專利名稱：檢測針對組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)的抗體的免疫方法,tTG在診斷和治療控制中的用途,和 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測體液中抗體的方法，它通過與組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tissuetransglutaminase，簡稱為“tTG”)，tTG的抗原結(jié)構(gòu)物、其免疫活性序列或類似物之間，以及通過與含有tTG的復(fù)合物(tTG-containing compound)，該復(fù)合物的抗原結(jié)構(gòu)物(structure)、其免疫活性序列或類似物之間的免疫反應(yīng)而進(jìn)行檢測。該方法可用于診斷和治療控制與針對tTG，含tTG的復(fù)合物及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明還涉及tTG和上述物質(zhì)在診斷和治療控制中的用途，較佳地在診斷和治療控制慢性炎性疾病或自身免疫疾病中，更佳地在診斷和治療控制口炎性腹瀉(sprue)和腹腔病(coeliac disease)中的用途。本發(fā)明還涉及一種口服藥劑，它含有tTG，含tTG的復(fù)合物及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物作為活性成分。該藥劑可用于治療伴有針對這些物質(zhì)的免疫反應(yīng)的疾病，因?yàn)榭诜┯蒙鲜龌衔锟稍斐擅庖吣褪苄浴?br> 本發(fā)明基于一個發(fā)現(xiàn)，即組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG,EC 2.3.2.13)是口炎性腹瀉(sprue)和腹腔病的自身抗原。
基于上述發(fā)現(xiàn)，開發(fā)出了本發(fā)明的檢測針對tTG和含tTG的復(fù)合物的抗體的免疫學(xué)方法。
腹腔病是一種小腸粘膜疾病，初次癥狀表現(xiàn)主要發(fā)生在嬰兒后期和剛學(xué)步的兒童期。如果相應(yīng)的臨床病癥沒有在成人期之前發(fā)生，就被稱為“非熱帶性口炎性腹瀉”。因此，這兩種術(shù)語描述的是同一種疾病?？谘仔愿篂a伴有粘膜的炎性改變并導(dǎo)致綜合性吸收不良。在大多數(shù)病例中，用不含谷蛋白的飲食進(jìn)行治療會產(chǎn)生形態(tài)上和臨床上的反應(yīng)。
眾所周知作為病因的是小麥、大麥、黑麥以及某種程度上燕麥中的谷蛋白，而來自種系發(fā)生關(guān)系程度較低的其他植物品種(如玉米、水稻和大豆)的谷蛋白卻是非致病的。在這些谷蛋白中，致病因子的作用被歸咎于醇溶谷蛋白，尤其是α-麥醇溶蛋白(α-gliadin)。
出于該原因，口炎性腹瀉主要發(fā)生在以小麥為主食的國家中(歐洲、美國、澳大利亞)，例如其發(fā)病率在丹麥為0.14/1000，在西班牙為0.7/1000，在意大利為1/1000，在德國為0.45/1000，在瑞典為2.42/1000。
然而，最近的研究表明，一種亞臨床形式，即粘膜發(fā)生形態(tài)變化而沒有嚴(yán)重癥狀的情況，比以前據(jù)信的更為廣泛。因此，在1994年意大利進(jìn)行的研究揭示，在學(xué)齡兒童中的發(fā)病率為3.28/1000。在雙親患口炎性腹瀉的家系的下一代中，患隱性口炎性腹瀉的危險(xiǎn)可高達(dá)50％。
隱性口炎性腹瀉主要是經(jīng)常伴有多形性皮膚病即皰疹樣皮炎，其中可觀察到特征性的表皮下小泡，并且在皮膚乳頭處有顆粒狀I(lǐng)gA沉著。對小腸進(jìn)行活組織檢查會顯示不規(guī)則的、或重或輕的粘膜損傷。
另一種已了解清楚的相關(guān)性可在口炎性腹瀉和胰島素依賴性糖尿病(Diabetes mellitus)、甲狀腺疾病和選擇性IgA缺陷癥之間觀察到。
口炎性腹瀉除了眾多的臨床并發(fā)癥狀(例如貧血(它被歸咎于維生素B12吸收不良)和維生素K不足(這是導(dǎo)致出血傾向增加的原因))之外，其對腸胃道惡性腫瘤的危險(xiǎn)大幅增加起著特殊作用。在高達(dá)15％的口炎性腹瀉病人(大多數(shù)年齡在50歲以上)中，會發(fā)展成腫瘤疾病，其中約50％涉及腸T細(xì)胞淋巴瘤，約25％涉及食道、口咽和小腸的腫瘤。
口炎性腹瀉的治療包括嚴(yán)格遵守終身無谷蛋白的飲食，其中不僅必須排除由小麥制成的含谷蛋白的產(chǎn)品，而且還必須排除由黑麥、大麥和燕麥制成的產(chǎn)品。對于病人，這意味著在飲食習(xí)慣和社交活動兩方面受到重大限制。
如果口炎性腹瀉的診斷和治療及時，那么將預(yù)后良好。然而，一旦發(fā)生并發(fā)癥，通常不能完全逆轉(zhuǎn)。相反，如果疾病仍然未被認(rèn)識到并且也沒有被治療，那么吸收不良將導(dǎo)致嚴(yán)重癥狀。最后，患腸淋巴瘤和其他腸胃道腫瘤的危險(xiǎn)將上升。
目前，小腸的活組織檢查代表了診斷口炎性腹瀉以及食用無谷蛋白飲食后隨訪標(biāo)準(zhǔn)的最高水平，但是以免疫標(biāo)記為基礎(chǔ)的非侵害性(non-invasive)診斷方法變得越來越重要。因?yàn)镮gA和IgG類抗體存在于口炎性腹瀉病人的血清中，這些抗體一方面針對麥醇溶蛋白，另一方面也針對肌內(nèi)膜(肌內(nèi)膜是一種特殊的結(jié)締組織，它含有膠原Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ，以及彈性纖維、非膠原蛋白如纖連蛋白和蛋白多糖)的自身抗原，因此可以用ELISA法測試血清中針對麥醇溶蛋白的IgG和IgA抗體，并且用間接免疫熒光法測試針對肌內(nèi)膜的IgG和IgA抗體。盡管針對麥醇溶蛋白的抗體對口炎性腹瀉還沒有足夠的特異性，但已報(bào)道對于針對肌內(nèi)膜的IgA抗體有高靈敏度和高特異性(97-100％)。然而，需要靈長動物的食道切片來進(jìn)行免疫熒光檢測。目前，還嘗試在臍帶材料上檢測肌內(nèi)膜抗體。
