一種活血止痛片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種活血止痛片，制備方法為：取當(dāng)歸22g、三七44g、醋乳香44g、冰片llg、土鱉蟲(chóng)111g、煅自然銅67g，采用特定的濃縮和干燥設(shè)備，制備得到的活血止痛片中阿魏酸含量高，并發(fā)現(xiàn)活血止痛片在制備抑制大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC?12細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
_種活血止痛片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種活血止痛片及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 活血止痛片活血散瘀，消腫止痛。用于跌打損傷，瘀血腫痛。現(xiàn)有技術(shù)中的制備方 法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，有效成分含量低，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了 本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種活血止痛片及其制備 方法。
[0004] 技術(shù)方案:本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的：
[0005] -種活血止痛片，制備方法為：取當(dāng)歸22g、三七44g、醋乳香44g、冰片llg、土鱉蟲(chóng) 111 g、煅自然銅67g，加藥材10倍重量的水，浸泡0.5h，煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再加入藥材8倍 重量的水，煎煮1小時(shí)，藥液濾出，合并兩次煎煮液，濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05，加乙醇使 含醇量的體積百分比達(dá)75%，攪拌，靜置，過(guò)濾，濾液濃縮至65°C時(shí)相對(duì)密度為1.25，并回收 乙醇，得濃縮液，使用微波萃取，得萃取液，繼續(xù)濃縮，將濃縮液進(jìn)行干燥，制粒，壓片，即得 活血止痛片。
[0006] 所述活血止痛片制備方法中所述微波萃取方法為:將水提醇沉后的濃縮液投入微 波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70 % 乙醇的量為濃縮液重量的2倍，得萃取液，濃縮，優(yōu)選條件為:微波萃取功率500W，每次萃取6 分鐘。
[0007] 所述活血止痛片，上述制備方法中三次濃縮使用裝置，包括罐體，設(shè)置在所述罐體 上的進(jìn)料口和設(shè)置在所述罐體底部的出料管，在所述罐體內(nèi)設(shè)有攪拌軸，在所述攪拌軸上 設(shè)有攪拌槳，在所述罐體的頂部設(shè)有與所述攪拌軸相連接的攪拌電機(jī)，在所述罐體的內(nèi)壁 上設(shè)有環(huán)形凹槽，所述環(huán)形凹槽的底端靠近所述罐體的底壁，在所述環(huán)形凹槽內(nèi)設(shè)有環(huán)形 旋轉(zhuǎn)塊，在所述罐體的側(cè)壁內(nèi)設(shè)有驅(qū)動(dòng)電機(jī)，在所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)的主軸上設(shè)有驅(qū)動(dòng)齒盤(pán)，在所 述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊的外環(huán)面上設(shè)有與所述驅(qū)動(dòng)齒盤(pán)相齒合的齒槽，在所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊的內(nèi)環(huán)面 上均勻設(shè)有至少三條刮筋，所述刮筋的底壁抵壓在所述罐體的底壁上端面上，在所述罐體 上設(shè)有與所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)相連接的調(diào)節(jié)器。
[0008] 所述活血止痛片，上述制備方法中濃縮裝置所述環(huán)形凹槽的頂壁與底壁均勻設(shè)有 滾珠，所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊的上端面和下端面抵壓在所述滾珠上。
[0009] 所述活血止痛片，上述制備方法中濃縮裝置所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊與所述環(huán)形凹槽的連 接面上設(shè)有密封金屬條，所述滾珠設(shè)置在所述密封金屬條與環(huán)形凹槽的內(nèi)側(cè)端。
[0010] 所述活血止痛片，上述制備方法中濃縮裝置所述出料管上還設(shè)有冷卻器，在所述 罐體內(nèi)設(shè)有水份測(cè)定儀。
[0011] 所述活血止痛片，上述制備方法中干燥使用裝置，包括箱體，設(shè)置在所述箱體內(nèi)的 物料架和設(shè)置在所述箱體頂部的進(jìn)風(fēng)管和出風(fēng)管，其特征在于:在所述箱體的側(cè)壁內(nèi)設(shè)有 與所述進(jìn)風(fēng)管相連通的進(jìn)風(fēng)通道，在所述箱體的側(cè)壁上設(shè)有與所述進(jìn)風(fēng)通道相連通的風(fēng) 孔，所述出風(fēng)管穿過(guò)所述箱體的頂壁連通箱體內(nèi)與箱體外部，在所述箱體的側(cè)壁內(nèi)還設(shè)有 調(diào)溫腔和滅菌腔，在所述調(diào)溫腔內(nèi)設(shè)有電加熱塊，所述進(jìn)風(fēng)通道穿過(guò)所述調(diào)節(jié)腔和滅菌腔 設(shè)置，在所述箱體的底壁內(nèi)設(shè)有旋轉(zhuǎn)腔，在所述旋轉(zhuǎn)腔內(nèi)設(shè)有旋轉(zhuǎn)電機(jī)，所述旋轉(zhuǎn)電機(jī)的主 軸與所述物料架相連接，在所述物料架內(nèi)設(shè)有震動(dòng)凹槽，在所述物料架的頂面設(shè)有盛放板， 在所述盛放板與所述震動(dòng)凹槽之間設(shè)有震動(dòng)裝置。
