加后趨于平衡，受時(shí) 間影響較大。
[0078] 2.5sCT-與SPC質(zhì)量比的影響
[00巧]考察質(zhì)量比分別為1: 5、1:10、1:15、1:20時(shí)的復(fù)合率，結(jié)果見表6。
[0080] 表6質(zhì)量比對(duì)復(fù)合率的影響
[0081]
[0082]小結(jié)：由表6可得，質(zhì)量比對(duì)復(fù)合率的影響較大，質(zhì)量比越大，復(fù)合率顯著增加。但 當(dāng)sCT與憐脂比例為1:10時(shí)，復(fù)合率趨于穩(wěn)定，結(jié)合也趨于完全。
[0083] 2.6正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0084] 根據(jù)單因素考察的結(jié)果可知，反應(yīng)溶劑比例、反應(yīng)時(shí)間和質(zhì)量比對(duì)sCT-SPC的復(fù)合 率影響較大，W復(fù)合率為指標(biāo)，對(duì)A(反應(yīng)溶劑比例）、B(反應(yīng)時(shí)間）、C(質(zhì)量比）為因素，進(jìn)行 Ξ因素四水平正交設(shè)計(jì)，采用L16(45)表，見表7,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。
[00化]表7因素水平表
[0089] 各因素極差的大小反映同一因素不同水平時(shí)試驗(yàn)指標(biāo)變化的幅度，變化幅度越 大，表明該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。由表中可看出，因素對(duì)指標(biāo)的影響順序?yàn)椋|(zhì)量比 最大，溶劑比例次之，反應(yīng)時(shí)間最小。
[0090] 表9方差分析結(jié)果
[0091]
[0092] 注：F0.05(3,3) = 9.280
[0093] 小結(jié):根據(jù)表9方差分析的結(jié)果可知，質(zhì)量比對(duì)復(fù)合率的影響顯著。優(yōu)化后的工藝 條件為反應(yīng)溶劑二氯甲燒與乙酸的比例為6:4,反應(yīng)時(shí)間為4h，sCT與SPC質(zhì)量比為1:10。按 照優(yōu)化后的工藝重復(fù)制備3批樣品，測(cè)定復(fù)合率平均為47.81%，RSD為1.29%。復(fù)合物為淡 黃色的粘稠物。
[0094] 3娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的理化性質(zhì)表征
[0095] 3.1娃魚降巧素在正辛醇中溶解性能的測(cè)定
[0096] 精密稱取娃魚降巧素、娃魚降巧素與憐脂物理混合物(質(zhì)量比為1:10)、娃魚降巧 素憐脂復(fù)合物適量(娃魚降巧素的質(zhì)量相當(dāng)），分別加入等量正辛醇，放置在25Γ恒溫水浴 振蕩器中，150r · mirTi水浴振蕩2地，使溶解達(dá)到平衡。平衡好的溶液用0.祉m的微孔濾膜過 濾后，取續(xù)濾液SOiiL按"2.1. Γ項(xiàng)下測(cè)定娃魚降巧素溶解百分率。結(jié)果見表10。
[0097] 表10娃魚降巧素、物理混合物和憐脂復(fù)合物在正辛醇中的溶解百分率 [009引
[0099] 小結(jié):表10結(jié)果表明，娃魚降巧素完全不溶于正辛醇中，與憐脂進(jìn)行物理混合或制 備成娃魚降巧素憐脂復(fù)合物都對(duì)娃魚降巧素有一定的增溶作用。娃魚降巧素憐脂復(fù)合物對(duì) 娃魚降巧素在正辛醇中的增溶作用不同于物理混合物，是物理混合物的20.67倍，說明娃魚 降巧素與憐脂確實(shí)形成了復(fù)合物，而不是簡(jiǎn)單的物理混合物。
[0100] 3.2娃魚降巧素表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定
[0101] 精密稱取娃魚降巧素、娃魚降巧素與憐脂的物理混合物(質(zhì)量比為1:10)、娃魚降 巧素憐脂復(fù)合物適量(娃魚降巧素的質(zhì)量相當(dāng)），分別加入等量〇.〇2mol · 1/1四甲基氨氧化 錠（用憐酸調(diào)pH2.5)飽和的正辛醇溶液和正辛醇飽和的0.02mol · 1/1四甲基氨氧化錠(用憐 酸調(diào)PH2.5)溶液，放置在恒溫水浴振蕩器中于25°C，150r-mirTi水浴振蕩2地，使溶解達(dá)到 平衡。取出溶液1300化· min-i離屯、15min，分離油相和水化并用0.祉m的微孔濾膜過濾后， 分別測(cè)定油相和水相中娃魚降巧素的濃度，計(jì)算表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果見表11。
[0102] 表11娃魚降巧素、物理混合物和娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)
[0103]
