二氫葉酸合成酶及其衍生物的應(yīng)用，以及制備和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種二氫葉酸合成酶在檢測磺胺類藥物殘留中的應(yīng)用，以及提供利用二氫葉酸合成酶建立磺胺類藥物的快速檢測方法。一種可檢測磺胺類藥物殘留的二氫葉酸合成酶，其為SEQIDNO.1序列中所示的氨基酸序列。與傳統(tǒng)的檢測方法相比較，本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明所公開和應(yīng)用的二氫葉酸合成酶，來源廣泛，只要是含有二氫葉酸合成酶核心序列的蛋白片段均可以應(yīng)用，可以通過基因工程的方法迅速、穩(wěn)定獲得。（2)利用本發(fā)明的所公開的二氫葉酸合成酶的新應(yīng)用，可以建立檢測含有對位氨基苯磺酰胺母核結(jié)構(gòu)的所有磺胺類藥物的快速檢測方法。
【專利說明】二氫葉酸合成酶及其衍生物的應(yīng)用，以及制備和檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及了一種二氫葉酸合成酶在藥物殘留檢測中的新應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 二氫葉酸合成酶（DHPS)是細菌合成二氫葉酸的必須催化酶，在細菌生長和繁殖 中具有重要作用。通常細菌生長需要利用環(huán)境中的對氨苯甲酸（PABA)和二氫喋啶、谷氨酸 在菌體內(nèi)的二氫葉酸合成酶催化下合成二氫葉酸。如果環(huán)境中存在與PABA結(jié)構(gòu)類似物時， 必然會對二氫葉酸合成產(chǎn)生抑制。
[0003] 磺胺類藥物（Sulfonamides)是一大類人工合成的抗菌藥，用于臨床已近50年，它 具有抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定、使用簡便、生產(chǎn)時不耗用糧食等優(yōu)點。該類藥物擁有的共同結(jié) 構(gòu)為對氨基苯磺酰胺（結(jié)構(gòu)式見圖1)，具有與對氨苯甲酸（PABA)類似的結(jié)構(gòu)，可以與PABA 競爭二氫葉酸合成酶，影響了二氫葉酸的合成，因而使細菌生長和繁殖受到抑制。
[0004] 近些年來，由于用藥劑量和類型變化，細菌與藥物反復(fù)接觸后，對藥物的敏感性下 降甚至消失。細菌對磺胺類藥物更易產(chǎn)生抗藥性，尤其在用量或療程不足時更易出現(xiàn)。產(chǎn)生 抗藥性的原因，可能是細菌改變代謝途徑，如產(chǎn)生較多二氫葉酸合成酶，或能直接利用環(huán)境 中的葉酸。由于磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)特性，細菌對各類磺胺藥物之間有交叉抗藥性，即細菌對 某一磺胺藥產(chǎn)生耐藥后，對另一種磺胺藥也無效，但與其它抗菌藥或者臨床藥物間無交叉 抗藥現(xiàn)象。由此可見二氫葉酸合成酶與磺胺類藥物之間的結(jié)合反應(yīng)屬于特異性專屬反應(yīng)。 利用這種特異性專屬反應(yīng)對開發(fā)各種基于DHPS的磺胺類藥物檢測方法非常有益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種二氫葉酸合成酶在檢測磺胺類藥物殘留中的應(yīng)用，以 及提供利用二氫葉酸合成酶建立磺胺類藥物的快速檢測方法。
[0006] 本發(fā)明所述的二氫葉酸合成酶，來源廣泛，存在于諸如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 等各類微生物中，是微生物生長代謝必不可少的關(guān)鍵合成酶。其氨基酸序列如SEQ. ID. No. 1 所示，可以通過如SEQ. ID. No. 2所示的基因克隆表達。
[0007] 本發(fā)明中所公開的二氫葉酸合成酶，還包括含有二氫葉酸合成酶或同源性達95% 以上的酶，或者經(jīng)過生物標記后的用于示蹤的活性蛋白質(zhì)，如利用辣根過氧化物酶（HRP)、 堿性磷酸酶（AP)、納米金顆粒（Colloid gold)或者熒光素（FITC)等標記的二氫葉酸合成 酶蛋白。
