同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜及制備方法。是利用同軸三通道靜電紡絲技術(shù)，將生物酶包埋于緩釋激活劑和多孔聚合物的夾層內(nèi)，構(gòu)成從里至外依次為緩釋激活劑層（1）、固定化生物酶層（2）和多孔聚合物層（3）的三明治結(jié)構(gòu)的多孔納米纖維膜，構(gòu)建相互貫通的孔道結(jié)構(gòu)，從而增大酶固載量，促進酶與底物的充分接觸，降低酶與底物的傳質(zhì)阻力，有效提高酶的催化效率和重復(fù)利用性，降低生物酶的環(huán)境敏感性和提高生物酶在復(fù)雜環(huán)境下應(yīng)用的持久穩(wěn)定性。
【專利說明】同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種靜電紡絲納米纖維膜及制備方法，尤其是一種所固定的生物酶具有高活性、持久穩(wěn)定性和環(huán)境廣譜性強等特點的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物酶固定化技術(shù)是采用化學(xué)或物理方法，將游離細胞定位于限定的區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用的技術(shù)，這種技術(shù)具有生物酶密度高、作用時間長、抗不良環(huán)境能力強、生物酶流失少等優(yōu)點。已有的生物酶固定化方法有吸附法、共價法、交聯(lián)法和包埋法等，吸附法是最簡單、最直接的酶固定化方法，具有操作簡便、固定化過程溫和、酶活力回收率高、載體易得且可再生等優(yōu)點，但酶和載體的結(jié)合力較弱，酶易受外界因素的影響而脫落；共價結(jié)合法是目前研究和應(yīng)用較多的一類方法，為了便于進行酶的固定化，通常載體上都帶有官能團，如芳香氨基、羥基、羧基、羥甲基和氨基等，共價結(jié)合法固定的酶穩(wěn)定性高，但由于固定化過程反應(yīng)劇烈，酶失活較嚴(yán)重，且載體不易再生。
[0003]靜電紡絲納米纖維膜是采用靜電紡絲裝置，在高壓電場作用下，直徑為l(T5000nm的靜電紡絲納米纖維(有同軸核殼或同軸三層結(jié)構(gòu))，再堆積成靜電紡絲納米纖維膜坯，最后在4°C恒溫環(huán)境冷卻，形成靜電紡絲納米纖維膜。納米纖維膜孔隙率高，孔徑范圍為flOOnm，為高度多孔結(jié)構(gòu)且孔洞具有良好的連通性，能降低底物的擴散阻力，有利于提高固定化酶保留活性。
[0004]目前，已有利用靜電紡絲納米纖維膜固定化酶的相關(guān)報道，盡管靜電紡絲納米纖維膜固載化生物酶可以在一定程度上提高酶的活性和環(huán)境耐受性，但迄今為止，相關(guān)報道只局限于兩種固載方式:第一種方式，生物酶吸附在納米纖維表面。該方法大多只能將酶單層固定在纖維膜表面，其酶載量受到限制，且反應(yīng)過程中有酶脫落現(xiàn)象，導(dǎo)致酶重復(fù)利用性低，雖然可以通過化學(xué)交聯(lián)方法提高酶載量及固定化酶的穩(wěn)定性，但是會使酶活性受到較大影響。第二種方式，將生物酶混紡于納米纖維內(nèi)或生物酶做為纖維內(nèi)核的核殼結(jié)構(gòu)，雖然克服可第一種方式所存在的問題，但酶的空間傳質(zhì)位阻較大，導(dǎo)致酶與底物的接觸性較差，從而很難持久性的保持酶的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種所固定的生物酶具有高活性、持久穩(wěn)定性和環(huán)境廣譜性強等特點的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜及制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜，由靜電紡絲納米纖維構(gòu)成，其特征在于:所述靜電紡絲納米纖維為同軸三層結(jié)構(gòu)，從里至外依次為緩釋激活劑層、固定化生物酶層和多孔聚合物層。[0007]所述緩釋激活劑層中的緩釋激活劑為K+、Mg2+、Ca2+或乙二胺四乙酸。
