專利名稱：一株有機磷農(nóng)藥降解菌的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株高效降解有機磷類農(nóng)藥的芽孢桿菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
有機磷農(nóng)藥以其品種多、藥效高、防治范圍廣譜等特點，至今仍是農(nóng)藥中的用量最 多的類別，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起到了舉足輕重的作用，我國有機磷農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用量占農(nóng)藥 總生產(chǎn)和使用量的一半以上。但是，有機磷農(nóng)藥具有較強的毒性，長期、大量使用后，其在農(nóng) 作物上的殘留會引起食品安全問題，也影響了我國農(nóng)產(chǎn)品出口，而且散落的農(nóng)藥也會使水 和土壤受到污染。 利用微生物降解有機磷農(nóng)藥殘留的生物修復(fù)方法具有低成本、無毒、無二次污染 等優(yōu)點，是最具應(yīng)用前景的削減農(nóng)藥污染的方法之一。有機磷農(nóng)藥降解微生物的培養(yǎng)方法 多數(shù)以葡萄糖提供碳源，酵母膏、蛋白胨或銨鹽提供氮源，還需要補充磷酸鹽和微量元素。 例如中國發(fā)明專利(申請?zhí)?00510022544.9)公開了一株降解有機磷農(nóng)藥毒死蜱的鞘 氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)，主要培養(yǎng)基成分包括葡萄糖、蛋白胨、硫酸銨、磷酸氫二 鉀、硫酸鎂等；中國發(fā)明專利(申請?zhí)?00410081019. X)公開了一株降解有機磷農(nóng)藥的蒼 白桿菌(Ochrobactrum sp.)，其培養(yǎng)基組成也主要是葡萄糖、蛋白胨、磷酸鹽、微量元素等， 這些培養(yǎng)基的成本較高，培養(yǎng)微生物菌體的成本也相應(yīng)較高。 甘薯易腐爛，不宜長期存放。甘薯的深加工，可以解決因貯存鮮薯不當(dāng)而導(dǎo)致大 量爛薯的現(xiàn)象，甘薯精制淀粉經(jīng)過不同深度的加工，可生產(chǎn)出數(shù)百種有價值的產(chǎn)品，增值 10-30倍左右。但是，目前的加工工藝，每生產(chǎn)1噸甘薯淀粉大約產(chǎn)出6噸高濃度有機廢水， 這些廢水的COD值高達(dá)10000mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白質(zhì)、果膠、有機酸及少量 的油脂，易腐敗發(fā)酵，使水質(zhì)發(fā)黑發(fā)臭，排入河流會消耗水中的溶解氧，促進(jìn)藻類及水生植 物繁殖，量大時河流嚴(yán)重缺氧，發(fā)生厭氧腐敗，散發(fā)惡臭，魚、蝦、貝類等水生動物可能會因 此而窒息死亡。而采用一般污水處理工藝將如此高濃度的廢水處理達(dá)標(biāo)，消耗驚人。從另 一個角度考慮，甘薯淀粉廢水中的有機質(zhì)(包括蛋白質(zhì)、果膠、糖類等)是微生物生長的良 好營養(yǎng)底物，可以做成微生物培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)微生物產(chǎn)品。 本專利發(fā)明了一種用甘薯淀粉廢水為主要原料，生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解菌的方法， 采用的菌株是從油菜葉際分離出的一株高效降解有機磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。目前尚未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報道用甘薯淀粉廢水生產(chǎn)降解有機磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)的培養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用甘薯淀粉廢水為主要原料，生產(chǎn)高效降解有機磷農(nóng) 藥的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的方法。 本發(fā)明采用的降解有機磷農(nóng)藥的菌株是由我們實驗室從油菜的葉面上分離篩選出來的。將其編號為N14，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 日期為2009年11月2日，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏編號為 CGMCC No. 3374。該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為 GU086422。在http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/網(wǎng)站上用blast程序與已登錄細(xì)菌菌株的 16S rDNA基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的相似性最 高，可以達(dá)到99%以上。 本發(fā)明所述的菌劑的生產(chǎn)方法如下
