專利名稱：α-淀粉酶混合物和使用所述混合物的方法
α-淀粉酶混合物和使用所述混合物的方法相關(guān)申請(qǐng)的交互參考本申請(qǐng)要求2008年9月25日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/100，092和2009 年9月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/238，891的優(yōu)先權(quán)，所述每個(gè)臨時(shí)專利申請(qǐng)以其整體引入作為參考。序列表本文附帶包含SEQ ID NO :1_20的序列表，并將序列表以其整體引入作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域本文描述了嗜熱脂肪土芽孢桿菌(GecAacillus stearothermophilus) α -淀粉酶和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α-淀粉酶的混合物。本文所描述的α -淀粉酶混合物適合于多種應(yīng)用例如淀粉液化和糖化、乙醇生產(chǎn)和/或增甜劑生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 1)構(gòu)成一組催化淀粉及其他線型或分支1，4_糖苷寡糖和多糖水解的酶。淀粉酶可以商業(yè)地用于淀粉加工的初始階段(液化)中；用于谷物濕磨工藝中； 用于醇生產(chǎn)中；用作為洗滌劑基質(zhì)中的清潔劑；在紡織工業(yè)中用于淀粉退漿；用在焙烘應(yīng)用中；用于飲料工業(yè)；用于油田的鉆井工藝中；用于再循環(huán)紙張的脫墨中和用于動(dòng)物飼料中。α-淀粉酶分離自多種多樣的細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物源。許多工業(yè)上重要的 α-淀粉酶分離自芽孢桿菌屬的某些物種(Bacillus sp.)，部分因?yàn)檠挎邨U菌屬分泌淀粉酶到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的能力普遍較高。此外，存在α-淀粉酶的混合物或其變體的需要，其可以利用來(lái)自至少兩種細(xì)菌菌株的至少兩種α-淀粉酶的最佳特性。例如，由于快速的黏性降低特性，分離自嗜熱脂肪芽孢桿菌 (B. stearothermophilus)的α -淀粉酶(AmyS)已經(jīng)在燃料乙醇應(yīng)用中使用。燃料乙醇工廠在漿液經(jīng)歷噴射蒸煮(jet cooking)步驟前具有20-30分鐘的漿化時(shí)間，并且必需在這 20-30分鐘內(nèi)破壞粘度以使?jié){液無(wú)障礙管流。然而，某些α -淀粉酶或其變體不是熱穩(wěn)定的，因此當(dāng)隨時(shí)間降低漿液的粘度時(shí)，它們?cè)诖渭?jí)液化中經(jīng)歷了更低的DE斜度(DE slope) 和更低的粘度降低，在所述次級(jí)液化中漿液可能保持在85-90°C直到90-120分鐘。因此，在工業(yè)中存在鑒定和優(yōu)化淀粉酶和它們的混合物的需要，所述淀粉酶和它們的混合物在多種生產(chǎn)工藝，例如商業(yè)化淀粉液化工藝和乙醇生產(chǎn)工藝中是有用的。低粘度淀粉液化物(starch liquefact)在當(dāng)前的乙醇生產(chǎn)工藝中是有用的。如果發(fā)現(xiàn)了使用優(yōu)化的α-淀粉酶或其變體的混合物來(lái)產(chǎn)生作為發(fā)酵原料的該低粘度液化物的方法，那么這對(duì)本領(lǐng)域?qū)⑹欠浅Ｓ杏玫呢暙I(xiàn)。此外，如果發(fā)現(xiàn)了用來(lái)自兩種不同細(xì)菌物種的α -淀粉酶或其變體的混合物處理全磨谷物以改善淀粉液化的方法，那么這對(duì)本領(lǐng)域也將是非常有用的貢獻(xiàn)。
在制備發(fā)酵原料中另外的挑戰(zhàn)是，發(fā)現(xiàn)來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，例如在水解線性淀粉酶中不太有效，在酵母發(fā)酵條件下造成了退變的不溶性殘余淀粉。已經(jīng)將在酵母發(fā)酵肉湯中的高水平殘余淀粉認(rèn)作為是影響蒸發(fā)器結(jié)垢的主要因素之一，所述蒸發(fā)器結(jié)垢影響乙醇工藝生產(chǎn)中下游工藝的運(yùn)行。因此，如果發(fā)現(xiàn)了可以使用優(yōu)化的α-淀粉酶或其變體的混合物來(lái)降低發(fā)酵肉湯中的殘余不可溶性淀粉的方法，那么這對(duì)本領(lǐng)域也將是有用的貢獻(xiàn)。發(fā)明概述描述了在發(fā)酵工藝中對(duì)全磨谷物的液化方法。方法包括將含有全磨谷物的含水漿液與來(lái)自至少兩種不同細(xì)菌物種的淀粉液化α-淀粉酶的混合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含α -淀粉酶混合物，所述α -淀粉酶混合物包含 (i)使用在SEQ ID NO :2中所示的氨基酸編號(hào)系統(tǒng)的，其中替換了 S242處氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(AmyS)；和(ii)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶?；旌衔锟梢赃M(jìn)一步包含植酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用重量比為大約40%的具有S242替換的AmyS和大約 60%的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶。以這種方式，每種酶的優(yōu)良特性，淀粉液化物的快速粘度降低和熱穩(wěn)定性，可以分別在發(fā)酵醇的方法中得到充分利用。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 具有S242替換的AmyS與地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的重量比為10 90，以在制作增甜劑的方法中充分利用酶的特性。在其他的實(shí)施方案中，具S242替換的AmyS與地衣芽孢桿菌 α -淀粉酶的重量比可以為 5 95,15 85,20 80,25 75,30 70,50 50,60 40、 70 30,75 25,80 20,85 15,90 10 或者它們的中間值。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用大約1400AAU/g至大約14000AAU/g的具有S242 替換的AmyS和大約8000LU/g至大約19000LU/g地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的活度比率。具有S242替換的AmyS與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的比率可以為1400AAU/g 14000LU/g、 2000AAU/g 15000LU/g、2100AAU/g 16000LU/g、1900AAU/g 17000LU/g 或者它們的中間值。在其他實(shí)施方案中，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶與具有S242替換的AmyS的比率為大約5. 5LU/AAU至大約9. 5LU/AAU。地衣芽孢桿菌α -淀粉酶與具有S242替換的AmyS的活度比率在大約0. 1LU/AAU至大約9. 5LU/AAU的范圍內(nèi)。例如活度比率可以為0. 1LU/AAU、 0. 2LU/AAU、0. 3LU/AAU、0. 4LU/AAU、0. 5LU/AAUU. OLU/AAUU. 5LU/AAU、2. 0LU/AAU、2. 5LU/ AAU、3. 0LU/AAU、4. 0LU/AAU、5. 0LU/AAU、5. 5LU/AAU、6. 0LU/AAU、6. 5LU/AAU、7. OLU/AAU、 7. 5LU/AAU、8. OLU/AAU、8. 