[0104] 小結(jié)：由表11可W看出，物理混合物使娃魚降巧素的油水分配系數(shù)稍有提高，而娃 魚降巧素憐脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)較物理混合物提高了245.50倍?？梢?，娃魚降巧 素憐脂復(fù)合物顯著提高了娃魚降巧素的表觀油水分配系數(shù)。
[0105] 3.3紅外光譜分析(IR)
[0106] 采用邸r壓片法分別對(duì)娃魚降巧素、憐脂、娃魚降巧素與憐脂物理混合物（質(zhì)量比 為1:10)、娃魚降巧素憐脂復(fù)合物在400~4000cm-l進(jìn)行紅外掃描（圖1)，由圖1可見，娃魚降 巧素(A)的特征吸收峰是1656、1538cm-l;憐脂(C)的特征吸收峰是1740、1620、1236、1064、 824cm-l;在娃魚降巧素與憐脂物理混合物(B)的紅外圖譜中無新峰形成;在娃魚降巧素憐 脂復(fù)合物(D)紅外圖譜中，娃魚降巧素的特征吸收峰強(qiáng)度減小，憐脂的特征吸收峰增強(qiáng)，但 并無新的峰形成。從運(yùn)些光譜特征看出，憐脂復(fù)合物區(qū)別于物理混合物，且在復(fù)合物的制備 過程中，娃魚降巧素和憐脂是通過物理作用結(jié)合在一起的，并沒有形成新的化學(xué)鍵。
[0107] 3.4X-射線衍射分析(X畑）
[010引檢測(cè)條件:石墨單色器單色化化-Ka，管壓40kV，管流20Ma，衍射范圍5-60°，分別將 娃魚降巧素、憐脂、娃魚降巧素與憐脂物理混合物(質(zhì)量比為1:10) W及娃魚降巧素憐脂復(fù) 合物進(jìn)行X-射線衍射分析，結(jié)果見圖2(圖2A-圖2D)。由圖2可見，娃魚降巧素和憐脂均為無 定形粉末。由于憐脂的比例大，娃魚降巧素與憐脂的物理混合物及復(fù)合物圖譜均和憐脂相 似，但娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的衍射強(qiáng)度明顯低于物理混合物，說明娃魚降巧素憐脂復(fù)合 物不同于物理混合物，娃魚降巧素憐脂復(fù)合物中娃魚降巧素高度分散于憐脂中，使衍射強(qiáng) 度降低。
[0109] 3.5差示掃描量熱分析(DSC)
[0110] 測(cè)定條件:溫度40-500°C，升溫速度10°C -min-1。分別測(cè)定娃魚降巧素、憐脂、娃 魚降巧素與憐脂物理混合物(質(zhì)量比為1:10)及娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的相變溫度，圖譜見 圖3(圖3A-圖3D)?？梢娡摁~降巧素在66.2°C和187.2°C存在特征性吸熱峰，憐脂在92.3°C、 191.7、261.7°C分別存在吸熱峰。在物理混合物的DSC圖譜中存在娃魚降巧素的特征吸收峰 (188.3 °C )和憐脂的特征吸收峰(268.3 °C )，出現(xiàn)了 75.3 °C的吸收峰，可能是娃魚降巧素與 憐脂混合后娃魚降巧素的66.2°C峰和憐脂的92.3°C的峰形成的。娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的 DSC圖譜中，出現(xiàn)了一個(gè)新的吸熱峰(336. rC)，娃魚降巧素的特征吸收峰均消失，且憐脂的 吸熱峰由261.7°C減小到237. rC，提示娃魚降巧素形成復(fù)合物后對(duì)娃魚降巧素和憐脂的相 變溫度都有影響，而物理混合物圖譜只是二者吸收峰的疊加，可見娃魚降巧素憐脂復(fù)合物 不同于物理混合物。
[0111] (二)脂質(zhì)納米粒的工藝選擇及優(yōu)化
[0112] 1.溶劑分散法制備脂質(zhì)納米粒
[0113] 1. IsCT脂質(zhì)納米粒的制備
[0114] 稱取2.5mg硬脂酸、2.5mg單硬脂酸甘油醋、25mg大豆卵憐脂溶于2.5mL乙酸乙醋 中，作為油相;稱取2mgsCT溶于0.5mL純凈水中，作為水相;將水相緩慢加入油相中，冰浴下， 細(xì)胞破碎儀探頭超聲(5s*6次，40w)得初乳；向其中加入lOmLO. 3 %泊洛沙姆188溶液，冰浴 下，探頭超聲（5s*6次，80w)，得復(fù)乳。將上述復(fù)乳用0.3%泊洛沙姆188溶液稀釋至25mL，冰 浴下探頭超聲（5s*6次，40w)，于40°C旋蒸除去有機(jī)溶劑，得到略帶乳光的半透明液體。用 ATS100D均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后得到sCT脂質(zhì)納米?；鞈乙?。測(cè)定其粒徑和ze化電位值。
[0115] 1.2sCT-SPC脂質(zhì)納米粒的制備
[0116] 稱取2.5mg硬脂酸，2.5mg單硬脂酸甘油醋、適量sCT-SPC(相當(dāng)于sCT2mg)溶于 2.5mL乙酸乙醋中，作為油相;量取0.5mL純凈水中緩慢加入油相中，冰浴下，細(xì)胞破碎儀探 頭超聲（5s*6次，40w)得初乳；向其中加入lOmLO. 3 %泊洛沙姆188溶液，冰浴下，探頭超聲 (5s*6次，80w)，得復(fù)乳。將上述復(fù)乳用0.3%泊洛沙姆188溶液稀釋至25mL，冰浴下探頭超聲 (5s*6次，40w)，于40°C旋蒸除去有機(jī)溶劑，得到略帶乳光的半透明液體。用ATS100D均質(zhì)機(jī) 均質(zhì)后得到S CT-SPC脂質(zhì)納米粒混懸液。測(cè)定其粒徑和Z e化電位值。
