專利名稱：包含植物乳桿菌素的生物質(zhì)的制備方法及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種包含植物乳桿菌素(Plantaricin)的生物質(zhì)的制備方法及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的用途。特別是，本發(fā)明涉及植物乳桿菌素A、N或K或它們的混合物的制備方法，或者包含ー種或以上上面提到的植物乳桿菌素連同用于制備的乳酸菌的生物質(zhì)的制備方法，及它們用于激發(fā)腸細(xì)胞或人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的屏障功能的用途。
背景技術(shù)：
已經(jīng)知道，表皮和腸壁具有對抗外部環(huán)境及其中有害物質(zhì)的屏障功能。由于各種各樣的因素，表皮和腸壁的屏障功能可被減弱。其中ー種更常導(dǎo)致表皮屏障功能改變的情 形是暴露于各種引發(fā)環(huán)境因素中。在正常情況下，無論如何，表皮通過導(dǎo)致達(dá)到“穩(wěn)態(tài)”和足夠的耐受性等級的適應(yīng)，能夠適應(yīng)可能的外源性損傷。表皮被刺激性洗滌劑和化學(xué)物質(zhì)(有機(jī)溶劑、肥皂、洗滌劑溶液)持續(xù)侵襲，例如，不僅會破壞表皮表面膜的脂質(zhì)成分，還會破壞角質(zhì)層細(xì)胞間的脂質(zhì)，導(dǎo)致屏障功能退化。這樣會導(dǎo)致輕度的皮炎，其特征在于水分經(jīng)皮流失増加、少量脫屑和角質(zhì)層彈性損失，可能隨之形成小型連續(xù)表面溶解(solution)。此較輕的刺激狀態(tài)(經(jīng)常是亞臨床的)觸發(fā)修復(fù)過程，該過程通過增加脂質(zhì)合成和激發(fā)基底角質(zhì)形成細(xì)胞増殖活性，達(dá)到新的平衡并修復(fù)屏障功能。當(dāng)表皮屏障不再適當(dāng)?shù)貓?zhí)行足夠的固有防御功能，由細(xì)胞因子釋放觸發(fā)的炎癥性皮膚病癥發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)增加，導(dǎo)致原位產(chǎn)生致炎的(fogogenic)介質(zhì)和自由基。后者，除通過氧化機(jī)制對DNA和蛋白質(zhì)造成損傷之外，還可對表皮細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化作用。盡管表皮不含有血管，但是其包含少量的必不可少的水以維持生理平衡和角質(zhì)組織完整性。來自表皮毛細(xì)血管的水流過真皮表皮交接處以及角質(zhì)細(xì)胞行之間的通道，其水平達(dá)到與大多數(shù)組織類似的水平，即在深入?yún)^(qū)域(緊密的角質(zhì))大約為60-70%，在較淺表的區(qū)域(間斷的角質(zhì))大約為10-35%。事實(shí)上，同樣在更外部的部分，與空氣接觸的表皮能夠維持水分儲存是基于兩個特殊的功能防止液體蒸發(fā)的屏障作用和角質(zhì)層的整體親水作用(持水能力)，這是由高吸濕性顆粒的存在導(dǎo)致的。基于間斷(disjunct)角質(zhì)層的最薄角質(zhì)細(xì)胞層逐漸剝離以及濕脂類重疊膜的試驗(yàn)表明，屏障功能未受顯著作用，同時(shí)，另一方面，通過移除底下緊密角質(zhì)層的深層，屏障功能逐漸退化，眾所周知緊密角質(zhì)層的水泥墻結(jié)構(gòu)，其具有由絲集蛋白緊密角蛋白簇(faggrin compacted keratin clusters)和硬質(zhì)蛋白質(zhì)包封組成的角質(zhì)細(xì)胞磚。電子顯微鏡顯示，角質(zhì)細(xì)胞被改性橋粒(desmosomial)板(角化粒(corneosomes))密封并且被嵌入在稱為內(nèi)角質(zhì)細(xì)胞混凝土的脂質(zhì)粘接劑中,產(chǎn)生柔性膜和幾乎不能穿過的屏障。應(yīng)激狀態(tài)可能會急性或慢性地影響皮膚屏障，并且為對抗相同的情形，身體會產(chǎn)生一系列穩(wěn)態(tài)機(jī)制，導(dǎo)致表皮具有監(jiān)測能力，并且當(dāng)獨(dú)立于有害急性病原的產(chǎn)生而發(fā)生對抗失敗時(shí)能夠恢復(fù)效率。表皮對長期暴露于低濕度的空氣(如代表性地在干燥氣候出現(xiàn))引起的慢性皮膚應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng)，其通過補(bǔ)償適應(yīng)性現(xiàn)象導(dǎo)致基底細(xì)胞增殖增カロ，以及隨后角質(zhì)層和表皮作為ー個整體的厚度增加。角質(zhì)小體(Odland bodies)和角質(zhì)細(xì)胞間脂質(zhì)(包括通常的成分)的產(chǎn)生和胞外分泌也増加了，這樣表皮就能夠以ー種更好的方式保留水資源。在任何情況下，水分缺乏都會導(dǎo)致相變，以至于角質(zhì)細(xì)胞間混凝土的液體-脂質(zhì)分層，隨后結(jié)晶。結(jié)果，對于由肌肉-關(guān)節(jié)運(yùn)動和外在動態(tài)刺激引起的牽引，產(chǎn)生較小的可塑性和硬度，因此容易產(chǎn)生微小損傷。另外ー個類似適應(yīng)性反應(yīng)的含義包括角化過度増殖層的增加未被相應(yīng)的角質(zhì)細(xì)胞較高的剝脫率平衡，角質(zhì)細(xì)胞不是被放大，而是保持嵌入在角質(zhì)大規(guī)模集群中并且僅僅以大規(guī)模剝離。此外，慢性環(huán)境應(yīng)激會激活與肥大和真皮肥大細(xì)胞脫粒相關(guān)的炎癥組織學(xué)方面的細(xì)胞因子級聯(lián)。這可以解釋在冬天觀察到的炎癥性皮膚病理學(xué)惡化。對抗表皮屏障的每ー個急性損傷會通過皮膚細(xì)胞的參與引起細(xì)胞因子反應(yīng)應(yīng)，其作用反映在角質(zhì)形成細(xì)胞和下面的真皮上，導(dǎo)致重要的形態(tài)學(xué)和功能性結(jié)果，目的在于修復(fù)屏障功能、紋理化表皮表面，以及，最重要的是，刺激成纖維細(xì)胞的活性，基于此可改善真皮的緊密性和充盈度。事實(shí)上為修復(fù)屏障功能所采用的方法是基于使用修復(fù)和水分調(diào)節(jié)的物質(zhì)，這些物質(zhì)適用于避免由屏障功能改變導(dǎo)致的皮膚防御不足。這些物質(zhì)是具有補(bǔ)水和重組功能的化 合物。很多真皮化妝品能使皮膚補(bǔ)水并且根據(jù)它的修復(fù)功能，有利于皮膚再生。然而通過對粗糙表面的簡單“美容掩蓋”能發(fā)揮相同作用，但這不具有任何實(shí)質(zhì)上的治療作用，治療作用的發(fā)揮將不得不通過g在修復(fù)皮膚形態(tài)功能完整性的修復(fù)和再生活性。最近有概述稱細(xì)菌適合于釋放并檢測作為對環(huán)境狀況改變的反應(yīng)的信號分子，包括其細(xì)胞密度和/或同一生態(tài)系統(tǒng)中存在的其它種微生物細(xì)胞種類數(shù)量的變化(Sturme 等，2007. Making sense of quorum sensing in lactobacilli:aspecial focus on Lactobacillus pi ant arum WCFAl.(理解乳酸桿菌的群體感應(yīng)對Lactobacillusplantarum (植物乳桿菌)WCFAl的特別關(guān)注)，Microbilogy (《微生物學(xué)》)第153卷3939-3947頁)。對于乳酸菌，根據(jù)“群體感應(yīng)”(QS)機(jī)制發(fā)生的這些反應(yīng)，包括命名為2型(AI-2，主要為呋喃酮類衍生物)自誘導(dǎo)劑的信號分子，其利用LuxS酶活性合成CMillere Bassier，2003. LuxS quorum sensing:more tnan just a numbers game (LuxS群體感應(yīng)不僅僅是ー個數(shù)字游戲)，Curr Opin Microbiol (《當(dāng)前生物學(xué)觀點(diǎn)》)第6卷191-197頁)，或者命名為肽信息素或肽自誘導(dǎo)劑(AIP)的信號分子(Nakajama等，2001.belatmase biosynthesis-activating pheromone:a peptide lactone tnat mediates aquorum sensing in Enterococcus faecalis (明膠酶生物合成激活信息素ー種在糞腸球菌中介導(dǎo)群體感應(yīng)的肽內(nèi)酯)，Mol Microbiol (《分子微生物學(xué)》)第41卷145-154頁)。最近已經(jīng)證明了植物乳桿菌(L.plantaiomOWCFSl基因組包含大量編碼AIP肽的基因，和編碼參與“群體感應(yīng)”機(jī)制中其它功能的其它基因(Sturme等，2007. Making sense of quorumsensing in lactobacilli : a special focus on Lactobacillus pi ant arum WCFAl(理角軍乳酸桿菌的群體感應(yīng)對Lactobacillus pi ant arum WCFAl的特別關(guān)注)，Microbilogy(《微生物學(xué)》)第153卷3939-3947頁)。ー些研究已經(jīng)證明了·在合成植物乳桿菌素型肽信息素的系統(tǒng)參與種內(nèi)細(xì)胞通訊機(jī)制。在這種情況下，肽信息素作為測量分子合成物種(species)的細(xì)胞密度的工具使用(Diep 等，1994. The gene encoding plantaricin A, a bacteriocinfrom Lactobacillus piantarum CU, is located on the same transcription unitas an agr-like regulatory system (編碼植物乳桿菌素 A (一種來自 LactobacillusPI ant arum Cll的細(xì)菌素)的基因，與類agr調(diào)節(jié)系統(tǒng)位于相同的轉(zhuǎn)錄單元)，Appl EnvironMicrobiol (《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》)第60卷160-166頁)。其它的研究也證明了植物乳桿菌素型肽信息素可參與種間細(xì)胞通訊機(jī)制。特別是，競爭性微生物的存在可激活參與微生物拮抗機(jī)制的調(diào)節(jié)系統(tǒng)(Maldonado 等,2004. Production of plantaricin NC8byLactobacillus piantarum NC8 is induced in the presence oi different types oiGram-positive bacteria (不同類型革蘭氏陽性菌的存在誘導(dǎo)Lactobacillus pi ant arumNC8產(chǎn)生植物乳桿菌素NC8), Arch Microbiol (《微生物學(xué)文獻(xiàn)集》)第181卷8-16頁)。存在高細(xì)胞密度的其它微生物種類時(shí)，肽信息素有利于磷酸化反應(yīng)的級聯(lián)系列，包括代謝調(diào)節(jié)的復(fù)雜現(xiàn)象，其導(dǎo)致合成特別地充當(dāng)細(xì)菌素型抗菌化合物(例如植物乳桿菌素A、K 和 N)的信號分子(Hauge 等，1998. Plantaricin A is an ampkiphilic alpha-helicalbacteriocin—like pheromone which exerts antimicrobial and pheromone activitiesthrough different mechanisms (植物乳桿菌素 A 是一種類兩性(ampkiphilic) α 螺旋細(xì)菌素信息素，其通過不同的機(jī)制發(fā)揮抗菌和信息素活性)，Biochemistry (《生物化學(xué)》)第37 卷 16026-16032 頁)。