通過及時診斷和嚴(yán)格遵守?zé)o谷蛋白的飲食，該疾病可以被緩解，因此病人升高的惡性腫瘤患病危險(xiǎn)也可被降至正常水平。因此，很有興趣來開發(fā)一種合適的檢測口炎性腹瀉的分析法。因?yàn)榛茧[性口炎性腹瀉的人群仍然屬于高危群體，因此所有的有關(guān)個體(尤其是家系中的下一代)，而且最終所有的學(xué)齡兒童(正如目前在意大利已被納入考慮范圍)，都應(yīng)當(dāng)用靈敏、特異、易操作和低成本的方法進(jìn)行檢查。
然而由于下列原因，目前還不能進(jìn)行大規(guī)模的過篩計(jì)劃-對無癥狀個體所進(jìn)行的侵害性十二指腸活組織檢查不合理而且過于昂貴。
-基于抗麥醇溶蛋白抗體的ELISA檢測法幾乎不實(shí)用，因?yàn)槠涮禺愋蕴睢?br> -作為通用過篩方法，基于靈長動物食道的，檢測IgA類肌內(nèi)膜抗體的免疫熒光檢測法過于昂貴。此外，評估有主觀性，而且不能鑒別出IgA不足的口炎性腹瀉病人(2％病人)。
因此目前為止，對于口炎性腹瀉/腹腔病還沒有非侵害性的、特異的、定量的、快速的、簡便的、價廉和可行的檢測方法和治療控制手段。
這一問題被本發(fā)明所解決。基于驚人的發(fā)現(xiàn)，即組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG,EC 2.3.2.13)是口炎性腹瀉的自身抗原，開發(fā)出了權(quán)利要求1-6所述的免疫方法，它們檢測體液(尤其血清)中抗tTG和含tTG的復(fù)合物的抗體。該方法不僅可診斷口炎性腹瀉或腹腔病，而且可檢測所有伴有針對tTG、含tTG的復(fù)合物、及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的免疫反應(yīng)的疾病。
組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶屬于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)類。TG(EC 2.3.2.13)是依賴于Ca2+的、催化酰基轉(zhuǎn)移的酶，其中肽鍵相連的谷氨酰胺殘基上的γ-氨甲酰(carboxamide)作為?；w。主要地，與蛋白質(zhì)相連的賴氨酸殘基作為酰基受體，因此轉(zhuǎn)移形成了ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸鍵。TG對于酰基供體的底物特異性非常高(取決于氨基酸序列)，但卻有異常廣譜的受體可供利用。形成的共價肽鍵很穩(wěn)定并且耐蛋白酶，這導(dǎo)致交聯(lián)的蛋白質(zhì)對化學(xué)、酶或物理作用有更高的抗性。
而且，在各種器官、組織、血漿和間隙體液中廣泛存在各種TG，這與被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾的蛋白質(zhì)存在于血塊、細(xì)胞膜、表皮的角質(zhì)層、毛發(fā)、指甲、和細(xì)胞外基質(zhì)是相關(guān)的。
所述的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以根據(jù)它們的物理性質(zhì)、它們在身體中的位置和它們的一級結(jié)構(gòu)而加以區(qū)分。
組織TG(tTG)還被稱為細(xì)胞的、紅血球的、內(nèi)皮的、胞漿的、肝臟的TG、或Ⅱ型TG，而且它是分子量為75-85KDa的單體。
包括687個殘基的完整氨基酸序列是來自于cDNA。在蛋白質(zhì)水平，人的酶與來自小鼠巨噬細(xì)胞的酶之間有84％同源度，而人和豚鼠的酶之間有81％同源度。通常，在這些物種之間核苷酸的交換對氨基酸序列沒有影響。活性中心是高度保守的，在3種物種之間有顯著的蛋白質(zhì)同源性(51個殘基中有49個是相同的)，而且與ⅩⅢ因子的a-亞基有高度的蛋白質(zhì)同源度(75％)。
既沒有信號肽，也沒有糖基化，而且盡管有多個半胱氨酸殘基，但是顯然沒有二硫鍵橋連。通過熒光雜交法，人組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因被定位于染色體20q12。盡管酶的釋放機(jī)制還不清楚，但是已有明確的證據(jù)表明，tTG在細(xì)胞內(nèi)的普遍存在使得它在胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中具有重要功能。此外，tTG活性所需的胞內(nèi)Ca2+濃度不可能在生理?xiàng)l件下達(dá)到，而在胞外區(qū)域是存在足夠高的Ca2+濃度的。
若干研究建立起了tTG與纖連蛋白ECM蛋白之間的聯(lián)系。除了纖連蛋白之外，ECM分子巢蛋白(nidogen)、N-端前膠原Ⅲ肽、膠原Ⅴ和Ⅺ、骨連蛋白(osteonectin)(它是一種與微纖絲締合的糖蛋白)、高分子量的硫酸皮膚素蛋白聚糖(proteoglycan)、和galectin 3外源凝集素都可被鑒定為tTG的特異底物。
通過對培養(yǎng)的WI38細(xì)胞(肺胚胎成纖維細(xì)胞)的免疫熒光研究，也獲得了tTG在傷口愈合中起重要作用的暗示W(wǎng)I38細(xì)胞在正常條件下不表現(xiàn)胞外tTG活性，但是一旦產(chǎn)生人工傷口就在胞外發(fā)生此酶的沉積。此酶可能被動地從受損的細(xì)胞中釋放出之后，首先是非共價地結(jié)合于ECM，尤其是結(jié)合于纖連蛋白和纖維膠原蛋白，此時酶具有數(shù)小時的催化活性。使用大鼠模型，同樣在人工產(chǎn)生傷口之后檢測到5天tTG活性上升。同樣，將人紅細(xì)胞裂解液與血漿進(jìn)行溫育時，釋放的tTG與纖連蛋白表現(xiàn)出強(qiáng)親和力。所有這些發(fā)現(xiàn)都表明，結(jié)合于ECM的tTG在傷口愈合早期起中心作用，而且它與因子ⅩⅢ一起使血纖維蛋白穩(wěn)定化，從而通過胞外蛋白的交聯(lián)而形成圍繞受傷細(xì)胞的保護(hù)層和穩(wěn)定的粘性物質(zhì)。目前，在脊椎動物中還沒有檢測到一種酶能夠酶切tTG所催化形成的極其穩(wěn)定的蛋白質(zhì)間的交聯(lián)鍵。
