專利名稱：一種復合靈芝孢子油及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及靈芝孢子油技術領域，特別是涉及一種復合靈芝孢子油及其制備方法。
背景技術：
靈芝是擔子菌綱多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌赤芝G.lucidum.karst和紫芝G.japonicum Lloyd的總稱，被《本經(jīng)》稱為上品，民間視為“靈藥仙丹”，是我國傳統(tǒng)扶正固本、滋補強壯的名貴中藥，在我國已有幾千年的藥用、食用歷史。文獻報導的靈芝主要成分包括三萜類、多糖類、核苷、甾醇類、氨基酸類、維生素類、生物堿類和無機離子等，其中靈芝三萜酸類為靈芝中具有很強生理活性的成分。
靈芝孢子是靈芝在成熟時期不斷從菌蓋下噴射出的生殖細胞，是繁殖下一代靈芝的種子，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)。其主要成分包括脂肪酸類、甾醇類、三萜類、維生素類、胡蘿卜素、內(nèi)酯、蛋白質(zhì)和氨基酸類、糖肽類、生物堿類和無機離子等。八十年代開始，有較多的對靈芝及其孢子粉抗腫瘤方面的基礎研究；到九十年代，美國、日本等國將靈芝應用至臨床，用于癌癥及AIDS(艾滋病)治療方面，得到了國際研究學者的廣泛注意。近年來研究和應用更多的是人工培育的靈芝孢子粉及其提取物。據(jù)文獻[江蘇藥學與臨床研究，2001，9(2)55]報導，我國科學家研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)是靈芝孢子的抗病“主力”。破壁靈芝孢子用超臨界二氧化碳萃取的脂質(zhì)活性物質(zhì)為靈芝孢子油。為充分利用靈芝孢子這一資源，現(xiàn)采用超臨界CO2萃取法從靈芝孢子萃取靈芝孢子油發(fā)明專利眾多，如CN1723958A、CN1239100C、CN1563335A、CN1631431A、CN1255519C、CN1194079C、CN1114446C、CN1094766C等。此外，還有用溶劑浸出法、壓榨法、溶劑超聲提取法從靈芝孢子中提取靈芝孢子油的方法，如發(fā)明專利CN1099455C、CN1116393C、CN1099455C。這些方法都是單純地從靈芝孢子中獲取靈芝孢子油，由于靈芝孢子的資源有限，而靈芝孢子具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，也就是說靈芝中含有與靈芝孢子基本相同的活性物質(zhì)，而且實際上具有很強生理活性的靈芝酸類成分在靈芝中的含量高于靈芝孢子中的含量。因此，將靈芝(靈芝茵絲體或靈芝子實體)與靈芝孢子混合組成靈芝孢子復合物提取復合靈芝孢子油，不僅擴大了靈芝孢子油的獲取資源，而且獲得的復合靈芝孢子油中靈芝酸類成分的含量比單純的靈芝孢子油中的含量更高，臨床應用效果更好。中國專利CN1273147C公開了一種全靈芝孢子中有效成分的超臨界CO2萃取方法，雖然該方法也用粉碎為顆粒的靈芝子實體與靈芝孢子為原料，但在超臨界CO2進行萃取時使用了食用乙醇作為提取劑參與萃取，獲得的提取物呈油膏狀，其提取物雖含有脂質(zhì)性成分但也含有水溶性多糖，與靈芝孢子油的成分組成有較大差別，且油膏狀物給后續(xù)的制劑工作造成較大的困難。中國專利CN1607001A公開了一種靈芝菌絲體萃取靈芝油的方法。該方法用粉碎為顆粒的靈芝菌絲體為原料，用超臨界CO2萃取法萃取靈芝油，萃取過程中萃取溫度較高，易造成活性成分損失，且未公開所獲靈芝油的成分組成。本發(fā)明充分利用靈芝菌絲體與靈芝孢子含有基本相同的脂質(zhì)成分的特點，選用一定比例的靈芝菌絲體(或靈芝子實體)細粉與破壁靈芝孢子混合組成復合靈芝孢子粉，再加入少量的粘合物混均后干壓制粒，用超臨界CO2萃取或超聲超臨界CO2萃取法萃取，獲取有一定明確化學組成的脂質(zhì)透明油狀液體→復合靈芝孢子油。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有靈芝孢子油生產(chǎn)上存在的問題，提供一種以非靈芝孢子為主要原料，而得到的復合靈芝孢子油用途效果不次于純靈芝孢子油的制備方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述制備方法所得到的復合靈芝孢子油。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以復合靈芝孢子粉為原料，即以靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉與靈芝孢子粉組成的復合靈芝孢子粉為原料。所述的靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉是指將靈芝菌絲體粉碎至大于或等于120目的細粉，以200目為佳；所述靈芝孢子粉是指將靈芝孢子破壁至破壁率≥95％的靈芝孢子粉。靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉與靈芝孢子粉的重量比為靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉∶靈芝孢子粉＝0.5～3∶1。由于靈芝中含有與靈芝孢子基本相同的活性物質(zhì)，而且實際上具有很強生理活性的靈芝酸類成分在靈芝中的含量高于靈芝孢子中的含量。因此，將靈芝(靈芝茵絲體或靈芝子實體)與靈芝孢子復合組成復合靈芝孢子粉，不僅擴大了靈芝孢子油的獲取資源，而且提高了復合靈芝孢子油中靈芝酸類成分的含量，使靈芝孢子粉與靈芝菌絲體得到了更好的應用。