盡管原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的細(xì)胞通訊機(jī)制已經(jīng)被部分闡明，但是關(guān)于細(xì)菌(例如，肽信息素)和人類腸粘膜細(xì)胞的“群體感應(yīng)”機(jī)制包含的信號分子的相互作用的文獻(xiàn)非常有限。唯一的例子是CSF五肽，其由Bacillus subtilis (枯草芽孢桿菌)益生菌微生物合成，作為參與感受態(tài)和產(chǎn)孢現(xiàn)象的分子(Fujija等,2007. The Bacillus subtilisquorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal homeostasis via 0しΓΝ2，ahost cell membrane transporter (Bacillus subtilis 群體感應(yīng)分子 CSF 通過宿主細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體0CTN2促進(jìn)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài))，Cell Host Microbe (《細(xì)胞宿主微生物》)第I卷299-308頁)。已經(jīng)證明了所述五肽適于誘導(dǎo)p38MAP激酶、B激酶(Akt)和低溫耐受性(cryotolerance),從而有利于在腸道級別防止氧化損傷和增強(qiáng)屏障功能。此外在本領(lǐng)域當(dāng)前狀態(tài)，沒有出版物或者專利關(guān)注與人表皮有關(guān)的細(xì)菌細(xì)胞通訊機(jī)制包含的信號分子的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的作者現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了植物乳桿菌素，特別是植物乳桿菌素A，對人表皮和腸內(nèi)細(xì)胞中的角質(zhì)形成細(xì)胞的屏障功能發(fā)揮積極作用。有關(guān)用細(xì)菌單培養(yǎng)物(種內(nèi))制備植物乳桿菌素的方法的研究是已知的。然而，對目標(biāo)微生物的培養(yǎng)，當(dāng)擴(kuò)大到為了治療目的制備信號分子的エ業(yè)級別時(shí)，所述培養(yǎng)將在復(fù)雜的和非常昂貴的培養(yǎng)基中完成。本發(fā)明的作者現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出ー種使用兩種特定乳酸菌的共培養(yǎng)物制備植物乳桿菌素的方法，其獲得的產(chǎn)量比依據(jù)已知技術(shù)的更高。特別是，L. PIantarum (植物乳桿菌)DC400 (于2009年12月21日以編號DSM 23213存放于德國布朗斯維克(Braunschweig)D-38124 因荷夫街(Inhoffenstr. )7B 的 DSMZ)與 L. rossiae (紅色乳桿菌)DPPMA174 (于2009年12月21日以編號DSM 23214存放于德國布朗斯維克(Braunschweig) D-38124因荷夫街(Inhoffenstr.) 7B的DSMZ)的共培養(yǎng)物的培養(yǎng)適于激活植物乳桿菌素型肽信息素的合成(特別是植物乳桿菌素A)，得到的濃度比L. Plantarum DC400單培養(yǎng)物(DSM 23213)存在時(shí)高大約50倍。此外，已經(jīng)證明L. plantarum DC400 (DSM 23213)與同樣由“天然酵頭(natural sourdough)”分離得到的其它種的乳酸菌的培養(yǎng)物,在與L. Rossiae 一起時(shí)不適于刺激肽信息素的合成。本發(fā)明方法的另ー個重要方面是，植物乳桿菌素A的合成不僅僅在乳酸菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)經(jīng)常采用的培養(yǎng)基中是可行的，而且在葡萄汁、乳清以及水果和蔬菜制品的水提物中也是可行的。根據(jù)已知技木，沒有出版物或?qū)＠读酥参锶闂U菌素A型(PlnA)的合成，作為存在于相同消化道生態(tài)系統(tǒng)中存在的兩種乳酸菌(例如，L. plantarum和L. sanfranciscensis)共培養(yǎng)的反應(yīng)機(jī)制,作為“天然酵頭”用于烘焙的發(fā)酵制品的制造。此外根據(jù)文獻(xiàn)，未報(bào)道過相對于單培養(yǎng)條件(種內(nèi))，共培養(yǎng)(種間)合成的植物乳桿菌素A增カロ。另外，如上所述，已知的方法使用非常昂貴和復(fù)雜的培養(yǎng)基。
此外，驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法得到的生物質(zhì)包含與L. plantarum DC400 (DSM
23213)和L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)乳酸菌相關(guān)的ー種或多種植物乳桿菌素，在增強(qiáng)表皮或者腸壁級別的屏障功能時(shí)比單獨(dú)的植物乳桿菌素發(fā)揮更高的效力。本發(fā)明的乳酸菌屬于Lactobacillus (乳桿菌)的種并且已經(jīng)從“天然酵頭”中分離，在南意大利用于傳統(tǒng)的面包生產(chǎn)。ー項(xiàng)生物技術(shù)協(xié)議涉及所述兩種細(xì)菌在CDM (化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基)、WFH (小麥面粉水解物)(Gobbetti,1998.The sourdough microflora:interactions of lacticacid bacteria and sourdoughs (酵頭菌群乳酸菌和酵頭的相互作用),Trends Food SciFechnol (《食品科學(xué)技術(shù)動態(tài)》)第9卷267-274頁)、葡萄汁(稀釋為1%的可溶性碳水化合物，加入O. 5%的麥芽糖和O. 5%的酵頭提取物，pH 5. 6)、乳清(加入O. 5%的麥芽糖和O. 5%的酵頭提取物，PH 5. 6)或蔬菜和水果制品的水提物(加入O. 5%的麥芽糖和O. 5%的酵頭提取物，pH 5.6)中在30-37°C共培養(yǎng)18-24小時(shí)，這已被標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過離心分離法細(xì)胞可以或者不從液體培養(yǎng)液(tooth-culture)中除去，然后通過干燥或冷凍干燥使上清液經(jīng)歷脫水過程。下面介紹配制基于植物乳桿菌素A的制備物的生物技術(shù)協(xié)議的方案。乳酸菌培養(yǎng)物在30°C增殖持續(xù)24小時(shí)，清洗，懸于水中細(xì)胞密度為9.01(^11化/1111，并且培養(yǎng)基聯(lián)合接種(co-inoculation)(1-4%) (CDM、WFH、葡萄汁、乳清、水果和蔬菜制品的水提物)I在30-37 °C 培養(yǎng) 18-24 小時(shí)I通過離心除去細(xì)胞I通過干燥或冷凍干燥使上清液脫水I配制用于護(hù)膚產(chǎn)品應(yīng)用的制備物當(dāng)將L. plantarum DC400 (DSM 23213)和 L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)在共培養(yǎng)條件下在如上所述任何一種底物上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，檢測到合成的植物乳桿菌素A的濃度為2. 5-4. O μ g/mL。在單培養(yǎng)條件下，通過L. plantarum DC400 (DSM 23213)合成的植物乳桿菌素A的濃度為約O. 06 μ g/mL。在與其它乳酸菌種(例如Pediococcus pentosaceus(戍糖片球菌)、Lactobacillus pentosus (戍糖乳桿菌)、Lactobacillus brevis (短乳桿菌)、Lactobacillus rossiae (紅色乳桿菌)、Lactobacillus rhamnosus (鼠李糖乳桿菌))共培養(yǎng)的條件下，合成的植物乳桿菌素A明顯減少。在與L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)共培養(yǎng)的條件下，其它肽信息素的合成，如植物乳桿菌素K和N型被檢測到，盡管與植物乳桿菌素A相比濃度較低，并且特別地范圍是O. 02-0. 06 μ g/mL·按照ー種可能的配方，如用重建表皮模型(SkinEthic )和跨膜電阻(TEER)試驗(yàn)已經(jīng)證明的那樣，2. 5 μ g/ml的植物乳桿菌素A刺激了屏障功能。使用適于再生腸粘膜的Caco-2/TC7腸細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果。根據(jù)使用微生物學(xué)技術(shù)、色譜的技術(shù)以及體外和離體試驗(yàn)對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的補(bǔ)充分析，L. plantarum DC400 (DSM 23213)和 L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)的共培養(yǎng) 從未在之前的研究中使用過，按照本發(fā)明，能夠(i)合成參與種間細(xì)胞通訊機(jī)制的信號分子，其濃度在單個生態(tài)系統(tǒng)中其它乳酸菌群體(association)存在時(shí)不能檢測到；(ii)合成植物乳桿菌素A和其它植物乳桿菌素(K和N)，也是采用低成本的底物；以及(1^)具有保護(hù)作用，其增強(qiáng)了表皮和腸細(xì)胞級別的屏障功能，從而證明了原核細(xì)胞合成的信號分子也可以被真核細(xì)胞檢測到。