5LU/AAU、9. OLU/AAU、9. 5LU/AAU 或者它們的中間值。AmyS可以包含SEQ ID NO :1或者SEQ ID NO :2的多肽序列，其中替換了 S242 殘基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，AmyS包含在SEQ ID NO :4中所述的氨基酸序列，其與 SPEZYME ^ra (SEQ ID NO 2)比較具有S242Q替換。在本文中，將這種酶命名為 "AmyS SM2Q”或者僅為“S242Q”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，AmyS可以選自包含SEQ ID NO :6、 7、8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一，其中替換了 S242殘基。S242 替換可以是S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H或者S242N替換。在一個(gè)實(shí)施方案中，在S242位置處的氨基酸替換改變了 AmyS的熱穩(wěn)定性。具有在S242位置處替換的AmyS與在S242位置處沒(méi)有替換的AmyS比較，在約80°C至約95°C之間具有更高的熱穩(wěn)定性。
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在一個(gè)實(shí)施方案中，AmyS包含與SEQ ID NO 1的AmyS具有至少60%、70%、80%、 85 %、90 %、95 %、98 %或99 %序列同一性的氨基酸序列，其中AmyS具有α -淀粉酶活性。 AmyS可以包含使用SEQ ID NO 1用于編號(hào)，在氨基酸位置349和4 處的半胱氨酸的替換。 AmyS也可以包含N193和/或V416的替換。AmyS還可以包含使用SEQ ID NO :1用于編號(hào)， 在氨基酸位置179和180處的缺失。AmyS酶與野生型AmyS比較可以具有改變的氨基酸序列，所述AmyS酶改變了一種或多種酶的特性，例如，底物特異性、底物結(jié)合、底物剪切模式、熱穩(wěn)定性、PH/活性譜、pH/ 穩(wěn)定性譜、對(duì)氧化的穩(wěn)定性、Ca2+依賴性和/或比活性。例如，與野生型AmyS比較，改變可能導(dǎo)致酶具有降低的Ca2+依賴性和/或改變的pH/活性譜和/或熱穩(wěn)定性。地衣芽孢桿菌α -淀粉酶可以是純化的野生型酶。地衣芽孢桿菌α -淀粉酶可以具有對(duì)野生型序列的選自M15T、H133Y、m88S和A209V的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含顯示于SEQ ID Ν0:20中的氨基酸序列，其也稱為SPEZYME FRED。在一個(gè)實(shí)施方案中，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含與 SPEZYME FRED(SEQ ID NO 20)具有至少 60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明的酶的DNA構(gòu)建體，涉及制備和純化酶的方法，以及涉及酶在多種工業(yè)工藝，例如淀粉液化或者增甜劑生產(chǎn)中的用途在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及使用α-淀粉酶(AA)活性和植酸水解酶(FTU或者植酸酶)水解可溶性淀粉底物，其中AAU FTU的比率為大約1 15至大約15 1，優(yōu)選地從1 10至大約10 1。在一個(gè)實(shí)施方案中，AAU FTU的比率為從1 4至3 1。在另外的實(shí)施方案中，AAU FTU的比率為1 1。植酸酶可以是來(lái)自任一來(lái)源的野生型酶。 植酸水解酶可以是細(xì)菌植酸酶或者真菌植酸酶。真菌植酸酶可以是曲霉屬(Aspergillus) 植酸酶或者布丘氏菌屬(Buttiauxella)植酸酶。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌植酸酶來(lái)自大腸桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，植酸酶可以包含SEQ ID NO :19的氨基酸序列。提供了用于液化淀粉的方法，包括將上述淀粉酶混合物添加到包含淀粉的溶液中，并液化包含淀粉的溶液。對(duì)于該應(yīng)用，優(yōu)選的淀粉酶混合物具有大約40% (按AAU/g DS)的具有S242替換的AmyS和大約60% (按LU/g DS)的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的活度比率。可使用用于該應(yīng)用的其他比率，例如為15 85,20 80,30 70,50 50,60 40、 70 30,80 20 和 85 15。淀粉底物可以獲自玉米、買羅高梁(milo)、黑麥、大麥、小麥、高粱或者燕麥。淀粉的其他來(lái)源包括其他谷物、牧草、塊莖和根并且更具體是稻、糠、木薯(cassava)、谷子、馬鈴薯、甘薯和木薯粉(tapioca)。底物可以包括植物材料，例如來(lái)自干磨法或濕磨法的顆粒淀粉。該方法可以包括初級(jí)和/或次級(jí)液化步驟，包括在初級(jí)和/或次級(jí)液化步驟中添加額外的底物到漿液中。該方法可以包括使用進(jìn)一步包含植酸水解酶的淀粉酶混合物。也提供了用于糖化液化的淀粉以獲得可發(fā)酵糖的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括在合適的發(fā)酵條件下發(fā)酵可發(fā)酵糖以獲得終產(chǎn)物如醇。通過(guò)本方法產(chǎn)生的醇包括例如乙醇和丁醇。在另外的方面中，本發(fā)明涉及并不需要添加酸或堿來(lái)調(diào)節(jié)pH的淀粉轉(zhuǎn)化工藝和/ 或乙醇發(fā)酵工藝。一個(gè)實(shí)施方案涉及無(wú)PH調(diào)節(jié)的液化步驟，其中液化的pH范圍為pH4. 5至PH5. 4，并且并不添加酸中和化學(xué)物質(zhì)到液化工藝步驟中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，液化的 PH為pH4. 8至pH5. 8，并且并不添加酸中和化學(xué)物質(zhì)到液化工藝步驟中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將含有顆粒淀粉的磨碎谷物漿液與植酸水解酶和上述的α -淀粉酶混合物在比淀粉凝膠化溫度低0°C至30°C的溫度接觸，升高溫度到凝膠化溫度以上，水解凝膠化的淀粉，并獲得可發(fā)酵底物。在另一方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法，包括a)將磨碎的含有淀粉的材料與水和稀釜餾物混合，其中稀釜餾物是10至70% ν/ν范圍，并且獲得包含淀粉及具有 20至干固體(ds)含量的漿液，b)用植酸酶在液化淀粉之前或與之同時(shí)處理該漿液，c)液化該淀粉，d)在步驟b)期間和/或與液化步驟同時(shí)地添加上述α-淀粉酶混合物至所述淀粉和e)糖化液化的淀粉以獲得可發(fā)酵糖，其中在步驟a)、b)、c)、d)或e)的任意步驟期間不調(diào)節(jié)PH。在一些實(shí)施方案中，將可發(fā)酵糖回收和純化或異構(gòu)化。在其他實(shí)施方案中，在液化步驟之前添加植酸酶。在另外的實(shí)施方案中，α-淀粉酶混合物隨植酸酶一起添加。又在另外的實(shí)施方案中，在液化步驟期間添加或者在糖化步驟期間添加第二份α-淀粉酶混合物劑量。在另外的方面，本發(fā)明涉及從含有淀粉的材料中產(chǎn)生醇的方法，包括液化和糖化如上所述的淀粉底物以獲得可發(fā)酵糖，并在合適的發(fā)酵條件下進(jìn)一步發(fā)酵可發(fā)酵糖以獲得醇。在一些實(shí)施方案中，糖化和發(fā)酵步驟是同時(shí)進(jìn)行的。在一些實(shí)施方案中，醇是乙醇或者丁醇。在另外的實(shí)施方案中，上述淀粉酶混合物可以用于轉(zhuǎn)化低粘度液化物成增甜劑例如葡萄糖、高果糖玉米糖漿等。