基于tTG是口炎性腹瀉的自身抗原這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還涉及tTG、含tTG的復(fù)合物、及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的用途，它們可用于診斷和治療控制伴有針對這些物質(zhì)的免疫反應(yīng)的有關(guān)疾病。具體地，可以用這種方法診斷急性炎性疾病如肺炎、腎小球性腎炎、病毒性肝炎，或慢性炎性疾病如克羅恩氏病(Morbus Crohn)、潰瘍性結(jié)腸炎(colitis ulcerosa)，或自身免疫疾病如自身免疫性肝炎、Sjoegren氏綜合癥、Wegener氏肉芽腫病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自發(fā)性器官纖維化(如肺纖維化)。特別合適的是用于診斷和治療控制口炎性腹瀉的檢測方法。因?yàn)樵摲椒梢钥焖偾业统杀镜剡M(jìn)行，因此，它可有效地過篩檢查群體是否有tTG抗體。
用于本發(fā)明的tTG可以源自動物、合成的或重組的，對于含tTG的復(fù)合物(它還額外地含有合并成分，例如與合成肽相連的動物tTG)同樣如此。在本發(fā)明中，含tTG的復(fù)合物應(yīng)理解為tTG與蛋白質(zhì)形成的化學(xué)復(fù)合物，或其類似物。在本發(fā)明中，tTG類似物或這些含tTG的復(fù)合物的類似物意指所有能與抗tTG或含tTG的復(fù)合物(如合成肽)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)構(gòu)物。免疫活性序列意指通過蛋白水解、合成或遺傳工程而產(chǎn)生的tTG或含tTG的復(fù)合物的片段，以及通過氨基酸替換而獲得的各種變異體。
本發(fā)明的免疫檢測可用公知的方法進(jìn)行。因此，任何直接(例如使用傳感器芯片)或間接程序都可用于檢測病人的抗體。
在直接程序中，待檢測抗體與抗原的結(jié)合是通過化學(xué)或物理性質(zhì)的改變而測定的，因此不需要用標(biāo)記的結(jié)合物進(jìn)行檢測的后續(xù)步驟。
根據(jù)本發(fā)明，宜用免疫分析法，較佳地固相免疫分析法來檢測tTG抗體，其中將反應(yīng)物直接或間接地偶連于易檢測的標(biāo)記物。更佳地，檢測可以用ELISA、RIA、或免疫熒光分析法進(jìn)行。這些檢測方法的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
例如在ELISA中，抗原(在本例子中例如是tTG)被直接或間接地連于載體物質(zhì)(如聚苯乙烯)上。在與待檢測的抗體(例如來自病人血清的抗體)一起溫育之后，用與酶偶連的物質(zhì)來直接或間接地檢測結(jié)合于抗原的抗體。這些物質(zhì)可以是抗體、抗體片段、或高親和力的配體，例如可結(jié)合于生物素標(biāo)記物的親和素。例如，過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或葡萄糖氧化酶都可以作為酶。例如，可以通過進(jìn)入生色底物來定量檢測結(jié)合的酶，并從而定量檢測結(jié)合的tTG抗體。
在放射性免疫分析中，抗原(例如tTG)也可直接或間接地結(jié)合于載體物質(zhì)如聚苯乙烯。在與待檢測的抗體(例如來自病人血清的抗體)一起溫育之后，用攜帶放射性標(biāo)記如125I的物質(zhì)來檢測結(jié)合于抗原的抗體。這些物質(zhì)可以是抗體、抗體片段、或高親和力的配體，例如可結(jié)合于生物素標(biāo)記物的親和素。用合適的測量儀器來定量測定結(jié)合放射性。
在免疫熒光分析中，可根據(jù)相同的原理，使用攜帶熒光標(biāo)記(如異硫氰酸熒光素(FITC))的物質(zhì)來檢測結(jié)合于抗原的抗體。這些物質(zhì)可以是抗體、抗體片段、或高親和力的配體，例如可結(jié)合于生物素標(biāo)記物的親和素。然后用合適的測量儀器來定量測定熒光染料的結(jié)合量。
根據(jù)本發(fā)明，還可以在凝集分析或凝膠擴(kuò)散分析中檢測病人的抗體。這些檢測分析法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。因此，例如在凝膠擴(kuò)散分析中，將抗原或抗體溶液分別置于瓊脂或瓊脂糖平板上緊緊毗鄰的孔中。這種情況下，抗原溶液可以是例如tTG溶液，而抗體溶液可以是例如血液的血清。當(dāng)物質(zhì)擴(kuò)散出所在孔時，會產(chǎn)生從孔開始的濃度梯度。如果在凝膠中重迭的抗原和抗體濃度在具體的比率之內(nèi)，而且抗體溶液中含有針對抗原的抗體，那么就會在凝膠中形成看得見的沉淀。
在凝集分析中，將攜帶抗原(如tTG)的顆粒(如乳膠或聚苯乙烯顆粒)與例如來自血清的抗體進(jìn)行交聯(lián)。然后可用例如濁度測定法來檢測產(chǎn)生的凝集物。