[0008]—種上述的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜的制備方法，其特征在于按如下步驟進行:
a.將親水性聚合物溶于極性溶劑中，配制質(zhì)量百分比濃度為5%~20%的溶液，磁力攪拌r2h ;再按照質(zhì)量百分比濃度為0.1%~10%向所配制的溶液中加入緩釋激活劑，繼續(xù)磁力攪拌Hh，得到均勻分散的緩釋激活劑聚合物溶膠液；
b.將活性生物酶溶于pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩搖勻至全部溶解，配制質(zhì)量百分比濃度為30-60%的生物酶分散液；將生物酶分散液加入到質(zhì)量百分比濃度為5~20%的親水性聚合物溶液中，生物酶分散液與親水性聚合物溶液的質(zhì)量百分比為0.廣3%，震蕩搖勻至均勻分散，存儲于4°C環(huán)境下待用；
c.將親油性聚合物溶于有機溶劑中，配制質(zhì)量百分比濃度為8%~25%的溶液，室溫下磁力攪拌1~3h ；
d.將步驟所的溶液分別灌制到三噴頭同軸電紡裝置中，以a步驟所得溶液為內(nèi)核、b步驟所得溶液為中間層、c步驟所的溶液為外層，接收裝置采用鋁箔，噴頭到接收裝置的距離為5~30cm，噴射電壓為5~30KV，推進速度為I~5ml/h，得到同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜。
[0009]所述極性溶劑為水、甲醇、乙醇、丙酮或乙酸。
[0010]所述親水性聚合物為聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚丙烯酰胺。
[0011]所述親油性聚合物為聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲脂、聚偏氟乙烯或聚丙烯腈。
[0012]所述有機溶劑為二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋喃、二氯甲烷、二氯乙烷、N-甲基吡咯烷酮或二甲基亞砜。
[0013]本發(fā)明是利用同軸三通道靜電紡絲技術(shù)，將生物酶包埋于緩釋激活劑和多孔聚合物的夾層內(nèi)，構(gòu)成具有三明治結(jié)構(gòu)的多孔納米纖維膜，構(gòu)建相互貫通的孔道結(jié)構(gòu)，從而增大酶固載量，促進酶與底物的充分接觸，降低酶與底物的傳質(zhì)阻力，有效提高酶的催化效率和重復(fù)利用性，降低生物酶的環(huán)境敏感性和提高生物酶在復(fù)雜環(huán)境下應(yīng)用的持久穩(wěn)定性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明實施例同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜的結(jié)構(gòu)圖。
[0015]圖2是電紡聚苯乙烯納米纖維膜(PS:10%)的掃描電子顯微鏡圖。
[0016]圖3為本發(fā)明實施例1的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜(PS:10%)的掃描電子顯微鏡圖。
[0017]圖4為本發(fā)明實施例1與同軸兩層(核殼結(jié)構(gòu))未加緩釋激活劑層的過氧化物酶O多孔聚苯乙烯固定化酶和游離過氧化物酶的活性熱穩(wěn)定性對比曲線。
【具體實施方式】
[0018]實施例1:
a.將1.0 g聚乙烯醇顆粒分散到9 ml去離子水中，室溫下磁力攪拌Ih至充分溶脹；溫度升至70°C，繼續(xù)攪拌至溶液澄清透明，向上述溶液中緩慢加入0.01 gKCl，磁力攪拌至完全溶解；