用于該應(yīng)用的優(yōu)選的淀粉酶混合物具有大約15% (作為 AAU/g DS)的具有S242替換的AmyS和大約85% (作為L(zhǎng)U/g DS)地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的活度比率。其他比率可以用于該應(yīng)用，例如5 95,10 90和20 80以及它們的中間值。用于產(chǎn)生增甜劑的方法可以包括將淀粉底物與上述淀粉酶混合物接觸，液化淀粉底物，并高溫溫育底物以產(chǎn)生包含葡萄糖的產(chǎn)物。溫育步驟可以是次級(jí)液化步驟。該溫育步驟可以在約90-100°C例如95°C的溫度進(jìn)行。可以進(jìn)行足夠的時(shí)間的溫育以使產(chǎn)物包含大約2-14DE的葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)物包含大約IODE的葡萄糖。用于產(chǎn)生增甜劑的方法進(jìn)一步可以包括糖化產(chǎn)物以產(chǎn)生富含葡萄糖的溶液。富含葡萄糖的溶液可以包含 80-99%的葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，富含葡萄糖的溶液包含大約93-96%的葡萄糖。糖化可以包括將葡萄糖產(chǎn)物與葡糖淀粉酶或者酶混合物例如包含葡糖淀粉酶和支鏈淀粉酶的 OPTIMAX 4060-VHP 接觸。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1D顯示了通過(guò)比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)的在其他親本SPEZYME )(tra樣α -淀粉酶中相對(duì)應(yīng)的位置。應(yīng)當(dāng)指出，SEQ ID NO :4是AmyS S242Q。AmyS S242A、AmyS S242E 分別為所述的SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :5。圖 2 顯示了 pHPLT-AmyS 質(zhì)粒。圖3顯示了 S242文庫(kù)變體在95°C熱應(yīng)激30分鐘后的殘余活性百分比。變體在 P、S、W和Y位置處缺失并通過(guò)野生型AmyS ( "wt")替代。SPEZYME )Ctra對(duì)照標(biāo)記為“Ζ”。另一陽(yáng)性對(duì)照，具有Δ 179-180缺失和C末端四個(gè)氨基酸截短的AmyS (SEQ IDNO 16)也顯示了( “$”)。SM2A和S242Q比野生型明顯顯示出更高的殘余活性。圖 4A-4I 顯示了 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 14 的配對(duì)比對(duì)。圖5顯示在沒(méi)有鈣添加的情況下野生型和淀粉酶變體的熱熔融曲線和熔點(diǎn)。圖6顯示在有鈣的情況下野生型和淀粉酶變體的熱熔融曲線和熔點(diǎn)。圖7顯示SPEZYME )Ctra和兩種變體相對(duì)于Liquozyme SC在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活性斷面圖。圖8 顯示因 30 μ g 劑量的 α -淀粉酶 Liquozyme SC、SPEZYME Ethyl 或 SPEZYME )(tra的作用所致的谷物粉粘度降低。圖9顯示因30 μ g劑量的α -淀粉酶Liquozyme SC或SPEZYME ^ra或兩種變體(SM2A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。圖10 顯示因 20 μ g 劑量的 α -淀粉酶 Liquozyme SC 或SPEZYME )(tra 或兩種變體(SM2A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。圖11 顯示用 Liquozyme SC、SPEZYME ^ra 或兩種變體(SM2A 和 S242Q) 之一經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(0、30、60和90分鐘)處理的全磨谷物的DE進(jìn)展。圖12 顯示用 Liquozyme SC、SPEZYME )(tra 或兩種變體(SM2A 和 S242Q) 之一經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(0、30、60和90分鐘)處理的全磨谷物的噴射之后粘度。圖13 顯示用 AmyS S242Q(SEQ ID NO 4)禾PSPEZYME FRED 的混合物以及單獨(dú)的每種酶在85-90°C經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(30、60、90和120分鐘)在分批液化工藝中處理全磨谷物的DE進(jìn)展。圖14 顯示用 AmyS S242Q(SEQ ID NO 4)禾PSPEZYME FRED 的混合物以及單獨(dú)的每種酶在85-90°C經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(30、60、90和120分鐘)在分批液化工藝中處理全磨谷物的漿液粘度。圖15顯示在SEQ ID NO 20中描述的SPEZYME FRED的氨基酸序列。圖16 顯示來(lái)自使用 AmyS S242Q (SEQ ID NO 4)禾PSPEZYME FRED 的混合物的淀粉底物的DE進(jìn)展。發(fā)明詳述提供了親本嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體和來(lái)自地衣芽孢桿菌的熱穩(wěn)定性α-淀粉酶的混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，α-淀粉酶混合物含有按活性為AAU/g DS的至少大約50%的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體酶。優(yōu)選的范圍是按活性為AAU/ g DS的大約10%至大約90%的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體酶。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將使用大約10%至大約70% (按AAU/g DS)的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶和大約30%至大約90% (按LU/g DS)的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的活度比率，以使每一菌株的優(yōu)良特性，即淀粉液化物的快速粘度降低和熱穩(wěn)定性，分別得以利用。親本嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體和來(lái)自地衣芽孢桿菌的熱穩(wěn)定性α -淀粉酶的混合物具有與加工淀粉液化物有關(guān)的其他有利的特性，例如DS水平、ρΗ、鈣含量、以及液化和蒸煮溫度。例如，在某些實(shí)施方案中，DS水平的范圍可以為大約32%至大約40%， 或者更高。在另一方面，淀粉液化物中的PH的范圍可以為大約ρΗ5. 5至大約ρΗ6.0。鈣水平的范圍可以多達(dá)大約IOppm添加的鈣。Tjet的范圍可以為大約100°C至大約110°C，而Th。ld 的范圍可以為大約85°C至大約95°C。這些工藝可以包括淀粉液化至產(chǎn)生增甜劑例如葡萄糖糖漿，例如高果糖玉米糖漿。盡管這些工藝更特別地應(yīng)用于增甜劑的生產(chǎn)，但是在一些實(shí)施方案中，該工藝可以應(yīng)用于發(fā)酵原料的生產(chǎn)。因此，如下更詳細(xì)的說(shuō)明，產(chǎn)生為發(fā)酵原料的液化物可以用于發(fā)酵工藝中以產(chǎn)生有用的終產(chǎn)物，包括乙醇和丁醇。