根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的是用IgA-特異性或IgG-特異性ELISA來檢測口炎性腹瀉病人的血清。已發(fā)現(xiàn)，新開發(fā)的基于tTG的、檢測口炎性腹瀉病人血清中IgA抗本的ELISA檢測法極其適合診斷和治療控制口炎性腹瀉，因?yàn)槠潇`敏度和特異性高。這在受治療的病人的隨訪中也很明顯(在治療中滴度下降)。將本發(fā)明的ELISA數(shù)據(jù)與第三者的免疫熒光評估(檢測抗肌內(nèi)膜的IgA)進(jìn)行比較，呈現(xiàn)出良好的一致性。不一致的情況主要發(fā)生在抗體滴度低的時候，然而這是由于間接免疫熒光法被認(rèn)為是目前頂尖水平的標(biāo)準(zhǔn)所造成的。這主要是由于主觀的評估以及這種已有技術(shù)方法同時存在非特異性反應(yīng)所造成的，基于其他類別的抗體(例如以IgG抗體為例)的相應(yīng)檢測方法，適用于鑒別IgA缺乏的口炎性腹瀉病人，還適用于檢測伴有抗tTG的免疫反應(yīng)的其他疾病。
當(dāng)在測試體系中使用純化的來自豚鼠的tTG、人tTG，通過蛋白水解或遺傳工程而獲得的序列或類似物，以及合成的免疫原性tTG肽時，可進(jìn)一步改善這種檢測方法。在實(shí)施例3.3中描述了一種診斷和隨訪伴有針對tTG的免疫反應(yīng)的其他疾病的ELISA法。
本發(fā)明還涉及權(quán)利要求10所述的口服藥劑，它用于治療伴有針對tTG、含tTG的復(fù)合物及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的免疫反應(yīng)的疾病。較佳地，該口服給藥形式是片劑或膠囊，其中通過施用tTG、含tTG的復(fù)合物及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物而產(chǎn)生口服耐受性。一方面，該口服耐受性是通過經(jīng)口供給自身抗原而實(shí)現(xiàn)的。另一方面，有所謂的“旁觀者效應(yīng)”如果誘導(dǎo)該疾病的自身抗原是未知的，那么在靶器官中接觸免疫系統(tǒng)的其他抗原可在某些情況下用于口服治療，該抗原能夠局部刺激抗原特異性的抑制性T細(xì)胞，從而抑制全身性免疫應(yīng)答。只有在較高的抗原劑量時，才會誘發(fā)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的無反應(yīng)性。
口服耐受性是治療各種自身免疫疾病的實(shí)用方法。
本發(fā)明的藥劑宜用于治療口炎性腹瀉，但是也可用于治療其他慢性炎性腸道疾病和自身免疫性肝炎。
根據(jù)本發(fā)明，tTG，含tTG的復(fù)合物及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物以0.01-100毫克/千克體重的劑量進(jìn)行施用。
本發(fā)明的藥劑可任選地含有藥學(xué)上可容忍的佐劑，例如在GALENISM中常用的填料、潤滑劑、崩解劑、粘合劑、或釋放劑。藥物佐劑的比例可根據(jù)選定的活性成分種類在大范圍內(nèi)變化，在各種情況下為0.1-20％(重量)。
具體地，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可以在口炎性腹瀉的檢測分析法和治療控制中體現(xiàn)出來，該分析法是非侵害性、高特異性、和直接針對疾病相關(guān)因素的。此外，開發(fā)出的該分析法的重要優(yōu)點(diǎn)是在實(shí)用性方面快速、簡便和成本低，并且可以在不同的實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。由此，該分析法可以有效地過篩人群是否有針對tTG的抗體。
而且，因?yàn)榉治鰯?shù)據(jù)是客觀的，所以與涉及主觀色彩的免疫熒光評估法相比，這種定量評估法的潛力占優(yōu)。此外，免疫熒光評估法(尤其在低滴度時)受到同時發(fā)生的非特異性反應(yīng)的阻礙。通過在測試系統(tǒng)中使用特異性自身抗原，可以最大限度地在免疫熒光中消除靈長動物食管材料或臍帶上的非特異性反應(yīng)。
因?yàn)樵摲治龇捎糜贗gA類抗體以及其他類別的抗體，所以IgA缺乏的口炎性腹瀉病人也能被鑒別?；诳箃TG抗體的檢測法還適用于鑒別、檢查和治療控制其他伴有針對tTG的免疫反應(yīng)的疾病。
同樣，因?yàn)閠TG被鑒定為口炎性腹瀉的自身抗原，因此在口服治療口炎性腹瀉或其他伴有針對tTG的免疫應(yīng)答的疾病時，可以使用完整的tTG或其免疫活性表位(通過蛋白水解或遺傳工程而產(chǎn)生的序列、類似物或合成肽)。實(shí)施例實(shí)施例1自身抗原的分離和特性分析1.1．免疫熒光法，APAAP染色對在-20℃，于100％甲醇中固定2分鐘的各種細(xì)胞系進(jìn)行染色。
在免疫熒光檢測中，將制品分別與口炎性腹瀉和對照血清一起溫育，然后洗滌，再用TRITC標(biāo)記的兔抗-人IgA抗體進(jìn)行檢測(Schuppan等人，J.Biol.Chem.1990；265,8823-32)。
在細(xì)胞與口炎性腹瀉血清一起溫育、洗滌之后進(jìn)行APAAP標(biāo)記，隨后用APAAP復(fù)合物進(jìn)行檢測(Cordell J.L.，等人，J.Histochem.Cytochem.1984；32,219-229)。
此處，HT1080(人纖維肉瘤細(xì)胞)、WI38(人肺胚胎成纖維細(xì)胞)、Hepl和HepG2(肝癌細(xì)胞)都明確地顯示出與病人血清反應(yīng)的陽性胞質(zhì)信號，而正常血清或用人IgA預(yù)處理后都沒有顯示出標(biāo)記。人包皮成纖維細(xì)胞、人橫紋肌肉瘤(RD)/大鼠Ito/大鼠Morris肝細(xì)胞瘤、和狗MDCK細(xì)胞表現(xiàn)出的反應(yīng)僅為非常弱至陰性。1.2代謝細(xì)胞標(biāo)記和自身抗原的免疫沉淀對自身抗原的定性和分離是用HT1080細(xì)胞進(jìn)行。
