皮膚更新生長因子及其于皮膚保養(yǎng)的用途及含其的保養(yǎng)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種皮膚更新生長因子，該皮膚更新生長因子是由豬全血分離出血小板后，通過活化劑激活血小板，然后經(jīng)過離心以及冷凍干燥而得之；本發(fā)明更提供一種前述的皮膚更新生長因子促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生的用途；本發(fā)明再提供一種前述的皮膚更新生長因子抑制黑色素分泌的用途；本發(fā)明再提供一種用于皮膚保養(yǎng)的保養(yǎng)品，其包含前述皮膚更新生長因子。本發(fā)明的皮膚更新生長因子可長時間保存，且由豬血獲得利于大規(guī)模制造，相當(dāng)具有經(jīng)濟(jì)效益，并可用于保養(yǎng)皮膚的保養(yǎng)品，由此促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生以及抑制黑色素分泌。
【專利說明】皮膚更新生長因子及其于皮膚保養(yǎng)的用途及含其的保養(yǎng)品
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種皮膚更新生長因子，尤指一種由豬全血分離血小板，并通過活化劑激活血小板以及離心及冷凍干燥的方法而得的皮膚更新生長因子。
【背景技術(shù)】
[0002]血小板(platelets)于醫(yī)學(xué)上應(yīng)用已有很長的一段時間，尤其是血小板所衍生的生長因子，可應(yīng)用于組織工程以及傷口愈合。其中血小板豐富血漿(platelet-richplasma, P RP)是由聚集血小板(aggregated platelets)釋放血小板顆粒(plateletgranules)所得的富含生長因子(growth factors,GFs)濃縮液,其生長因子包括血小板衍生生長因子(platelet-derivedgrow factor, F1DGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growthfactor β , TGF-β )、基本纖維母細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)、類膜島素生長因子 1、II (insulin-like growthfactor-1, II，IGF-1, II)以及與類胰島素生長因子1、II結(jié)合的類胰島素生長因子結(jié)合蛋白(IGF binding protein, IGFBPs),并且上述生長因子具有促進(jìn)傷口愈合、修補(bǔ)組織以及血管新生等特性，血小板豐富血衆(zhòng)被廣泛應(yīng)用矯型外科學(xué)(orthopaedics)、運動相關(guān)傷害(sport-relatedinjuries)、腫瘤生物學(xué)(cancer biology)以及皮膚學(xué)(dermatology)等。
[0003]自體血小板豐富血漿雖可避免傳染性疾病的缺點，但自體可萃取的血小板有限，且萃取所得的血小板為液狀，以及血小板生命周期短(約為7天至10天)，而使得保存血小板豐富血漿相當(dāng)困難，并使得血小板豐富血漿應(yīng)用于大面積的傷口以及保養(yǎng)品大規(guī)模量產(chǎn)相當(dāng)有限，而且現(xiàn)有技術(shù)的血小板豐富血漿僅應(yīng)用于傷口愈合以及修補(bǔ)組織。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)的血小板豐`富血漿保存不易、且源于自體所萃取而得的血小板豐富血漿相當(dāng)有限。因此，研發(fā)出一種可長時間維持活性的血小板豐富血漿，并使其應(yīng)用于保養(yǎng)品，仍是本領(lǐng)域亟待解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種由豬全血(porcine wholeblood)分離血小板，并通過活化劑激活血小板，以及離心及冷凍干燥的方法而得的皮膚更新生長因子(skin renewal growth factors, SRGF),該皮膚更新生長因子可長時間維持活性，并將該皮膚更新生長因子應(yīng)用于皮膚保養(yǎng)等相關(guān)領(lǐng)域。
[0006]為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供一種皮膚更新生長因子，該皮膚更新生長因子是由豬全血分離出血小板后，通過活化劑激活血小板，然后經(jīng)過離心以及冷凍干燥而獲得該皮膚更新生長因子，其中該皮膚更新生長因子具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
[0007]依據(jù)本發(fā)明，“活化劑激活血小板”如此處所指是利用活化劑與與血小板共培育，而與血小板反應(yīng)，釋放出適當(dāng)細(xì)胞激素。優(yōu)選地，是通過將活化劑與血小板置于一容器中，搖晃該容器使得血小板細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器的阿法顆粒(a granule)被活化而釋放皮膚更新生長因子。
[0008]在上述皮膚更新生長因子中，優(yōu)選地，所述活化劑為牛凝血酶以及氯化鈣。
[0009]在上述皮膚更新生長因子中，更優(yōu)選地，所述牛凝血酶在所述血小板中的濃度為20U/mL至30U/mL ;氯化鈣在所述血小板中的質(zhì)量濃度為7.5%至15%。
[0010]依據(jù)本發(fā)明，“冷凍干燥”如此處所指是將皮膚更新生長因子經(jīng)過瞬間降溫使其凝固，并于緩慢回復(fù)至室溫環(huán)境下連續(xù)抽真空并析出水分所制得。