[0117] 實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)不管是sCT脂質(zhì)納米粒還是sCT-SPC脂質(zhì)納米粒，Zeta電位均為-45~- 50，較穩(wěn)定;粒徑也符合納米粒要求，但是兩者的PDI的分布較大，在0.45~0.5之間；增加均 質(zhì)次數(shù)可W明顯降低其PDI，可是均質(zhì)機(jī)需要溶液進(jìn)行循環(huán)，無法準(zhǔn)確計(jì)算均質(zhì)次數(shù)，運(yùn)樣 勢(shì)必會(huì)使工藝的重復(fù)性降低。且此法的操作也較復(fù)雜，制備周期長(zhǎng)。
[011引2.薄膜分散法制備脂質(zhì)納米粒
[0119] 2. IsCT脂質(zhì)納米粒的制備
[0120] 稱取2.5mg的sCT，溶于1%冰醋酸的甲醇溶液中；加入處方量的脂質(zhì)材料后用乙酸 溶解后旋蒸除去乙酸，得到一層淡黃色的薄膜。加入適量表面活性劑水溶液浸泡過夜，并加 表面活性劑水溶液至5mL，將溶液采用細(xì)胞破碎儀超聲，功率為200W，超聲9次，每次間隔5s， 得娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米?；鞈乙?；向制得的納米混懸液中加入凍干保護(hù)劑，進(jìn) 行冷凍干燥，得到娃魚降巧素固體脂質(zhì)納米粒凍干粉。結(jié)果發(fā)現(xiàn)sCT脂質(zhì)納米的粒徑與Zeta 電位均較好，但由于sCT是水溶性的，故直接將其制備成納米粒的包封率較低。
[0121] 2.2sCT-SPC脂質(zhì)納米粒的制備
[0122] 稱取處方量的脂質(zhì)材料，加入含2.5mg娃魚降巧素的憐脂復(fù)合物中，用乙酸溶解后 旋蒸除去乙酸，得到一層淡黃色的薄膜。加入適量表面活性劑水溶液(泊洛沙姆188溶液)浸 泡過夜，并加上述表面活性劑水溶液至5mL，將溶液采用細(xì)胞破碎儀超聲，功率為200W，超聲 9次，每次間隔5s，得sCT-SPC脂質(zhì)納米?；鞈乙?；向制得的納米混懸液中加入凍干保護(hù)劑， 進(jìn)行冷凍干燥，得到sCT-SPC脂質(zhì)納米粒凍干粉。結(jié)果發(fā)現(xiàn)sCT-SPC脂質(zhì)納米粒的包封率大 于sCT脂質(zhì)納米粒的包封率。
[0123] 2.3SCT-SPC脂質(zhì)納米粒工藝的單因素考察
[0124] 分別考察脂質(zhì)材料與sCT比例、泊洛沙姆188濃度、單硬脂酸甘油醋與硬脂酸比例 及超聲破碎次數(shù)運(yùn)四個(gè)因素對(duì)納米粒包封率、電位及粒徑的影響。
[0125] 2.3.1脂質(zhì)材料與sCT比例
[01 %]考察當(dāng)脂質(zhì)材料與sCT質(zhì)量比例為1:1、4:1、8:1時(shí)，包封率、電位及粒徑的變化規(guī) 律。
[0127]表12脂質(zhì)材料與sCT比例 [012 引
[0129] 小結(jié):隨著脂質(zhì)材料的增加，納米粒的粒徑逐漸增大，PDI也有增大的趨勢(shì);Zeta電 位的變化不大;當(dāng)脂質(zhì)材料為sCT的4倍時(shí)，包封率已達(dá)到飽和，增大的趨勢(shì)不再明顯。
[0130] 2.3.2泊洛沙姆188濃度
[0131] 當(dāng)脂質(zhì)材料與sCT比例為4:1時(shí)，考察泊洛沙姆濃度(重量體積濃度g/ lOOmL)分別 為0.05 %、0.3%、0.5%，對(duì)納米粒各個(gè)指標(biāo)的影響。
[0132] 表13泊洛沙姆濃度
[0133]
[0134] 小結(jié)：泊洛沙姆濃度對(duì)納米粒粒徑、PDI的影響很??；Zeta電位隨濃度的增加呈先 減小后增加的變化;隨泊洛沙姆濃度的增加包封率也有所增大。
[0135] 2.3.3單硬脂酸甘油醋與硬脂酸比例
[0136] W脂質(zhì)材料與sCT比例為4:1，泊洛沙姆濃度為0.3%，當(dāng)單硬脂酸甘油醋與硬脂酸 重量比分別為4:1、1:1、1:4時(shí)，考察納米粒的各個(gè)指標(biāo)的變化。
[0137] 表14單硬脂酸甘油醋與硬脂酸比 [013 引
[0139] 小結(jié)：由表14可W看出單硬脂酸甘油醋與硬脂酸比的變化并不會(huì)引起包封率及 Zeta電位的變化;增加單硬脂酸甘油醋或硬脂酸的比例都會(huì)使粒徑增大，PDI隨著硬脂酸比 例的增大而增大。
[0140] 2.3.4超聲破碎次數(shù)
[0141] 當(dāng)脂質(zhì)材料與sCT重量比為4:1，泊洛沙姆濃度為0.3%，單硬脂酸甘油醋與硬脂酸 重量比為1:1時(shí)，考察超聲次數(shù)分別為3次、6次、9次時(shí)納米粒的各個(gè)指標(biāo)。
[0142] 表15超聲破碎次數(shù)
[0143]