[0012] 所述活血止痛片，上述制備方法中干燥使用裝置所述震動(dòng)裝置包括驅(qū)動(dòng)電機(jī)，設(shè) 置在所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)主軸上的偏心輪，所述偏心輪的輪邊抵壓在所述盛放板的底面中心，在 所述盛放板的底部與所述震動(dòng)凹槽的底壁之間設(shè)有拉簧，所述拉簧以所述偏心輪為中心對(duì) 稱設(shè)置。
[0013] 所述活血止痛片，上述制備方法中干燥使用裝置所述箱體內(nèi)設(shè)有溫度傳感器，在 所述箱體的側(cè)壁內(nèi)設(shè)有與所述溫度傳感器相連接的驅(qū)動(dòng)器，所述驅(qū)動(dòng)器與所述電加熱塊的 控制端相連接，在所述箱體上還設(shè)有箱門(mén)。
[0014] 所述活血止痛片在制備抑制大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng) 用。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中，活血止痛片采用醇提的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量 過(guò)大，不方便服用，本發(fā)明制備的活血止痛片中阿魏酸得率增加，含量高。本發(fā)明中的濃縮 設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作便捷，在加熱濃縮時(shí)，可以通過(guò)驅(qū)動(dòng)電機(jī)驅(qū)動(dòng)環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊旋轉(zhuǎn)，從而使 刮筋在罐體的底面刮動(dòng)，從而可有效的防止罐體的底壁結(jié)塊，一定程度上可提高加熱濃縮 效率，解決了傳統(tǒng)技術(shù)中藥濃縮設(shè)備罐底容易結(jié)塊從而影響加熱效率的技術(shù)不足，使用穩(wěn) 定性好，藥物的有效成分穩(wěn)定不被破壞。本干燥設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單快捷，其采用箱體 側(cè)壁進(jìn)行送風(fēng)，并增設(shè)了電加熱塊，可以根據(jù)箱內(nèi)的溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而保證了干燥溫度的 穩(wěn)定性，而且設(shè)有旋轉(zhuǎn)電機(jī)和震動(dòng)裝置，可以在加熱的同時(shí)對(duì)盛放板進(jìn)行旋轉(zhuǎn)和震動(dòng)，從而 可防止藥局部干燥，從而一定程度上可以提高干燥的效率，解決了傳統(tǒng)技術(shù)的干燥裝置干 燥效率低的技術(shù)不足。并發(fā)現(xiàn)活血止痛片在制備抑制大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞增 殖藥物中的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中：
[0017] 圖1為本發(fā)明濃縮裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明干燥裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下通過(guò)實(shí)施例形式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此 理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均 屬于本發(fā)明的范圍。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 取當(dāng)歸22g、三七44g、醋乳香44g、冰片llg、土鱉蟲(chóng)lllg、煅自然銅67g，加藥材10倍 重量的水，浸泡〇 . 5h，煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再加入藥材8倍重量的水，煎煮1小時(shí)，藥液濾 出，合并兩次煎煮液，濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05,加乙醇使含醇量的體積百分比達(dá)75%， 攪拌，靜置，過(guò)濾，濾液濃縮至65 °C時(shí)相對(duì)密度為1.25，并回收乙醇，得濃縮液，使用微波萃 取，得萃取液，繼續(xù)濃縮，將濃縮液進(jìn)行干燥，制粒，壓片，即得活血止痛片。
[0022] 所述活血止痛片的制備方法，所述微波萃取方法為:將水提醇沉后的濃縮液投入 微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次8分鐘，每次加入的70%乙醇 的量為濃縮液重量的2倍，得萃取液，濃縮。
[0023]見(jiàn)圖1:所述活血止痛片的制備方法，上述三次濃縮裝置，包括罐體1，設(shè)置在所述 罐體1上的進(jìn)料口 2和設(shè)置在所述罐體1底部的出料管3，在所述罐體1內(nèi)設(shè)有攪拌軸4，在所 述攪拌軸4上設(shè)有攪拌槳5,在所述罐體1的頂部設(shè)有與所述攪拌軸4相連接的攪拌電機(jī)6,在 所述罐體1的內(nèi)壁上設(shè)有環(huán)形凹槽7,所述環(huán)形凹槽7的底端靠近所述罐體1的底壁，在所述 環(huán)形凹槽7內(nèi)設(shè)有環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊8,在所述罐體1的側(cè)壁內(nèi)設(shè)有驅(qū)動(dòng)電機(jī)9,在所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)9的 主軸上設(shè)有驅(qū)動(dòng)齒盤(pán)10,在所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊8的外環(huán)面上設(shè)有與所述驅(qū)動(dòng)齒盤(pán)10相齒合的 齒槽11，在所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊8的內(nèi)環(huán)面上均勻設(shè)有至少三條刮筋12,所述刮筋12的底壁抵壓 在所述罐體1的底壁上端面上，在所述罐體1上設(shè)有與所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)9相連接的調(diào)節(jié)器13,調(diào) 節(jié)器為市場(chǎng)上已使用結(jié)構(gòu)，只需要按照其連接要求連接使用即可。