在一些方面，本發(fā)明依賴于遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域中使用的常規(guī)技術(shù)和方法。以下資源包括對(duì)根據(jù)本發(fā)明有用的一般方法學(xué)的描述Sambrook等人，MOLE⑶LAR CLONING :A LABORATORY MANUAL(第二 版，1989) ；Kreigler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION ；A LABORATORY MANUAL (1990)和 Ausubel 等人編著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLE⑶LAR BIOLOGY(1994)。這些通用參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。 然而，不意圖使本發(fā)明限于所描述的任何具體方法、方案和試劑，因而這些可以變動(dòng)。除非本文另外定義，本文中所用的全部技術(shù)術(shù)語(yǔ)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同意義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第 2 版，John Wiley and Sons, New York(1994)；以及 Hale 和 Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)向技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的眾多術(shù)語(yǔ)的通用字典。盡管可以在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明中使用與本文中所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料，然而描述了優(yōu)選的方法和材料?，F(xiàn)在本發(fā)明將僅通過(guò)引用的方式使用以下定義和實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。通過(guò)引用的方式明確并入全部專利和出版物，包括此類專利和出版物中公開(kāi)的全部序列，作為參考。數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)字在內(nèi)。除非另外說(shuō)明，分別將核酸序列從左至右以5’至3’方向顯示；將氨基酸序列從左至右以氨基至羧基方向顯示。本文中提供的標(biāo)題不限制本發(fā)明的多個(gè)方面或?qū)嵤┓桨福梢詫⑵湟哉w引入本說(shuō)明書，作為參考。定義如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“淀粉”指包含植物的復(fù)雜多糖碳水化合物的任意物質(zhì)，其包含具有式(C6HltlO5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任意數(shù)字。具體而言，該術(shù)語(yǔ)指來(lái)自包括但不限于谷物、牧草、塊莖和根并且更具體地來(lái)自小麥、大麥、玉米、黑麥、燕麥、高梁、買羅高梁、稻、高粱、糠、木薯(cassava)、谷子、馬鈴薯、甘薯和木薯粉(tapioca)的任一基于植物物質(zhì)的直鏈淀粉和/或支鏈淀粉。術(shù)語(yǔ)“α-淀粉酶(例如EC 3. 2. 1. 1類)”指催化α _1，4_糖苷鍵水解的酶。也已經(jīng)將這些酶描述為在含有1，4- α -連接的D-葡萄糖單位的多糖中實(shí)現(xiàn)1，4- α -D糖苷鍵的外切水解或者內(nèi)切水解的那些酶。用于描述這種酶的另一術(shù)語(yǔ)是“糖原酶”。示例性酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶(alpha-l，4_glucan 4-glucanohydrase)葡聚糖水解 Sl (glucanohydrolase)。當(dāng)涉及細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組”指通過(guò)導(dǎo)入異源核苷酸或蛋白質(zhì)或者改變天然核苷酸或蛋白質(zhì)而被修飾的細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體，或從如此修飾的細(xì)胞衍生的細(xì)胞。因而，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然(非重組)形式中不存在的基因或可以表達(dá)本來(lái)異常表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。
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術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文可互換地使用。本文中使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母或三字母代碼?！靶盘?hào)序列”意指與蛋白質(zhì)的氨基端部分結(jié)合的氨基酸序列，所述氨基酸序列促進(jìn)該蛋白質(zhì)的成熟形式分泌到細(xì)胞外。信號(hào)序列的定義是功能性的。胞外蛋白的成熟形式缺少在分泌過(guò)程期間被切除的信號(hào)序列。“基因”指參與產(chǎn)生多肽的DNA區(qū)段并包括在編碼區(qū)之前及之后的區(qū)域以及各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。術(shù)語(yǔ)“核酸”包括DNA、RNA、它們的單鏈或雙鏈和化學(xué)修飾物。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文可互換地使用。因?yàn)檫z傳密碼是簡(jiǎn)并的，所以多個(gè)密碼子可以用于編碼特定的氨基酸，并且本發(fā)明包括編碼特定氨基酸序列的多核苷酸?！拜d體”指設(shè)計(jì)的將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型的核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、盒等。如本文中所用的“表達(dá)載體”意指包含與適宜調(diào)控序列有效連接的DNA序列的DNA 構(gòu)建體，其中所述的調(diào)控序列能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA在合適宿主中的表達(dá)。此類調(diào)控序列可以包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制轉(zhuǎn)錄的任選操縱基因序列、編碼mRNA上的合適核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子和控制轉(zhuǎn)錄及翻譯終止的序列?！皢?dòng)子”是參與結(jié)合RNA聚合酶以啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子里氏木霉 (Trichoderma reesei)cbhl0“在轉(zhuǎn)錄調(diào)控下”是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語(yǔ)，指多核苷酸序列通常是DNA序列的轉(zhuǎn)錄取決于與其有效連接的元件，所述元件有助于轉(zhuǎn)錄的起始或者促進(jìn)轉(zhuǎn)錄?！霸诜g調(diào)控下”是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語(yǔ)，指在mRNA已經(jīng)形成后發(fā)生的調(diào)節(jié)過(guò)程。