[0144] 小結(jié)：由表15可知:超聲破碎次數(shù)增大，納米粒的粒徑減小，包封率逐漸增加，超聲 次數(shù)為9次時(shí)的粒徑和包封率值最優(yōu)。
[0145] 2.4sCT-SPC脂質(zhì)納米粒工藝優(yōu)化
[0146] 從單因素考察的結(jié)果可W看出，脂質(zhì)材料的用量、泊洛沙姆188的濃度、單硬脂酸 甘油醋與硬脂酸對(duì)娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒的粒徑和包封率影響較大，為了得到 最佳的處方工藝，在固定細(xì)胞破碎儀的超聲次數(shù)為9次的條件下，W脂質(zhì)材料的用量(XI)、 泊洛沙姆188的濃度(X2)、單硬脂酸甘油醋比硬脂酸的質(zhì)量比(X3)為影響因素，W平均粒徑 (Y1)，包封率(Y2)為指標(biāo)，在3個(gè)水平上進(jìn)行研究，并根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí) 驗(yàn)。因素水平實(shí)驗(yàn)和處方的組合及結(jié)果，見表16、17。
[0147] 表1GBox-Betuiken設(shè)計(jì)因素水平實(shí)驗(yàn)表 [014 引
[0149] 表UBox-Belmken優(yōu)化sCT-PC-LN處方的組合及結(jié)果
[0150]
[0151] 2.4.1二次回歸方程的建立
[0152] 運(yùn)用Desi即-Expert.8.05b版軟件對(duì)表17中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得 到模型的二次多項(xiàng)式回歸方程：￥1 = 144.14+47.81乂1+8.15乂2+3.7^3 + 11.32乂1乂2- 0.15X1X3+10.23X2X3-4.77X1 化4.60X2 化 27.6 拙32(P = 0.0007，R2 = 0.95：M)
[0153] Υ2 = 0.91+0.10X1-0.026X2-0.036X3+0.038X1X2+0.089X1X3+0.044X2X3- 0.070X12-0.031X22-0.036Χ32(Ρ = 0.0013,R2 = 0.9446) ο
[0154] 2.4.2方差分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)
[01W]經(jīng)方差分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，其結(jié)果見表18。
[0156]表18方差分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果
[0157]
[0158] 注:*表示經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
[0159] 上述2個(gè)擬合方程的相關(guān)系數(shù)說明設(shè)計(jì)模型擬合程度良好，可W用此模型對(duì)脂質(zhì) 納米粒的處方進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由表16顯示的回歸系數(shù)可知，對(duì)于粒徑，X1(P〈0.0001)，X32 (P = 0.0030)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他項(xiàng)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)于包封率，X1(P = 0.0001)，X3(P = 0.0335)，X1X3(P = 0.0025)，X12(P = 0.0079)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其 他項(xiàng)其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0160] 2.4.3效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè)
[0161 ] 根據(jù)"2.4.1"項(xiàng)中的二元多次回歸方程，應(yīng)用軟件Design-Expert. 8.0f5b版本，并 對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化和預(yù)測(cè)，得到優(yōu)化后的處方為XI = 7.45，X2 = 0.1，X3 = 0.32，對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn) 行預(yù)測(cè)得 Υ1 = 159.6，Υ2 = 94.44。
[0162] 2.4.4工藝驗(yàn)證
