專利名稱：齒根膜保護劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及齒根膜保護劑及其用途，該齒根膜保護劑具有降低Porphyromonas gingivalis對牙周組織之一的齒根膜的危害效果的原花色素特征的多酚、尤其具有來源于啤酒花苞或蘋果未成熟果實的有原花色素特征的多酚。
背景技術(shù)：
俗話說牙好生活就好。失去牙齒會大幅降低人的生活質(zhì)量(QOL)，這是勿庸置疑的事實。
近年，日本醫(yī)療費用的總額約達到30萬億日元，牙科的醫(yī)療費用也達到2萬5000億日元。期望增進口腔健康不僅要減輕牙科醫(yī)療費，還要削減總醫(yī)療費。也就是說，以美國為中心的近期研究結(jié)果表明口腔健康、尤其牙周病的有無與全身健康有著密切的關(guān)聯(lián)。而且，在我國，根據(jù)兵庫縣牙科醫(yī)師會的調(diào)查(《“8020運動”和醫(yī)療費的關(guān)系》第2次調(diào)查，2002年)，失去牙齒越少的人(自己的牙齒大部分保留的人)全身健康狀況越好，支付的醫(yī)療費越少。在日本趨于老齡化的社會中，口腔衛(wèi)生的重要性日益提高。
不僅從QOL的觀點，還從抑制和削減醫(yī)療費的觀點來看，開發(fā)良好的預(yù)防失去牙齒的方法，具有重大的產(chǎn)業(yè)性意義。
而且近年，在牙科領(lǐng)域，使失去的牙齒以及牙周組織再生，即再生醫(yī)療正在進入實用階段。從上述觀點來看，可以說該技術(shù)的確立有著重大的意義。
牙周組織疾病即牙周病是世界性蔓延的口腔疾病，是失去牙齒的主要原因之一?，F(xiàn)已得出以下結(jié)論牙周病是由細菌引起的感染癥。其原因可以認為是由在牙周袋中的牙斑中生長的各種細菌引起的，其中Porphyromonas gingivalis(以下稱P.gingivalis)是其主要的至病菌。
P.gingivalis是從牙周病患者的牙周袋被檢測出的頻率很高的細菌，通過產(chǎn)生/釋放具有強炎癥性的蛋白質(zhì)分解酶(Arg-gingipain以及Lys-gingipain)和LPS(酯多糖)，來損壞牙周組織(齒根膜、牙槽骨)。其結(jié)果，使牙周組織不能支撐牙齒，以至于失去牙齒。
齒根膜是主要由膠原神經(jīng)纖維構(gòu)成的組織，其神經(jīng)纖維的一側(cè)埋入牙槽骨中，另一側(cè)埋入牙骨質(zhì)中。齒根膜是起結(jié)合牙齒和牙槽骨作用的、吸收牙齒上的壓力而使壓力不直接作用在骨上的重要組織。如上所述，在牙周病發(fā)展過程中，特別重要的過程之一是對齒根膜以及牙槽骨的破壞。如果沒有這兩個組織，牙齒就不能負擔攝食時所必要的力量。
而且，作為在牙科領(lǐng)域中再生醫(yī)療的嘗試，正在研究通過對齒根膜細胞使用增長因子來使失去的齒根膜再生的方法，以及培養(yǎng)片狀齒根膜再移植到人口腔的方法。但是，在這種情形下，當患者感染了P.gingivalis，再生引導或移植的齒根膜被P.gingivalis破壞，從而不能達到其應(yīng)起的作用而導致了很多問題。
作為預(yù)防/改善牙周疾病的技術(shù)，除了平常人們通過刷牙等物理方法除去牙斑，還有通過使用來源于綠茶的多酚(專利文獻1)、來源于樹木的多酚(專利文獻2)等。其抗牙周病的效果是基于通過P.gingivalis蛋白質(zhì)分解酶的抑制效果、或阻礙向P.gingivalis培養(yǎng)細胞粘連，來抑制牙周病的發(fā)生和發(fā)展。