[0008] 利用本發(fā)明中所公開的二氫葉酸合成酶及其衍生物，可以建立磺胺類藥物的快速 檢測試劑盒，檢測方法可以是酶聯(lián)免疫檢測法、免疫膠體金檢測法、免疫熒光檢測法、化學(xué) 發(fā)光檢測法、電化學(xué)檢測法、生物傳感器法等，檢測的樣本可以是食品（包括牛奶、蜂蜜、動 物組織等）、土壤和水樣等。
[0009] 其具體發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0010] 一種可檢測磺胺類藥物殘留的二氫葉酸合成酶，其為SEQ ID NO. 1序列中所示的 氨基酸序列。
[0011] 進一步，所述的二氫葉酸合成酶是與二氫葉酸合成酶及其同源酶同源性大于80% 的蛋白片段。
[0012] 進一步，上述二氫葉酸合成酶其可用于磺胺類藥物殘留。
[0013] 進一步，二氫葉酸合成酶的衍生物，該衍生物為以下a?d中的任意一種：
[0014] a)將所述二氫葉酸合成酶經(jīng)過辣根過氧化物酶（HRP)生物標記后的用于示蹤的 活性蛋白質(zhì)；
[0015] b)將所述二氫葉酸合成酶經(jīng)過堿性磷酸酶（AP)生物標記后的用于示蹤的活性蛋 白質(zhì)；
[0016] c)將所述二氫葉酸合成酶經(jīng)過膠體金標記后的用于示蹤的活性蛋白質(zhì)；
[0017] d)將所述二氫葉酸合成酶經(jīng)過熒光素（FITC)生物標記后的用于示蹤的活性蛋白 質(zhì)；
[0018] 進一步，二氫葉酸合成酶的衍生物，其可用于磺胺類藥物殘留。
[0019] 進一步，二氫葉酸合成酶或其衍生物，其所述磺胺類藥物為含有對位氨基苯磺酰 胺母核結(jié)構(gòu)的化合物。
[0020] 同時，本發(fā)明還包括如下方法：
[0021] 一種的二氫葉酸合成酶的克隆、表達及純化方法，具體步驟如下：
[0022] 1)根據(jù)Genebank公開的編號為EDV67101對應(yīng)基因序列設(shè)計引物，上游引物 Pl(5' CGCGGATCC ATGAAACTCTTTGC3'）和下游引物 P2(5' AACTGCAGTTACTCATAGCGTTTG3'） 分別含有BamHl和PstI酶切位點；從大腸菌病病雞分離的大腸桿菌中分離得到大腸桿菌 Fll培養(yǎng)后挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至0D600nm在0. 4左右，取菌液50 μ 1高速 離心，其轉(zhuǎn)速為l〇〇〇〇r/min，離心時間為lmin，棄去上清，加入100 μ I PBS懸浮，然后再次 離心并懸浮，重復(fù)3次后加入100 μ 1雙蒸水，并離心再次以雙蒸水懸浮，而后進行PCR擴增 目標基因，SDS電泳檢測產(chǎn)物；
[0023] 2)用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用BamHI和PstI雙酶切PCR產(chǎn)物和載體DNA， 雙酶切后產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，并用Τ4連接酶16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至活化 的感受態(tài)細胞E Coli DH5a中并均勻涂在Amp抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時后菌落 PCR鑒定；將初步鑒定的菌落提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，陽性結(jié)果進行測序，并與報道的序列進 行比對；確認后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達菌株BL21 (DE3)中，以IPTG進行誘導(dǎo)表達，電泳檢測 表達結(jié)果；大量表達后以鎳柱純化，純化蛋白除鹽后凍存。
[0024] 還包括一種二氫葉酸合成酶的制備，所述的標記方法為戊二醛法，具體步驟如 下：
[0025] 1)稱取5mg HRP(sigma，P8375)溶解于0. 5ml蒸饋水中，并向其中加入0. 5ml新 配的0. IM NaKM溶液，混勻，4°C靜置30分鐘使HRP充分活化；