[0163] 經(jīng)上述結(jié)果可知，優(yōu)化后的處方為:含娃魚降巧素2.5mg的憐脂復(fù)合物，脂質(zhì)材料 總質(zhì)量(Xl)7.45mg，其中單硬脂酸甘油醋與硬脂酸的質(zhì)量比(X3)為0.32,泊洛沙姆188濃度 (X2)為0.1 %，超聲功率為200W，超聲次數(shù)為9次。
[0164] 即本發(fā)明娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒中組分的重量配比為： 蛙魚降巧素憐脂復(fù)合物^ 6-21份 脂質(zhì)材料 1-8份
[01 化] 表面活性劑 1-20份 水 1000-視齡儉。
[0166] 優(yōu)選組分的重量配比為： 魅魚降巧素憐脂復(fù)合物 1]份 脂質(zhì)材料 1-8份
[0167] 表面活性劑 1-20傲 水 1000-4000 化。
[0168] 最優(yōu)選組分的重量配比為： 蛙魚降巧素磯脂復(fù)合物 11巧 脂質(zhì)材料 ：1;蹤份
[0169] 表面活性劑 2份 水 2000份。
[0170] 按優(yōu)選的處方制備3批娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒，并測(cè)定其粒徑和包封 率值。其粒徑和包封率情況，見表19。
[0171] 表19顯示W(wǎng)優(yōu)化后的處方制備娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的脂質(zhì)納米粒，其粒徑和包 封率的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差均較低，Ξ批測(cè)定的粒徑平均值為160.4nm，包封率平均 值為 93.01 %。
[0172] 表19實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的比較
[0173]
[0174] 發(fā)明人先將sCT制備成憐脂復(fù)合物，再在其基礎(chǔ)上制備脂質(zhì)納米粒的原因有W下 幾點(diǎn)：
[01對(duì) 一.sCT為水溶性藥物，脂溶性差，而細(xì)胞膜為憐脂雙分子層結(jié)構(gòu)，sCT難W透過細(xì) 胞膜而被吸收，所W將其制備成憐脂復(fù)合物W改變其理化性質(zhì)，增加其油水分配系數(shù)，W使 sCT能夠更好地透過細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)明人也證明了sCT-SPC的油水分配系數(shù)和脂溶 性比sCT及sCT與SPC的物理混合物有很大提高。
[0176] 二.制備成脂質(zhì)納米粒主要是由于sCT作為一個(gè)多膚，口服后易被胃腸道的蛋白水 解酶水解代謝，制成納米?？蒞避免藥物被水解酶代謝，所W將其制備成脂質(zhì)納米粒是為 sCT在體內(nèi)的穩(wěn)定性考慮的。
[0177] 水溶性的藥物直接制備成納米粒的包封率較脂溶性藥物低，所W在憐脂復(fù)合 物的基礎(chǔ)上制備納米粒相當(dāng)于將水溶性的藥物的脂溶性提高，不僅增加其透膜吸收，也提 高了納米粒的包封率。
[0178] (Ξ)透射電鏡檢查
[0179] 取稀釋的sCT-PC-LN混懸液1滴，滴于覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，W0.1%憐鶴酸負(fù)染。在 室溫條件下干燥，并于透射電子顯微鏡下觀察該納米粒的形態(tài)特征。電鏡下可W看到該固 體脂質(zhì)納米粒的呈圓整的圓形，且分布均勻，結(jié)果見圖4。
[0180] (四）釋放度考察
[0181] 照優(yōu)化處方制備納米粒，用pH4.5的PBS為釋放介質(zhì)，進(jìn)行釋放度的考察，按設(shè)定的 時(shí)間取樣，0.8皿水性濾膜過濾，進(jìn)行HPLC測(cè)定分析，計(jì)算各時(shí)間的累積釋放量，繪制釋放曲 線如圖5。
[0182] (五)藥效血巧實(shí)驗(yàn)
[0183] 照優(yōu)化處方制備納米粒，腸道給予SD大鼠考察體內(nèi)降巧效果
[0184] 試驗(yàn)方法:取15只SD雌性大鼠，體重200 ± 25g，將大鼠隨機(jī)分為5組(每組3只），A組 大鼠皮下注市售娃魚降巧素注射液，分別在給藥后〇、〇.5、1、1.5、2、化于眼靜脈叢取血0.3- 0.4mL，37°C解育30min后4000Γ · min-i離屯、15min，分別取出血清，測(cè)定巧離子濃度。
[0185] 另四組大鼠予W結(jié)腸給藥，用戊己比妥鋼麻醉(30mg · kg-1)后固定，分離頸靜脈， 先取空白血0.3-0.4mL，作為0時(shí)刻血樣;沿腹中線打開腹腔，分離結(jié)腸，從上端注射生理鹽 水把腸道排空，結(jié)扎結(jié)腸上端和下端，用注射器將含有一定濃度藥物的腸灌注液(B:空白納 米粒;C:娃魚降巧素水溶液;D:娃魚降巧素憐脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒(sCT-PC-LN)、E:娃 魚降巧素脂質(zhì)納米粒(sCT-LN))約0.5mL注入結(jié)腸腸臀中，并注入少量空氣將藥液完全推入 腸臀中，檢查藥液是否充滿整個(gè)腸段，再結(jié)扎注藥處W免藥液外漏，將注藥后的腸臀放入腹 腔內(nèi)，用紅外燈保持體溫，并開始記時(shí)。分別在0.5、1、1.5、2、化于頸靜脈取血0.3-0.4mL，37 °C解育20min后4000r · min-1離屯、，分離取出血清，測(cè)定巧離子濃度。
