灰葉酸抑制真核細(xì)胞線粒體atp生成的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種灰葉酸抑制真核細(xì)胞線粒體ATP生成的應(yīng)用；灰葉酸作為真核細(xì)胞線粒體膜電位抑制劑的應(yīng)用；灰葉酸作為線粒體氧化磷酸化抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明提出了灰葉酸的新用途，這些用途基于其新的功能發(fā)現(xiàn)和證實?；胰~酸可劑量依賴性和時間依賴性地降低多種細(xì)胞的線粒體膜電位，細(xì)胞的ATP水平也隨之下降，細(xì)胞的活性顯著降低并最終死亡。
【專利說明】
灰葉酸抑制真核細(xì)胞線粒體ATP生成的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于灰葉酸應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種灰葉酸抑制真核細(xì)胞線粒體ATP 生成的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]線粒體是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)能量生成的細(xì)胞器，對于細(xì)胞的功能狀態(tài)至關(guān)重要。線粒體通過氧化磷酸化的方式把來源于葡萄糖和脂肪酸等產(chǎn)生的乙酰輔酶A通過三羧酸循環(huán)生成 C02,同時把氫離子通過遞氫體沿呼吸鏈傳遞，在此過程中建立線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的氫離子濃度差，并將此勢能差用于ATP生成。氫離子最后氧化生成水。線粒體膜電位是維持ATP生成的能量來源，膜電位消失將導(dǎo)致ATP生成減少，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞因能量缺乏而死亡。
[0003]灰葉酸(grifolic acid)屬于酸類化合物，被作為游離脂肪酸受體激動劑或者詰抗劑而使用，通過檢索國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)，尚未有文獻(xiàn)報道灰葉酸的其它生物學(xué)效應(yīng)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種灰葉酸抑制真核細(xì)胞線粒體ATP生成的應(yīng)用，為抑制癌細(xì)胞的增殖提供了新的思路。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，灰葉酸抑制真核細(xì)胞線粒體ATP生成的應(yīng)用。
[0006]灰葉酸作為真核細(xì)胞線粒體膜電位抑制劑的應(yīng)用。
[0007]灰葉酸作為線粒體氧化磷酸化抑制劑的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明提出了灰葉酸的新用途，這些用途基于其新的功能發(fā)現(xiàn)和證實。灰葉酸可劑量依賴性和時間依賴性地降低多種細(xì)胞的線粒體膜電位，細(xì)胞的 ATP水平也隨之下降，細(xì)胞的活性顯著降低并最終死亡。【附圖說明】
[0009]圖1:灰葉酸降低真核細(xì)胞的線粒體膜電位:共聚焦顯微鏡拍攝人L2肝細(xì)胞的JC-1 熒光強(qiáng)度的變化過程，分別為加藥前(A)和20mi〇1/L灰葉酸處理5分鐘(B)、10分鐘(C)、20分鐘(D)之后熒光強(qiáng)度變化;共聚焦顯微鏡拍攝小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞的JC-1熒光強(qiáng)度的變化過程，分別為加藥前(E)和20wnol/L灰葉酸處理5分鐘(F)、20分鐘(G)、30分鐘(H);A-H圖中的1號為585nm激光下熒光強(qiáng)度，2號為514nm激光下熒光強(qiáng)度；
[0010]圖2:灰葉酸降低真核細(xì)胞的線粒體膜電位的統(tǒng)計結(jié)果;不同細(xì)胞在不同濃度灰葉酸處理5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘和60分鐘之后，細(xì)胞內(nèi)JC-1紅色熒光與綠色焚光比值相對于加藥前的變化比例;A:人L2肝細(xì)胞;B:人胚腎HEK293細(xì)胞;C:人MCF-1乳腺癌細(xì)胞;D:大鼠GH3垂體細(xì)胞;E:大鼠腎NRK細(xì)胞;F:小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)目n = 100;[〇〇11]圖3:灰葉酸減少真核細(xì)胞的細(xì)胞ATP水平;20wi1l/L灰葉酸處理0.5小時后各種細(xì)胞的胞內(nèi)ATP水平顯著下降，并隨時間延長至2小時后降低幅度顯著增加(圖A);10mi〇1/L灰葉酸處理2小時和6小時后各種細(xì)胞的胞內(nèi)ATP水平時間依賴性出現(xiàn)下降(圖B)，每組細(xì)胞數(shù) n = 12；[〇〇12]圖4:灰葉酸誘導(dǎo)真核細(xì)胞死亡;不同細(xì)胞在不同濃度灰葉酸處理2小時、6小時、12 小時和24小時之后，經(jīng)MTT檢測發(fā)生死亡的情況。A:人L2肝細(xì)胞;B:人胚腎HEK293細(xì)胞;C:人 MCF-1乳腺癌細(xì)胞;D:大鼠GH3垂體細(xì)胞;E:大鼠腎NRK細(xì)胞;F:小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞;灰葉酸劑量依賴性和時間依賴性促進(jìn)上述各種細(xì)胞的死亡，每組細(xì)胞數(shù)n = 16?！揪唧w實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0014]一、細(xì)胞培養(yǎng):人、大鼠和小鼠來源的多種細(xì)胞用于灰葉酸作用的檢測。人L2肝細(xì)胞、人MCF-1乳腺癌細(xì)胞、人胚腎HEK293細(xì)胞、大鼠GH3垂體細(xì)胞、大鼠腎NRK細(xì)胞、小鼠 Raw264.7巨噬細(xì)胞等用于檢測。上述所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中， 在37 °C的5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長至80 %后傳代。