因此，本發(fā)明的ー個具體目的是提供一種用于合成生物質(zhì)的生物技術(shù)方法，該生物質(zhì)包含或由以下組成至少ー種植物乳桿菌素，其選自植物乳桿菌素A、K或N，優(yōu)選地為 A,或者它們的混合物，以及 Lactobacillus plantarum DSM 23213 和 Lactobacillusrossiae DSM23214乳酸菌，或者用于制備ー種或多種選自植物乳桿菌素A、K或N，優(yōu)選地為A的植物乳桿菌素，或者它們的混合物的生物技術(shù)方法，所述方法包含以下步驟或由以下步驟組成a)培養(yǎng)增通 Lactobacillus plantarum DSM 23213 和 Lactobacillus rossiaeDSM 23214乳酸菌；b)對選自CDM、WFH、葡萄汁、乳清或水果和蔬菜制品提取物的底物，利用步驟a)中限定的乳酸菌的水性懸液，進(jìn)行聯(lián)合接種；c)培育(incubation);以及，任選地，d)對培養(yǎng)液進(jìn)行離心，以除去乳酸菌細(xì)胞。具體地，來自步驟a)的懸液中，每種乳酸菌的細(xì)胞密度可為約9. OLog ufc/ml并且將其以基于底物體積的1-4%范圍的百分比加入到底物中。培育步驟可在30-37°C (優(yōu)選30°C)的溫度下進(jìn)行，持續(xù)18-24小時(shí)，優(yōu)選18小時(shí)，同時(shí)可在10000Xg，4°C時(shí)離心15分鐘。本發(fā)明方法可進(jìn)ー步包含步驟e)，利用干燥或冷凍干燥對步驟d)中獲得的上清液進(jìn)行脫水。本發(fā)明進(jìn)ー步的目的是按照上述方法可得到的或得到的生物質(zhì)，包含或由以下組成選自植物乳桿菌素A、N或K的至少ー種植物乳桿菌素或它們的混合物以及Lactobacillus plantarum DSM 23213 和 Lactobacillus rossiae DSM 23214 乳酸菌。本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥物組合物或者化妝品組合物,其包含或者由以下組成如上所定義的生物質(zhì)，作為ー種活性成分，連同一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或佐劑。本發(fā)明的ー個特定方面進(jìn)ー步指如上所定義的生物質(zhì)或組合物用于制備藥物以增強(qiáng)表皮或腸壁的屏障功能或用于傷ロ愈合的用途。Lactobacillus plantarum DSM 23213 或者 Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌或者它們的混合物是本發(fā)明進(jìn)ー步的目的。此外，本發(fā)明涉及選自植物乳桿菌素A、K或N (優(yōu)選為A)中的ー種或多種植物乳桿菌素的用途，所述植物乳桿菌素用于制備藥物以增強(qiáng)表皮或腸壁的屏障功能，或用于使傷ロ愈合。現(xiàn)將根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，特別是參照包含的附圖，以說明性但不是限制性的方式描述本發(fā)明。


圖 Ia顯不了對由 Lactobacillus plantarum DC400CDSM 23213)和 Lactobacillusrossiae DPPMA174 (DSM 23214)共培養(yǎng)而獲得的發(fā)酵液中游離細(xì)胞上清液的電噴霧-電離(ESI)離子阱MS (nano-ESI/MS-MS)耦合多維HPLC (MDLC)分析的結(jié)果。圖Ib顯示了基于特定采集時(shí)間采用與植物乳桿菌素A相關(guān)的m/z比率從圖Ia的真實(shí)色譜圖獲得的色譜圖。圖Ic顯示了 MS/MS圖譜，其基于圖Ia色譜圖中觀察到的1493. 7m/z比率檢測物種。圖2顯示了植物乳桿菌素A的濃度，所述植物乳桿菌素A由LactobaciIIusplantarum DC400 (DC400)> L.plantarum DPPMA 20 (DPPMA20)、 Lactobacilluspentosus 12H5 (12H5)、Lactobacillus rossiae DPPMA174 (DPPMA174)和 Pediococcuspentosaceus 2XA ￡ (2XA3)單培養(yǎng)物以及 L. plantarum DC400 跟 L. plantarum DPPMA 20(DC400-DPPMA20)、L. pentosusl2H5 (DC400-12H5) ；L. rossiae DPPA 174 (DC400-DPPMA174)或P. pentosaceus 2XA3 (DC400-2XA3)的共培養(yǎng)物合成。數(shù)據(jù)是三個一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值。圖3 顯不了 Lactobacillus rossiae DPPMA174 的生長動力學(xué)。單培養(yǎng)(·)；與Lactobacillus plantarum DC400共培養(yǎng)(O);單培養(yǎng)，帶有純化的植物乳桿菌素A(2. 5μ g/ml) ( Λ );以及單培養(yǎng)，帶有化學(xué)合成的植物乳桿菌素A (2. 5μ g/ml) (A)0純化的植物乳桿菌素A對應(yīng)于用L. plantarum DC400和L. rossiae DPPMA174共培養(yǎng)合成的植物乳桿菌素A。數(shù)據(jù)是三個一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值。圖4顯不了 Lactobacillus rossiae DPPMA174經(jīng)18小時(shí)培養(yǎng)后表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)電泳ニ維分析的部分凝膠。板A,單培養(yǎng)；板B,與Lactobacillus plantarum DC400共培養(yǎng)；以及板C，在純化的植物乳桿菌素A (2. 5 μ g/ml)存在下的單培養(yǎng)。橢圓形或三角形標(biāo)記的數(shù)字指的是用L. plantarum DC400或純化的植物乳桿菌素A培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出表達(dá)水平升高或降低的蛋白質(zhì)。菱形或雙三角標(biāo)記的數(shù)字指的是只在與L. plantarum DC400共培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出表達(dá)水平升高或降低的蛋白質(zhì)。圖5顯示了分別暴露于PBS緩沖液、植物乳桿菌素A (2. 5 μ g/ml)或包含2. 5 μ g/ml植物乳桿菌素A的生物質(zhì)，在O和24小時(shí)后重建表皮(SkinEthic )的跨膜電阻(TEER)(OhmsXcm2)0數(shù)據(jù)是三個一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值。圖6顯示了用純化的植物乳桿菌素A (2. 5 μ g/ml)培育24、48和72小時(shí)后測量為中性紅吸收的Caco2/TC7細(xì)胞活力(viability)，所述純化的植物乳桿菌素A由Lactobacillus plantarum DC400 (DC400)單培養(yǎng)或與 Lactobacillus rossiae DPPMA174(DC400-DPPMA174)共培養(yǎng)產(chǎn)生。按照植物乳桿菌素A的色譜條件洗脫的L. rossiaeDPPMA174單培養(yǎng)的純化餾分(fraction)，已被用作陰性對照(DPPMA174)。另ー個陰性對照是DMEM培養(yǎng)基(DMEM)?；瘜W(xué)合成的植物乳桿菌素A( 2. 5 μ g/ml)已被用作陽性對照(PlnA)。數(shù)據(jù)是三個一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值。星號表明相對于陰性對照存在顯著差異(P〈0. 01)。圖7顯示了單獨(dú)用Y-干擾素(IFN-Y) (100(^/!111)和用正トパ純化的植物乳桿菌素A (2. 5 μ g/ml) (IFN-Y+DC400-DPPMA174)培育24,48和72小時(shí)后，測量為中性紅吸收的Caco2/TC7細(xì)胞活力。純化的植物乳桿菌素A來自Lactobacillus plantarumDC400 (DC400)和 Lactobacillus rossiae DPPMA174 的共培養(yǎng)。DMEM 培養(yǎng)基被用作陰性 對照(DMEM)?；瘜W(xué)合成的植物乳桿菌素A (2. 5 μ g/ml)和IFN- Y被用作陽性對照(PlnA)。數(shù)據(jù)是三個一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值。星號表明相對于陰性對照存在顯著差異(P〈0. 01)。圖8顯示了 Caco2/TC7細(xì)胞在培育24和48小時(shí)后的跨膜電阻(TEER)(OhmsXcm2)。培育是在以下環(huán)境中進(jìn)行的來自 Lactobacillus plantarum DC400CDC400)單培養(yǎng)的純化的植物乳桿菌素Α(2· 5 μ g/ml);來自L. plantarum DC400與Lactobacillusrossiae DPPMA174 (DC400-DPPMA174)共培養(yǎng)的純化的植物乳桿菌素 A (2. 5μ g/ml);化學(xué)合成的植物乳桿菌素 A (2. 5 μ g/ml) (PlnA);來自 L. plantarum DOiOO 和 L. rossiaeDPPMA174 (IFN-Y+DC400-DPPMA174)共培養(yǎng)的 Y-干擾素(IFN-γ) (1000U/ml)和純化的植物乳桿菌素A ；以及IFN- Y和化學(xué)合成的植物乳桿菌素A (PlnA+IFN- Y )。DMEM培養(yǎng)基(DMEM)被用作陰性對照。數(shù)據(jù)是三個一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值。星號表明相對于陰性對照存在顯著差異(P〈0. 01)。圖9顯示了分別用對照、植物乳桿菌素A或包含植物乳桿菌素A的生物質(zhì)處理角質(zhì)形成細(xì)胞的傷ロ愈合試驗(yàn)的結(jié)果。圖10顯示了用對照、植物乳桿菌素A或包含植物乳桿菌素A的生物質(zhì)處理的傷ロ邊緣之間的距離。圖11顯示了用對照、植物乳桿菌素A或包含植物乳桿菌素A的生物質(zhì)處理的傷ロ愈合增加百分比。圖12顯示了人2544NCTC角質(zhì)形成細(xì)胞單層在切割后用共培養(yǎng)的植物乳桿菌素Ca)和合成的植物乳桿菌素(b)在經(jīng)考慮的不同時(shí)間間隔處理得到的代表性圖像。單層切害I]采用200 μ I的移液器吸頭完成。這些細(xì)胞獨(dú)立地用濃度為0. I、I和10 μ g/ml的共培養(yǎng)的和合成的植物乳桿菌素處理。圖13顯示了用共培養(yǎng)的植物乳桿菌素(0. 1、1和10 μ g/ml)處理后，遷移通過切割區(qū)域的細(xì)胞百分比。遷移百分比通過測量切割后0、4、8、12、24、48和72小時(shí)的兩條切割線間的清晰面積(clear area)確定。橫條代表兩個一式三份的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土S. Ε· Μ。