在使用時(shí)通過(guò)控制驅(qū)動(dòng) 電機(jī)，使驅(qū)動(dòng)電機(jī)帶動(dòng)環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊旋轉(zhuǎn)，從而使刮筋在環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊的帶動(dòng)下在罐體的底壁 頂面刮動(dòng)，從而可以槳聚積在罐體底壁頂面的藥渣刮松，從而可防止結(jié)塊。
[0024] 在所述環(huán)形凹槽7的頂壁與底壁均勻設(shè)有滾珠14,所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊8的上端面和下 端面抵壓在所述滾珠14上。設(shè)有滾珠，可以保證環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊的正常旋轉(zhuǎn)，減少環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊與 環(huán)形凹槽之間的摩擦，從而提高使用壽命和使用穩(wěn)定性。
[0025] 在所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊8與所述環(huán)形凹槽7的連接面上設(shè)有密封金屬條15,所述滾珠設(shè) 置在所述密封金屬條與環(huán)形凹槽的內(nèi)側(cè)端。
[0026] 在所述出料管上還設(shè)有冷卻器16,在所述罐體內(nèi)設(shè)有水份測(cè)定儀17。
[0027] 見(jiàn)圖2:所述活血止痛片的制備方法，上述干燥使用裝置，包括箱體1，設(shè)置在所述 箱體1內(nèi)的物料架2和設(shè)置在所述箱體1頂部的進(jìn)風(fēng)管3和出風(fēng)管4,在所述箱體1的側(cè)壁內(nèi)設(shè) 有與所述進(jìn)風(fēng)管3相連通的進(jìn)風(fēng)通道5,在所述箱體1的側(cè)壁上設(shè)有與所述進(jìn)風(fēng)通道5相連通 的風(fēng)孔6,進(jìn)風(fēng)孔設(shè)置在側(cè)壁上，可以保證通風(fēng)的均勻性，而且可以大大提高與藥物的接觸 面積，所述出風(fēng)管4穿過(guò)所述箱體1的頂壁連通箱體1內(nèi)與箱體1外部，在所述箱體1的側(cè)壁內(nèi) 還設(shè)有調(diào)溫腔7和滅菌腔8,在所述調(diào)溫腔7內(nèi)設(shè)有電加熱塊9,設(shè)有電加熱塊可以根據(jù)需要 對(duì)進(jìn)風(fēng)管的溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，保證干燥溫度的穩(wěn)定性，所述進(jìn)風(fēng)通道5穿過(guò)所述調(diào)節(jié)腔7和滅 菌腔8設(shè)置，在所述箱體1的底壁內(nèi)設(shè)有旋轉(zhuǎn)腔10,在所述旋轉(zhuǎn)腔10內(nèi)設(shè)有旋轉(zhuǎn)電機(jī)11，所述 旋轉(zhuǎn)電機(jī)11的主軸與所述物料架2相連接，在所述物料架2內(nèi)設(shè)有震動(dòng)凹槽12，在所述物料 架2的頂面設(shè)有盛放板13,在所述盛放板13與所述震動(dòng)凹槽12之間設(shè)有震動(dòng)裝置14。
[0028] 所述震動(dòng)裝置14包括驅(qū)動(dòng)電機(jī)141，設(shè)置在所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)141主軸上的偏心輪142， 所述偏心輪142的輪邊抵壓在所述盛放板13的底面中心，在所述盛放板13的底部與所述震 動(dòng)凹槽12的底壁之間設(shè)有拉簧15,所述拉簧以所述偏心輪為中心對(duì)稱設(shè)置，在使用時(shí)通過(guò) 偏心輪的抵壓使盛放板上升，當(dāng)偏心輪的凹部抵壓盛放板時(shí)，盛放板在拉簧的作用下復(fù)位， 在下落過(guò)程中使物材脫離盛放板之后再跌落在盛放板上實(shí)現(xiàn)物料的震動(dòng)。
[0029] 在所述箱體1內(nèi)設(shè)有溫度傳感器16,在所述箱體的側(cè)壁內(nèi)設(shè)有與所述溫度傳感器 相連接的驅(qū)動(dòng)器17,所述驅(qū)動(dòng)器與所述電加熱塊的控制端相連接。溫度傳干器和驅(qū)動(dòng)器為 市場(chǎng)上已有的現(xiàn)有技術(shù)，其在使用連接時(shí)只需要按照對(duì)應(yīng)的連接說(shuō)明連接即可。
[0030] 在所述箱體上還設(shè)有箱門(mén)18。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 取當(dāng)歸22g、三七44g、醋乳香44g、冰片llg、土鱉蟲(chóng)lllg、煅自然銅67g，加藥材10倍 重量的水，浸泡〇 . 5h，煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再加入藥材8倍重量的水，煎煮1小時(shí)，藥液濾 出，合并兩次煎煮液，濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05,加乙醇使含醇量的體積百分比達(dá)75%， 攪拌，靜置，過(guò)濾，濾液濃縮至65 °C時(shí)相對(duì)密度為1.25，并回收乙醇，得濃縮液，使用微波萃 取，得萃取液，繼續(xù)濃縮，將濃縮液進(jìn)行干燥，制粒，壓片，即得活血止痛片。