專利文獻1特開平5-944號公報專利文獻2特開平8-81380號公報發(fā)明內(nèi)容但是，即使有效抑制了P.gingivalis向上皮細胞粘連，也會因少量粘連的P.gingivalis為誘因形成了牙斑，或即使有效抑制了P.gingivalis的蛋白質(zhì)分解酶，但因為P.gingivalis還分泌例如LPS等炎癥因子，所以在這些例子中，在牙周病的病情惡化的重要過程中，不能直接證明能抑制牙周組織的破壞。
而且，關(guān)于在再生醫(yī)療領(lǐng)域牙對周組織保護效果的說明，沒有在所涉及的現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的課題是提供克服上述問題，即由P.gingivalis引起齒根膜損害的方法。
本發(fā)明人關(guān)于上述課題進行了堅持不懈地研究，其結(jié)果來源于啤酒花苞或蘋果未成熟果實、有原花色素特征的多酚能夠強力地抑制由P.gingivalis菌引起的齒根膜的損害，并具有保護效果。而且，還確認了該多酚具有降低P.gingivalis菌對于被引導的齒根膜細胞膜再生的損害的效果。而且通過將該物質(zhì)作為齒根膜保護材料運用于醫(yī)藥品、漱口劑等準藥品、或飲食品中，來完成本發(fā)明。這里所說的多酚主要是在植物體所包含的分子內(nèi)具有多個酚羥基團的化合物的總稱。所說的有原花色素特征的多酚是一種化合物，通過加水分解生成紅色系色素中的花色素(花青素或翠雀素或花葵素)。
即，本發(fā)明第1是關(guān)于具有原花色素特征的多酚的齒根膜保護劑，第2是關(guān)于具有來源自蘋果未成熟果實的原花色素特征的多酚的齒根膜保護劑，第3是關(guān)于具有來源于啤酒花苞的有原花色素特征的多酚的齒根膜保護劑。
如上所述，在牙周病的發(fā)展(病情的惡化)中，最重要的過程之一是齒根膜的破壞，為了解決由于牙周病而喪失牙齒的問題，需要一種保護齒根膜的技術(shù)。而且，在口腔領(lǐng)域的再生醫(yī)療中，以再生牙齒的形成為目標，但即使將再生牙齒安裝進人的口腔中，當已經(jīng)失去齒根膜組織時，牙齒是不可能被固定的。這時就需要即使失去牙齒后，也能保護齒根膜的技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明，能夠強力地抑制由P.gingivalis菌引起的、對齒根膜的損害，并具有保護效果，還可以作為齒根膜保護材料而運用于醫(yī)藥品、漱口劑等準藥品、或飲食品中。


圖1為實施例12的齒根膜細胞保護效果的示意圖?？v軸表示吸光度。
圖2為實施例13的齒根膜細胞保護效果的示意圖?？v軸表示齒根膜再生率(％)，橫軸表示時間(h)。
具體實施例方式
作為本發(fā)明原料的蘋果未成熟果實是在蘋果果實成熟之前人為采摘得到的，或從果樹上自然掉落的。
而且，作為本發(fā)明原料的啤酒花苞是通過將啤酒花球果去除啤酒花苦味素腺部分得到的。通常，粉碎啤酒花球果之后，通過篩分將蛇麻素腺部分去除而得到啤酒花苞。但是，在最近的啤酒釀造中，為了省去篩分后再去除啤酒花苞的麻煩，不去除在啤酒釀造中沒有用的啤酒花苞，而將啤酒花球果直接形成球狀作為啤酒花顆粒用于啤酒釀造。因此，作為本發(fā)明的原料，對含有啤酒花苞的物質(zhì)沒有特別限定，用含有啤酒花苞的啤酒花球果、啤酒花顆粒為原料也沒有任何問題。