圖14顯示了用合成的植物乳桿菌素(0. 1、1和10 μ g/ml)處理后在起始時(shí)間遷移通過切割區(qū)域的細(xì)胞百分比。遷移百分比通過測量切割后0、4、8、12、24、48和72小時(shí)的兩條切割線間的清晰面積與起始的清晰面積的比較來確定。橫條代表兩個一式三份獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 S. E.M。圖15顯示了用共培養(yǎng)的植物乳桿菌素(0. 1、1和10μ g/ml)處理人NCTC2544角質(zhì)形成細(xì)胞單層后，清晰面積相對于起始切割面積的百分比。遷移百分比通過測量切割后O、4、8、12、24、48和72小時(shí)的兩條切割線間的清晰面積與起始的清晰面積的比較來確定。橫條代表兩個一式三份獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土S. E. M0圖16顯示了用合成的植物乳桿菌素(O. I、I和1(^8/1111)處理人從1^2544角質(zhì)形成細(xì)胞單層后的清晰面積相對于起始切割面積的百分比。該百分比通過測量切割后0、4、8、12、24、48和72小時(shí)兩條切割線間的清晰面積與起始的清晰面積的比較來確定。橫條代表兩個一式三份獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土S. EM。圖17顯示了共培養(yǎng)的植物乳桿菌素(O.1、1和10 μ g/ml)、合成的植物乳桿菌素(O. I、I 和 10 μ g/ml)和連結(jié)劑(Connectivine) (200 μ g/ml)對人 NCTC 2544 角質(zhì)形成細(xì)胞單層中TGFii. I表達(dá)的作用，所述單層被切開以獲得200 μ I移液管吸頭切ロ。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I :植物乳桿菌素型肽信息素的合成和純化以及它們對表皮和Caco-2細(xì)胞的 作用研究。來自 Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piantee Microbiologia Applicata dell’Universita degli Studi di Bari (巴里大學(xué)植物保護(hù)和應(yīng)用微生物學(xué)系收集的培養(yǎng)物)的L. plantarum DC400 (DSM 23213)和L. rossiaeDPPMA174 (DSM)，以前是從“天然酵頭”中分離得到的，已經(jīng)在30°C在改性的MRS培養(yǎng)基(mMRS)中增殖24小時(shí)，該培養(yǎng)基除了通常的成分，還包含5%的麥芽糖和10%的酵頭水ー最終 ρΗ5· 6。將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，通過離心(4°C下10. OOOXg離心15分鐘)收集細(xì)胞，用50mM pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗兩次，然后再懸于水中，細(xì)胞密度為9. Olog ufc/ml，將其在單培養(yǎng)或共培養(yǎng)條件下接種(4%,姆種)到WFH培養(yǎng)基上(Gobbetti, 1998. The sourdoughmicrofora: interactions of lactic acid bacteria and sourdoughs (酵頭|6| 群乳酸和酵頭的相互作用).Trends Food Ski Technol (《食品科學(xué)技術(shù)動態(tài)》)第9卷267 - 274頁)。采用相同的操作過程并且使用葡萄汁(稀釋為1%的可溶性碳水化合物，加入O. 5%的麥芽糖和O. 5%的酵頭提取物，pH 5. 6)、乳清(見之前的摻合物(integrations))或蔬菜和水果制品的水提物(見之前的摻合物)作為培養(yǎng)底物獲得了先后描述的相同的結(jié)果。培育在30°C下進(jìn)行18小吋。通過離心(4°C下10. OOOXg離心15分鐘)除去細(xì)胞后，往單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的上清液中加入三氟こ酸(O. 05%)并在10. OOOXg離心10分鐘。使用O. 22μπι的微孔過濾器過濾上清液。使用配備有在214nm處操作的檢測器的AKTA純化儀(GE醫(yī)療)設(shè)備和反相C18XTerra柱(Waters, Mildford)進(jìn)行HPLC分析。用水、2-丙醇和三氟こ酸(O. 05%)的混合物作為流動相。所有包含A型植物乳桿菌素的餾分都使用ESI-離子阱MS質(zhì)譜儀偶聯(lián)多維色譜分析(MDLC)進(jìn)行分析。用于鑒定和定量植物乳桿菌素A、K和N的分析條件是遵照 Di Cagno 等的條件(Di Cagno 等，2010. Quorum sensing in sourdoughLactobacillus plantarum DC400(DSM 23213): induction of plantaricin A. (PlnA)under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PlnA onbacterial and Caco_2cells (酵頭 Lactobacillus plantarum DC400 (DSM 23213)的群體感應(yīng)在與其它乳酸菌的共培養(yǎng)下植物乳桿菌素A(PlnA)的誘導(dǎo)以及PlnA對細(xì)菌和Caco-2細(xì)胞的作用)，Proteomics in press (出版中的《蛋白組學(xué)》))。(2) Lactobacillus rossiae DPPMAl74 (DSM 23214)的生長動力學(xué)L. ro ssiae DPPMA174(DSM 23214)的生長動力學(xué)數(shù)據(jù)已用襲拍茲(Gompertz)方程進(jìn)行處理，接著進(jìn)行了修正(Zwietering等，1990. Modelling of bacterial growth curve(細(xì)菌生長曲線建模)，Appl Environ Microbiol(《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》)第56卷1875-1881頁)。細(xì)胞計(jì)數(shù)通過在SDB培養(yǎng)基上平板接種(plating)，于30°C培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行。細(xì)胞活力和受損和/或死亡細(xì)胞的數(shù)量通過活/死背光細(xì)菌活力試劑盒(Molecular Probes,INC. , Cambridge)方法進(jìn)行確定。(3) ニ維電泳分析和蛋白質(zhì)鑒定已使用固相-聚丙烯酰胺系統(tǒng)對來自單培養(yǎng)或共培養(yǎng)的L. rossiae DPPMA174(DSM23214)的細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行ニ維電泳分析(De Angelis 等，2005. Biochim. Biophys.Acta.(《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》)第1762卷80-93頁)。對每種條件下的四塊凝膠進(jìn)行分析并且根據(jù)Bini等的操作過程將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(Bini等，1997. Protein expressionprofIes in human breast auctal carcinoma and histologically normal tissue 、人乳腺導(dǎo)管癌和組織學(xué)上正常的組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜).Electrophoresis (《電泳》).第18卷 2831-2841 頁)。使用LC-ESI-MS/MS分析以及將得到的序列與不同的數(shù)據(jù)庫(National Centerfor Biotechnology Information (國家生物技術(shù)信息中心)，Bethesda,MD,USA ;ProFound,http://www. prowl, rockefeller, edu/cRibin/ProFound)進(jìn)行比較來進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。(4)對重建表皮的試驗(yàn)和TEER (跨膜電阻)確定重建人表皮SkinEthic (重建的人表皮)由來自多層人表皮的正常角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成。其為來自人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物的完全分化的表皮，所述人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物用未添加小牛血清(calf serum)的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(MCDM 153)培養(yǎng)，在惰性多孔聚碳酸酯載體上于氣-液界面培養(yǎng)17天。在此生長階段，形態(tài)學(xué)分析顯示多層可存活的表皮和角質(zhì)層由超過十層緊密的細(xì)胞層構(gòu)成。根據(jù)先前所描述的協(xié)議使用重建人表皮SkinEthic (Di Cagno 等，2009.Synthesis of Y-amino butyric acid(GABA)by Lactobacillusplantarum DSMZ19463: functional grape must beverage and dermatologica丄application (通過 Lactobacillus plantarum DSMZ19463 合成 Y -氨基丁酸(GABA):功能性葡萄汁飲料以及皮膚學(xué)應(yīng)用).Appl Biotechnol Microbiol (《應(yīng)用微生物學(xué)生物技木》)DOI 10.1007/s00253-009-23704)。使用Millicell-ERS Volthommeter 進(jìn)行 TEER 確定(Di Cagno 等，2010. Quorumsensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400: induction of plantaricinA(PInA) under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PInAon bacterial and Caco_2cells (酵頭 Lactobacillus plantarum DC400 的群體感應(yīng)在與其它乳酸菌的共培養(yǎng)下植物乳桿菌素A (PlnA)的誘導(dǎo)以及PlnA對細(xì)菌和Caco-2細(xì)胞的作用)· Proteomics in press (出版中的《蛋白組學(xué)》))。