本發(fā)明的復合靈芝孢子油的制備方法，是以靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉與靈芝孢子粉組成的復合靈芝孢子粉為原料，采用超臨界流體萃取或超聲強化超臨界流體萃取其油狀復合脂質(zhì)物質(zhì)，即為復合靈芝孢子油。
上述超臨界流體萃取的流體為CO2，萃取溫度為21～42℃，萃取壓力為10～34Mpa，萃取時間為1～5小時，萃取流量為32～58kg/h；采用二級分離，分離的工藝條件是一級解析器壓力為9～13MPa分離溫度38～42℃；二級解析器壓力為4～6MPa，分離溫度為28～32℃。采用超聲強化超臨界流體萃取時，除包括上述條件外，其超聲的頻率為25～60kHz，功率為60～800W。超聲強化超臨界流體萃取是加裝了超聲提取裝置的超臨界流體設備，該方法將超聲提取方法與超臨界流體提取方法相結合提取孢子油，達到提高出油率、降低萃取溫度和壓力，縮短提取時間的目的。
在上述提取方法中，由于直接采用復合靈芝孢子粉進行超臨界二氧化碳萃取，細微粉狀物易沖料，細微粉狀物易進入孢子油中，使孢子油的顏色變深、變渾濁；同時，工業(yè)生產(chǎn)時，會帶來操作的危險。為切實解決生產(chǎn)的安全操作問題，確保孢子油萃取過程質(zhì)量的穩(wěn)定，本發(fā)明采取了將復合靈芝孢子粉原料中加入0.2％～1.2％的的淀粉或糊精，混合均勻后，采用制粒機用干壓法一步制成粒徑大小為0.1～0.3cm的顆粒，制粒時，優(yōu)選制粒機主壓力為5～8MPa，側壓力為0.5～1Mpa；制粒后再投料于超臨界二氧化碳萃取釜中或超聲強化超臨界二氧化碳萃取釜中，采用超臨界流體萃取或超聲強化超臨界流體萃取、二級分離的方法，提取得到淡黃色油狀物。
本發(fā)明制備方法所得到的復合靈芝孢子油，含有脂肪酸與甘油結合組成的靈芝孢子脂肪酸甘油三酯類、脂肪酸類、靈芝三萜酸類(靈芝酸類)等成分，其中靈芝孢子脂肪酸甘油三酯類中的結合有機酸與游離脂肪酸類、靈芝酸類組成的總有機酸的重量含量以油酸計為復合靈芝孢子油的90％以上；靈芝酸類的重量含量以靈芝酸E計為復合靈芝孢子油的0.1％～2.5％；其酸值按《中華人民共和國藥典》2005年版一部附錄IXP酸敗度測定法中的酸值測定法測定小于或等于25。
靈芝孢子脂肪酸甘油三酯類是由脂肪酸與甘油結合構成，為復合靈芝孢子油的主成分；脂肪酸類為復合靈芝孢子油中游離脂肪酸；復合靈芝孢子油中的結合脂肪酸與游離脂肪酸及靈芝酸之和為總有機酸，其中含量最高者為油酸，靈芝孢子脂肪酸甘油三酯類通過水解，得到的有機酸，與游離脂肪酸及靈芝酸一起，采用滴定法測定，以油酸為標準計算其總有機酸的含量，本發(fā)明所提供的復合靈芝孢子油中總有機酸的重量含量為復合靈芝孢子油的90％以上。
復合靈芝孢子油中總有機酸含量測定方法將復合靈芝孢子油樣品溶于中性乙醇(對酚酞指示液顯中性)中，精密加入過量的氫氧化鉀乙醇溶液，置水浴中加熱回流1.5小時，讓復合靈芝孢子油中的三酸甘油酯類充分水解，并中和復合靈芝孢子油中的游離脂肪酸、靈芝酸和水解脂肪酸，再用鹽酸液滴定中和過量的氫氧化鉀，通過消耗的氫氧化鉀的量計測定樣品中的總有機酸的含量。
精密稱取本品0.8g，加中性乙醇(對酚酞指示液顯中性)10ml，精密加入氫氧化鉀乙醇溶液(0.5mol/L)25ml，置水浴中加熱回流1.5小時，放冷，用中性乙醇10ml沖洗冷凝器，合并溶液，加酚酞指示液3滴，用鹽酸液(0.5mol/L)滴定至粉紅色消失，并將滴定的結果用空白試驗校正。每1ml的鹽酸液(0.5mol/L)相當于282.47mg的油酸(C18H34O2，分子量282.47)。
式中A-供試晶消耗鹽酸液(0.5mol/L)的毫升數(shù)B-空白試驗消耗鹽酸液(0.5mol/L)的毫升數(shù)C-鹽酸液的摩爾濃度(0.5mol/L)G-供試品的重量(g)靈芝酸類為靈芝、靈芝孢子中活性很強的一類成分，在復合靈芝孢子油中靈芝酸類成分有靈芝酸C、靈芝酸E、靈芝酸B等，靈芝酸類的重量含量以靈芝酸E計為復合靈芝孢子油的0.1％～2.5％。
復合靈芝孢子油中總靈芝酸的含量測定對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的靈芝酸E對照品2.5～7.5mg，置于25ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，每1ml中含靈芝酸E為0.1～0.3mg。