[0033]所述活血止痛片的制備方法，所述微波萃取方法為:將水提醇沉后的濃縮液投入 微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次4分鐘，每次加入的70%乙醇 的量為濃縮液重量的2倍，得萃取液，濃縮。
[0034]濃縮和干燥裝置同上。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 取當(dāng)歸22g、三七44g、醋乳香44g、冰片llg、土鱉蟲(chóng)lllg、煅自然銅67g，加藥材10倍 重量的水，浸泡〇 . 5h，煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再加入藥材8倍重量的水，煎煮1小時(shí)，藥液濾 出，合并兩次煎煮液，濃縮至60°C相對(duì)密度為1.05,加乙醇使含醇量的體積百分比達(dá)75%， 攪拌，靜置，過(guò)濾，濾液濃縮至65 °C時(shí)相對(duì)密度為1.25，并回收乙醇，得濃縮液，使用微波萃 取，得萃取液，繼續(xù)濃縮，將濃縮液進(jìn)行干燥，制粒，壓片，即得活血止痛片。
[0037]所述活血止痛片的制備方法，所述微波萃取方法為:將水提醇沉后的濃縮液投入 微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分鐘，每次加入的70%乙醇 的量為濃縮液重量的2倍，得萃取液，濃縮。
[0038]濃縮和干燥裝置同上。
[0039] 上述實(shí)施例中原料均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。
[0040] 實(shí)施例4:本發(fā)明活血止痛片中阿魏酸含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)研究資料
[0041] 1.1實(shí)驗(yàn)藥物:本發(fā)明活血止痛片:按實(shí)施例1-3方法制備。對(duì)照組采用普通濃縮方 法制備活血止痛片提取物。
[0042] 1.2儀器:高效液相色譜儀系統(tǒng)包括高效液相色譜儀(Waters 515) ;P200高壓栗； Waters2487紫外檢測(cè)器及GJ605型高壓六通進(jìn)樣閥；色譜柱為0DS-C18(鉆石)色譜柱(250mm X 4.6mm，5μπι);數(shù)據(jù)采集及處理采用HS色譜數(shù)據(jù)工作站V4.0+(杭州英譜科技）
[0043] 1.3測(cè)定條件：照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2000年版二部附錄VD)測(cè)定。采用 0DS-C18(鉆石）色譜柱（25〇111111\4.6111111，5以111)，流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸（20:80)，流速為 1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為322nm，進(jìn)樣量為10yL。
[0044] h 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0045] 各實(shí)施例制備的活血止痛片中阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果
[0046]
[0047] 根據(jù)上表的試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的活血止痛片中阿魏酸含量明 顯高于對(duì)照組。
[0048] 實(shí)施例5:本發(fā)明活血止痛片抑制大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研 究資料
[0049] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0050] 1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
[00511 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞，南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10%FBS常 規(guī)培養(yǎng)。
[0052] 1.2實(shí)驗(yàn)藥物
[0053] 研究藥物:本發(fā)明活血止痛片:按實(shí)施例1方法制備。
[0054] 藥液儲(chǔ)液：稱取100mg活血止痛片，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2μπι濾器過(guò)濾，500μ ldoff管分裝，-20°C存儲(chǔ)，同時(shí)0.2μπι濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0055] 1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0056] DMEM(GIBC0 公司Cat.No. 12100-061 Lot.No.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科 技有限公司Lot. No. 100419) ;NaH⑶3 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot ·Νο · 1088387); Trypsin(AMRESC0公司批號(hào)：2010/04) ;EDTA(AMRESC0公司批號(hào)：2009/ 10) ;Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0 公司批號(hào)：2010242) ;Streptomycin Sulfate (AMRES⑶公司批號(hào)：2010382);無(wú)水乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司批號(hào)：080310182) ;MTT (Biosharp批號(hào)：0793) ;PBS(實(shí)驗(yàn)室自配）；
[0057] 1.4實(shí)驗(yàn)器材