(5)對 Caco_2/TC7 細(xì)胞的試驗(yàn)將人Caco_2/TC7細(xì)胞(TC7克隆)在杜氏培養(yǎng)基(DMB0中進(jìn)行培養(yǎng)，其中加入小牛血清(10%)、非必需氨基酸(1%)、慶大霉素/鏈霉素(50μ g/rnl)、谷氨酰胺(2mM)和4-2-輕こ基-I-哌嗪-こ石黃酸(4-2-hydroxyethl-l-piperazinil-etansulfonic acid)(1%) (Di Cagno Φ,2010.Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarumDC400: induction of plantaricin A (PInA) under co-cultivation with other lacticacid bacteria and effect of PInA on bacteria丄 and Caco_2cells(酵頭Lactobacillusplantarum DC400的群體感應(yīng)在與其它乳酸菌的共培養(yǎng)下植物乳桿菌素A (PlnA)的誘導(dǎo)以及PlnA對細(xì)菌和Caco-2細(xì)胞的作用)· Proteomics in press(出版中的《蛋白組學(xué)》))。使用中性紅染料進(jìn)行吸收試驗(yàn)以確定細(xì)胞活力(Balls等，1987. Approaches to validationalternative methods in toxicology(毒理學(xué)驗(yàn)證替代方法的途徑)· In:GoldberA. M. (Ed)N. Y. Academic Press (在GoldberA. M. (Ed)紐約大學(xué)出版社)45-58頁)。用各種制備物處理24-72小時(shí)后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞并且用中性紅溶液(33mg/l)在37°C培養(yǎng)4小時(shí)。接著，再次用PBS緩沖液洗滌這些細(xì)胞并用裂解液(溶于含1%こ酸的水中的50%的こ醇)處理這些細(xì)胞。使用Novapath讀板器(Biorad, Hercules, CA)進(jìn)行讀板(Di Cagno等，2010.Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400: induct ionof plantaricin A (PInA) under co-cultivation conditions with other lactic acidbacteria and effect of PInA on bacterial and Caco_2cells (醉頭 Lactobacillus plantarum DC400的群體感應(yīng)在與其它乳酸菌的共培養(yǎng)下植物乳桿菌素A (PlnA)的誘導(dǎo)以及PlnA對細(xì)菌和Caco-2細(xì)胞的作用),Proteomics inpress (出版中的《蛋白組學(xué)》))。對于TEER的確定，將Caco_2/TC7細(xì)胞在24孔板和聚こ烯過濾器(O. 4 μ m孔)中進(jìn)行接種(7. 5X IO4個細(xì)胞/ml)。處理前，這些細(xì)胞已在37°C培養(yǎng)了 21天。用各種制備物處理18、24和48小吋。通過TEER測定進(jìn)行細(xì)胞層完整性的確定。結(jié)果(I)植物乳桿菌素型肽信息素的合成與純化在Wi7H培養(yǎng)基中生長18小時(shí)后，Lplantarum DC400 (DSM 23213)單培養(yǎng)物的細(xì)胞密度為 9. 27±0. 181og ufc/ml。μ 眶和 λ 值分別為約 O. 271og ufc/ml/h 和 3. 77h。乳酸菌的細(xì)胞密度從9. 0±0. 05 (L. brevis (短乳桿菌)CR13)變?yōu)?. 43±0. 311og ufc/ml (L. plantarum DPPMA20)。μ max 值從 0· 11 ±0. 05 (L. pentosus (戍糖乳桿菌)12Η5)變?yōu)?0.15±0.041og ufc/ml/h (L. plantarum DPPMA20),以及 λ 值從 0·37±0·07(P. pentosaceus (戊糖片球菌)2XA3)變?yōu)?4. 20±0. 36h (L. rossiae DPPMA174 (DSM23214))。與單培養(yǎng)相比，當(dāng)此微生物與其它乳酸菌共培養(yǎng)時(shí)，L. plantarum DC400 (DSM23213)的細(xì)胞密度沒有顯著改變(P>0. 05) (9. 06±0. 34-9. 28±0. 421og ufc/ml)。L. plantarum DPPMA20、Lactobacillus paralimentarius (類食品乳桿菌)8D、L. pentosus12H5、Lactobacillus reuterie Weissella cibaria (羅伊氏乳桿菌食竇魏斯氏菌)10XA16的細(xì)胞產(chǎn)量未受到共培養(yǎng)條件的作用。相反，L.rossiae DPPMA174 (DSM23214)和P. pentosaceus 2XA3的細(xì)胞密度與單培養(yǎng)條件相比顯著降低(P〈0. 05)(約8. 08和8. 391og cfu/ml)0通常，當(dāng)與L. plantarum DC400CDSM 23213)共培養(yǎng)時(shí)，所有的乳酸菌的μ _值都會降低。除了 L. plantarum DPPMA20，所有的乳酸菌的λ潛伏期也會增加。在與L. plantarum DC400CDSM 23213)共培養(yǎng)時(shí)顯示出抑制的乳酸菌菌株(L. rossiae DPPMA174(DSM 23214)和P. pentosaceus 2XA)以及一些不受共培養(yǎng)條件影響的菌株(L. plantarumDPPMA20和L. pentosus 12H5)被用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中。
與前面的結(jié)果一致，當(dāng)從單培養(yǎng)轉(zhuǎn)到與L. plantarum DC400CDSM 23213)共培養(yǎng)的條件時(shí)，L. rossiae DPPMA174CDSM 23214)活細(xì)胞的數(shù)量從 9. 0±0· 28 降至 8. 32±0. 251og細(xì)胞/ml。活細(xì)胞和可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量沒有呈現(xiàn)顯著差異(P>0. 05)。再次參照單培養(yǎng)條件，當(dāng)處于與L. plantarum DC400 (DSM 23213)共培養(yǎng)的條件時(shí)，死亡或受損L. rossiaeDPPMA174 (DSM 23214)細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(Ρ〈0· 05)。同樣，當(dāng)乳酸菌與L. plantarumDC400 (DSM23213)共培養(yǎng)時(shí)，可培養(yǎng)？46社08306118細(xì)胞的數(shù)量也顯著(？〈0.05)降低。移除細(xì)胞后，單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的上清液用于通過nano-ESI/MS-MS質(zhì)譜法偶聯(lián)MDLC分析確定植物乳桿菌素型肽信息素。圖Ia顯示了 L. plantarum DC400 (DSM 23213)和L.rossiae DPPMA174 (DSM 23214)共培養(yǎng)樣品的全掃描色圖譜。由于基質(zhì)復(fù)雜，有可能鑒別ー些(菌)種，而相反，難以完全分離相鄰的峰。然而，對應(yīng)于特定的m/z值，信號過濾有可能分離共洗脫的種。圖Ib報(bào)道了ー個鑒別菌種的實(shí)例。已經(jīng)獲得每個種的MS/MS圖譜。例如圖Ic顯示了對應(yīng)1493. 7m/z值的圖譜,該值被選擇用于來自L. plantarum DC400(DSM 23213)和L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)共培養(yǎng)的樣品。指定以下參數(shù)用于在NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列搜索種(Lactobacillus),用于離子識別的m/z公差比(0. 2Da)和 用于分析的儀器。L. plantarum DC400CDSM 23213)和DPPMA20單培養(yǎng)以及其中DC400菌株與其它乳酸菌培養(yǎng)的所有共培養(yǎng)中，都觀察到植物乳桿菌素A(SEQ ID NO: ILys-Ser-Ser-AIa-Tyr-Ser-Leu-Gln-Met-Gly-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys——Gln-Val-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Trp-Gly-Trp)的存在。基于前面的結(jié)果，將來自單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的樣品用4個色譜運(yùn)行(run)進(jìn)行純化并且用nano-ESI-MS進(jìn)行進(jìn)ー步的分析，以排除其它肽污染。L. plantarum DC400(DSM 23213)合成的植物乳桿菌素A的濃度通過色譜分析確定，所述色譜分析采用反相C18XTerra柱(Waters, Mildford)和OPA法。圖2顯示了不同條件下植物乳桿菌素A的濃度。從單培養(yǎng)條件(約0. 06 μ g/ml)到L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)存在下的共培養(yǎng)條件(約2. 5μ g/ml)，可以觀察到肽信息素的合成產(chǎn)量增加了。在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，植物乳桿菌素A的濃度為約4. O μ g/ml。盡管在與其它乳酸菌種共培養(yǎng)的條件下觀察到植物乳桿菌素 A 的產(chǎn)生，得到的量比 L. plantarum DC400 (DSM 23213)和 L. rossiae DPPMA174(DSM 23214)共培養(yǎng)得到的明顯降低。此結(jié)果證明，在適于誘導(dǎo)信號分子釋放的特定微生物相互作用存在時(shí)，肽信息素的合成是特定的。植物乳桿菌素A的合成開始于中間的指數(shù)生長期(約7小吋)并且一直增加至指數(shù)期結(jié)束(約12小吋)。盡管濃度較低，即，約0.02-0. 06 μ g/ml，K型和N型植物乳桿菌素也僅在 L. plantarum DC400 (DSM 23213)和 L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)共培養(yǎng)時(shí)被檢測到。