如本文中所用，當(dāng)描述蛋白質(zhì)和編碼它們的基因時(shí)，用于該基因的術(shù)語(yǔ)一般用斜體(例如，編碼amyL(地衣芽孢桿菌AA)的基因可以表示為amyL)。用于蛋白質(zhì)的術(shù)語(yǔ)一般不用斜體并且首字母通常大寫(例如，由amyL基因編碼的蛋白質(zhì)可以表示為AmyL或 amyL)。術(shù)語(yǔ)“衍生的”包括術(shù)語(yǔ)“源自”、“獲得”或“從......可獲得”和“從......分離”。術(shù)語(yǔ)“有效連接的”指這樣的接近，其中諸元件處在允許它們功能性地聯(lián)系的排列中。例如，如果一個(gè)啟動(dòng)子能夠控制序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子與此編碼序列有效連接。術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”指這樣的基因，該基因能夠在宿主中表達(dá)并允許容易地選擇含有導(dǎo)入了核酸或載體的那些宿主。選擇標(biāo)記的例子包括但不限于抗微生物物質(zhì)(例如潮霉素、博來(lái)霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝優(yōu)勢(shì)如營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)的基因。多核苷酸或多肽與另一個(gè)序列具有某個(gè)序列同一性百分?jǐn)?shù)(例如80%、85%、 90%、95%或99% )意指當(dāng)比對(duì)時(shí)，在比較的這兩個(gè)序列中堿基或氨基酸殘基是相同的時(shí)的百分?jǐn)?shù)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任意合適軟件程序例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. Μ.等人(編著)1987，附錄30，第7. 7. 18部分)中描述的那些軟件程序確定這種比對(duì)結(jié)果和同源性或同一性百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的程序包括Vector NTI Advance 9. 0(lnvitrogen Corp. Carlsbad, CA)、GCG Pileup、FASTA (Pearson 等人(1988)Proc.Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448)和 BLAST(BLAST Manual，Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf.，Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)，Bethesda, Md.和 Altschul 等人， (1997)NAR25 :3389-3402)程序。另一種優(yōu)選的比對(duì)程序是優(yōu)選地使用默認(rèn)參數(shù)的ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)?？墒褂玫牧硪环N序列軟件程序是在序列軟件包6. 0版(Sequence Software Package Version6. 0)(威斯康星州麥迪遜威斯康辛大學(xué)Genetics Computer Group)中可獲得的TFASTA數(shù)據(jù)搜索程序。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到由本發(fā)明包括的序列也可以通過(guò)嚴(yán)格的雜交條件下與所例舉的amyS序列(例如WO 06/0(^643的SEQ ID NO 5)雜交的能力進(jìn)行定義。當(dāng)單鏈形式的核酸可以在適宜的溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下與另一種核酸復(fù)性時(shí)，則該核酸可與另一種核酸序列是可雜交的。雜交和洗滌條件是本領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)，例如上文的 Sambrook (1989)，尤其第9和11章)。在一些實(shí)施方案中，嚴(yán)格條件對(duì)應(yīng)于65°C的Tm和 0. 1XSSC,0. 1% SDS?！八拗骶辍被颉八拗骷?xì)胞”意指用于表達(dá)載體或DNA構(gòu)建體的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建體包含編碼根據(jù)本發(fā)明的變體α-淀粉酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是細(xì)菌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，“宿主細(xì)胞”意指從微生物株特別是芽孢桿菌屬的某些物種的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”指在合適的條件下在液體或者固體培養(yǎng)基中培育微生物細(xì)胞群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)指將含有淀粉底物的顆粒淀粉發(fā)酵性生物轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物(一般在容器或反應(yīng)器中)。發(fā)酵是由微生物酶促地和厭氧地分解有機(jī)物質(zhì)以產(chǎn)生更簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。盡管發(fā)酵在厭氧的條件下進(jìn)行，然而意圖該術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)不限于嚴(yán)格厭氧條件，因?yàn)榘l(fā)酵也在氧存在下發(fā)生。術(shù)語(yǔ)“接觸”指將分別的酶放置在足夠靠近各自的底物的地方以使酶能轉(zhuǎn)化底物成終產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，酶與各自的底物的混合溶液可以實(shí)現(xiàn)接觸。術(shù)語(yǔ)“酶轉(zhuǎn)化”一般指通過(guò)酶作用修飾底物。如本文中所用的該術(shù)語(yǔ)也指通過(guò)酶的作用修飾淀粉底物。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“糖化”指淀粉經(jīng)酶轉(zhuǎn)化成葡萄糖或者其他低分子量多糖。術(shù)語(yǔ)“凝膠化”意指增溶淀粉分子，通過(guò)蒸煮以形成粘性混懸液。術(shù)語(yǔ)“液化”指淀粉轉(zhuǎn)化中水解凝膠化淀粉以產(chǎn)生低分子量可溶性糊精的階段。術(shù)語(yǔ)“聚合程度(DP) ”指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單元的數(shù)目(n)。DPI的例子是單糖類，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖類，如麥芽糖和蔗糖。DP > 3指具有大于3的聚合程度的聚合物。術(shù)語(yǔ)“終產(chǎn)物”或“目的終產(chǎn)物”指從淀粉底物以酶方式轉(zhuǎn)化而來(lái)的任一碳源來(lái)源的分子產(chǎn)物。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“酶單位”指在測(cè)定法的條件下每給定的時(shí)間量產(chǎn)生給定的產(chǎn)物量的酶的量。在一些實(shí)施方案中，酶單位指在特定的測(cè)定法條件下每分鐘產(chǎn)生1微摩爾的產(chǎn)物的酶的量。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“葡糖淀粉酶活性單位” (GAU)定義為在pH 4. 