[0058]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DM1L);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司 型號(hào):SPECTRA MAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型 號(hào)：SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào)：S/N 020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司 型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱 (西門(mén)子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠 型號(hào)：KA-1000);0 · 2μπι濾器(MILLIP0RE型號(hào)：SLGP033RB); 10cm培養(yǎng)皿（NEST公司）、96孔培 養(yǎng)板(NEST公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板;離心管、移液管、Tips若干。
[0059] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0060] 1)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培 養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿），當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25 %胰蛋白酶-0.04 %EDTA，37 °C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打 細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，lOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3 X 104個(gè)/ml。
[0061 ] 2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180μ1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中 (37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0062] 3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50 % -70 %，加入活血止痛片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0063] 4)24h 后加入 20μ1 MTT 溶液（5mg/ml，即0·5%ΜΤΤ)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0064] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200μ1二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0065] 6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0066] 7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示：
[0067] 細(xì)胞增值抑制率（％ )=(對(duì)照孔0D值-給藥孔0D值)/對(duì)照孔0D值X 100%。實(shí)驗(yàn)重 復(fù)3次。
[0068] 3統(tǒng)計(jì)處理
[0069] 米用Microsoft Excel 2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean土 S.D.表示。
[0070] 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0071] MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)大鼠腎上腺 嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞增殖抑制有差異(P〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈 〇. 01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0072] 活血止痛片對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞增殖抑制影響研究(?土SD)
[0073]
[0074] 注：與對(duì)照組比較，*P〈0 · 01;林P〈0 · 001
[0075] 5實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0076] 活血止痛片可以抑制大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞增殖，減少大鼠腎上腺嗜 鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)目，該作用呈劑量依賴性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種活血止痛片，其特征在于制備方法為：取當(dāng)歸22g、三七44g、醋乳香44g、冰片 11 g、土鱉蟲(chóng)111 g、煅自然銅67g，加藥材10倍重量的水，浸泡0.5h，煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再 加入藥材8倍重量的水，煎煮1小時(shí)，藥液濾出，合并兩次煎煮液，濃縮至60°C相對(duì)密度為 1.05，加乙醇使含醇量的體積百分比達(dá)75%，攪拌，靜置，過(guò)濾，濾液濃縮至65°C時(shí)相對(duì)密度 為1.25，并回收乙醇，得濃縮液，使用微波萃取，得萃取液，繼續(xù)濃縮，將濃縮液進(jìn)行干燥，制 粒，壓片，即得活血止痛片。