標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分別置10ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液至刻度，搖勻；以相應的飽和NaHCO3溶液為空白，照紫外-分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
測定法取靈芝孢子油制劑1～5g，精密稱定，加石油醚10～50ml溶解，加入已處理好的硅膠柱(8g，18mm×400mm)上，加入100～150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝25∶75的混合溶液洗脫，棄去洗脫液，硅膠柱繼續(xù)加入100～150ml乙酸乙酯∶甲醇＝80∶20的混合溶液洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加氯仿20ml，超聲2min溶解，轉(zhuǎn)移置分液漏斗中，用飽和NaHCO3萃取4次，每次20ml，合并萃取液，置100ml量瓶中，加飽和NaHCO3溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。照分光光度法，在262nm波長處測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中靈芝酸E的重量，計算，即得。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果1、本發(fā)明的復合靈芝孢子油的提取是以靈芝孢子與靈芝菌絲體或靈芝子實體為原料，靈芝菌絲體和靈芝子實體的成本遠低于靈芝孢子，因此擴大了靈芝孢子的應用資源，節(jié)約了生產(chǎn)成本。
2、本發(fā)明的復合靈芝孢子油主要化學組成清楚，易控制產(chǎn)品的質(zhì)量，產(chǎn)品純度高。
3、本發(fā)明的復合靈芝孢子油不僅具有和純靈芝孢子油相同的效果，而且比純靈芝孢子油作用強度更大。生理活性很強的靈芝酸類成分的含量復合靈芝孢子油明顯高于純靈芝孢子油。
4、本發(fā)明采用超臨界CO2流體萃取法制備復合靈芝孢子油，干壓一步制粒法將復合靈芝孢子粉制成顆粒后提取，解決了超臨界CO2提取時的沖料的安全性和提取不完全的問題，制粒方法簡單，不需要經(jīng)過加熱和干燥的過程，避免了因加熱而造成成分破壞的可能。采用超聲超臨界CO2流體萃取時，將超聲提取和超臨界流體萃取技術相結合，在相同的萃取時的溫度和壓力下又能縮短提取時間。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明的提取方法生產(chǎn)周期短、有效成分不易破壞，無溶劑殘留、不污染環(huán)境等優(yōu)點。
具體實施例方式
實施例1取破壁率在95％以上的赤芝的靈芝孢子粉3kg、粉碎為200目的靈芝菌絲體粉2kg，加入淀粉50g，混合均勻，用干壓制粒機直接干壓制粒，主壓力5MPa，側壓力0.5MPa，制成0.2～0.3cm的顆粒，過篩，篩去60目以上的細粉，細粉再同法制粒。制得的孢子粉顆粒，置于超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為25MPa，溫度40℃，一級分離10MPa、42℃，二級分離5MPa、32℃。連續(xù)萃取3小時后，于分離器中收集孢子油，得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的復合靈芝孢子油764.8g，收率15.30％。其中總有機酸的含量為97.36％，總靈芝酸的含量為1.67％，酸值為8.7。
實施例2取破壁率在95％以上的赤芝的靈芝孢子粉5kg，加入淀粉50g，用與實施例1相同的實驗條件與方法萃取，得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的純靈芝孢子油905.1g，收率18.21％。其中總有機酸的含量為93.73％，總靈芝酸的含量為0.42％，酸值為13.9。得到的純靈芝孢子油與實施例1的復合靈芝孢子油比較，復合靈芝孢子油中總靈芝酸的含量明顯較高。
實施例3取破壁的靈芝孢子粉6kg、粉碎為180目的靈芝菌絲體粉3kg，加入糊精45g，混合均勻，用干壓制粒機直接干壓制粒，主壓力8MPa，側壓力0.8MPa，制成0.1～0.2cm的顆粒，過篩，篩去60目以上的細粉，細粉再同法制粒。制得的復合孢子粉顆粒，置于超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為34MPa，溫度30℃，一級分離9MPa、38℃，二級分離4MPa、28℃。連續(xù)萃取2.5小時后，于分離器中收集孢子油，得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的復合靈芝孢子油1482.3g，收率16.47％。其中總有機酸的含量為98.55％，總靈芝酸的含量為1.32％，酸值為10.5。