1、培養(yǎng)基配制 1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體)硫酸銨1 3g，磷酸氫二鉀1 2g，硫酸鎂0. lg，瓊 脂20g，加甘薯淀粉廢水至1L， pH 7. 0-7. 5 ; 2)菌種活化培養(yǎng)基(液體)硫酸銨1 3g，磷酸氫二鉀1 2g，硫酸鎂0. lg，加 甘薯淀粉廢水至1L， pH 7. 0-7. 5 ; 3)種子培養(yǎng)基(液體)硫酸銨10 30g，磷酸氫二鉀10 20g，硫酸鎂1. Og，加 甘薯淀粉廢水至IOL， pH 7. 0-7. 5 ; 4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0. 1 0. 5kg，磷酸氫二鉀0. 1 0. 4kg，硫酸鎂 20g，加甘薯淀粉廢水至200L， pH 7. 0-7. 5 ;
以上培養(yǎng)基均在121。C滅菌15-30min。 2、菌種轉(zhuǎn)接與活化挑取斜面保存的有機磷農(nóng)藥降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基平板， 35t:連續(xù)劃線、挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于35t:，150-200r/ min搖床振蕩培養(yǎng)12-24h ; 3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% _10%的接 種量接種步驟2活化的有機磷農(nóng)藥降解菌，于25-37°C ，通空氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子。
4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% _10%的接種量 接種步驟3制備的有機磷農(nóng)藥降解菌液體種子，于25-37t:，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌 體培養(yǎng)物，菌體濃度達(dá)到50億CFU/mL以上。 5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計數(shù)后，加入甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 3% -2% )
和甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%-5%)，灌裝保藏。使用時用水稀釋500-1000倍。 由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的有機磷農(nóng)藥降解菌劑能夠有效降解作物表面殘留的有
機磷農(nóng)藥，而且生產(chǎn)成本低廉，還實現(xiàn)了高濃度有機廢水的資源化。以下通過具體實施例詳
細(xì)說明本發(fā)明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實質(zhì)，但不作為對本發(fā)
明實施范圍的限定。 實施例1 :有機磷農(nóng)藥降解菌劑培養(yǎng)方法
1、培養(yǎng)基配制 1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體)硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. lg，瓊脂20g，加 甘薯淀粉廢水至1L， pH 7. 0-7. 5 ; 2)菌種活化培養(yǎng)基(液體)硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. lg，加甘薯淀粉 廢水至1L， pH 7. 0-7. 5 ; 3)種子培養(yǎng)基(液體)硫酸銨20g，磷酸氫二鉀20g，硫酸鎂1.0g，加甘薯淀粉廢 水至IOL， pH 7. 0-7. 5 ;
4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0. 5kg，硫酸鎂20g，磷酸氫二鉀0. 4kg，加甘薯淀
粉廢水至200L， pH 7. 0-7. 5 ; 以上培養(yǎng)基均在12rC滅菌15-30min。 2、菌種轉(zhuǎn)接與活化挑取斜面保存的有機磷農(nóng)藥降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基平板， 35t:連續(xù)劃線、挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于35t:，150r/min 搖床振蕩培養(yǎng)20h ; 3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%的接種量 接種有機磷農(nóng)藥降解菌，于37°C ，通空氣培養(yǎng)24h，得到液體種子。 4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照10%的接種量接種 有機磷農(nóng)藥降解菌液體種子，于37°C ，通空氣培養(yǎng)36h，得到活菌體培養(yǎng)物，菌體濃度達(dá)到 50億CFU/mL。 5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計數(shù)后，加入甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% )和甘油
(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% )，灌裝保藏。使用時用水稀釋500-1000倍。 實施例2 :有機磷農(nóng)藥降解菌劑對油菜葉面敵敵畏農(nóng)藥殘留的降解效果 1)選取兩個完全相同的油菜地塊，各30!112，均勻噴灑1000倍稀釋的80%敵敵畏乳