[0026] 2)加入0. 16M乙二醇水溶液0. 5ml，混勻，靜置30分鐘；
[0027] 3)將二氫葉酸合成酶用生理鹽水溶解成2. 5mg/ml的溶液，取Iml逐滴加入前述 HRP溶液中；
[0028] 4)充分混勻，置于pH9. 5碳酸鹽緩沖液透析4°C透析過夜；
[0029] 5)加0. 2M賴氨酸0. 25ml，混勻后，置室溫2小時，然后以飽和硫酸銨沉淀蛋白后 取沉淀物溶于〇. IM PBS中；
[0030] 6)將溶解有標記物的PBS溶液裝入透析袋，繼續(xù)透析3h除去銨離子，然后高速離 心，其離心轉(zhuǎn)速大于SOOOrpm，除去沉淀，上清液即為HRP標記號的二氫葉酸合成酶；分裝后 保存于_80°C備用；
[0031] 還包括一種HRP標記二氫葉酸合成酶檢測水體中的磺胺類藥物的方法，具體步驟 如下：
[0032] 1)將對氨基苯磺酰胺通過重氮化法與卵清蛋白OVA偶聯(lián)得到包被原SAS-OVAJf 其用以pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至1 μ g/mL濃度作為包被液，以100 μ 1每孔包被酶標板， 4°C孵育過夜；完畢后甩出液體，以PBS-T洗板，拍干加入封閉液，所述封閉液為1 %脫脂奶 粉100 μ 1，37°C孵育2小時，甩出液體后拍干備用；
[0033] 2)磺胺標準品配置濃度為 0 μ g/L，1 μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L，27 μ g/L 和 81 μ g/L ;
[0034] 測定時按照以下步驟進行：
[0035] (1)加標準品：將磺胺標準品以50 μ 1每孔加入到包被好的酶標板中，將將HRP標 記的重組二氫葉酸合成酶蛋白以ΡΗ7. 2的0. IM PBS稀釋至1 μ g/mL，以50 μ 1每孔加入到 包被好的酶標板中，輕輕振蕩混勻后置37°C孵育60分鐘；
[0036] (2)完畢后取出酶標板，倒出其中液體，以吸水紙拍干后，加入顯色底物液 100 μ L/孔，再置于37°C孵育15分鐘；
[0037] (3)取出后用酶標儀于450nm處讀取吸光度值，以雙對數(shù)曲線繪制標準曲線。
[0038] 還包括一種利用膠體金標記二氫葉酸合成酶檢測牛奶中的磺胺類藥物的方法，具 體步驟如下：
[0039] 1)膠體金標記二氫葉酸合成酶
[0040] 采用朽1檬酸還原法制備得到20_40nm范圍的納米金顆粒溶液，調(diào)節(jié)pH值至8. 0 備用；取一定量的納米金顆粒溶液，置于磁力攪拌器上，然后將純化后的二氫葉酸合成酶以 PBS按照1:2000的比例稀釋后加入納米金溶液中攪拌反應(yīng)20-30分鐘，然后將PEG10000溶 液加入混合反應(yīng)液中，使PEG的最終濃度約為1 %，置于冷凍離心機，其溫度為4°C，在速度 為1500?2500rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘后棄去上清液；將下層沉淀用PBS反復(fù)洗滌并繼 續(xù)離心棄去多余上清液；最后將沉淀物以PBS緩沖液重新懸浮，使最終的DHPS蛋白濃度約 為SOyg/ml左右，保存于4°C備用；
[0041] 2)膠體金試紙條的組裝
[0042] (1)粘貼：將樣品墊、纖維素膜、吸水墊和保護膜按一定順序逐一貼在支持背板 上；樣品墊與纖維素膜相接，纖維素膜與吸水墊相接，同時在樣品墊和吸水墊上分別貼有保 護膜，其中樣品墊的保護膜印有"MAX"標記，方便檢測使用；纖維素膜上分別標記了控制線 (C線）和檢測線（T線）；C線標記的是二氫葉酸合成酶特異性單克隆抗體，而T線標記的 是牛血清白蛋白標記的磺胺類藥物；
[0043] (2)切條：將粘貼好的試紙條大板用切條機進行切割，每個試紙條的寬度為 0. 8cm，偏差范圍為0. 78?0. 82cm，切割好的試紙條儲藏在室溫下備用；
[0044] (3)微孔試劑的組裝：將納米金顆粒標記的二氫葉酸合成酶用全自動化加樣裝置 定量加到塑料微孔后，置于凍干機冷凍干燥；冷凍干燥的微孔試劑用塑料微孔蓋蓋好，儲藏 于4-8°C備用；
[0045] (4)試紙條和微孔試劑的組裝：將制備好的試紙條和微孔試劑按照1:1的比例密 封于包裝袋或者包裝瓶中，密封好后存放于4-8°C備用；