2和60°C的測(cè)定法條件下每小時(shí)從可溶性淀粉底物ds)產(chǎn)生Ig葡糖糖所需的酶的量。α -淀粉酶活性(AAU)通過(guò)淀粉水解的速率測(cè)定，其反映為分光光度測(cè)量的碘著色能力降低的速率。細(xì)菌α-淀粉酶活性的一個(gè)AAU是在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解IOmg的淀粉所需的酶的量。α -淀粉酶活性也可以測(cè)定為可溶性淀粉單位(SSU)，并且基于酶樣品的等份試樣在pH 4.2、50°C水解可溶性馬鈴薯淀粉底物0%此)的程度。還原糖含量使用如在 Miller, G. L. (1959)Anal. Chem. 31 :426-428 中所述的 DNS 方法測(cè)量。以Liquefon單位(LU)表示的α -淀粉酶活性根據(jù)在USP 5，958，739中公開(kāi)的方法測(cè)量。簡(jiǎn)言之，該測(cè)定方法使用對(duì)硝基苯麥芽七糖苷作為底物，該底物具有化學(xué)封閉的非還原性末端糖。對(duì)硝基苯釋放的速率與α-淀粉酶活性成比例并在410nm監(jiān)測(cè)釋放。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照計(jì)算活性。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“干固體含量”(ds)指基于干重量的以％表示的漿液總固體。 術(shù)語(yǔ)“漿液”指含有不溶性固體的含水混合物。術(shù)語(yǔ)“殘余淀粉”指含淀粉的底物發(fā)酵后組合物中留下的任何殘留(可溶性或不可溶性)淀粉。如本文中所用，“再循環(huán)步驟”指糖化醪組分的再循環(huán)，所述糖化醪組分可以包括殘余淀粉、酶和/或微生物至包含淀粉的發(fā)酵底物。術(shù)語(yǔ)“糖化醪(mash) ”指水中用來(lái)產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如醇的可發(fā)酵碳源(碳水化合物) 的混合物。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵醪(beer)”和“糖化醪”可互換地使用。術(shù)語(yǔ)“釜餾物”意指未發(fā)酵的固體與水的混合物，其是從發(fā)酵的糖化醪去除醇后的殘余物。術(shù)語(yǔ)“蒸餾器干酒糟(distillers dried grain ;DDG) ”和“具有可溶物的蒸餾器干酒糟(distillers dried grain with solubles ；DDGS) ”指谷物發(fā)酵的有用副產(chǎn)物。如本文中所用，“產(chǎn)乙醇微生物”指具有將糖或者寡糖轉(zhuǎn)化成乙醇的能力的微生物。產(chǎn)乙醇微生物因其表達(dá)單獨(dú)地或共同將糖轉(zhuǎn)化成乙醇的一種或多種酶的能力而具有產(chǎn)乙醇性。如本文中所用，“乙醇生產(chǎn)者”或“產(chǎn)乙醇微生物”指能夠從己糖或戊糖產(chǎn)生乙醇的任何生物或細(xì)胞。通常，產(chǎn)乙醇細(xì)胞含有醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。產(chǎn)乙醇微生物的例子包括真菌微生物如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)菌株，特別是釀酒酵母 (S. cerevisiae)菌株。就多核苷酸或蛋白質(zhì)而言，術(shù)語(yǔ)“異源的”指不天然存在于宿主細(xì)胞中的多核苷酸或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)是商業(yè)重要的工業(yè)用蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括由天然存在的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。就多核苷酸或蛋白質(zhì)而言，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源的”指天然存在于宿主細(xì)胞中的多核苷酸或蛋白質(zhì)。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“回收的”、“分離的”和“分開(kāi)的”指從與其天然關(guān)聯(lián)的至少一種組分中移出的化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或者氨基酸。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)基因的”就細(xì)胞而言使用時(shí)， 意指該細(xì)胞具有整合到其基因組中作為經(jīng)多個(gè)世代仍保留的附加型質(zhì)粒的非天然(例如異源的)核酸序列。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指基于基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括
13轉(zhuǎn)錄和翻譯。在核酸序列插入細(xì)胞中的上下文中，術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”并且包括對(duì)核酸序列摻入真核或原核細(xì)胞的談及，其中所述核酸序列可以摻入該細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，被轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的 mRNA)。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“比活性”意指一種酶單位，其定義為在特定條件下每單位時(shí)間由酶制備物轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物的底物的摩爾數(shù)。比活性表示為單位(U)/mg的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”指使用本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的終產(chǎn)物或目的終產(chǎn)物的量。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該產(chǎn)量大于使用本領(lǐng)域已知方法所產(chǎn)生的產(chǎn)量。在一些實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)指終產(chǎn)物的體積，并且在其他實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)指終產(chǎn)物的濃度?！癆TCC”指位于弗吉尼亞州Manassas 20108的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)?！癗RRL”指美國(guó)伊利諾伊州皮奧里亞縣，國(guó)家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心，農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心(并且以前稱為USDA北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室)?！耙粋€(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)稱謂，除非上下文另外清楚地說(shuō)明并非如此。如本文中所用術(shù)語(yǔ)“包含”及其關(guān)聯(lián)詞以其包含……在內(nèi)的意義使用；即，等同于術(shù)語(yǔ)“包括”及其對(duì)應(yīng)的關(guān)聯(lián)詞。命名在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母或三字母代碼。出于引用方便，本發(fā)明的α-淀粉酶變體由以下命名描述原始氨基酸位置替換的氨基酸根據(jù)這種命名，例如將第242位置處用丙氨酸替換絲氨酸顯示為Ser242Ala 或 S242A將第30位置處的丙氨酸缺失顯示為Ala30*或 A30*或 ΔΑ30并且將額外氨基酸殘基如賴氨酸的插入顯示為
