植物乳桿菌固定化制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物菌劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 乳酸菌是對一類能利用可發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。在分類學(xué)上屬于 非正式、非規(guī)范的慣用名稱，但因為它很容易被人們所理解和接受而廣泛引用。乳酸菌是正 常人體腸道中極為重要的生理菌群之一，它具有維持人體微生態(tài)平衡、促進(jìn)消化、防癌抗 癌、增強(qiáng)免疫力、抗衰老等作用，與機(jī)體健康息息相關(guān)。近年來，乳酸菌作為一種有益菌得到 了廣泛的研究和開發(fā)，目前已廣泛應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥和食品等行業(yè)中 [1]。但是乳酸菌較 難長期保存，因此，乳酸菌的保藏成了熱門的研究課題。利用真空冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)活菌制 劑是多種保藏方法中較為理想的一種 [2]。而制作菌粉的關(guān)鍵是保護(hù)劑種類及配比的選擇。 因此，選擇一種使用便捷的保藏形式，以及研究使菌種存活率高的保護(hù)劑配方有著積極意 義。
[0003] 乳酸菌容易退化、失活，如何解決乳酸菌的保藏是生產(chǎn)中面臨的首要問題。目前， 日本把培養(yǎng)的乳酸菌制成懸浮液密封在包裝材料里(包裝材料可用合成樹脂薄膜制或用鋁 箱制），其裝量可根據(jù)具體情況而定。封好的乳酸菌懸液，一定要保存在30°C以下，最好在Ο-? 〇°C 保存。
[0004] 乳酸菌的長期保藏方法，多采用冷凍干燥法或噴霧干燥法，將乳酸菌制成粉劑，用 以延長保存時間。冷凍干燥是將欲保藏的微生物細(xì)胞懸浮液凍結(jié)后，在真空條件下使冰升 華，最后達(dá)到干燥的目的。此方法主要是根據(jù)微生物生理、生化特點(diǎn)，干燥后使微生物的代 謝處于不活潑、生長繁殖受到抑制，達(dá)到休眠狀態(tài)，以保持菌株原有特性。而且用這種方法 生產(chǎn)的發(fā)酵劑與噴霧干燥法等其他方法生產(chǎn)的發(fā)酵劑相比具有更高的穩(wěn)定性、活性。
[0005] 但真空冷凍干燥過程是使發(fā)酵液中的游離水在凍結(jié)狀態(tài)下失去的一個過程，冷凍 和干燥兩個過程會造成部分微生物細(xì)胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化 [8]，如果凍 干工藝中保護(hù)劑選擇不當(dāng)，就會使乳酸菌的存活率下降。發(fā)酵液干燥前后乳酸菌的存活率 大小可直接體現(xiàn)不同保護(hù)劑對乳酸菌活力的影響。因此，凍干保護(hù)劑是制作干燥發(fā)酵劑最 為關(guān)鍵的因素之一，它不僅影響發(fā)酵劑在凍干過程中的細(xì)胞存活率，也影響保藏期間的細(xì) 胞穩(wěn)定性。
[0006] 如今對于微生物菌粉保護(hù)劑的研究日益深入，駱承庫、劉振民等[9]研究發(fā)現(xiàn)乳酸 菌經(jīng)過凍融處理后，致死率增加。引起致死損傷的主要因素是機(jī)械效應(yīng)、溶質(zhì)效應(yīng)和干燥效 應(yīng)。在冷凍保存菌種時加入保護(hù)劑或采取適宜的凍藏、凍干條件，可以減輕菌體的生理性或 致死性損傷。保護(hù)劑明顯提高菌體存活率的原因是由于：
[0007] ①保護(hù)劑存在的氫鍵和/或離子基團(tuán)具有與細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，這種結(jié)合起 到穩(wěn)定細(xì)胞蛋白結(jié)構(gòu)的作用，從而保護(hù)菌體，避免損傷。不同保護(hù)劑結(jié)合能力不同，所形成 的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊密程度就不一樣。
[0008] ②保護(hù)劑的持水性和形成的網(wǎng)絡(luò)，使得干燥過程中細(xì)胞的水分不至于急劇下降， 而使細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，菌體受損。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越緊密，干劑殘存水分含量越高。
[0009] ③網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)還使較多的菌體被包裹其中，從而減少菌體與氧氣接觸的機(jī)會，得到 較好的保護(hù)。而纖維結(jié)構(gòu)表面積大，包裹的菌相對較少，大量的菌體暴露于表面，受損嚴(yán)重。
[0010] 保護(hù)劑可以改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學(xué)環(huán)境，進(jìn)而減輕或防止冷凍干 燥或復(fù)水對細(xì)胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性。保護(hù)劑按作用 方式可分為能透入細(xì)胞的保護(hù)劑和不能透入細(xì)胞的保護(hù)劑2種，按分子大小分為低分子化 合物(如低聚糖類、醇類、緩沖鹽類、氨基酸和維生素類） [1<)]和高分子化合物(如蛋白質(zhì)、多 肽和多糖類)[11]。曹永梅[12]等對大分子保護(hù)劑對乳酸菌的保護(hù)作用進(jìn)行了研究，他們認(rèn)為 以脫脂奶粉與蔗糖、甘油復(fù)配后的保護(hù)效果最佳。這是因為三者具有互補(bǔ)作用，脫脂奶粉主 要在細(xì)胞表面起保護(hù)層作用，甘油能滲透到細(xì)胞內(nèi)部。呂為群等 [13]提出作為低分子保護(hù)劑 應(yīng)具有較強(qiáng)親水性，結(jié)構(gòu)上應(yīng)具備3個以上氫鍵，對糖、醇而言應(yīng)有5個以上羥基，可與菌體 細(xì)胞膜的磷脂中的磷酸基團(tuán)或與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵 [14]，從而保持菌體結(jié)構(gòu)與 功能的完整。而大分子保護(hù)劑主要是通過包裹菌體而起到保護(hù)作用，且能對低分子保護(hù)劑 有促進(jìn)作用 [11>14]，可兩者協(xié)同使用效果更佳。