[0046] 3)利用膠體金標記法檢測牛奶樣本
[0047] (1)將待測的牛奶樣本和從冷藏環(huán)境中拿出來的試紙條放置在室溫下至少 30min ；
[0048] (2)加樣：將準備好的樣品用一次性塑料吸管或者微量移液器吸取200 μ 1，加入 到已經(jīng)去掉蓋的微孔試劑中；所述的一個微孔試劑對應(yīng)一個試紙條，只能檢測一個樣品，不 能重復(fù)使用；
[0049] (3)混合：用微量移液器或者一次性塑料吸管上下吸打微孔試劑中的液體使之充 分混勻；混勻后的微孔應(yīng)呈現(xiàn)粉紅色或者淺粉色等；
[0050] (4)插條：取出試紙條并將其的帶有"MAX"標記的一端插入微孔中；
[0051] (5)計時：插條后開始計時3分鐘，觀察C線是否出現(xiàn)，如果3min內(nèi)C線已經(jīng)出現(xiàn)， 即可判讀結(jié)果；如果C線沒有出現(xiàn)，請延長2分鐘使液體爬升至C線出現(xiàn)后判讀結(jié)果；
[0052] (6)進行結(jié)果判定：陰性：C線顯色，T線也顯色；陽性：C線顯色，T線不顯色；無 效：C線不顯示。
[0053] 與傳統(tǒng)的檢測方法相比較，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0054] (1)本發(fā)明所公開和應(yīng)用的二氫葉酸合成酶，來源廣泛，只要是含有二氫葉酸合成 酶核心序列的蛋白片段均可以應(yīng)用，可以通過基因工程的方法迅速、穩(wěn)定獲得。
[0055] (2)利用本發(fā)明的所公開的二氫葉酸合成酶的新應(yīng)用，可以建立檢測含有對位氨 基苯磺酰胺母核結(jié)構(gòu)的所有磺胺類藥物的快速檢測方法。
[0056] (3)所述的檢測方法不局限于某一種類，只要是利用蛋白質(zhì)和小分子特異性結(jié)合 作用的方法均可以建立。
[0057] (4)所述的檢測方法檢測樣本不受限制，只要能提取凈化目標藥物，均可以進行檢 測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0058] 圖1為磺胺類藥物的共同結(jié)構(gòu)對氨基苯磺酰胺，其中R為取代基團，不同磺胺類藥 物，R基因不同；
[0059] 圖2為對氨苯甲酸的結(jié)構(gòu)，其與圖1中的對氨基苯磺酰胺具有類似結(jié)構(gòu)；
[0060] 圖3為HRP標記的二氫葉酸合成酶檢測磺胺類藥物含量的標準曲線示意圖，其中 X軸為濃度對數(shù)，Y軸為Logit值。
[0061] 圖4 :膠體金標記的二氫葉酸合成酶檢測牛奶中的磺胺類藥物結(jié)果判定示意圖。

【具體實施方式】
[0062] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0063] 實施例1 :二氫葉酸合成酶的克隆、表達及純化
[0064] 根據(jù)Genebank公開的編號為EDV67101對應(yīng)基因序列設(shè)計引物，上游引物 Pl(5' CGCGGATCC ATGAAACTCTTTGC3'）和下游引物 P2(5' AACTGCAGTTACTCATAGCGTTTG3'） 分別含有BamHl和PstI酶切位點。從大腸菌病病雞分離的大腸桿菌中分離得到大腸桿菌 Fll培養(yǎng)后挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至0D600nm在0. 4左右，取菌液50 μ 1高速 離心（轉(zhuǎn)速l〇〇〇〇r/min，Imin)，棄去上清，加入100 μ I PBS懸浮，然后再次離心并懸浮，重 復(fù)3次后加入100 μ 1雙蒸水，并離心再次以雙蒸水懸浮，而后進行PCR擴增目標基因，SDS 電泳檢測產(chǎn)物。