Ala30AlaLys 或 A30AK氨基酸殘基連續(xù)區(qū)段(如氨基酸殘基30-3 的缺失顯示為(30-33) *或 Δ (Α30-Ν33)。在特定α-淀粉酶與其他α-淀粉酶相比含有“缺失”并且在該位置內(nèi)產(chǎn)生插入的情況下，對(duì)于在第36位置插入天冬氨酸而言，這表示為*36Asp 或 *36D多個(gè)突變由加號(hào)隔開(kāi)，即Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表在30和34位置中將丙氨酸和谷氨酸分別替換為天冬酰胺和絲氨酸的突變。當(dāng)可以在一個(gè)給定位置插入一個(gè)或多個(gè)備選氨基酸殘基時(shí)，它表示為A30N, E 或者，A30N 或 A30E。另外，當(dāng)本文中鑒定到適合修飾的位置而未指出任何具體的修飾時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解任意氨基酸殘基可以替換該位置內(nèi)存在的氨基酸殘基。因而，例如，當(dāng)提到修飾在第30位置處的丙氨酸，但不具體說(shuō)明時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解該丙氨酸可以缺失或替換為任何其他氨基酸，即，以下任一氨基酸R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。另外，“Α30Χ”意指以下的任一替換A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、 A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y 或 A30V ；或簡(jiǎn)寫為A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。如果用于編號(hào)的親本酶已經(jīng)在該位置處具有建議替換的所討論氨基酸殘基，則使用以下的命名在例如一個(gè)N或V存在于野生型中的情況下，為“X30N”或“X30N，V”。因此，其意為其他相應(yīng)的親本酶在位置30被替換成“Asn”或“Val ”。氨基酸殘基的特征帶電荷的氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His帶負(fù)電荷的氨基酸(負(fù)電荷最多的殘基排在首位)Asp、Glu帶正電荷的氨基酸(正電荷最多的殘基排在首位)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Tyr> Trp、Met、Cys> Asn、Gin、Ser> Thr> Pro疏水性氨基酸殘基(疏水性最強(qiáng)的殘基排在最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe、Trp，親水性氨基酸(親水性最強(qiáng)的殘基排在最后)Thr、Ser、Cys、Gin、Asn0α-淀粉酶該淀粉酶混合物包含AmyS α -淀粉酶和地衣芽孢桿菌α -淀粉酶。AmyS酶可以包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的多肽序列，其中替換了 S242。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，AmyS包含在SEQ ID NO :4中所述的氨基酸序列，也稱為“AmyS S242Q”或“SM2Q”，其與 SPEZYME )(tra(SEQ ID NO 2)比較具有S242Q替換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，AmyS可以選自包含SEQ ID NO :6、7、8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一，其中替換 T S242殘基。S242 替換可以是S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H或者S242N替換。在一個(gè)實(shí)施方案中，在S242位置處的氨基酸替換改變了 AmyS的熱穩(wěn)定性。具有在S242位置處替換的AmyS與不具有S242替換的AmyS比較，可以具有在大約80°C至大約95°C之間的更高的熱穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，AmyS包含具有與SEQ ID NO :1的AmyS至少60 %、70 %、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或者99%序列同一性的氨基酸序列，其中AmyS具有α-淀粉酶活性。使用SEQ ID NO :1用于編號(hào)，AmyS可以包含在氨基酸349和似8處的半胱氨酸的替換。AmyS也可以包含W93和/或V416的替換。使用SEQ ID N0:1的編號(hào)， AmyS也可以包含氨基酸179和180的缺失。與野生型AmyS比較，具有改變的氨基酸序列的AmyS酶改變了酶的一種或多種特性，例如，底物特異性、底物結(jié)合、底物剪切模式、熱穩(wěn)定性、PH/活性譜、pH/穩(wěn)定性譜、對(duì)氧化的穩(wěn)定性、Ca2+依賴性和/或比活性。例如，與野生型AmyS比較，改變可能導(dǎo)致酶具有降低的Ca2+依賴性和/或改變的pH/活性譜和/或熱穩(wěn)定性。由芽孢桿菌屬某些物種產(chǎn)生的多種α -淀粉酶在氨基酸水平是高度同源(同一) 的。可以在下表1中找到多種已知芽孢桿菌α-淀粉酶的同一性百分?jǐn)?shù)。表1同一性百分?jǐn)?shù)
權(quán)利要求
1.α-淀粉酶混合物，其包含(i)嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophiIus) α -淀粉酶(AmyS)，其使用在SEQ ID NO 2中所示的氨基酸編號(hào)系統(tǒng)，其中替換了 S242位置處的氨基酸；和(ii)地衣芽孢桿菌(B.Iicheniformis) α -淀粉酶。
2.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其進(jìn)一步包含植酸酶。
3.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述混合物包含重量比為大約40%的具有S242替換的AmyS和大約60%的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶。
4.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中具有S242替換的AmyS與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的重量比為10 90。
5.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，進(jìn)一步地其包含大約1400AAU/g至大約 14000AAU/g的具有S242替換的AmyS和大約8000LU/g至大約19000LU/g地衣芽孢桿菌 α-淀粉酶的活度比率。
6.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含SEQIDNO :1或SEQ ID NO 2的多肽序列。
7.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含SEQ IDNO 4的多肽序列。
8.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS選自包含SEQID NO :6、7、 8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一。