實施例4取破壁的靈芝孢子粉3kg、粉碎為250目的靈芝菌絲體粉6kg，加入淀粉108g，混合均勻，用干壓制粒機直接干壓制粒，主壓力6MPa，側壓力0.6MPa，制成0.2～0.3cm的顆粒，過篩，篩去60目以上的細粉，細粉再同法制粒。制得的復合孢子粉顆粒，置于超臨界二氧化碳萃取釜中，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為15MPa，溫度38℃，一級分離12MPa、40℃，二級分離5MPa、30℃。連續(xù)萃取4小時后，于分離器中收集孢子油，得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的復合靈芝孢子油1092.6g，收率12.14％。其中總有機酸的含量為96.93％，總靈芝酸的含量為1.94％，酸值為15.7。
實施例5取破壁的靈芝孢子粉6kg、粉碎為200目的靈芝子實體粉3kg，加入淀粉80g，混合均勻，用干壓制粒機直接干壓制粒，主壓力6MPa，側壓力0.7MPa，制成0.1～0.2cm的顆粒，過篩，篩去60目以上的細粉，細粉再同法制粒。制得的復合孢子粉顆粒，置于加裝了超聲提取裝置的超臨界流體萃取釜中提取，CO2經(jīng)高壓泵加壓，循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為26MPa，溫度35℃，當達到指示的溫度和壓力時，開啟超聲設備，超聲波的頻率為35kHz，功率為100W；一級分離9MPa、40℃，二級分離4MPa、34℃。連續(xù)萃取1.5小時后，于分離器中收集孢子油，得淡黃色具有孢子粉特殊氣味的復合靈芝孢子油1515.7g，收率16.84％。其中總有機酸的含量為98.31％，總靈芝酸的含量為1.58％，酸值為11.3。
實施例6復合靈芝孢子油的藥效學實驗試驗條件樣品按上述工藝分別以復合靈芝孢子粉(靈芝菌絲體粉∶靈芝孢子粉＝1∶1)、純靈芝孢子粉獲得的復合靈芝孢子油、純靈芝孢子油作為供試樣品。
實驗動物與環(huán)境條件清潔級昆明種雌性小鼠96只，體重為18g～22g，由南方醫(yī)科大學動物養(yǎng)殖場提供。每48只分為1組，共二組。I組進行遲發(fā)型變態(tài)反應實驗、半數(shù)溶血值(HC50)的測定和抗體生成細胞數(shù)的測定；II組進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗測定。實驗溫度23℃～24℃，濕度58％～60％。
劑量選擇及樣品處理據(jù)人體口服推薦量，按60公斤成人為0.04g/kg·bw設計，設純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油劑量分別為0.80g/kg·bw(分別相當于人體推薦劑量的20倍)。分別取樣品4.50g加豆油定容配成所需濃度受試液，對照組予以等體積的豆油，分別給予受試動物灌胃，每天一次，灌胃體積為0.2ml/10g·bw，連續(xù)30d。
實驗方法根據(jù)國家《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》(2003版)進行。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計所得數(shù)據(jù)采用SAS軟件進行分析。
1.純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油對小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應的影響見表1。
表1、對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響

由表1可知，經(jīng)口給予小鼠純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油30d，劑量組小鼠足跖腫脹度與對照組比較，差異具有顯著性，且復合靈芝孢子油組差異更顯著。
2.純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油對小鼠ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力實驗的影響，見表2。
表2、對小鼠ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力實驗的影響

由表2可知，經(jīng)口給予純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油30d，劑量組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力與對照組比較，差異具有顯著性，且復合靈芝孢子油組差異更顯著。