[0065] 用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用BamHI和PstI雙酶切PCR產(chǎn)物和載體DNA， 用DNA回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，并用Τ4連接酶16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至活化 的感受態(tài)細胞E Coli DH5a中并均勻涂在Amp抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時后菌落 PCR鑒定。將初步鑒定的菌落提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，陽性結(jié)果進行測序，并與報道的序列進 行比對。確認后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達菌株BL21(DE3)中，以IPTG進行誘導(dǎo)表達，電泳檢 測表達結(jié)果。大量表達后以鎳柱純化，純化蛋白除鹽后凍存。
[0066] 2) HRP標記二氫葉酸合成酶的制備
[0067] 將純化好的二氫葉酸合成酶用辣根過氧化物酶（HRP)標記。標記方法采用戊二醛 法，具體如下：
[0068] (1)稱取5mgHRP(sigma，P8375)溶解于0· 5ml蒸饋水中，并向其中加入0· 5ml新 配的0. IM NaKM溶液，混勻，4°C靜置30分鐘使HRP充分活化；
[0069] (2)加入0· 16M乙二醇水溶液0· 5ml，混勻，靜置30分鐘；
[0070] (3)將二氫葉酸合成酶用生理鹽水溶解成2. 5mg/ml的溶液（此濃度可以適當調(diào)整 以獲得較高的標記率），取Iml逐滴加入前述HRP溶液中；
[0071] (4)充分混勻，置于ρΗ9· 5碳酸鹽緩沖液透析4°C透析過夜；
[0072] (5)加0· 2M賴氣酸0· 25ml，混勾后，直室溫2小時，然后以飽和硫酸按沉淀蛋白后 取沉淀物溶于〇. IM PBS中；
[0073] (6)將溶解有標記物的PBS溶液裝入透析袋，繼續(xù)透析3h除去銨離子，然后高速離 心（轉(zhuǎn)速大于SOOOrpm)，除去沉淀，上清液即為HRP標記號的二氫葉酸合成酶。分裝后保存 于-80°C備用。
[0074] 實施例3 :利用HRP標記二氫葉酸合成酶檢測水體中的磺胺類藥物
[0075] 將對氨基苯磺酰胺（V900101，sigma)通過重氮化法與卵清蛋白OVA偶聯(lián)得到包被 原SAS-0VA，將其用以pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至1 μ g/mL濃度作為包被液，以100 μ 1每孔 包被酶標板，4°C孵育過夜。完畢后甩出液體，以PBS-T洗板，拍干加入封閉液（1%脫脂奶 粉）100μ 1，37°C孵育2小時，甩出液體后拍干備用。
[0076] 磺胺標準品配置濃度為 0 μ g/L，1 μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L，27 μ g/L 和 81 μ g/L。
[0077] 測定時按照以下步驟進行：
[0078] (1)加標準品：將磺胺標準品以50 μ 1每孔加入到包被好的酶標板中，將將HRP標 記的重組二氫葉酸合成酶蛋白以ΡΗ7. 2的0. IM PBS稀釋至1 μ g/mL，以50 μ 1每孔加入到 包被好的酶標板中，輕輕振蕩混勻后置37°C孵育60分鐘；
[0079] (2)完畢后取出酶標板，倒出其中液體，以吸水紙拍干后，加入顯色底物液 100 μ L/孔，再置于37°C孵育15分鐘；
[0080] (3)取出后用酶標儀于450nm處讀取吸光度值，以雙對數(shù)曲線繪制標準曲線。
[0081] 標準曲線如圖3所示，其中X軸為標準品濃度對數(shù)，Y軸為吸光度值，從曲線計算 可知，磺胺類藥物的50%抑制濃度為4. 1 μ g/L。由于我國目前磺胺類藥物的殘留限量規(guī)定 為100 μ g/L,因此完全滿足檢測需要。
[0082] 實施例4 :利用膠體金標記二氫葉酸合成酶檢測牛奶中的磺胺類藥物
[0083] 1、膠體金標記二氫葉酸合成酶