將這些原料通過壓縮榨汁或用酒精水溶液等提取，作為含有齒根膜保護材料的溶液，也可以直接以粉末狀使用。必要時，也可以使用填充了對多酚具有親合性的粒狀樹脂等的柱(column)等來進行精制齒根保護材料，提高精制度后使用。
得到的齒根膜保護材料可以用于蛋糕類、食品類、飲料等食品、特別優(yōu)選用于糖果、巧克力、焦糖、口香糖等在口腔滯留時間較長的食品。而且，也可以向漱口液、潔齒劑等口腔用劑添加使用。向這些飲食品、口腔用劑添加齒根膜保護材料時，齒根膜保護材料以粉末狀添加較好，優(yōu)選將齒根膜保護材料作為1～2％的水溶液或酒精水溶液的溶液或酒精溶液，對于飲食品或口腔用藥劑的最終濃度為1～5000ppm，優(yōu)選100～2000ppm來添加。
實施例1(從蘋果未成熟果實調(diào)制齒根膜保護材料)
將蘋果未成熟果實(平均重量5.03g)400g與1％鹽酸酸性的甲醇共同均化后，一邊加熱環(huán)流一邊提取(3次)。減壓濃縮提取液并除去甲醇后，加入氯仿后分層(2次)，回收水層，過濾后其200ml用蒸餾水混合。然后通過使用Sep-pak C18的固相提取法精制，凍干得到齒根膜保護材料8.9g。從蘋果未成熟果實的收得率為2.2％。
實施例2(從啤酒花苞調(diào)制齒根膜保護材料)將啤酒花苞50g用1000ml的40％酒精水溶液在攪拌下、50℃下進行60分鐘提取。過濾后，減壓壓縮至容積為500ml，將其濃縮液流過填充了150ml苯乙烯-聯(lián)乙烯苯樹脂(三菱化學社制Sepabeads SP70)的柱，然后用500ml的水溶液清洗。而且向同一柱流過50％酒精水溶液600ml，回收合成溶液，并進行凍干，得到無嗅的、微苦味的、淡黃色粉末形式的1.7g齒根膜保護材料。從啤酒花苞的收得率為3.4％。
實施例3(使用超濾膜的齒根膜保護材料的精制)將與實施例2同樣地得到的5g齒根膜保護材料溶解于500ml的50％酒精水溶液中，用分數(shù)分子量10000的超濾膜進行處理。濃縮沒有通過該膜的上部殘留液后，進行凍干，而且得到黃色～褐色粉末形式的2.2g進一步精制后的齒根膜保護材料。
實施例4(潔齒劑)
二堿式磷酸鈣42.0甘油18.0角叉膠 0.7月桂基硫酸鈉1.2糖精鈉 0.09對羥基苯甲酸丁酯0.005實施例1中得到的材料 0.005香料1.0水 37.0合計100.0使用上述各重量份的各成分，根據(jù)通常方法制造潔齒劑。且代替實施例1中得到的材料，分別添加實施例2以及3中得到的材料同樣可以得到潔齒劑。
實施例5(漱口液)甘油7.0山梨醇 5.0乙醇15.0月桂基硫酸鈉0.8
糖精鈉 0.11-薄荷醇 0.05香料 0.045實施例1中得到的材料0.005水 72.0合計 100.0使用上述各重量份的各成分，根據(jù)通常方法制造漱口液。且代替實施例1中得到的材料，分別添加實施例2以及3中得到的材料同樣可以得到漱口液。
實施例6(片劑)阿拉伯樹膠 6.0硬脂酸鎂 3.0葡萄糖 73.0乳糖 17.6磷酸氫二鉀 0.2磷酸二氫鉀 0.1香料 0.095實施例1中得到的材料0.005
合計 100.0使用上述各重量份的各成分，根據(jù)通常方法制造片劑。且代替實施例1中得到的材料，分別添加實施例2以及3中得到的材料同樣可以得到片劑。
實施例7(糖果)蔗糖 20.0粘性淀粉糖漿(75％固體部分)70.0水9.5著色劑0.45香料 0.045實施例1中得到的材料 0.005合計 100.0使用上述各重量份的各成分，根據(jù)通常方法制造糖果。且代替實施例1中得到的材料，分別添加實施例2以及3中得到的材料同樣可以得到糖果。