用L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺，10％胎牛血清(FCS,Gibco),100U/毫升青霉素，和100微克/毫升鏈霉素(Seromed)，在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM,Gibco)中于37℃和8％二氧化碳下培養(yǎng)細(xì)胞。對于代謝標(biāo)記，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入直徑5厘米的培養(yǎng)皿中。一旦達(dá)到約90％匯合度，就將其保持在不含甲硫氨酸和FCS的培養(yǎng)基中，之后該培養(yǎng)基被3毫升無FCS但含35S-甲硫氨酸(0.2mCi,Expre35S35S,NEN-Dupont)的培養(yǎng)基替換。在溫育16-20小時后，除去上清液。用磷酸鹽緩沖液(PBS,Seromed)洗滌細(xì)胞，然后用3毫升裂解緩沖液(50mM Tris-HCl,150mMNaCl,0.5％Triton X-100,0.5％IGEPAL CA-630非離子型洗滌劑[Sigma],Complete蛋白酶抑制劑[Boehringer],pH7.5)進(jìn)行裂解。隨后，使用CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)，用培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解液兩者進(jìn)行免疫沉淀。
活化和結(jié)合于Sepherose都根據(jù)制造商的說明進(jìn)行。在膨脹和用1mM HCl(pH2.5)洗滌之后，將CNBr-活化的Sepharose 4B與針對人IgA的兔抗體(Dianova,2.4毫克抗體/毫升Sepharose)在0.1M碳酸氫鈉，0.5M氯化鈉，pH8.3，于4℃一起溫育過夜。未結(jié)合的抗體通過偶聯(lián)緩沖液的洗滌而除去，然后在室溫下加入1M乙醇胺(pH9.0,2小時)而使未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)飽和。隨后，用0.1M乙酸鈉、0.5M氯化鈉(pH4.0)和0.1M Tris-HCl,0.5M氯化鈉(pH8.0)交替地洗滌Sepharose 3次(每次10×體積)。再將Sepharose分別與口炎性腹瀉病人和健康人的血清(0.5毫升血清/毫升Sepharose)，在偶聯(lián)緩沖液(50mM Tris-HCl,150mM氯化鈉，1mM氯化鈣，1mM氯化鎂，pH8.0)中4℃溫育過夜。過量的血清抗體通過偶聯(lián)緩沖液洗滌3次而去除。
每次，將1毫升HT1080的培養(yǎng)基或代謝標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞裂解液(約5×104細(xì)胞)與50微升C14B Sepharose(Pharmacia)，在室溫下預(yù)溫育30分鐘，以去除非特異性結(jié)合的蛋白。在離心(10,000×g,4℃,5分鐘)之后，將各上清液與50微升Sepharose在4℃溫育攪拌過夜，其中該Sepharose早已分別結(jié)合有病人或?qū)φ諅€體的lgA。然后，Sepharose沉積物每次用3×1毫升洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl,1％IGEPAL CA-630[Sigma],0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％月桂基磺酸鈉，Complete蛋白酶抑制劑[Boehringer],pH8.0)洗滌，再用1毫升10mM Tris-HCl(pH8.0)洗滌。接著，沉淀物被置于SDS分析緩沖液中，于還原或非還原條件下在95℃孵育5分鐘，在10-12.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離(Lammli,U.K.，自然(Nature)1970；227,680-685)，然后用放射自顯影進(jìn)行檢測(

圖1)。
在進(jìn)一步檢查中，發(fā)現(xiàn)結(jié)合的來自培養(yǎng)基的高分子量蛋白是纖連蛋白，它可非特異地結(jié)合于Sepharose。
然而，一種與細(xì)胞結(jié)合的85kDa蛋白質(zhì)，在這種方式下可被全部30種所用的口炎性腹瀉血清所沉淀，而用15種對照血清(其中包括正常血清、潰瘍性結(jié)腸炎和Sjoegren氏綜合癥病人的血清)卻沒有沉淀。從這一事實(shí)得出結(jié)論該蛋白質(zhì)是口炎性腹瀉的主要自身抗原。
用硝酸銀對凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)染色(Henkeshoven,J.等人，Electtrophoresis 1985；6,103-112)，在放射性自顯影時可見的85kDa條帶處有一明顯的蛋白質(zhì)條帶。
1.3．85kDa自身抗原的分離和純化為了分離數(shù)量更多的自身抗原，總計(jì)培養(yǎng)了65個培養(yǎng)皿(每個175平方厘米)的HT1080細(xì)胞(約109細(xì)胞)。在得到匯合前不久，用無FCS的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，再在二氧化碳孵育箱中孵育16-20小時。如上分別進(jìn)行裂解和免疫沉淀。Sepharose沉積物在總共4.5毫升含2％DL-二硫蘇糖醇(Sigma)的SDS分析液中，于95℃溫育5分鐘，以脫去結(jié)合的蛋白質(zhì)，隨后在分析性SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行仔細(xì)檢查。