傳代用 0.25 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA消化后按照1: 3?5比例傳代。培養(yǎng)液和血清以及消化酶均為 Gibco公司產(chǎn)品。[〇〇15]二、細(xì)胞線粒體膜電位檢測:將上述所有細(xì)胞種植于0.01 %多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，第二天換至無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中加入JC-1 (終濃度5yg/ml)進(jìn)行負(fù)載20分鐘，隨后清洗去培養(yǎng)液中JC-1。細(xì)胞放置于共聚焦顯微鏡上，連續(xù)定時觀察JC-1的熒光強(qiáng)度變化。 JC-1熒光探針在線粒體膜電位較高時，可聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光;JC-1在線粒體膜電位較低時，不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時成為單體，產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可通過紅綠熒光的相對比例來衡量檢測線粒體膜電位的變化。JC-1熒光強(qiáng)度記錄圖如圖1所示，由圖1可見JC-1熒光強(qiáng)度隨灰葉酸處理時間延長而在585nm出現(xiàn)下降，在 514nm出現(xiàn)增強(qiáng)，說明JC-1從線粒體漏出到細(xì)胞漿內(nèi)，說明細(xì)胞的線粒體膜電位下降。
[0016]對每個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量后進(jìn)行比值分析，采用方差分析對各組間熒光比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果如圖2所示。例如，在人L2肝細(xì)胞，灰葉酸在20wn〇l/L的濃度處理5 分鐘后，細(xì)胞即可出現(xiàn)顯著的JC-1紅色熒光強(qiáng)度減弱，綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說明線粒體膜電位開始減小。20wi1l/L灰葉酸處理30分鐘后，JC-1紅綠熒光比值降至最低。lOwnol/L灰葉酸在處理5分鐘后起效，并隨時間延長而效果更加明顯，其消除線粒體膜電位的作用較20y mol/L灰葉酸為弱。5ymol/L灰葉酸在10分鐘后起效，其削弱線粒體膜電位的作用較lOymol/ L灰葉酸為弱。2.5m1 1 /L灰葉酸的作用則進(jìn)一步減弱，1.2 5m〇 1 /L灰葉酸在1小時之內(nèi)未見對線粒體膜電位有顯著的影響。雖然灰葉酸在不同細(xì)胞的作用效果有所不同，但是在2.5y mol/L及以上的濃度下，灰葉酸在所測試的細(xì)胞均有降低線粒體膜電位的作用，且作用具有時間依賴性和劑量依賴性。
[0017]三、細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測:上述所培養(yǎng)的各種細(xì)胞種植于24孔培養(yǎng)板中，待生長至 90 %之后，更換至無血清培養(yǎng)液，分別加入不同濃度灰葉酸，在作用0.5小時、2小時、6小時后去除上清液，加入細(xì)胞裂解液。冰冷狀態(tài)下裂解收取細(xì)胞液，用于ATP水平測定。[〇〇18] ATP水平采用化學(xué)發(fā)光法測定，具體步驟如下:在化學(xué)發(fā)光板中每孔加入lOOiil的 ATP檢測工作液，室溫放置5分鐘，隨后用排槍迅速分別在每孔加入檢測樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品20y1，放置20秒后，放置于化學(xué)發(fā)光儀上測定發(fā)光亮度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各個樣本的ATP水平，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。[〇〇19] 具體結(jié)果如圖3所示。20wi1l/L灰葉酸作用0.5小時后，在人L2肝細(xì)胞即可見到顯著的ATP水平下降，2小時后更為明顯。1 Owno 1 /L灰葉酸的作用較20m1 1 /L灰葉酸為弱，在2 小時也可引起顯著ATP水平下降，在6小時后作用更為明顯。
[0020]四、細(xì)胞活性檢測:上述所培養(yǎng)的各種細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板中，待生長至90%之后，更換至無血清培養(yǎng)液，分別加入不同濃度灰葉酸，孵育2小時、6小時、12小時、24小時。隨后加入MTT(終濃度0.5mg/ml) JTT可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍(lán)紫色的針狀結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，結(jié)晶物能被DMS0 溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在560nm波長處測定其光吸收值，可反映細(xì)胞數(shù)量。在MTT孵育4小時后，完全去除上清液，每孔加入l〇〇yl的DMS0,應(yīng)用酶標(biāo)儀在560nm處讀取吸光度(0D值)。 采用方差分析對各組的0D值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。具體結(jié)果如圖4所示。灰葉酸自2.5wn〇l/L至 20wii〇l/L以劑量依賴性和時間依賴性方式顯著降低所有檢測的細(xì)胞的活性。
【主權(quán)項】
1.灰葉酸抑制真核細(xì)胞線粒體ATP生成的應(yīng)用。2.灰葉酸作為真核細(xì)胞線粒體膜電位抑制劑的應(yīng)用。3.灰葉酸作為線粒體氧化磷酸化抑制劑的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P43/00GK106074475SQ201610364908
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】趙玉峰, 王莉, 蘇興利, 徐曦, 劉珂, 陳鏑, 劉英光, 謝榮, 梁向燕
【申請人】西安醫(yī)學(xué)院