油農(nóng)藥； 2)噴灑敵敵畏12h后，害蟲已被殺死，均勻噴施農(nóng)藥降解菌劑(用清水稀釋600 倍)，以噴施清水作對照； 3)噴灑菌劑24h后，五點取樣法檢測油菜葉面敵敵畏殘留，發(fā)現(xiàn)噴灑菌劑的處理 組與不噴灑菌劑的對照組相比，敵敵畏殘留量顯著降低，低于蔬菜中敵敵畏殘留國家限量 標(biāo)準(zhǔn)(0. lmg/kg)。 實施例3 :有機磷農(nóng)藥降解菌劑對油菜葉面樂果的降解效果 1)選取兩個完全相同的油菜地塊，各301112，均勻噴灑1000倍稀釋的50%樂果乳油 農(nóng)藥； 2) 12h后，均勻噴施農(nóng)藥降解菌劑(用清水稀釋500倍)，以噴施清水作對照；
3)48d后，五點取樣法檢測油菜葉面樂果的殘留，發(fā)現(xiàn)處理組較對照組油菜中樂果 殘留量顯著降低，低于蔬菜中樂果殘留國家限量標(biāo)準(zhǔn)。 本發(fā)明所提供的降解有機磷農(nóng)藥的菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏日期為2009年11月2日，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏編號為:CGMCC No. 3374。
權(quán)利要求
一種培養(yǎng)高效降解有機磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基以甘薯淀粉廢水為主要營養(yǎng)物質(zhì)來源，培養(yǎng)步驟包括(1)培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體)硫酸銨1～3g，磷酸氫二鉀1～2g，硫酸鎂0.1g，瓊脂20g，加甘薯淀粉廢水至1L，pH7.0-7.5；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體)硫酸銨1～3g，磷酸氫二鉀1～2g，硫酸鎂0.1g，加甘薯淀粉廢水至1L，pH7.0-7.5；3)種子培養(yǎng)基(液體)硫酸銨10～30g，磷酸氫二鉀10～20g，硫酸鎂1.0g，加甘薯淀粉廢水至10L，pH7.0-7.5；4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)硫酸銨0.1～0.5kg，磷酸氫二鉀0.1～0.4kg，硫酸鎂20g，加甘薯淀粉廢水至200L，pH7.0-7.5；以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌15-30min。(2)菌種活化挑取斜面保存的有機磷農(nóng)藥降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基平板，35℃連續(xù)劃線、挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于35℃，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-24h；(3)液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5％-10％的接種量接種步驟(2)活化的有機磷農(nóng)藥降解菌，于25-37℃，通空氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子。(4)液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5％-10％的接種量接種步驟(3)制備的有機磷農(nóng)藥降解菌液體種子，于25-37℃，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體培養(yǎng)物，菌體濃度達(dá)到50億CFU/mL以上。(5)菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計數(shù)后，加入甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3％-2％)和甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％-5％)，灌裝保藏。使用時用水稀釋500-1000倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)高效降解有機磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基以甘薯淀粉廢水為主要營養(yǎng)物質(zhì)來源，培養(yǎng)步驟包括培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備。由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的有機磷農(nóng)藥降解菌劑能高效原位降解植物葉片上有機磷農(nóng)藥殘留，保障食品安全；本發(fā)明技術(shù)方案還能有效資源化甘薯淀粉廢水，減少高濃度廢水排放，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
文檔編號A62D101/26GK101724596SQ20101000046
公開日2010年6月9日 申請日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月11日
發(fā)明者徐圣君, 李祖明, 楊建州, 白志輝, 韓慶莉 申請人:北京聯(lián)合大學(xué)