[0186] W時(shí)間（TA)為橫坐標(biāo)，W各時(shí)間點(diǎn)血巧百分率(w/%)為縱坐標(biāo)作圖，得到血巧百 分率和時(shí)間的關(guān)系曲線。各時(shí)間點(diǎn)血巧濃度變化率按W% = CT/C0 X 100% (CT和C0分別表示 化和給藥前大鼠血清巧離子濃度，并W給藥前大鼠血清巧離子濃度作為100%)計(jì)算得到。 不同樣品結(jié)腸給藥后各時(shí)間點(diǎn)的血巧百分率-時(shí)間曲線見圖6。
[0187] 由圖6可知:皮下注射娃魚降巧素注射液能快速降低血巧水平，降血巧幅度大，達(dá) 到70% W下。結(jié)腸給予空白納米粒后，血巧濃度上下波動(dòng)，無明顯降血巧效應(yīng);娃魚降巧素 水溶液、娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒、娃魚降巧素脂質(zhì)納米粒組均有一定的降血巧 效應(yīng)，在1-化達(dá)到血巧濃度最低值，其中娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒的血巧濃度可 降至初始濃度的75 %左右。
[0188] 采用梯形法計(jì)算血巧百分率-時(shí)間曲線上的面積(AAC)來評(píng)價(jià)在娃魚降巧素在大 鼠體內(nèi)的藥理相對(duì)生物利用度(F% ) "AAC的計(jì)算方法為
[0189] AAC = SUM{(Ti + l-Ti)[(100-Ci) + (100-Ci + l)]/2}
[0190] 其中Ti，Ci分別為第i個(gè)取血點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的時(shí)間值和血巧百分率值。AAC為所有相鄰 兩點(diǎn)與100%水平線構(gòu)成的梯形面積的總和。
[0191] 娃魚降巧素在大鼠體內(nèi)的藥理相對(duì)生物利用度F%通過下式計(jì)算得到，對(duì)各樣品 結(jié)腸給藥的F%用SPSS19.0進(jìn)行方差分析。
[0192]
[0193] 其中，F(xiàn)為結(jié)腸給藥制劑相對(duì)于皮下注射娃魚降巧素注射液的藥理相對(duì)生物利用 度;AACcoi。。和AACsc分別為娃魚降巧素結(jié)腸給藥和皮下注射娃魚降巧素注射液的血巧百分 率-時(shí)間曲線上面積；（(1〇36)。。1。。，（(1〇36)3。分別為結(jié)腸給藥和皮下注射娃魚降巧素的劑量。
[0194] 對(duì)各樣品結(jié)腸給藥相對(duì)于皮下注射娃魚降巧素注射液的藥理相對(duì)生物利用度和 方差分析結(jié)果見表20所示。方差分析的結(jié)果WP值表示，為各組與G組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較 的結(jié)果。
[01M]表20大鼠給藥后藥理相對(duì)生物利用度和方差分析結(jié)果(x±s，n = 3)
[0196]
[0197] 由表20可知，娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒在結(jié)腸給藥后的藥理相對(duì)生物利 用度為0.32%，分別是娃魚降巧素溶液(0.16%)和娃魚降巧素脂質(zhì)納米粒(0.15%)的2倍， 且方差分析結(jié)果顯示具有顯著性差異，可見在憐脂復(fù)合物基礎(chǔ)上制備成脂質(zhì)納米粒后極大 地提高了娃魚降巧素在結(jié)腸粘膜的吸收。
[0198] 本發(fā)明娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒組分為娃魚降巧素憐脂復(fù)合物、脂質(zhì)材 料、表面活性劑和水，通過薄膜分散法制備而成;具有改善藥物脂溶性，并使其具有一定的 腸黏附性而易于透過腸粘膜吸收，且能保護(hù)藥物免受胃腸道蛋白酶降解的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方 法制備的水溶性藥物納米粒中，藥物油水分配系數(shù)高，透膜性好，可改善其口服生物利用 度，制備方法工藝過程簡(jiǎn)單，為臨床應(yīng)用提供了一種全新的選擇。
[0199] 名詞解釋及技術(shù)說明
[0200] 本發(fā)明的娃魚降巧素憐脂復(fù)合物復(fù)合率可通過間接法和直接法測(cè)定。間接法是將 娃魚降巧素憐脂復(fù)合物用乙酸溶解后過濾測(cè)定濾紙上游離娃魚降巧素的量計(jì)算復(fù)合率;直 接法是通過測(cè)定濾液中娃魚降巧素濃度來推算娃魚降巧素憐脂復(fù)合物的復(fù)合率。