9.權(quán)利要求1、6、7或8中任一項(xiàng)所述的α-淀粉酶混合物，其中所述S242替換是 S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H 或 S242N 替換。
10.權(quán)利要求1、6、7或8中任一項(xiàng)所述的α-淀粉酶混合物，其中所述具有在S242位置處替換的AmyS與在S242位置處沒(méi)有替換的AmyS比較在約80°C至約95°C之間具有更高的熱穩(wěn)定性。
11.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含與SEQIDΝ0:1的 AmyS具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述AmyS具有α-淀粉酶活性。
12.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含純化的野生型酶。
13.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含野生型序列的選自M15T、H133Y、N188S和A209V的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。
14.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含在 SEQ ID NO 20中所示的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含與 SEQ ID NO :20 具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性的氨基酸序列。
16.用于液化淀粉的方法，其包括添加權(quán)利要求1所述的淀粉酶混合物到包含淀粉的溶液中，并液化包含淀粉的溶液以形成漿液。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述淀粉酶混合物具有大約40%(作為AAU/g DS)的具有S242替換的AmyS和大約60% (作為L(zhǎng)U/g DS)的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的活度比率。
18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述淀粉獲自植物材料、谷物、買羅高梁、黑麥、大麥、小麥、高粱、燕麥、稻、糠、木薯、谷子、馬鈴薯、甘薯或木薯粉。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述淀粉是來(lái)自干磨法或濕磨法的顆粒淀粉。
20.權(quán)利要求16所述的方法，其進(jìn)一步包括初級(jí)和/或次級(jí)液化步驟，包括在初級(jí)和/ 或次級(jí)液化步驟中添加額外的底物到漿液中。
21.權(quán)利要求16所述的方法，其進(jìn)一步包括添加植酸水解酶。
22.權(quán)利要求16所述的方法，其進(jìn)一步包括糖化所述液化的淀粉以獲得可發(fā)酵糖。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其進(jìn)一步包括在合適的發(fā)酵條件下發(fā)酵可發(fā)酵糖以獲得醇終產(chǎn)物。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述醇終產(chǎn)物是乙醇或丁醇。
25.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述液化的ρΗ范圍為ρΗ4.5至ρΗ5. 4，并且不添加酸中和化學(xué)物質(zhì)到該液化工藝步驟中。
26.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述液化的ρΗ范圍為ρΗ4.8至ρΗ5. 8，并且不添加酸中和化學(xué)物質(zhì)到該液化工藝步驟中。
27.獲得可發(fā)酵底物的方法，包括將含有顆粒淀粉的磨碎谷物漿液與植酸水解酶和權(quán)利要求1所述的α-淀粉酶混合物在比淀粉凝膠化溫度低0°C至30°C的溫度接觸，升高溫度高于凝膠化溫度，水解凝膠化的淀粉，和獲得可發(fā)酵底物。
28.生產(chǎn)可發(fā)酵糖的方法，包括(a)將磨碎的含有淀粉的材料與水和稀釜餾物混合，其中所述稀釜餾物是在10至70% ν/ν范圍，和獲得包含淀粉及具有20至50% w/w干固體(ds)含量的漿液，(b)用植酸酶在液化淀粉之前或在液化淀粉的同時(shí)處理所述漿液，(c)液化所述淀粉，(d)在步驟(b)期間和/或與液化步驟同時(shí)地添加權(quán)利要求1所述的α-淀粉酶混合物至所述淀粉，和(e)糖化所述液化的淀粉以獲得可發(fā)酵糖，其中在步驟(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的任一步驟期間不調(diào)節(jié)ρΗ。
29.權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述可發(fā)酵糖是回收的和純化的或異構(gòu)化的。
30.權(quán)利要求觀所述的方法，其中在液化步驟之前添加所述植酸酶。
31.權(quán)利要求觀所述的方法，其中將所述α-淀粉酶混合物隨所述植酸酶一起添加。
32.權(quán)利要求觀所述的方法，其中在液化步驟期間添加或者在糖化步驟期間添加第二份α -淀粉酶混合物劑量。
33.用于生產(chǎn)葡萄糖的方法，包括將淀粉底物與權(quán)利要求1所述的淀粉酶混合物接觸，液化所述淀粉底物，和高溫溫育所述底物以產(chǎn)生包含葡萄糖的產(chǎn)物。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述溫育步驟是次級(jí)液化步驟。
35.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述溫育步驟在大約90-100°C的溫度進(jìn)行。
36.權(quán)利要求33所述的方法，其中進(jìn)行足夠時(shí)間的溫育以使產(chǎn)物包含大約2-14DE的葡萄糖。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中進(jìn)行足夠時(shí)間的溫育以使產(chǎn)物包含大約IODE的葡萄糖。
38.權(quán)利要求33所述的方法，進(jìn)一步包括糖化所述產(chǎn)物以產(chǎn)生富含葡萄糖的溶液。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述富含葡萄糖的溶液包含80-99%的葡萄糖。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述富含葡萄糖的溶液包含約93-96%的葡萄糖。
41.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述糖化包括將所述葡萄糖產(chǎn)物與葡糖淀粉酶或者包含葡糖淀粉酶和支鏈淀粉酶的酶混合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及α-淀粉酶混合物，包括其中替換了S242位置處的氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)α-淀粉酶(AmyS)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)α-淀粉酶。本發(fā)明也涉及使用α-淀粉酶混合物用于淀粉液化和糖化、乙醇生產(chǎn)和增甜劑生產(chǎn)的方法。
文檔編號(hào)C11D3/386GK102224234SQ200980147153
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者B·A·保爾森, J·舍蒂, V·夏爾馬 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司