為了進(jìn)一步純化自身抗原，使用Prep Cell(491型，BIO-RAD)，如下通過洗脫電泳分離免疫沉淀物將4.5毫升蛋白質(zhì)混合物置于圓凝膠(外徑3厘米)的頂部，該凝膠由6.5厘米分離膠(8％聚丙烯酰胺，pH8.8)和1.5厘米收集膠(4％聚丙烯酰胺，pH6.8)構(gòu)成，然后通過電泳進(jìn)行分離。各蛋白質(zhì)被收集在洗脫緩沖液(25mM Tris-HCl,0.1M甘氨酸，0.01％SDS,pH8.3)中，每份洗脫組份為1.2毫升(0.8毫升/分鐘)。洗脫組份在SDS-PAGE中仔細(xì)檢查，含有所需蛋白的組份(約15毫升)被合并，用超濾法(Amicon Centriprep-50，在1,000×g)將其濃縮至總體積約為1毫升。
1.4．自身抗原的蛋白酶消化在數(shù)種經(jīng)測試的蛋白酶中，內(nèi)切蛋白酶Asp-N(測序級，BoehringerMannheim)被確定為適用于片段化處理，因?yàn)樗兄貜?fù)性較高的切割模式，而且獲得的片段可較好地分離。酶/底物的濃度調(diào)節(jié)至1∶100，消化是在37℃進(jìn)行30分鐘。
1.5．轉(zhuǎn)移至PDVF膜在純化的自身抗原被消化之后，在制備性的10％Tricine凝膠上分離各個肽片段(Schagger,H.等人，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)1987；166,368-379)(圖2)。然后用含石墨的電極片(Fastblot B32/33,Biometra)，按半干的快速印跡(fastblot)程序，在4℃將其轉(zhuǎn)至PVDF膜(聚偏二氯乙烯，ImmobilonTM,Millipore)。為此，將下列各層置于陽極片上(1)在陽極緩沖液1(300mM Tris-HCl,20％甲醇，pH10.4)中浸泡過的濾紙，(2)在陽極緩沖液2(30mM Tris-HCl,20％甲醇，pH10.4)中浸泡過的濾紙，(3)在甲醇中活化并在陽極緩沖液2中預(yù)平衡過的PVDF膜，(4)Tricine凝膠，(5)在陰極緩沖液(25mM Tris-HCl,40mMε-氨基-正己酸，20％甲醇，pH9.4)中浸泡過的2片濾紙，(6)陰極片。在180mA下轉(zhuǎn)移進(jìn)行35分鐘以上。
之后，PVDF膜在0.1％考馬斯藍(lán)Serva R250,50％甲醇中染色5分鐘，用50％甲醇和10％乙酸漂白，用蒸餾水充分洗滌，并空氣干燥。小心地切取位于10kDa、14kDa,16kDa和25kDa處的消化后自身抗原的特征性條帶，對N末端進(jìn)行第一輪測序。
1.6．Edman降解法(根據(jù)Edman和Henschen在Needleman,S.B.蛋白質(zhì)序列測定(ProteinSequence Determination),Springer Verlag,Berlin 1975；232-279)用Applied Biosystems 4778型測序儀進(jìn)行測序，結(jié)果得到3段氨基酸序列。將它們與Swiss Prot 31數(shù)據(jù)庫(用PC/GENES,IntelliGenetics)進(jìn)行比較。根據(jù)比較，在不一致性最小的情況下，可以明確地將該3個片段指定為人組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG,EC 2.3.2.13，蛋白質(zhì)谷氨酰胺γ-谷氨?；?轉(zhuǎn)移酶)。以“單字符”形式表示；X表示不相同。t-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 28′REKLVVRRGQPFW10kDa片段 REKLVVRRGQPF(S)t-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶581′DLYLENPEIKIRILG14kDa片段 DLYLENPEIXIXILGt-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶438′DITHTYKYPE16kDa片段 DITLTYQYP(V)對于25kDa片段沒有明確序列，因?yàn)樗请幕旌衔铩?br> 實(shí)施例2證實(shí)組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)是口炎性腹瀉的自身抗原2.1．豚鼠tTG的免疫沉淀可購得的并且與人tTG有序列同源性(＞80％)的豚鼠肝臟tTG(Sigma)，首先通過凝膠電泳進(jìn)行分離，以檢查其純度。除了數(shù)種其他蛋白質(zhì)之外，tTG(約50％)是主要條帶中的一條。
盡管687個氨基酸的人tTG與690個氨基酸的豚鼠蛋白僅稍有差別，但是這兩種蛋白質(zhì)在SDS聚丙烯酰胺凝膠中的遷移行為很不相同。動物來源的蛋白如預(yù)期的那樣表現(xiàn)為75-80kDa，而人的蛋白卻表現(xiàn)出明顯較慢的遷移，如文獻(xiàn)中所述的那樣(Gentile,V.等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)1991；266,478-483)，盡管明顯缺乏N-糖基化卻假裝成表觀分子量為85kDa。
通過免疫沉淀來測試口炎性腹瀉血清的人自身抗體與豚鼠tTG的反應(yīng)性。為此，將500微升裂解液中的4微克tTG(Sigma)和0.5％牛血清白蛋白與偶聯(lián)于4BSepharose的口炎性腹瀉IgA在4℃攪拌過夜，洗滌，在還原條件下在SDS分析緩沖液中煮沸，然后在10％聚丙烯酰胺凝膠上分離(cf.,4.1.2)。此時，產(chǎn)生特異性的預(yù)計(jì)條帶的沉淀(分子量80kDa)，但無雜質(zhì)。