[0201] 本發(fā)明的娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒的包封率測(cè)定方法如下:取新制備的 一定體積的娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米?；鞈乙?，加入不同體積的O.lmol · 1/1肥1溶 液，對(duì)混懸液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，并測(cè)定相應(yīng)的Zeta電位。取Zeta電位接近0時(shí)的混懸液與 0.1mol · [1肥1的比例為包封率測(cè)定的比例（1:0.2)，12000巧m離屯、15min，分離上清液與納 米粒，取上清直接進(jìn)樣分析間接計(jì)算脂質(zhì)納米粒的包封率。
[0202] 動(dòng)物血清中血巧離子濃度的測(cè)定。目前通用的檢測(cè)方法有MTB甲基廳香草酪蘭法、 0CPC鄰甲酪獻(xiàn)絡(luò)合法和AR3偶氮神虹法。本發(fā)明采用穩(wěn)定性較好的0CPC鄰甲酪獻(xiàn)絡(luò)合法用 于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中血巧的分析測(cè)定，本法也是中國(guó)藥典引用的測(cè)定方法。其測(cè)定原理為化離子 與0CPC在堿性條件下作用，生成紫色馨合物，而邸TA與化離子絡(luò)合能力強(qiáng)于0CPC，競(jìng)爭(zhēng)絡(luò)合 化離子，使0CPC游離，從而吸光度下降，與化離子濃度成正比。
[0203] 綜上，本發(fā)明提供的娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒具有改善藥物脂溶性，并 使其具有一定的腸黏附性而易于透過腸粘膜吸收，且能保護(hù)藥物免受胃腸道蛋白酶降解的 優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明娃魚降巧素憐脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒組分為娃魚降巧素憐脂復(fù)合物、脂質(zhì)材料、 表面活性劑和水，通過薄膜分散法制備而成。本發(fā)明方法制備的水溶性藥物納米粒中，藥物 油水分配系數(shù)高，透膜性好，可改善其口服生物利用度，制備方法工藝過程簡(jiǎn)單。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物，其特征在于:包括下述重量配比的組分： 鮭魚降鈣素 1份 磷脂 5-20份； 優(yōu)選，包括下述重量配比的組分： 鮭魚降鈣素 1份 磷脂 10份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物，其特征在于：以下至滿足少任意一 項(xiàng)： 所述磷脂為蛋黃卵磷脂、大豆磷脂中的至少一種； 由鮭魚降鈣素與磷脂采用溶劑揮發(fā)法、凍干法制備而成;優(yōu)選的，由鮭魚降鈣素與磷脂 采用溶劑揮發(fā)法制備而成。3. 權(quán)利要求1或2所述的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于:包括以下步 驟： (a) 將鮭魚降鈣素和磷脂溶解于溶劑I; (b) 在適當(dāng)溫度下恒溫?cái)嚢杌亓鞣磻?yīng)后減壓旋蒸除去溶劑I; (c) 加入乙醚，溶解磷脂復(fù)合物后過濾，將濾液減壓旋蒸至干，除去未反應(yīng)的鮭魚降鈣 素，得到淡黃色的粘稠狀鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于：以下至滿足 少任意一項(xiàng)： 步驟(a)所述溶劑I為弱極性溶劑； 進(jìn)一步的，所述弱極性溶劑為乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷中的一種或兩種的 混合溶劑； 步驟(a)所述溶劑I為二氯甲烷與乙醚按體積比7:3-9:1混合所得試劑； 優(yōu)選，步驟(a)所述溶劑I為二氯甲烷與乙醚按體積比6:4~7:3混合所得試劑； 步驟(b)所述溫度為40°C以下； 優(yōu)選的，步驟(b)所述溫度為25 °C。5. 鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒，其特征在于：以權(quán)利要求1或2所述鮭魚降鈣素 磷脂復(fù)合物為原料之一，包括下述重量配比的組分： 鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物 6-21份 脂質(zhì)材料 1-8份 表面活性劑 1-20份 水 1000-4000 份； 優(yōu)選的，包括下述重量配比的組分： 鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物 11份 脂質(zhì)材料 1-8份 表面活性劑 1-20份 水 1000-4000 份； 最優(yōu)選，包括下述重量配比的組分： 鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物 11份 脂質(zhì)材料 2.98份 表面活性劑 2份 水 2000份。