[0011]在上述皮膚更新生長因子中，優(yōu)選地，所述冷凍干燥是經(jīng)過將一諸如經(jīng)培育的培養(yǎng)基的樣品瞬間降溫凝固呈固態(tài)；緩慢上升溫度，使得樣品內(nèi)水氣升華至空氣中；連續(xù)低壓令水分從樣品中升華；提升溫度，使樣品回溫過程中避免水分再次滲入樣品；維持環(huán)境溫度，使樣品適應(yīng)環(huán)境溫度時的濕度，達(dá)到平衡狀態(tài)，以取得所欲的皮膚更新生長因子。
[0012]依據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，“適應(yīng)環(huán)境溫度時的濕度，達(dá)到平衡狀態(tài)”如此處所指是樣品于平均濕度為60%至70%的無菌室中，封裝并冷藏于-20°C以下，即可長時間保持皮膚更新生長因子的品質(zhì)。
[0013]依據(jù)本發(fā)明，所述的皮膚更新生長因子的品質(zhì)包括皮膚更新生長因子可以促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
[0014]在上述皮膚更新生長因子中，更優(yōu)選地，所述冷凍干燥包含以下7個區(qū)段:區(qū)段I是于零下20°C保持5小時；區(qū)段2至區(qū)段4是于32小時內(nèi)，緩慢地將溫度由零下10°C提升4°C;區(qū)段5是于10°C保持16小時，并連續(xù)抽真空；區(qū)段6是于25°C保持15小時；區(qū)段7是維持于27°C—段時間，以達(dá)到平衡狀態(tài)；該達(dá)到平衡的時間可無限延長至經(jīng)冷凍干燥的含有皮膚更新生長因子的樣品被使用之前。
[0015]本發(fā)明更提供一種皮膚更新生長因子促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生的用途，其包含:
[0016]齊備一如前述的皮膚更新生長因子，其通過促使皮膚細(xì)胞的纖維母細(xì)胞數(shù)量增多、促進(jìn)膠原蛋白表現(xiàn)、增加蛋白多糖(proteoglycan)合成以及抑制角質(zhì)細(xì)胞分化以達(dá)到促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生。換而言之，本發(fā)明提供一種皮膚更新生長因子在具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生作用的保養(yǎng)品中的應(yīng)用。
[0017]依據(jù)本發(fā)明，“促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生”如此處所指意指能夠促使皮膚細(xì)胞的纖維母細(xì)胞數(shù)量增多、促進(jìn)膠原蛋白表現(xiàn)、增加蛋白多糖合成以及抑制角質(zhì)細(xì)胞分化，根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生可透過活體外細(xì)胞增生倍率、蛋白多糖合成增加以及角質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因表現(xiàn)予以測定而得。
[0018]在上述方法中，優(yōu)選地，所述抑制角質(zhì)細(xì)胞分化是指抑制包括，但不限于基膜素V (IamininV)及角蛋白10 (keratin 10)的基因表現(xiàn)。
[0019]在上述方法中，優(yōu)選地，以總重量為基礎(chǔ)，所述促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生的皮膚更新生長因子的質(zhì)量濃度為0.06wt%至0.3wt%。
[0020]本發(fā)明再提供一種皮膚更新生長因子抑制黑色素分泌的用途，其包含:
[0021]齊備一如前述的皮膚更新生長因子，其通過抑制皮膚的黑色素細(xì)胞增殖以及抑制黑色素生成的相關(guān)基因或蛋白酶表現(xiàn)以達(dá)到抑制黑色素分泌。換而言之，本發(fā)明提供一種皮膚更新生長因子在具有抑制黑色素分泌作用的保養(yǎng)品中的應(yīng)用。
[0022]依據(jù)本發(fā)明，“抑制黑色素分泌”如此處所指意指能夠抑制皮膚的黑色素細(xì)胞增殖以及抑制黑色素生成的相關(guān)基因或蛋白酶表現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，其可抑制PAX3 (paired box 3)基因表現(xiàn)、抑制小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associtated transcription factor, MITF)基因表現(xiàn)、抑制酪胺酸酶(tyrosinase)表現(xiàn)以及抑制黑色素分泌，并可透過活體外細(xì)胞抑制增生倍率以及抑制上述相關(guān)基因表現(xiàn)予以測定而得。
[0023]在上述方法中，優(yōu)選地，以總重量為基礎(chǔ)，所述抑制黑色素分泌的皮膚更新生長因子的質(zhì)量濃度為0.06wt%至0.3wt%。
[0024]本發(fā)明再提供一種用于皮膚保養(yǎng)的保養(yǎng)品，其包含如前述的皮膚更新生長因子。
[0025]本發(fā)明通過豬全血分離出血小板后，通過活化劑激活血小板，并經(jīng)過離心以及冷凍干燥所得的皮膚更新生長因子經(jīng)證實具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生以及抑制黑色素分泌的功效；相較于現(xiàn)有技術(shù)的血小板豐富血漿，本發(fā)明經(jīng)特定濃度的活化劑激活血小板后，可釋放較多皮膚更新生長因子，且該皮膚更新生長因子經(jīng)由冷凍干燥可避免冷凍或\及解凍過程中形成冰晶而破壞生長因子的結(jié)構(gòu)以及可降低污染的機(jī)率，而使得本發(fā)明的皮膚更新生長因子可長時間保存并具有較高的活性，且由豬血獲得較利于較大規(guī)模制造，相當(dāng)具有經(jīng)濟(jì)效益，是以能作為一種新穎的、用于皮膚保養(yǎng)的保養(yǎng)品，由此來促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生以及抑制黑色素分泌。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為實施例的皮膚更新生長因子于不同活化劑比例的活性表現(xiàn)圖。