[0084] 采用朽1檬酸還原法制備得到20_40nm范圍的納米金顆粒溶液，調(diào)節(jié)pH值至8. 0備 用。取一定量的納米金顆粒溶液，置于磁力攪拌器上，然后將純化后的二氫葉酸合成酶以 PBS按照1:2000的比例稀釋后加入納米金溶液中攪拌反應(yīng)20-30分鐘，然后將PEG10000溶 液加入混合反應(yīng)液中，使PEG的最終濃度約為1 %，置于冷凍離心機（4°C )上慢速（速度為 1500?2500rpm)離心20分鐘后棄去上清液。將下層沉淀用PBS反復(fù)洗滌并繼續(xù)離心棄去 多余上清液。最后將沉淀物以PBS緩沖液重新懸浮，使最終的DHPS蛋白濃度約為50 μ g/ml 左右，保存于4°C備用。
[0085] 2、膠體金試紙條的組裝
[0086] (1)粘貼：將樣品墊、纖維素膜、吸水墊和保護膜按一定順序逐一貼在支持背板 上。樣品墊與纖維素膜相接，纖維素膜與吸水墊相接，同時在樣品墊和吸水墊上分別貼有保 護膜，其中樣品墊的保護膜印有"MAX"標記，方便檢測使用。纖維素膜上分別標記了控制線 (C線）和檢測線（T線）。C線標記的是二氫葉酸合成酶特異性單克隆抗體，而T線標記的 是牛血清白蛋白標記的磺胺類藥物。
[0087] (2)切條：將粘貼好的試紙條大板用切條機進行切割，每個試紙條的寬度為 0. 8cm，偏差范圍為0. 78?0. 82cm，切割好的試紙條儲藏在室溫下備用。
[0088] (3)微孔試劑的組裝：將納米金顆粒標記的二氫葉酸合成酶用全自動化加樣裝置 定量加到塑料微孔后，置于凍干機冷凍干燥。冷凍干燥的微孔試劑用塑料微孔蓋蓋好，儲藏 于4-8°C備用。
[0089] (4)試紙條和微孔試劑的組裝：將制備好的試紙條和微孔試劑按照1:1的比例密 封于包裝袋或者包裝瓶中，密封好后存放于4-8°C備用。
[0090] 3、利用膠體金標記法檢測牛奶樣本
[0091] (1)將待測的牛奶樣本和從冷藏環(huán)境中拿出來的試紙條放置在室溫下至少 30min〇
[0092] (2)加樣：將準備好的樣品用一次性塑料吸管或者微量移液器吸取200 μ 1，加入 到已經(jīng)去掉蓋的微孔試劑中。注意：一個微孔試劑對應(yīng)一個試紙條，只能檢測一個樣品，不 能重復(fù)使用。
[0093] (3)混合：用微量移液器或者一次性塑料吸管上下吸打微孔試劑中的液體使之充 分混勻?；靹蚝蟮奈⒖讘?yīng)呈現(xiàn)粉紅色或者淺粉色等。
[0094] (4)插條：取出試紙條并將其的帶有"MAX"標記的一端插入微孔中。請不要用手 指或者其他物體觸碰試紙條的中段，即含有檢測限和控制線的纖維素膜段。
[0095] (5)計時：插條后開始計時3分鐘，觀察C線是否出現(xiàn)，如果3min內(nèi)C線已經(jīng)出現(xiàn)， 即可判讀結(jié)果；如果C線沒有出現(xiàn)，請延長2分鐘使液體爬升至C線出現(xiàn)后判讀結(jié)果。
[0096] (6)結(jié)果判定（圖4):
[0097] 陰性：C線顯色，T線也顯色；
[0098] 陽性：C線顯色，T線不顯色；
[0099] 無效：C線不顯示。
[0100] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，本發(fā)明涉及的材 料均為已知材料，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng) 包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種可檢測磺胺類藥物殘留的二氫葉酸合成酶，其為SEQ ID NO. 1序列中所示的氨 基酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的二氫葉酸合成酶，是與二氫葉酸合成酶及其同源酶同源性大于 80 %的蛋白片段。
3. 如權(quán)利要求2所述的二氫葉酸合成酶，其可用于磺胺類藥物殘留。
4. 一種如權(quán)利要求1所述二氫葉酸合成酶的衍生物，該衍生物為以下a?d中的任意 一種： a) 將所述二氫葉酸合成酶經(jīng)過辣根過氧化物酶（HRP)生物標記后的用于示蹤的活性 蛋白質(zhì)； b) 將所述二氫葉酸合成酶經(jīng)過堿性磷酸酶（AP)生物標記后的用于示蹤的活性蛋白 質(zhì)； c) 將所述二氫葉酸合成酶經(jīng)過膠體金標記后的用于示蹤的活性蛋白質(zhì)； d) 將所述二氫葉酸合成酶經(jīng)過熒光素（FITC)生物標記后的用于示蹤的活性蛋白質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求4所述的二氫葉酸合成酶的衍生物，其可用于磺胺類藥物殘留。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、3或5所述的二氫葉酸合成酶或其衍生物，其所述磺胺類藥物為含 有對位氨基苯磺酰胺母核結(jié)構(gòu)的化合物。