用CDM、葡萄汁、乳清或水果和蔬菜制品水提物作為共培養(yǎng)底物，得到相同的結(jié)果。(2) Lactobacillus rossiae DPPMAl74 (DSM 23214)的生長動力學(xué)將L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)在加入了 2. 5 μ g/ml 純化的或者化學(xué)合成的植物乳桿菌素A的WFH培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。在圖3中觀察到純化的植物乳桿菌素A的存在導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量明顯降低，即從9. 18±0. 26 (在單培養(yǎng)條件下)降至8. 4±0. 141og ufc/ml。用化學(xué)合成的植物乳桿菌素A得到了類似的結(jié)果。在這兩種情況下觀察到的結(jié)果跟L. plantarum DC400 (DSM 23213)和 L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果類似。當(dāng)在純化的或者化學(xué)合成的植物乳桿菌素A存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，受損的或死亡的L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)細(xì)胞數(shù)量顯著(P〈0. 05)高于單培養(yǎng)(約 8. 80±0. 141og個細(xì)胞/ml相對于6. 08±0· 221og個細(xì)胞/ml)。獲得的數(shù)據(jù)表明，L.plantarum DC400 (DSM 23213)對 L. rossiae DPPMA174 (DSM23214)的抑制作用是由植物乳桿菌素A以及(很可能地)其它屬于相同化學(xué)類別的肽信息素的合成引起的。(3) L.rossiae DPPMA174 (DSM 23214)中蛋白表達(dá)水平的變化與單培養(yǎng)相比，L.rossiae DPPMA174 (DSM 23214)與 L. plantarum DC400 (DSM
23213)共培養(yǎng)或者在純化的植物乳桿菌素A存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其細(xì)胞質(zhì)提取物的ニ維電泳分析分別顯示51和27種蛋白表達(dá)水平變化。所有在植物乳桿菌素A存在下高表達(dá)(hyper-express)的蛋白在共培養(yǎng)條件下也高表達(dá)。通過舉例的方式，圖4顯示了涉及單培養(yǎng)、與L. plantarum DC440共培養(yǎng)以及在純化的植物乳桿菌素A存在下單培養(yǎng)的條 件下的部分凝膠。對ー些更高表達(dá)的蛋白質(zhì)用質(zhì)譜分析法進(jìn)行鑒定并且發(fā)現(xiàn)其參與蛋白質(zhì)生物合成(氨酰-tRNA合成酶)、能量代謝(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶、こ醛-輔酶A脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和β -磷酸葡萄糖變位酶)、蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝(ATP依賴性Clp蛋白酶和R氨肽酶)、環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)(GroEL、GroES, S2和S5核糖體蛋白)以及氧化還原電位平衡(NADH氧化酶)。這些蛋白質(zhì)中的大多數(shù)也在其它乳酸菌中被鑒定，作為對環(huán)境壓カ條件和/或細(xì)胞通訊機(jī)制的反應(yīng)(Di Cagno等，2007.しell—ceil communication in sourdough lactic acid bacteria:a protomic study inLactobacillus sanfranciscensis CBl (酵頭乳酸菌的細(xì)胞-細(xì)胞通訊Lactobacillussanfranciscensis CBl的蛋白組學(xué)研究)· Proteomics (《蛋白組學(xué)》)第7卷2430-2446頁)。特別是，葡糖-6-磷酸脫氫酶以Escherichia coli (大腸埃希氏菌)細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制酶催化殺傷性五肽的釋放(Kolodkin-Gal等，2007. A linear pentapeptide isa quorum-sensing factor required for mazei—mediated cell death in Escherichiacoli(線性五肽是mazef介導(dǎo)的大腸埃希氏菌細(xì)胞死亡必需的群體感應(yīng)因子),Science(《科學(xué)》)第318卷652-655頁)。獲得的結(jié)果表明，作為植物乳桿菌素A合成的結(jié)果的L.rossiae DPPMA174 (DSM
23214)的抑制作用是基于細(xì)胞通訊機(jī)制并且(很可能地)適于觸發(fā)反應(yīng)導(dǎo)致目標(biāo)微生物死亡。這些結(jié)果證明了信號分子的殺菌效價(jià)。(4)對重建表皮的試驗(yàn)和TEER (跨膜電阻)確定來自濃度為2. 5 μ g/ml的植物乳桿菌素A的plantarum DC400 (DSM 23213)和L. rossiae DPPMA174 (DSM 23214)共培養(yǎng)以及與相同濃度2. 5 μ g/ml的共培養(yǎng)獲得的純化植物乳桿菌素A的生物質(zhì)樣品都根據(jù)SkinEthic 模型進(jìn)行了試驗(yàn)，用于重建人表皮的處理。此模型已被科學(xué)界廣泛應(yīng)用和接受(Di Cagno等,2009. Synthesis of y -aminobutyric acid (GABA) by Lactobaci丄丄us plantarum DSMZ19463: functional grape mustbeverage and dermatological application(通過 Lactobaci丄丄us plantarum DSMZ19463合成Y-氨基丁酸(GABA):功能性葡萄汁飲料以及皮膚學(xué)的應(yīng)用)，Appl BiotechnolMicrobiol (《應(yīng)用生物技術(shù)微生物學(xué)》)DOI: 10. 1007/s00253-009_23704)。經(jīng)過24小時(shí)的處理后，進(jìn)行TEER的測量。此種類型的分析已被國際科學(xué)界廣泛接受，其評價(jià)組織腐蝕性作為角質(zhì)層和屏障功能的完整性的參考。特別是，用此種評價(jià)可以獲得有關(guān)存在于角質(zhì)層級別的層狀致密結(jié)構(gòu)、緊密的整體連接部以及表皮厚度的信息。這些因素作為ー個整體限定了有效的屏障功能。圖5顯示了存在包含植物乳桿菌素的生物質(zhì)以及獲自物質(zhì)共培養(yǎng)的純化的植物乳桿菌素A吋，TEER值出現(xiàn)顯著增加(P〈0. 05)，從而證明了此分子在皮膚級別的保護(hù)作用。用化學(xué)合成的植物乳桿菌素A獲得了相同的結(jié)果。根據(jù)本領(lǐng)域目前的狀態(tài)，這是肽信息素應(yīng)用的第一個例子，其參與細(xì)菌細(xì)胞通訊機(jī)制，適于被表皮人細(xì)胞感知而導(dǎo)致屏障功能的激發(fā)。(5)對 Caco_2/TC7 細(xì)胞的試驗(yàn)Caco-2/TC7細(xì)胞的活力以中性紅染料吸收能力評估。與DMEM培養(yǎng)基(陰性對照)相比，用純化的植物乳桿菌素A(2. 5 μ g/ml)培育24-72小時(shí)顯著增加了 Caco-2/TC7細(xì)胞的 活力(圖6)。用化學(xué)合成的植物乳桿菌素A獲得了相同的結(jié)果。用從L.rossiae DPPMA174(DSM23214)單培養(yǎng)純化餾分獲得的樣品進(jìn)行處理，未觀察到誘導(dǎo)，所述純化餾分依照用于植物乳桿菌素A的相同色譜條件進(jìn)行洗脫。正如預(yù)期的，Caco-2/TC7細(xì)胞暴露于γ-干擾素(IFN-Y)導(dǎo)致活力顯著降低(Ρ〈0. 05)(圖7)。相反，當(dāng)用純化的或化學(xué)合成的植物乳桿菌素A同時(shí)處理吋，IFN-Y的負(fù)面作用被完全消除。加入純化的植物乳桿菌素A導(dǎo)致Caco-2/TC7細(xì)胞的TEER值明顯增加(P〈0. 05)(圖8)。用Caco_2/TC7細(xì)胞觀察到相同的結(jié)果。與DMEM培養(yǎng)基相比，加入IFN-Y顯著地(P〈0. 05)降低了 TEER值。然而，加入純化的或化學(xué)合成的植物乳桿菌素A也消除此種情況中的負(fù)面作用。Caco-2/TC7細(xì)胞是體外最常使用的用以模擬腸粘膜的系統(tǒng)之一。盡管它起源于腫瘤，但是所述細(xì)胞適于在成熟的腸細(xì)胞中自發(fā)地分化并且表達(dá)刷狀緣酶。在培養(yǎng)條件下，Caco-2/TC7細(xì)胞適于發(fā)展形態(tài)和功能特征，包括緊密的細(xì)胞間連接，其完整性通過TEER 測量確定(Sambuy 等,2005. The Caco_2cell line as a model of the intestinalbarrier:infuence of cell and culture-related factors on Cao_2cell functionalcharacteristics (Caco-2細(xì)胞系作為腸道屏障功能的模型細(xì)胞和培養(yǎng)相關(guān)的因素對Cao-2細(xì)胞功能特征的作用)，Cell Biol Toxicol (《細(xì)胞生物學(xué)和毒理學(xué)》)第21卷1-26頁)。這個研究的結(jié)果證明，純化的 L. plantarum DC400(DSM23213)和 L. rossiae DPPMA174(DSM 23214)共培養(yǎng)得到的或化學(xué)合成的植物乳桿菌素A適于刺激腸粘膜的屏障功能并防止Y-干擾素處理引起的負(fù)面作用。(6)用于植物乳桿菌素A的合成及其在皮膚學(xué)領(lǐng)域的用途的生物技術(shù)協(xié)議的發(fā)展如本文以上其它部分描述的，已開發(fā)出用于植物乳桿菌素A的合成及其在皮膚學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用的生物技術(shù)方法。所述方法包括a)在 mMRS 培養(yǎng)基上對 L. plantarum DC400 (DSM 23213)和 L. rossiae DPPMA174(DSM23214)進(jìn)行純培養(yǎng)；b)細(xì)胞收集、洗滌、重懸于適當(dāng)?shù)卣献鳛榕囵B(yǎng)基用于養(yǎng)分供應(yīng)的WFH、CDM、葡萄汁、乳清或者蔬菜或水果水提物中；c)共培養(yǎng)培育18-24小時(shí)，優(yōu)選地在30_37°C (優(yōu)選地30°C )培育24小時(shí)；d)通過離心分離細(xì)胞。根據(jù)程序的變形，此制備物也可以包含乳酸菌細(xì)胞；e)通過干燥或冷凍干燥方法進(jìn)行制備物脫水；f)生產(chǎn)皮膚學(xué)制備物。