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒，其特征在于：以下至滿足 少任意一項(xiàng)： 所述脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、棕櫚酸、三棕櫚酸甘油酯中的至少一種； 所述表面活性劑為泊洛沙姆188、吐溫80中的至少一種； 由鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物與脂質(zhì)材料、表面活性劑、水采用薄膜分散法或溶劑分散法 制備而成； 優(yōu)選的，由鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物與脂質(zhì)材料、表面活性劑、水采用薄膜分散法制備而 成； 所述鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒以混懸液形式存在;或者將混懸液制成凍干粉 形式。7. 權(quán)利要求5或6所述的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒制備方法，其特征在于包括 以下步驟： (i) 表面活性劑加水制成表面活性劑水溶液;鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物加入脂質(zhì)材料，用 溶劑Π 溶解后減壓旋蒸去除溶劑Π ，加入適量表面活性劑水溶液浸泡過夜。 (ii) 將（i)溶液采用細(xì)胞破碎儀超聲或高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，得鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂 質(zhì)納米?；鞈乙?。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒制備方法，其特征在于：以 下至滿足少任意一項(xiàng)： 步驟(i)所述表面活性劑水溶液的濃度為〇. 1 %_〇. 5% ; 步驟（i)所述脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、棕櫚酸、三棕櫚酸甘油酯中的至少 一種； 進(jìn)一步優(yōu)選，步驟（i)所述脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯與硬脂酸的混合物，其重量比 為:單硬脂酸甘油酯1-4份、硬脂酸1-4份； 最優(yōu)選，步驟（i)所述脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯與硬脂酸的混合物，其重量比為：?jiǎn)?硬脂酸甘油酯1份、硬脂酸3.125份； 步驟(i)所述溶劑Π 為脂溶性溶劑； 步驟（i)所述脂溶性溶劑為乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷中的一種或兩種的混 合溶劑； 步驟(i)所述脂溶性溶劑為乙醚； 步驟(i)所述表面活性劑為泊洛沙姆188、吐溫80中的至少一種； 優(yōu)選，步驟(i)所述表面活性劑為泊洛沙姆188; 進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(i)所述表面活性劑為濃度為〇. 05 %-0.5 %的泊洛沙姆188; 最優(yōu)選，步驟(i)所述表面活性劑為濃度為0.1 %的泊洛沙姆188。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒制備方法，其特征在于：向 步驟(ii)制得的納米混懸液中加入凍干保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥，得到鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合 物脂質(zhì)納米粒凍干粉。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的鮭魚降鈣素磷脂復(fù)合物脂質(zhì)納米粒制備方法，其特征在于： 所述凍干保護(hù)劑為甘露醇、海藻糖中的一種或兩種的混合物。
【文檔編號(hào)】A61K9/51GK105919974SQ201610272127
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日
【發(fā)明人】張穎, 王彩云, 高燕, 杜偉宏, 符海娟, 李佳
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所