3.純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響，見表3。
表3、對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響

由表3可知，經(jīng)口給予小鼠純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油30d，劑量組小鼠抗體生成細胞數(shù)與對照組比較，差異具有顯著性。
4.純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油對小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響，見表4。
表4、對小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響

由表4可知，經(jīng)口給予小鼠純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油30d，劑量組小鼠半數(shù)溶血值與對照組比較，差異具有顯著性，且復合靈芝孢子油組差異更顯著。
5.結論純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油經(jīng)口給予小鼠0.80g/kg·bw劑量，均能提高小鼠的半數(shù)溶血值、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)能力、ConA誘導的淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力、增加抗體生成細胞數(shù)，且復合靈芝孢子油比純靈芝孢子油作用更強。依據(jù)《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》中免疫調(diào)節(jié)作用的判定標準，可以認為純靈芝孢子油、復合靈芝孢子油均具有增強免疫力功能。
權利要求
1.一種復合靈芝孢子油，其特征在于含有甘油三酯類、脂肪酸類和靈芝酸類，其總有機酸含量以油酸計大于或等于90％，總靈芝酸0.1～2.5％，酸價小于或等于25。
2.權利要求1所述復合靈芝孢子油的制備方法，其特征是以靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉與靈芝孢子粉組成的復合靈芝孢子粉為原料，采用超臨界流體萃取或超聲強化超臨界流體萃取其油狀復合脂質(zhì)物質(zhì)，即為復合靈芝孢子油。
3.如權利要求2所述的復合靈芝孢子油的制備方法，其特征在于所述超臨界流體萃取的流體為CO2，萃取溫度為21～42℃，萃取壓力為10～34Mpa，萃取時間為1～5小時，萃取流量為32～58kg/h；采用二級分離，分離的條件是一級解析器壓力為9～13Mpa，二級解析器壓力為4～6MPa。
4.如權利要求2所述的復合靈芝孢子油的制備方法，其特征在于所述超聲強化超臨界流體萃取的流體為CO2，萃取溫度為21～42℃，萃取壓力為10～34Mpa，萃取時間為1～5小時，萃取流量為32～58kg/h；采用二級分離，分離的條件是一級解析器壓力為9～13Mpa，二級解析器壓力為4～6Mpa；超聲頻率為25～60kHz，功率為60～800W。
5.如權利要求2所述的復合靈芝孢子油的制備方法，其特征在于所述的靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉與靈芝孢子粉的重量比為靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉∶靈芝孢子粉＝0.5～3∶1。
6.如權利要求2所述的復合靈芝孢子油的制備方法，其特征在于所述的靈芝菌絲體粉或靈芝子實體粉是指將靈芝菌絲體粉碎至大于或等于120目的細粉，所述靈芝孢子粉是指將靈芝孢子破壁至破壁率≥95％的靈芝孢子粉。
7.如權利要求2所述的復合靈芝孢子油的制備方法，其特征在于先往復合靈芝孢子粉原料中加入0.2％～1.2％的淀粉或糊精，混合均勻，采用制粒機干壓制成粒徑大小為0.1～0.3cm的顆粒，再進行超臨界萃取或超聲強化超臨界萃取。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復合靈芝孢子油及其制備方法。本發(fā)明以破壁的靈芝孢子粉復合粉碎的靈芝菌絲體或靈芝子實體組成的復合靈芝孢子粉為原料，干壓一步制粒后，置于萃取釜，通入處于超臨界狀態(tài)的CO
文檔編號C11B1/00GK1944609SQ20061012292
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月20日 優(yōu)先權日2006年10月20日
發(fā)明者吳敏, 李穎, 黃光華 申請人:吳敏, 李穎, 黃光華