b.將0.2 mg活性過氧化物酶溶于0.5 mlpH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩搖勻至全部溶解，得過氧化物酶分散液；將上述過氧化物酶分散液加入到12ml濃度為11% (wt)的聚乙烯醇溶液中，震蕩搖勻至均勻分散，存儲于4°C環(huán)境下待用；
c.將1.0 g聚苯乙烯顆粒溶解于9ml四氫呋喃溶劑中，室溫下磁力攪拌Ih至形成均一、穩(wěn)定、粘稠的溶膠液；
d.將步驟所的溶液分別灌制到三噴頭同軸電紡裝置中，以a步驟所得溶液為內(nèi)核、b步驟所得溶液為中間層、c步驟所的溶液為外層，接收裝置采用鋁箔，噴頭到接收裝置的距離為10cm，噴射電壓為10KV，推進速度為lml/h，得到如圖1所示的IKCl，2過氧化物酶，3多孔聚苯乙烯的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜，將同軸三層結(jié)構(gòu)納米纖維膜存儲于4°C恒溫環(huán)境下。
[0019]實施例1所得KC1@過氧化物酶@多孔聚苯乙烯的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜的掃描電子顯微鏡圖如圖2所示，聚苯乙烯納米纖維掃描電子顯微鏡圖如圖2所示。從圖2可以看出聚苯乙烯纖維直徑在400nm左右，且分布比較均勻，表面光滑。從圖3可以看出，聚苯乙烯納米纖維包埋過氧化物酶后，纖維直徑增至2500 nm左右，纖維表面有大量的粗糙褶皺結(jié)構(gòu)。圖3插圖為KClO過氧化物酶@多孔聚苯乙烯的同軸三層結(jié)構(gòu)納米纖維膜放大80，000倍的掃描電子顯微鏡圖，圖中斷裂處出現(xiàn)三層斷裂帶。本發(fā)明實施例1與過氧化物酶@多孔聚苯乙烯固定化酶和游離過氧化物酶的熱穩(wěn)定性變化曲線如圖4所示。從圖4中可以看出隨著溫度的提升兩種形式的固定化酶均比游離酶相對活性有所提高，耐熱性能最差的為游離過氧化物酶，當(dāng)溫度達到70 1:時，游離酶的活性幾乎完全失活；耐熱性最好的為本發(fā)明實施例的同軸三層固定化酶，溫度為70 1:時，仍保留有50%的活性，而未加緩釋激活劑層的同軸兩層固定化酶也只保留有21%的活性。因此，從實驗結(jié)果可以看出，經(jīng)過本發(fā)明技術(shù)獲得的同軸三層固定化酶其耐熱性能更佳。
[0020]實施例2:
a.將1.0 g聚丙烯酸顆粒分散到6 ml去離子水中，室溫下磁力攪拌Ih至充分溶脹，溫度升至70°C，繼續(xù)攪拌至溶液澄清透明，向上述溶液中緩慢加入0.01 gCaCl2，磁力攪拌至完全溶解；
b.將0.2 mg活性脂肪酶溶于0.5 mlpH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩搖勻至全部溶解，得脂肪酶分散液；將上述脂肪酶分散液加入到IOml濃度為10% (wt)的聚乙烯酸溶液中，震蕩搖勻至均勻分散，存儲于4°C環(huán)境下待用；
c.將1.0g聚甲基丙烯酸甲脂顆粒溶解于3.5ml四氫呋喃溶劑中，室溫下磁力攪拌Ih至形成均一、穩(wěn)定、粘稠的溶膠液；
d.將步驟所的溶液分別灌制到三噴頭同軸電紡裝置中，以a步驟所得溶液為內(nèi)核、b步驟所得溶液為中間層、c步驟所的溶液為外層，接收裝置采用鋁箔，噴頭到接收裝置的距離為30cm，噴射電壓為30KV，推進速度為5ml/h，得到如圖1所示的ICaCl2, 2脂肪酶，3多孔聚甲基丙烯酸的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜，將同軸三層結(jié)構(gòu)納米纖維膜存儲于4°C恒溫環(huán)境下。
[0021]經(jīng)測定實施例2所得的CaCl2O脂肪酶@多孔聚甲基丙烯酸的固定化脂肪酶的活性具有比未加緩釋激活劑層的同軸兩層固定化酶和游離酶的活性更好，穩(wěn)定性更高。[0022]實施例3:
a.將1.0 g聚丙烯酰胺顆粒分散到19ml去離子水中，室溫下磁力攪拌Ih至溶液澄清透明，向上述溶液中緩慢加入0.2 g乙二胺四乙酸(EDTA)，磁力攪拌至完全溶解；
b.將0.2 mg活性尿酶溶于0.6 mlpH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩搖勻至全部溶解，得尿酶分散液，將上述尿酶分散液加入到IOml濃度為10%(wt)的聚丙烯酰胺溶液中，震蕩搖勻至均勻分散，存儲于4°C環(huán)境下待用；
c.將1.0 g聚丙烯腈顆粒溶解于12ml 二甲基甲酰胺溶劑中，室溫下磁力攪拌Ih至形成均一、穩(wěn)定、粘稠的溶膠液；
d.將步驟所的溶液分別灌制到三噴頭同軸電紡裝置中，以a步驟所得溶液為內(nèi)核、b步驟所得溶液為中間層、c步驟所的溶液為外層，接收裝置采用鋁箔，噴頭到接收裝置的距離為10cm，噴射電壓為15KV，推進速度為2ml/h，得到如圖1所示的1EDTA，2尿酶，3聚丙烯腈的同軸三層結(jié)構(gòu)納米纖維膜成品，將同軸三層結(jié)構(gòu)納米纖維膜存儲于4°C恒溫環(huán)境下。
[0023]經(jīng)測定實施例3所得的EDTA @尿酶@聚丙烯腈的固定化尿酶的活性具有比未加緩釋激活劑層的同軸兩層固定化酶和游離酶的活性更好的穩(wěn)定性。
【權(quán)利要求】
1.一種同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜，由靜電紡絲納米纖維構(gòu)成，其特征在于:所述靜電紡絲納米纖維為同軸三層結(jié)構(gòu)，從里至外依次為緩釋激活劑層(1)、固定化生物酶層(2)和多孔聚合物層(3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜，其特征在于:所述緩釋激活劑層(1)中的緩釋激活劑為K+、Mg2+、Ca2+或乙二胺四乙酸。
3.—種如權(quán)利要求1所述的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜的制備方法，其特征在于按如下步驟進行: a.將親水性聚合物溶于極性溶劑中，配制質(zhì)量百分比濃度為5%~20%的溶液，磁力攪拌1~2h ;再按照質(zhì)量百分比濃度為0.1%~10%向所配制的溶液中加入緩釋激活劑，繼續(xù)磁力攪拌Hh，得到均勻分散的緩釋激活劑聚合物溶膠液； b.將活性生物酶溶于pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩搖勻至全部溶解，配制質(zhì)量百分比濃度為30-60%的生物酶分散液；將生物酶分散液加入到質(zhì)量百分比濃度為5~20%的親水性聚合物溶液中，生物酶分散液與親水性聚合物溶液的質(zhì)量百分比為0.1~3%，震蕩搖勻至均勻分散，存儲于4°C環(huán)境下待用； c.將親油性聚合物溶于有機溶劑中，配制質(zhì)量百分比濃度為8%~25%的溶液，室溫下磁力攪拌1~31h ； d.將步驟所的溶液分別灌制到三噴頭同軸電紡裝置中，以a步驟所得溶液為內(nèi)核、b步驟所得溶液為中間層、c步驟所的溶液為外層，接收裝置采用鋁箔，噴頭到接收裝置的距離為5~30cm，噴射電壓為5~30KV，推進速度為1~5ml/h，得到同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同軸三層高活性包埋生物酶的靜電紡絲納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述親水性聚合物為聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚丙烯酰胺。
【文檔編號】D01D5/00GK103668485SQ201310637787
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】潘超 申請人:大連海洋大學(xué), 潘超