[0027]圖2為實施例的皮膚更新生長因子以冷凍干燥處理的區(qū)段所需時間與溫度的曲線圖。
[0028]圖3為實施例的經(jīng)冷凍干燥處理的皮膚更新生長因子粉末與溶液狀態(tài)的皮膚更新生長因子的活性曲線圖。
[0029]圖4為實施例的經(jīng)冷凍干燥處理的皮膚更新生長因子再經(jīng)研磨處理與研磨前的活性比較的柱狀圖。
[0030]圖5為實施例的經(jīng)冷凍干燥處理的皮膚更新生長因子于零下20°C保存4年后，與新鮮制備的皮膚更新生長因子的活性比較的柱狀圖。
[0031]圖6A為實施例的含有0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于促進(jìn)人類皮膚纖維母細(xì)胞增殖的柱狀圖。
[0032]圖6B為實施例的對照組的人類皮膚纖維母細(xì)胞狀態(tài)圖。
[0033]圖6C為實施例的含有0.3wt%皮膚更新生長因子的人類皮膚纖維母細(xì)胞狀態(tài)圖。
[0034]圖7為實施例的含有0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于促進(jìn)人類皮膚纖維母細(xì)胞的膠原蛋白次型的增加倍率的柱狀圖。
[0035]圖8A為實施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于促進(jìn)人類皮膚纖維母細(xì)胞的蛋白多糖合成的柱狀圖。
[0036]圖8B為實施例的以艾爾遜藍(lán)染色評估含有0.06wt%、0.15wt%&0.3wt%皮膚更新生長因子的培養(yǎng)液對于促進(jìn)蛋白多糖合成影響的人類皮膚纖維母細(xì)胞染色圖。
[0037]圖9A為實施例的含有0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于抑制人類表皮角質(zhì)細(xì)胞增殖的柱狀圖。[0038]圖9B為實施例的對照組的人類表皮角質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)圖。
[0039]圖9C為實施例的含有0.3wt%皮膚更新生長因子的人類表皮角質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)圖。
[0040]圖10為實施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于抑制人類表皮角質(zhì)細(xì)胞的基膜素V的柱狀圖。
[0041]圖11為實施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于抑制人類表皮角質(zhì)細(xì)胞的角蛋白10的柱狀圖。
[0042]圖12A為實施例的含有0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于抑制人類黑色素細(xì)胞生長的柱狀圖。
[0043]圖12B為實施例的對照組的人類黑色素細(xì)胞狀態(tài)圖。
[0044]圖12C為實施例的含有0.3wt%皮膚更新生長因子的人類黑色素細(xì)胞狀態(tài)圖。
[0045]圖13為實施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于抑制人類黑色素細(xì)胞的PAX3基因表現(xiàn)的柱狀圖。
[0046]圖14為實施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于抑制人類黑色素細(xì)胞的MITF基因表現(xiàn)的柱狀圖。
[0047]圖15為實施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于抑制人類黑色素細(xì)胞的酪胺酸酶表現(xiàn)的柱狀圖。
[0048]圖16為實施例的含有0.3wt%皮膚更新生長因子與對照組對于抑制人類黑色素細(xì)胞分泌黑色素的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0049]本發(fā)明將由下列的實施例作為進(jìn)一步說明，這些實施例并不限制本發(fā)明前面所揭示的內(nèi)容。所述領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，可以做些許的改良與修飾，但不脫離本發(fā)明的范疇。
[0050]制備例
[0051]材料與方法[0052]1.化學(xué)藥品與試劑