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述活血止痛片，其特征在于上述制備方法中所述微波萃取方法為： 將水提醇沉后的濃縮液投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次， 每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為濃縮液重量的2倍，得萃取液，濃縮，優(yōu)選條件為： 微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述活血止痛片，其特征在于上述制備方法中三次濃縮使用裝置，包 括罐體，設(shè)置在所述罐體上的進(jìn)料口和設(shè)置在所述罐體底部的出料管，在所述罐體內(nèi)設(shè)有 攪拌軸，在所述攪拌軸上設(shè)有攪拌槳，在所述罐體的頂部設(shè)有與所述攪拌軸相連接的攪拌 電機(jī)，在所述罐體的內(nèi)壁上設(shè)有環(huán)形凹槽，所述環(huán)形凹槽的底端靠近所述罐體的底壁，在所 述環(huán)形凹槽內(nèi)設(shè)有環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊，在所述罐體的側(cè)壁內(nèi)設(shè)有驅(qū)動(dòng)電機(jī)，在所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)的主 軸上設(shè)有驅(qū)動(dòng)齒盤(pán)，在所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊的外環(huán)面上設(shè)有與所述驅(qū)動(dòng)齒盤(pán)相齒合的齒槽，在 所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊的內(nèi)環(huán)面上均勻設(shè)有至少三條刮筋，所述刮筋的底壁抵壓在所述罐體的底 壁上端面上，在所述罐體上設(shè)有與所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)相連接的調(diào)節(jié)器。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述活血止痛片，其特征在于上述制備方法中濃縮裝置所述環(huán)形凹 槽的頂壁與底壁均勻設(shè)有滾珠，所述環(huán)形旋轉(zhuǎn)塊的上端面和下端面抵壓在所述滾珠上。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述活血止痛片，其特征在于上述制備方法中濃縮裝置所述環(huán)形旋 轉(zhuǎn)塊與所述環(huán)形凹槽的連接面上設(shè)有密封金屬條，所述滾珠設(shè)置在所述密封金屬條與環(huán)形 凹槽的內(nèi)側(cè)端。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述活血止痛片，其特征在于上述制備方法中濃縮裝置所述出料管 上還設(shè)有冷卻器，在所述罐體內(nèi)設(shè)有水份測(cè)定儀。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述活血止痛片，其特征在于上述制備方法中干燥使用裝置，包括箱 體，設(shè)置在所述箱體內(nèi)的物料架和設(shè)置在所述箱體頂部的進(jìn)風(fēng)管和出風(fēng)管，其特征在于:在 所述箱體的側(cè)壁內(nèi)設(shè)有與所述進(jìn)風(fēng)管相連通的進(jìn)風(fēng)通道，在所述箱體的側(cè)壁上設(shè)有與所述 進(jìn)風(fēng)通道相連通的風(fēng)孔，所述出風(fēng)管穿過(guò)所述箱體的頂壁連通箱體內(nèi)與箱體外部，在所述 箱體的側(cè)壁內(nèi)還設(shè)有調(diào)溫腔和滅菌腔，在所述調(diào)溫腔內(nèi)設(shè)有電加熱塊，所述進(jìn)風(fēng)通道穿過(guò) 所述調(diào)節(jié)腔和滅菌腔設(shè)置，在所述箱體的底壁內(nèi)設(shè)有旋轉(zhuǎn)腔，在所述旋轉(zhuǎn)腔內(nèi)設(shè)有旋轉(zhuǎn)電 機(jī)，所述旋轉(zhuǎn)電機(jī)的主軸與所述物料架相連接，在所述物料架內(nèi)設(shè)有震動(dòng)凹槽，在所述物料 架的頂面設(shè)有盛放板，在所述盛放板與所述震動(dòng)凹槽之間設(shè)有震動(dòng)裝置。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述活血止痛片，其特征在于上述制備方法中干燥使用裝置所述震 動(dòng)裝置包括驅(qū)動(dòng)電機(jī)，設(shè)置在所述驅(qū)動(dòng)電機(jī)主軸上的偏心輪，所述偏心輪的輪邊抵壓在所 述盛放板的底面中心，在所述盛放板的底部與所述震動(dòng)凹槽的底壁之間設(shè)有拉簧，所述拉 簧以所述偏心輪為中心對(duì)稱設(shè)置。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述活血止痛片，其特征在于上述制備方法中干燥使用裝置所述箱 體內(nèi)設(shè)有溫度傳感器，在所述箱體的側(cè)壁內(nèi)設(shè)有與所述溫度傳感器相連接的驅(qū)動(dòng)器，所述 驅(qū)動(dòng)器與所述電加熱塊的控制端相連接，在所述箱體上還設(shè)有箱門(mén)。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述活血止痛片在制備抑制大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞增殖 藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K35/64GK106038657SQ201610543777
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】李洋
【申請(qǐng)人】南京多寶生物科技有限公司