實施例8(口香糖)膠質(zhì)基底 20.0
碳酸鈣 2.0乳糖 77.0卡哈苡苷 0.095實施例1中得到的材料 0.005香料 0.9合計 100.0使用上述各重量份的各成分，根據(jù)通常方法制造口香糖。且代替實施例1中得到的材料，分別添加實施例2以及3中得到的材料同樣可以得到口香糖。
實施例9(果汁)濃縮桔子汁 15.0果糖 5.0檸檬酸 0.2香料 0.1色素 0.15維丙鈉 0.048實施例1中得到的材料 0.002水 79.5
合計 100.0使用上述各重量份的各成分，根據(jù)通常方法制造果汁。且代替實施例1中得到的材料，分別添加實施例2以及3中得到的材料同樣可以得到果汁。
實施例10(曲奇)低黏性面粉32.0全蛋 16.0黃油 16.0砂糖 25.0水10.8發(fā)酵粉0.198實施例1中得到的材料 0.002合計 100.0使用上述各重量份的各成分，根據(jù)通常方法制造曲奇。且代替實施例1中得到的材料，分別添加實施例2以及3中得到的材料同樣可以得到曲奇。
實施例11(焦糖)
砂糖 31.0粘性淀粉糖漿(75％固體部分)70.0奶粉 40.0硬化油5.0食鹽 0.6香料 0.025實施例1中得到的材料 0.005水3.37合計 100.0使用上述各重量份的各成分，根據(jù)通常方法制造焦糖。且代替實施例1中得到的材料，分別添加實施例2以及3中得到的材料同樣可以得到焦糖。
實施例12(齒根膜細胞保護效果)在齒根膜細胞中，從被拔去牙齒的人的第三臼齒的齒根中央部剝離的齒根膜，使來源于該齒根膜的細胞在DMEM培養(yǎng)基中進行5～7代次培養(yǎng)，在確認堿性磷酸酶活性之后使用。在比較例中，使用來源于綠茶的表焙兒茶素作為多酚，并使用了實施例1、2以及3中得到齒根膜保護劑。P.gingivalis菌使用了ATCC33277菌株。
1×104齒根膜細胞被孵育在96孔平板中，在含有FCS10％的DMEM培養(yǎng)基中、在37℃下進行12小時孵育，形成了細胞的單層。將培養(yǎng)基替換成不含有FCS的DMEM培養(yǎng)基后，在37℃下進行12小時孵育。之后將沒食子酸表焙兒茶素(比較例)、實施例1、2以及3加入培養(yǎng)基，而且將細胞數(shù)量100倍的P.gingivalis菌添加到培養(yǎng)基中，使細胞感染，在37℃下進行6小時孵育。孵育后，用PBS清洗3次，用25％的戊二醛水溶液處理5分鐘，固定細胞。將固定了的細胞再用PBS清洗3次，用0.5％結(jié)晶紫的20％酒精溶液染色細胞。再用PBS清洗細胞5次，用平板讀取器(BIO-Rad Co.，type 680)測定了在590nm的吸光度。
由于結(jié)晶紫是用于染色細胞的色素，所以如果由P.gingivalis菌引起的細胞損傷很少，可以很好地保存細胞的單層膜，由于被很好染色，因此在590nm的吸光度升高；相反如果細胞損傷很大，細胞的單層膜被破壞，則被染色的細胞減少，因此在590nm的吸光度降低。
試驗結(jié)果如圖1所示。加入實施例1、2以及3(各1μg/ml)的情況下，與對照(沒添加多酚)相比較細胞膜的損傷低，細胞膜被更好地保存，因此顯示具有很高的吸光度。該效果與10μg/ml的表焙兒茶素鎵酸鹽(比較例)的效果相同，或更好。即，實施例1～3的效果與10倍量的比較例相同，或更好。