2.2．用Western印跡法證實(shí)tTG為自身抗原在SDS凝膠上分離出2微克豚鼠tTG并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上之后，將印跡在用2％低脂的脫脂奶粉，0.3％Tween 20,pH7.3的PBS緩沖液，于4℃封閉過夜。隨后與相同緩沖液中的口炎性腹瀉血清(1/200)溫育1小時，洗滌3次，再與偶聯(lián)有堿性磷酸酯酶的兔抗人IgA抗體(1/500)溫育1小時。印跡用PBS洗滌，并用氮藍(lán)四唑和以5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸為底物進(jìn)行顯色(Blake,M.S.，等人，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)1984；136,175-179)。
75-80kDa條帶給出了與口炎性腹瀉血清反應(yīng)的明確陽性信號，這再次證明了口炎性腹瀉病人的血清中含有針對tTG的IgA類抗體。而對照血清確沒有給出任何信號。
2.3．用間接免疫熒光法證實(shí)tTG是肌內(nèi)膜的自身抗原來自靈長動物的食管組織切片(Euroimmun,Germany)，被用于間接檢測口炎性腹瀉血清中抗肌內(nèi)膜的IgA抗體以及它們受tTG抑制的情況。在室溫下，將10微升用PBS以1/320稀釋過的病人血清，與0.5或10微克豚鼠tTG(Sigma)和10微克BSA(Sigma)一起預(yù)孵育1小時之后，在室溫和潮濕氣氛下將其與該食管切片溫育1小時。將口炎性腹瀉血清(1/320)和健康個體(1/50)血清分別用作陽性和陰性對照。在切片用PBS/0.2％BSA洗滌3次并空氣干燥之后，使用以1/50用PBS稀釋的、TRITC標(biāo)記的兔抗人IgA抗體(Dianova)，在室溫下檢測自身抗原1小時。過量的抗體通過依次用PBS/0.2％BSA,PBS和蒸餾水洗滌而除去。
病人血清顯示出IgA類抗體明晰地對ECM進(jìn)行了染色，該染色可通過加入更高濃度的tTG而被抑制，但是不能通過與BSA的預(yù)孵育而加以抑制。使用健康個體血清的對照，沒有顯示出對食管切片的染色。
實(shí)施例33.1．開發(fā)利用IgA抗體來診斷和隨訪口炎性腹瀉的口炎性腹瀉-特異性ELISA法將100微升PBS中的1微克豚鼠轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Sigma T-5398)加至聚苯乙烯微孔板的各孔(Greiner Labortechnic,96孔)中，在輕度旋轉(zhuǎn)運(yùn)動下于37℃孵育2小時。通過用PBS(3×200微升)洗滌而除去未結(jié)合的tTG，未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)用含1％牛血清白蛋白的250微升PBS在4℃封閉過夜。在用PBS/0.1％Tween 20(3×200微升)洗滌之后，將各孔依次與PBS/0.1％Tween 20系列稀釋的血清稀釋液(100微升)，在室溫下于輕度旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的情況下溫育1小時，用PBS/0.1％Tween 20(3×200微升)洗滌，隨后與偶聯(lián)有過氧化物酶的兔抗人IgA抗體(Dianova)(100微升，用PBS/0.1％Tween 20以1/400稀釋)于室溫下溫育1小時。在用PBS洗滌3次之后，在黑暗中于室溫下用200微升0.1M檸檬酸緩沖液，17.6mM過氧化氫，5.5mM鹽酸鄰苯二胺(Sigma),pH4.2溫育30分鐘，然后用ELISA讀數(shù)儀(MRX,DynatechLaboratories)在450納米處檢測形成的染料。
在用無谷蛋白的飲食療法治療之前和之后(疾病的活動期和次活躍期)，測試20位口炎性腹瀉病人的血清。發(fā)現(xiàn)該測試系統(tǒng)的靈敏度高，并且數(shù)值與口炎性腹瀉的活動期有良好的相關(guān)性。因遵守飲食而治療成功就反映為抗tTG的IgA抗體的下降。在健康個體，潰瘍性結(jié)腸炎、肝硬化、各種腫瘤，Sjoegren綜合癥等病人的對照血清的低消光對比下(背景水平)，高特異性是很明顯的(圖3)。
3.2開發(fā)利用其他類別抗體ELISA法來診斷和隨訪口炎性腹瀉，以IgG抗體為例因?yàn)榧s2％口炎性腹瀉病人的IgA不足，因此測試其血清抗tTG的IgG抗體的靈敏度和特異性。如3.1節(jié)中所述進(jìn)行ELISA，只有偶聯(lián)過氧化物酶的抗人IgA抗體(Dianova)被抗人IgG抗體(Dianova)所替換。在測試靈敏度方面，在無谷蛋白飲食之前和之后口炎性腹瀉病人的數(shù)據(jù)與用IgA抗體獲得的數(shù)據(jù)相符。
某些對照血清顯示出數(shù)值稍增加，這與較早的發(fā)現(xiàn)相一致，即在IgG類的間接免疫熒光法中肌內(nèi)膜抗體的特異性下降。
3.3．開發(fā)用于診斷和隨訪伴有針對tTG的免疫反應(yīng)的其他疾病的ELISA法，以IgG抗體為例如3.2．章節(jié)那樣進(jìn)行ELISA。
患有慢性炎性或自身免疫疾病(潰瘍性結(jié)腸炎(C.U.)，克羅恩氏病、急性自身免疫性肝炎)的病人血清，顯示出從輕度到中度增加的數(shù)值。
因此，對于抗tTG的自身抗體通過使用IgG-特異性ELISA，可以診斷和隨訪患伴有針對tTG的免疫反應(yīng)的其他疾病的病人。