[0053]牛凝血酶(bovine thrombin)購自美國SIGMA公司；氯化鈣(CaCl2)購自美國SIGMA 公司；酵素免疫分析套組(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)購自德國Quantikine公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國GIBCO公司；青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin)購自美國GIBCO公司；杜氏改良英格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle' s medium, DMEM)購自美國 GIBCO 公司；M154 基礎(chǔ)培養(yǎng)液(M154basal medium)購自美國Cascade Biologies公司；含有人類黑色素細(xì)胞生長添加劑(human melanocyte growth supplement-2, HMGS-2)的 254 培養(yǎng)液(254medium)購自美國Cascade Biologies公司；3_(4, 5_ 二四基噻唑_2) _2, 5_ 二苯基四氮唑溴鹽{3_[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT}購自德國 Roche公司；Trizol?'試劑以及SuperSuMple III 反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)購自美國Invitrogen公司；Taq脫氧核糖核酸聚合酶(Taq DNA polymerase)購自美國Invitrogen公司；洋菜膠(agarose gel)購自美國AMRESC0公司。
[0054]2.細(xì)胞培養(yǎng)
[0055]成人人類皮膚纖維母細(xì)胞(adult human dermal fibroblast, hDFa)購自美國CascadeBiologics公司，細(xì)胞以每毫升5X IO5密度培養(yǎng)于含有體積濃度10v/v%胎牛血清、1￥八％的靑霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，并于37°C含有體積濃度5%二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0056]人類表皮角質(zhì)細(xì)胞(humandermal keratinocyte, HEK)購自美國 CascadeBiologies公司，細(xì)胞以每毫升5 X IO5密度培養(yǎng)于含有體積濃度10v/v%胎牛血清、lv/v%的靑霉素-鏈霉素的M154基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并于37°C含有體積濃度5%二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0057]人類黑色素細(xì)胞(humanepidermal melanocytes)購自美國 Cascade Biologies公司，細(xì)胞以每毫升5X IO5密度培養(yǎng)于含有體積濃度10V/V%胎牛血清、1V/V%的靑霉素-鏈霉素以及含有人類黑色素細(xì)胞生長添加劑的254培養(yǎng)液，并于37°C含有體積濃度5 %二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0058]3.方法
[0059](I)制備皮膚更新生長因子(skin renewal growth factors, SRGF)
[0060]將豬全血收集后，通過MCS+血衆(zhòng)收集系統(tǒng)(MCS+plasma collection system)(購自美國Haemonetics公司)分離血小板。
[0061]表1以不同濃度、種類活化劑所使用的濃度
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種皮膚更新生長因子，該皮膚更新生長因子是由豬全血分離出血小板后，通過活化劑激活血小板，然后經(jīng)過離心以及冷凍干燥而獲得該皮膚更新生長因子，其中該皮膚更新生長因子具有促進(jìn)細(xì)胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
2.如權(quán)利要求1所述的皮膚更新生長因子，其中，所述活化劑為牛凝血酶以及氯化鈣。
3.如權(quán)利要求2所述的皮膚更新生長因子，其中，所述牛凝血酶的濃度為20U/mL至30U/mL ;所述氯化鈣的質(zhì)量濃度為7.5%至15%。
4.一種用于保養(yǎng)皮膚的保養(yǎng)品，其包含如權(quán)利要求1至3任一項所述的皮膚更新生長因子。
5.一種皮膚更新生長因子促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生的用途，其包含: 齊備一如權(quán)利要求1至3任一項所述的皮膚更新生長因子，其通過促使皮膚細(xì)胞的纖維母細(xì)胞數(shù)量增多、促進(jìn)膠原蛋白表現(xiàn)、增加蛋白多糖合成以及抑制角質(zhì)細(xì)胞分化以達(dá)到促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述抑制角質(zhì)細(xì)胞分化是指抑制基膜素V及角蛋白10的基因表現(xiàn)。
7.如權(quán)利要求5或6所述的用途，其中，以總重量為基礎(chǔ)，所述皮膚更新生長因子的質(zhì)量濃度為0.06%至0.3%0
8.一種皮膚更新生長因子抑制黑色素分泌的用途，其包含: 齊備一如權(quán)利要求1至3任一項所述的皮膚更新生長因子，其通過抑制皮膚的黑色素細(xì)胞增殖以及抑制黑色素生成 的相關(guān)基因或蛋白酶表現(xiàn)以達(dá)到抑制黑色素分泌。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述黑色素生成的相關(guān)基因或蛋白酶為PAX3基因、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因以及酪胺酸酶。
10.如權(quán)利要求8或9所述的用途，其中，以總重量為基礎(chǔ)，所述皮膚更新生長因子的質(zhì)量濃度為0.06%至0.3%。
【文檔編號】A61Q19/00GK103524613SQ201210229686
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月4日
【發(fā)明者】羅文政, 陳韋弘, 林佐文 申請人:晶光源生技股份有限公司