實施例13(齒根膜細胞保護效果)在齒根膜細胞中，將從被拔去牙齒的人的第三臼齒的齒根中央部剝離的齒根膜提取的細胞在DMEM培養(yǎng)基中進行5～7代次培養(yǎng)之后，在確認堿性磷酸酶活性之后使用。作為多酚，以來源于綠茶的沒食子酸表焙兒茶素作為比較例，使用了實施例1、2以及3中得到齒根膜保護劑。P.gingivalis菌為ATCC33277菌株。作為齒根膜的再生誘發(fā)劑使用了emdogain(エムドゲイン)(注冊商標，EMD)。
1×104齒根膜細胞被孵育在事先涂上emdogain的96孔平板中，在含有FCS10％的DMEM培養(yǎng)基中、在37℃下進行12小時孵育，形成了細胞的單層。將培養(yǎng)基替換成不含有FCS的DMEM培養(yǎng)基后，再在37℃下進行12小時孵育。
之后用鋒利針尖刺傷膜，將沒食子酸表焙兒茶素(比較例)、實施例1、2以及3加入培養(yǎng)基，再將細胞數(shù)量的100倍的P.gingivalis菌添加到培養(yǎng)基中，使細胞感染，在37℃下進行40分鐘孵育。在孵育前以及孵育開始后20分鐘、40分鐘時，在顯微鏡下對被刺傷的膜拍照，再用圖像處理裝置將膜的再生狀態(tài)進行數(shù)字化處理。
試驗結(jié)果如圖2所示，加入實施例1、2以及3(各10μg/ml)的情況下，對照(沒添加多酚、EMD+Pg)以及與10μg/ml的沒食子酸表焙兒茶素(比較例EGCg)相比較，明確地發(fā)現(xiàn)了齒根膜的再生。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明的齒根膜保護劑在再生醫(yī)療領(lǐng)域具有對牙周組織的保護效果，可以使用在醫(yī)藥品、漱口劑等準藥品，以及飲食品中。
權(quán)利要求
1.一種齒根膜保護劑，其特征在于，包括用于抑制Porphyromonasgingivalis菌對齒根膜的破壞的、有原花色素特征的多酚。
2.如權(quán)利要求1所述的齒根膜保護劑，其特征在于，來源于啤酒花，尤其是啤酒花苞。
3.如權(quán)利要求1所述的齒根膜保護劑，其特征在于，來源于蘋果。
4.一種口腔用劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1記載的齒根膜保護劑。
5.一種口腔用劑，其特征在于，含有權(quán)利要求2記載的齒根膜保護劑。
6.一種口腔用劑，其特征在于，含有權(quán)利要求3記載的齒根膜保護劑。
7.一種飲食品，其特征在于，含有權(quán)利要求1記載的齒根膜保護劑。
8.一種飲食品，其特征在于，含有權(quán)利要求2記載的齒根膜保護劑。
9.一種飲食品，其特征在于，含有權(quán)利要求3記載的齒根膜保護劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種齒根膜保護劑，用于抑制Porphyromonas gingivalisn.(真菌屬齒根炎)菌對齒根膜的破壞；以及還提供含有該齒根膜保護劑的、具有預(yù)防齒根膜損傷疾病和治療效果的口腔用劑或飲食品。一種齒根膜保護劑是具有降低Porohyromonas gingivalis對齒根膜的危害效果的原花色素類、特別優(yōu)選來源于蘋果未成熟果實或啤酒花苞的原花色素類；以及將該齒根膜保護劑作為有效成分而含有的口腔用劑和飲食品。
文檔編號A61Q17/00GK1764448SQ20058000005
公開日2006年4月26日 申請日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者稻葉裕明, 田頭素行, 神田智正, 天野敦雄 申請人:朝日啤酒株式會社