實(shí)例2 :關(guān)于本發(fā)明生物質(zhì)和植物乳桿菌素A在傷ロ愈合中的作用的研究方法將經(jīng)培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞用植物乳桿菌素A (2. 5 μ g/ml)或包含植物乳桿菌素A的生物質(zhì)培育I小時(shí)。培育結(jié)束時(shí)，清洗細(xì)胞并恢復(fù)培養(yǎng)基。傷ロ愈合本試驗(yàn)包括對細(xì)胞單層的連續(xù)性進(jìn)行機(jī)械中斷，目的是對處理作用是否有利于角質(zhì)形成細(xì)胞遷移超過受損邊緣并因此“治愈損傷”的能力進(jìn)行評估。為此，如上所述進(jìn)行處理的角質(zhì)形成細(xì)胞單層在施加刺激后另外培養(yǎng)24小時(shí)，然后用蘇木素/伊紅染色法進(jìn)行固定和染色。圖像使用帶有5X物鏡的光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。
對于每個圖像，分別檢測和計(jì)算最大細(xì)胞遷移極限和距離或之間的間隙(圖9-10)。結(jié)果圖9中，報(bào)告了傷ロ愈合試驗(yàn)的結(jié)果。中斷細(xì)胞連續(xù)性后培育24小時(shí)，未受刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞單層(對照)顯示ー些細(xì)胞從傷ロ邊緣擴(kuò)展。然而當(dāng)細(xì)胞用透明質(zhì)酸刺激后，細(xì)胞遷移特別地明顯。在這種情況下，事實(shí)上傷ロ間隙比不進(jìn)行處理的細(xì)胞(對照)變窄了，證明了細(xì)胞遷移能力對傷ロ愈合的作用。為了分析評估細(xì)胞遷移能力，如圖10報(bào)告的，將傷ロ邊緣進(jìn)行描繪、測量并分析。與對照細(xì)胞相比，用植物乳桿菌素A或包含植物乳桿菌素A的生物質(zhì)培育的角質(zhì)形成細(xì)胞減少了傷ロ邊緣的間隙，如圖11所報(bào)告的，愈合的百分比與對照相比増加了。試驗(yàn)系統(tǒng)人重建表皮所用的表皮模型由Skinethic Laboratories, Nice (France) ( SkinetMc 實(shí)驗(yàn)室，尼斯(法國))制作并且被用作分化第17天的O. 5cm2的樣本，其批平均厚度為120μ (角質(zhì)層和活的表皮)。完全分化的表皮獲自人角質(zhì)形成細(xì)胞，該人角質(zhì)形成細(xì)胞在沒有添加小牛血清的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(MCDB 153)中，在多孔聚碳酸酷惰性載體上于氣-液界面培養(yǎng)17天；在此分化階段，形態(tài)學(xué)分析表明，多層有活力的表皮和角質(zhì)層由超過十層緊密的細(xì)胞層構(gòu)成。TEER 確定跨膜電阻(TEER)是皮膚屏障功能性的直接測量它反映了厚度和結(jié)構(gòu)作為ー個整體的組織電阻。它反映了緊密連接水平的細(xì)胞間接觸的完整性、免受外界物質(zhì)侵入的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性。TEER是試驗(yàn)鑒別參數(shù)——大鼠皮膚電阻(B 40)——用于腐蝕性評估的經(jīng)EU驗(yàn)證的測試，其被認(rèn)為是角質(zhì)層和屏障功能完整性的終點(diǎn)。當(dāng)在體內(nèi)測量時(shí)，它與TEWL成反比，TEWL是對經(jīng)皮失水的測量較高的TEWL對應(yīng)較高的屏障功能損傷，而較高的TEER對應(yīng)較低的屏障功能損傷。通過插入，給予Iml的PBS，并使用Millicell-ERS儀器(范圍0-20kQ)測量跨膜電阻。對每種組織進(jìn)行各種測量。圖5顯示了 TEER值，所述TEER值是3種組織的平均值，每種組織進(jìn)行了 3次測定。與TEER值有關(guān)的以下性質(zhì)是重要的存在于角質(zhì)層級別的層狀緊密結(jié)構(gòu)、完整的緊密連接部和表皮厚度，它們作為ー個整體限定了有效的屏障功能。每種組織引用自己在t=0和t=24小時(shí)的測定。獲得的結(jié)果特別有意思，事實(shí)上很明顯在植物乳桿菌素A和包含植物乳桿菌素A的生物質(zhì)存在下TEER都明顯增加。這種增加是表皮厚度増加和在緊密連接水平處角質(zhì)層的較好的緊密型和完整性所得到的結(jié)果。實(shí)例3 :植物乳桿菌素A :其對維持和修復(fù)皮膚屏障功能的作用的研究此研究基于獲自L. plantarum DC400 (DSM 23213)和 L. rossiae DPPMA174 (DSM
23214)共培養(yǎng)的植物乳桿菌素A的用途，目的在于獲得以下目標(biāo)通過與陽性對照(未處理的細(xì)胞)和商業(yè)可獲得的/陰性已知活性對照進(jìn)行比較，研究對人角質(zhì)形成細(xì)胞單層(NCTC2544)的遷移和増殖作用，評價(jià)生物質(zhì)對創(chuàng)傷修復(fù)的作用。用不同濃度的受試植物乳桿菌素(用細(xì)胞毒性試驗(yàn)進(jìn)行測定后)先后三次(24、48、72小吋)進(jìn)行處理。在考慮好的時(shí)間和濃度，與陽性對照(未處理的細(xì)胞)和商業(yè)可獲得的/陰性已知活性對照進(jìn)行比較，通過實(shí)時(shí)PCR的方法,評估介導(dǎo)劑調(diào)節(jié)(mediator modulation)如IL-8、KGF (角質(zhì)化細(xì)胞生長因子)、TGF-β I (轉(zhuǎn)化生長因子β )，分析細(xì)胞損傷反應(yīng)。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)物所用的細(xì)胞系為人NCTC 2544角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞系(Perry，V. P. ,Sanford，K. K.，Evans, V. J. , Hyatt, G. ff. , Earle, ff. R. ,1957. Establishment of clones of epithelialcells from human skin (建立人皮膚上皮細(xì)胞的無性系),J Natl Cancer Inst.(《國立癌癥研究所雜志》)，第18卷第5期709-717頁)，其在無菌燒瓶中培養(yǎng)，在37°C、CO2為5%的潮濕氣氛中，在加入10%牛的牛血清(bovine calfserum)(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、存在1%青霉素和鏈霉素的MEM (最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞在體外附著到培養(yǎng)板表面作為單層生長。通過傷ロ愈合對組織損傷隨時(shí)間推移修復(fù)情況的研究該方法的原理本實(shí)驗(yàn)首先涉及融合細(xì)胞單層的發(fā)展(development)。接著,進(jìn)行切割，并且當(dāng)細(xì)胞逐漸移動修復(fù)此損傷時(shí)用顯微鏡觀察到產(chǎn)生的“缺ロ”。這個瘢痕(cicatrisation)形成的過程(所述的“愈合”)可持續(xù)幾個小時(shí)至多于ー天，這取決于細(xì)胞系、傷情和范圍。實(shí)驗(yàn)程序接種NCTC 2544細(xì)胞，并在37°C、具有5%的CO2中培養(yǎng)24小時(shí)。經(jīng)過24小時(shí)后，用無血清培養(yǎng)基替換完全生長培養(yǎng)基以避免血清對細(xì)胞增殖的影響，并且將細(xì)胞在37°C、5%的CO2中進(jìn)ー步培育24小吋。24小時(shí)后，用溫和的200μ I移液器吸頭劃出ー個約Imm寬的水平線以對細(xì)胞單層進(jìn)行機(jī)械損傷。然后洗滌此單層并在加入待測物質(zhì)后，將平板在37°C、5%的CO2中培育72小吋。這些物質(zhì)對細(xì)胞運(yùn)動性(motility)的作用通過相位差倒置顯微鏡進(jìn)行評估，在各種適當(dāng)選擇的分析時(shí)間處獲取圖像。使用圖像處理軟件(萊卡(しが(^)成套應(yīng)用系統(tǒng))在切割后0、4、8、12、24、48和72小時(shí)測量切割后的兩條遷移前端之間的清晰面積，測定損傷修復(fù)。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計(jì)處理，用于0、4、8、12、24、48和72小時(shí)處的測定。利用實(shí)時(shí)PCR評估IL-8、KGF、TGF_g基因表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞損傷反應(yīng)分析此程序由3個基本的步驟構(gòu)成 I.從細(xì)胞中提取總RNAII.反轉(zhuǎn)錄成 cDNAIII.實(shí)時(shí) PCRI.從細(xì)胞中提取總RNA使用永生NCTC 2544人角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞系，其保持在培養(yǎng)瓶中，在37°C、CO2為5%的潮濕大氣中，在加入10%小牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、1%非必需氨基酸，在1%青霉素和鏈霉素存在下的MEM (最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。用200 μ I的移液器吸頭刮下此細(xì)胞系，并在不同的時(shí)間和不同的濃度進(jìn)行處理。II. RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA此過程包括用“高容量的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒”(Applied Byosistem (應(yīng)用生物系統(tǒng)))提取的RNA樣品的擴(kuò)增。III.實(shí)時(shí) PCR此過程包括用特定的Taqman基因試驗(yàn)和“TaqMan Universal PCR Master Mixwith Amperase UNG 2X” 試劑盒(Applied Biosystem)進(jìn)行 cDNA 擴(kuò)增。根據(jù)2_ΛΛα法，通過管家基因，進(jìn)行數(shù)據(jù)歸ー化和數(shù)據(jù)分析，使用相對類型量化以測定目標(biāo)基因表達(dá)相對于陽性對照(未處理的細(xì)胞)的可能變化。結(jié)果傷ロ愈合通過傷ロ愈合試驗(yàn)評估了共培養(yǎng)獲得的植物乳桿菌素改善人NCTC 2544角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的能力。