7. -種如權(quán)利要求1所述的二氫葉酸合成酶的克隆、表達及純化方法，具體步驟如下： 1) 根據(jù)Genebank公開的編號為EDV67101對應(yīng)基因序列設(shè)計引物，上游引物 Pl(5' CGCGGATCC ATGAAACTCTTTGC3'）和下游引物 P2(5' AACTGCAGTTACTCATAGCGTTTG3'） 分別含有BamHl和PstI酶切位點；從大腸菌病病雞分離的大腸桿菌中分離得到大腸桿菌 Fl 1培養(yǎng)后挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至0D600nm在0. 4左右，取菌液50 μ 1高速 離心，其轉(zhuǎn)速為l〇〇〇〇r/min，離心時間為lmin，棄去上清，加入100 μ I PBS懸浮，然后再次 離心并懸浮，重復(fù)3次后加入100 μ 1雙蒸水，并離心再次以雙蒸水懸浮，而后進行PCR擴 增目標基因，SDS電泳檢測產(chǎn)物； 2) 用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用BamHI和PstI雙酶切PCR產(chǎn)物和載體DNA，用 DNA回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，并用Τ4連接酶16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至活化的 感受態(tài)細胞E Coli DH5a中并均勻涂在Amp抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時后菌落 PCR鑒定；將初步鑒定的菌落提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，陽性結(jié)果進行測序，并與報道的序列進 行比對；確認后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達菌株BL21 (DE3)中，以IPTG進行誘導(dǎo)表達，電泳檢測 表達結(jié)果；大量表達后以鎳柱純化，純化蛋白除鹽后凍存。
8. -種如權(quán)利要求4所述的HRP標記二氫葉酸合成酶的制備，所述的標記方法為戊二 醛法，具體步驟如下： 1) 稱取5mgHRP(sigma，P8375)溶解于0. 5ml蒸餾水中，并向其中加入0. 5ml新配的 0. IM NaKM溶液，混勻，4°C靜置30分鐘使HRP充分活化； 2) 加入0. 16M乙二醇水溶液0. 5ml，混勻，靜置30分鐘； 3) 將二氫葉酸合成酶用生理鹽水溶解成2. 5mg/ml的溶液，取Iml逐滴加入前述HRP溶 液中； 4) 充分混勻，置于pH9. 5碳酸鹽緩沖液透析4°C透析過夜； 5) 加0. 2M賴氨酸0. 25ml,混勻后,置室溫2小時,然后以飽和硫酸銨沉淀蛋白后取沉 淀物溶于0. IM PBS中； 6)將溶解有標記物的PBS溶液裝入透析袋，繼續(xù)透析3h除去銨離子，然后高速離心，其 離心轉(zhuǎn)速大于SOOOrpm，除去沉淀，上清液即為HRP標記號的二氫葉酸合成酶；分裝后保存 于-80°C備用。