[0011]隨著20世70年代興起的固定化微生物細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，為細(xì)胞濃縮和發(fā)酵劑保藏 開辟了新的途徑。人們發(fā)現(xiàn)固定化的微生物細(xì)胞因受固定化材料的保護(hù)而提高了微生物對 環(huán)境的適應(yīng)性。把細(xì)胞固定在某種載體上，可提高細(xì)胞的穩(wěn)定性、抗污染能力，并縮短細(xì)胞 的延遲期。細(xì)胞的固定化材料很多，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乙烯醇等無毒性的聚合物，其能夠形 成凝膠狀結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0012]本發(fā)明提供一種植物乳桿菌固定化制劑及其制備方法。
[0013]技術(shù)方案如下：
[0014]植物乳桿菌固定化制劑由如下方法制得植物乳桿菌液體培養(yǎng)到對數(shù)期中后期時 停止發(fā)酵離心收集菌體備用。
[0015]冷凍干燥保護(hù)劑以10%脫脂乳為懸浮基質(zhì)，添加2-5%小分子聚谷氨酸(20萬Da)、 1-2 %大分子普魯蘭多糖、5-12 %麥精，混合冷凍干燥保護(hù)劑溶液稀釋菌體，將懸浮液中菌 體濃度調(diào)節(jié)為101()cfu/mL左右。懸浮液lmL置于-20°C冰箱預(yù)凍4小時后，置于真空度為1 .Opa 的冷凍干燥器凍干24小時制得菌粉。
[0016] 植物乳桿菌為CGMCC NO. 11763,所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)于 2015年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)，保 藏號為，保藏地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵 編：100101 〇
[0017] 植物乳桿菌益生特性如下：
[0018] 本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC N0.11763經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)能夠在pH為1.50的條件 下存活，在1%膽鹽培養(yǎng)4小時后仍處于存活狀態(tài);植物乳桿菌CGMCC N0.11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達(dá)到10.9mg/h/kg，該菌種在生產(chǎn)泡菜時，整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kg以下；CGMCC N0.11763在發(fā)酵60h小時后，對膽固醇降解率可達(dá)到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力測定的自凝集率為95 · 71 %。
[0019] CGMCC NO. 11763對膽固醇降解能力研究和測定：
[0020] 取lml CGMCC N0.11763母液接種于10mL的MRS膽固醇液體培養(yǎng)基（膽固醇含量 0.1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒溫靜置分別培養(yǎng)20h、40h、60h備用，以接入lmL無菌水的MRS 膽固醇培養(yǎng)基為對照，取以上培養(yǎng)不同時間的菌液樣品及對照液各lml，9000r/min，4°C下 離心10min，得到發(fā)酵上清液，鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . lml于相應(yīng)的試管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的鄰苯二甲醛0.15ml，緩緩加入濃硫酸 1.0ml，混合均勻。室溫靜置lOmin，于550nm下測吸光值）。每一處理3個重復(fù)，以同樣方法制 作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算上清液中膽固醇含量及降解率，結(jié)果見表1。可知，CGMCCN0.11763 對膽固醇有很好的降解作用，在發(fā)酵60h小時后，降解率可達(dá)到64.76%。
[0021] 表1對膽固醇的降解情況
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[0023] 菌CGMCC NO. 11763菌株的耐膽鹽試驗：
[0024] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接種菌種于含有不同膽鹽（含量梯度為0.0%、0.2%