此研究也涉及了合成的以及L. plantarum DC400和L. rossiae DPPMA174共培養(yǎng)獲得的植物乳桿菌素的作用的對比評價(jià)。用200μ I的移液器吸頭對細(xì)胞單層進(jìn)行切割后，兩條切割線之間的間隙內(nèi)的細(xì)胞被完全移除，所述細(xì)胞用合成的和共培養(yǎng)獲得的植物乳桿菌素在以下濃度進(jìn)行處理O. 1-1-10 μ g/ml O陽性和陰性對照(100 μ g/ml的連結(jié)劑)也被復(fù)制測試。在O時(shí)和4、8、12、24、48和72小時(shí)后獲取相同切割區(qū)域的圖像，以監(jiān)測切割區(qū)域的細(xì)胞遷移。圖12-16顯示了共培養(yǎng)的(O. 1、1和μ g/ml) (a)和合成的植物乳桿菌素(O. I、I和μ g/ml) (b)對NCTC 2544細(xì)胞系遷移的作用的時(shí)序分析。圖12顯示了兩種受試活性物以及陽性和陰性對照在每個經(jīng)過考慮的時(shí)間點(diǎn)(間隔4小時(shí))的瘢痕形成過程(Λ μ m/時(shí)間)。在細(xì)胞瘢痕形成的早期階段，在O時(shí)不可能檢測到對照和受試活性物細(xì)胞遷移之間有意義的區(qū)別。如圖12a中顯而易見的，與對照相比，濃度為O. I和lyg/ml的共培養(yǎng)的植物乳桿菌素不適合明顯加速細(xì)胞遷移。切割4小時(shí)后，此作用已經(jīng)顯著并且保持恒定和顯著直至72小吋。相反，用濃度為10 μ g/ml的共培養(yǎng)的植物乳桿菌素進(jìn)行處理，在所有經(jīng)過考慮的時(shí)間間隔都產(chǎn)生了堪比陽性對照(即未處理過的細(xì)胞)的組織損傷修復(fù)。用等量濃度的合成植物乳桿菌素在相同的時(shí)間段處理細(xì)胞所進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)證明，同樣在這種情況下，與陰性對照相比，用植物乳桿菌素(合成的)處理具有更強(qiáng)的加速兩條切割線間細(xì)胞遷移的能力。特別地，也是在這種情況下，在細(xì)胞瘢痕形成的早期階段不可能檢測到這兩個所用的對照和兩個在研究中的活性物在細(xì)胞遷移方面在O時(shí)有意義的區(qū)別。圖12b顯示了濃度分別為O. I和10 μ g/ml的合成植物乳桿菌素，在切割后4小時(shí) 后引起高于陽性和陰性對照的細(xì)胞遷移的増加，并在所有經(jīng)過考慮的時(shí)間間隔保持恒定直至72小吋。相反，采用濃度為10 μ g/ml的合成植物乳桿菌素進(jìn)行處理，產(chǎn)生了堪比于陽性和陰性對照的組織損傷的修復(fù)。為了更全面地包含并分析用共培養(yǎng)的和合成的植物乳桿菌素相對于陽性和陰性對照在所有經(jīng)過考慮的時(shí)間間隔的處理作用，我們統(tǒng)計(jì)分析了來自圖像分析的測量結(jié)果。圖13和14分別報(bào)告了對于用共培養(yǎng)的(圖13)和合成的植物乳桿菌素(圖14)進(jìn)行處理，遷移通過兩條切割線的細(xì)胞與陽性對照相比的百分比數(shù)據(jù)。此結(jié)果也分別作為兩條切割線和起始區(qū)域的面積百分比進(jìn)行了報(bào)告(圖15-16)。圖13和14中報(bào)告的圖表分別顯示了對于陽性和陰性對照、共培養(yǎng)的(O. 1-1和10 μ g/ml)和合成的植物乳桿菌素(O. 1-1和10 μ g/ml)，與在各個經(jīng)過考慮的時(shí)間間隔過程中遷移的細(xì)胞百分比有關(guān)的數(shù)據(jù)。與從圖像處理獲得的數(shù)據(jù)一致，在處理的最初8小時(shí)后，陰性對照不能繼續(xù)進(jìn)行切ロ瘢痕形成活動并且呈現(xiàn)與陽性對照類似的遷移細(xì)胞百分比。對于一般意義的共培養(yǎng)的植物乳桿菌素(圖13)，可以宣布，在所有三種使用的處理濃度下，可以勾畫出從O至72小時(shí)處理的細(xì)胞遷移的較大增量，在最低濃度處理時(shí)也是如此。特別是，用濃度為10μ g/ml的共培養(yǎng)的植物乳桿菌素處理，在所有考慮的時(shí)間間隔(除了 72小時(shí)處理后)顯示了最高的遷移百分比，但是這些數(shù)據(jù)并不顯著，遷移的細(xì)胞百分比值分別為 165. 56%、138. 18%、134. 64%、118. 08%、139. 07% 和 149. 04%。圖14顯示了用等量濃度合成的植物乳桿菌素在各考慮的時(shí)間間隔處理后遷移的細(xì)胞百分比。用濃度為O. I μ g/ml的合成植物乳桿菌素進(jìn)行處理，在所有考慮的時(shí)間間隔產(chǎn)生了最高的遷移細(xì)胞百分比值，從開始時(shí)間直至處理72小時(shí)的值分別是158. 30%、115. 15%、124. 32%、141. 82%、141. 91%和128. 51%。用濃度為10 μ g/ml的合成植物乳桿菌素處理，得到所有考慮的時(shí)間間隔的遷移細(xì)胞百分比，與用濃度為O. I μ g/ml的相同活性物處理的相比，但是同時(shí)與處理8至72小時(shí)后的陰性對照相比，導(dǎo)致的遷移細(xì)胞百分比增加較高，其百分比分別增加T +4. 62%、+20. 28%、+14. 84%和+7. 47%。相反，與陰性對照相比，用濃度為I μ g/ml的合成植物乳桿菌素處理僅僅在處理12和24小時(shí)后產(chǎn)生較大的遷移細(xì)胞百分比增加，其百分比值分別為+9. 86%和15. 48%。盡管用相同濃度的共培養(yǎng)的和合成的植物乳桿菌素處理細(xì)胞在所有考慮的時(shí)間間隔導(dǎo)致的遷移細(xì)胞百分比增加并未高于陰性對照，但是，將來自用共培養(yǎng)的植物乳桿菌素與來自用合成的植物乳桿菌素在可能的相同條件下處理人NCTC 2544角質(zhì)形成細(xì)胞的傷ロ愈合試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果證明，與考慮的陰性對照相比，共培養(yǎng)的植物乳桿菌素對通過產(chǎn)生的切割區(qū)域的細(xì)胞遷移產(chǎn)生較大的作用。TGFβ . I基因是參與瘢痕形成過程最多的。在所有考慮的用于傷ロ愈合監(jiān)測的時(shí)間，在處理8小時(shí)后進(jìn)行基因表達(dá)的評估，作為對獲自瘢痕形成評價(jià)的數(shù)據(jù)的確認(rèn)。獲得的結(jié)果說明并確認(rèn)了連結(jié)劑對瘢痕形成的明顯作用。
關(guān)于合成的植物乳桿菌素的數(shù)據(jù)指出，基因表達(dá)明顯増加，甚至可證明相同濃度(le 10 μ g/ml)的共培養(yǎng)的植物乳桿菌素刺激了較大的基因表達(dá)增加，進(jìn)ー步證實(shí)了生物質(zhì)的作用。
權(quán)利要求
1.生物技術(shù)方法，其用于合成包含或者由其組成的選自植物乳桿菌素A、N或K的至少一種植物乳桿菌素，或它們的混合物以及Lactobacillus pi ant arum DSM 23213和Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌,或者用于制備一種或多種選自于植物乳桿菌素A、N或K的植物乳桿菌素或它們的混合物，所述方法包括或者由以下步驟組成a)培養(yǎng)增通Lactobacillus pi ant arum DSM 23213 以及 Lactobacillus rossiae DSM23214乳酸菌； b)對選自CDM、WFH、葡萄汁、乳清或水果和蔬菜制品提取物的底物，利用步驟a)中限定的乳酸菌的水性懸液進(jìn)行聯(lián)合接種； c)培育；以及，任選地， d)對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，以除去乳酸菌細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中來自步驟a)的懸液的每種乳酸菌的細(xì)胞密度為約.9.OLog ufc/ml，并且相對于底物的體積將其以1%至4%的百分比加入到底物中。
3.根據(jù)上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中培育在30-37°C的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地在30°C下進(jìn)行，持續(xù)18-24小時(shí)，優(yōu)選地持續(xù)18小時(shí)。
4.根據(jù)上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中離心在10.000Xg、4°C下進(jìn)行離心15分鐘。
5.根據(jù)上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，進(jìn)ー步包括步驟e)，用于通過干燥或冷凍干燥使步驟d)中獲得的上清液脫水。
6.通過如權(quán)利要求1-5中任何ー項(xiàng)所限定的方法可得到的或得到的生物質(zhì)，所述生物質(zhì)包含或由以下組成選自植物乳桿菌素A、K或N的至少ー種植物乳桿菌素或它們的混合物以及 Lactobacillus pi ant arum DSM 23213 和 Lactobacillus rossiae DSM 23214 乳酸菌。
7.包含或由以下組成的藥用組合物或者化妝品組合物權(quán)利要求6所限定的生物質(zhì)，其作為有效成分，連同一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或佐劑。
8.如權(quán)利要求6所限定的生物質(zhì)或如權(quán)利要求7所限定的組合物的用途，所述生物質(zhì)或組合物用于制備藥物以增強(qiáng)表皮或者腸壁的屏障功能。
9.如權(quán)利要求6所限定的生物質(zhì)或如權(quán)利要求7所限定的組合物用于制備使傷ロ愈合的藥物的用途。
10.Lactobacillus pi ant arum DSM 23213 以及 Lactobacillus rossiae DSM 23214 乳酸菌或者它們的混合物。
11.ー種或多種植物乳桿菌素用于制備藥物以增強(qiáng)表皮的屏障功能的用途，所述ー種或多種植物乳桿菌素選自植物乳桿菌素A、K或N，優(yōu)選為植物乳桿菌素A。
12.—種或多種植物乳桿菌素用于制備使傷ロ愈合的藥物的用途，所述ー種或多種植物乳桿菌素選自植物乳桿菌素A、K或N，優(yōu)選為植物乳桿菌素A。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物質(zhì)的制備方法，該生物質(zhì)包括一種或多種植物乳桿菌素A、N或K，連同用于制備的乳酸菌，及其用途，以刺激腸細(xì)胞或人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的屏障功能。
文檔編號A61Q19/08GK102844039SQ201180013649
公開日2012年12月26日 申請日期2011年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日
發(fā)明者G·朱利亞尼, A·本納杜斯, M·戈貝蒂, R·迪家格諾, M·德安格利斯, M·加拉索 申請人:吉利亞尼股份公司