9. 一種根據(jù)權(quán)利要求8所述的HRP標記二氫葉酸合成酶檢測水體中的磺胺類藥物的方 法，具體步驟如下： 1) 將對氨基苯磺酰胺通過重氮化法與卵清蛋白OVA偶聯(lián)得到包被原SAS-OVA，將其用 以PH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至1 μ g/mL濃度作為包被液，以100 μ 1每孔包被酶標板，4°C 孵育過夜；完畢后甩出液體，以PBS-T洗板，拍干加入封閉液，所述封閉液為1 %脫脂奶粉 100 μ 1，37°C孵育2小時，甩出液體后拍干備用； 2) 磺胺標準品配置濃度為0 μ g/L，1 μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L，27 μ g/L和81 μ g/L ;測定 時按照以下步驟進行： (1) 加標準品：將磺胺標準品以50 μ 1每孔加入到包被好的酶標板中，將將HRP標記的 重組二氫葉酸合成酶蛋白以ΡΗ7. 2的0. IM PBS稀釋至1 μ g/mL，以50 μ 1每孔加入到包被 好的酶標板中，輕輕振蕩混勻后置37°C孵育60分鐘； (2) 完畢后取出酶標板，倒出其中液體，以吸水紙拍干后，加入顯色底物液100 μ L/孔， 再置于37°C孵育15分鐘； (3) 取出后用酶標儀于450nm處讀取吸光度值，以雙對數(shù)曲線繪制標準曲線。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測牛奶中的磺胺類藥物的方法，具體步驟如下： 1) 膠體金標記二氫葉酸合成，其特征在于所用示蹤物為膠體金標記的重組二氫葉酸 合成酶酶 采用檸檬酸還原法制備得到20-40nm范圍的納米金顆粒溶液，調(diào)節(jié)pH值至8. 0備用； 取一定量的納米金顆粒溶液，置于磁力攪拌器上，然后將純化后的二氫葉酸合成酶以PBS 按照1:2000的比例稀釋后加入納米金溶液中攪拌反應(yīng)20-30分鐘，然后將PEG10000溶液 加入混合反應(yīng)液中，使PEG的最終濃度約為1 %，置于冷凍離心機，其溫度為4°C，在速度為 1500?2500rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘后棄去上清液；將下層沉淀用PBS反復(fù)洗滌并繼續(xù) 離心棄去多余上清液；最后將沉淀物以PBS緩沖液重新懸浮，使最終的DHPS蛋白濃度約為 5(^ 8/1111左右，保存于41：備用； 2) 膠體金試紙條的組裝 (1) 粘貼：將樣品墊、纖維素膜、吸水墊和保護膜按一定順序逐一貼在支持背板上；樣 品墊與纖維素膜相接，纖維素膜與吸水墊相接，同時在樣品墊和吸水墊上分別貼有保護膜， 其中樣品墊的保護膜印有"MAX"標記，方便檢測使用；纖維素膜上分別標記了控制線（C線） 和檢測線（T線）；C線標記的是二氫葉酸合成酶特異性單克隆抗體，而T線標記的是牛血清 白蛋白標記的磺胺類藥物； (2) 切條：將粘貼好的試紙條大板用切條機進行切割，每個試紙條的寬度為0. 8cm，偏 差范圍為0. 78?0. 82cm，切割好的試紙條儲藏在室溫下備用； (3) 微孔試劑的組裝：將納米金顆粒標記的二氫葉酸合成酶用全自動化加樣裝置定量 加到塑料微孔后，置于凍干機冷凍干燥；冷凍干燥的微孔試劑用塑料微孔蓋蓋好，儲藏于 4-8 °C備用； (4)試紙條和微孔試劑的組裝：將制備好的試紙條和微孔試劑按照1:1的比例密封于 包裝袋或者包裝瓶中，密封好后存放于4-8°C備用； 3)利用膠體金標記法檢測牛奶樣本 (1) 將待測的牛奶樣本和從冷藏環(huán)境中拿出來的試紙條放置在室溫下至少30min ; (2) 加樣：將準備好的樣品用一次性塑料吸管或者微量移液器吸取200 μ 1，加入到已 經(jīng)去掉蓋的微孔試劑中；所述的一個微孔試劑對應(yīng)一個試紙條，只能檢測一個樣品，不能重 復(fù)使用； (3) 混合：用微量移液器或者一次性塑料吸管上下吸打微孔試劑中的液體使之充分混 勻；混勻后的微孔應(yīng)呈現(xiàn)粉紅色或者淺粉色等； (4) 插條：取出試紙條并將其的帶有"MAX"標記的一端插入微孔中； (5) 計時：插條后開始計時3分鐘，觀察C線是否出現(xiàn)，如果3min內(nèi)C線已經(jīng)出現(xiàn)，即 可判讀結(jié)果；如果C線沒有出現(xiàn)，請延長2分鐘使液體爬升至C線出現(xiàn)后判讀結(jié)果； (6) 進行結(jié)果判定：陰性：C線顯色，T線也顯色；陽性：C線顯色，T線不顯色；無效：C 線不顯示。
【文檔編號】G01N33/532GK104212773SQ201410447196
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】楊春江, 劉勇, 朱文壯, 孟賡, 秦堃, 莫勛, 馬孝斌 申請人:北京納百景弈生物科技有限公司