實(shí)施例4組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGG)在麥醇溶蛋白交聯(lián)過程中的新功能盡管tTG所催化的反應(yīng)有廣泛的?；荏w可供利用，但是僅有少數(shù)分子可以作為?；w。在體外試驗(yàn)中，tTG介導(dǎo)了摻入作用(即將放射性標(biāo)記的腐胺摻入到麥醇溶蛋白中)，從而確立了麥醇溶蛋白作為tTG供體底物的功能。在160微升緩沖液(0.1M Tris-HCl,150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH7.5)中，將1微克底物(麥醇溶蛋白，或?qū)φ盏鞍兹绨椎鞍?，2μCi[3H]-腐胺，和1微克tTG(豚鼠的，Sigma)在37℃下溫育2小時。通過加入100微升50％三氯乙酸(TCA)而終止反應(yīng)，然后蛋白質(zhì)在4℃沉淀過夜。在離心之后，沉淀物用10％TCA洗滌，溶于SDS分析緩沖液中。然后一方面在SDS PAGE中分離，另一方面進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。在閃爍計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)和SDS PAGE中，雖然對照被確定為沒有摻入腐胺，但是麥醇溶蛋白卻清楚地顯示出摻入了[3H]-腐胺，這證明了麥醇溶蛋白是tTG的極好底物。
縮寫Ab 抗體APAAP堿性磷酸酯酶抗堿性磷酸酯酶BSA 牛血清白蛋白cm 厘米DMEM Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基EC 酶委員會分類ELISA酶聯(lián)免疫吸附分析ECM 胞外基質(zhì)FCS 胎牛血清h小時H2O2過氧化氫HLA 人淋巴細(xì)胞抗原IEL 上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞Ig 免疫球蛋白kDa 千道爾頓M摩爾mA 毫安培MHC 主組織相容性復(fù)合體min 分鐘mM 毫摩爾Mr 相對分子量μg 微克μl 微升PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS 磷酸鹽緩沖液PLA2磷酸脂酶A2PVDF 聚偏二氯乙烯SDS 十二烷基磺酸鈉TCA 三氯乙酸TGF 轉(zhuǎn)化生長因子Tris 三(羥甲基)氨基甲烷tTG 組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶
權(quán)利要求
1．一種檢測體液中抗體的方法，其特征在于，通過與組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG，含tTG的復(fù)合物，及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，被檢測的是人IgA和/或IgG抗體。
3．如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，tTG或含tTG的復(fù)合物來自于人、動物，或是人工合成或重組的。
4．如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，檢測是用本身已知的免疫分析法，宜通過將一種反應(yīng)物直接或間接地偶聯(lián)于易檢測的標(biāo)記物上而進(jìn)行。
5．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，檢測是在固相上進(jìn)行。
6．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，檢測是用ELISA、RIA或免疫熒光分析法進(jìn)行。
7．tTG，含tTG的復(fù)合物，及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的用途，其特征在于，它們被用于診斷或治療控制伴有針對這些物質(zhì)的免疫反應(yīng)的疾病。
8．如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，用于診斷或治療控制慢性炎性疾病或自身免疫疾病。
9．如權(quán)利要求7或8所述的用途，其特征在于，用于診斷或治療控制口炎性腹瀉或腹腔病。
10．一種口服藥劑，其特征在于，它含有tTG，含tTG的復(fù)合物，及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物，以及任選的藥學(xué)上可耐受的佐劑，它被用于治療伴有針對這些物質(zhì)的免疫反應(yīng)的疾病。
11．如權(quán)利要求10所述的口服藥劑，其特征在于，它被用于診斷或治療控制口炎性腹瀉或腹腔病。
12．tTG，含tTG的復(fù)合物，及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)治療伴有針對這些物質(zhì)的免疫反應(yīng)的疾病的口服藥劑。
13．如權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)治療口炎性腹瀉或腹腔病的口服藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過與組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG,含tTG的復(fù)合物,及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的免疫反應(yīng),來檢測體液抗體的方法。該方法可用于診斷和治療控制那些與針對tTG,含tTG的復(fù)合物,及其抗原結(jié)構(gòu)物、免疫活性序列或類似物的免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病。本發(fā)明還涉及將tTG和這些物質(zhì)用于診斷和治療控制,較佳地用于診斷和治療控制慢性炎性疾病或自身免疫疾病,更佳地用于診斷和治療控制口炎性腹瀉或腹腔病。
文檔編號G01N33/573GK1225723SQ97196526
公開日1999年8月11日 申請日期1997年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月18日
發(fā)明者戴特萊夫·舒潘, 瓦爾伯格·狄特列胥, 托比亞斯·埃尼斯 申請人:戴特萊夫·舒潘, 瓦爾伯格·狄特列胥