專利名稱：一種農(nóng)藥降解酶劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶制劑制備工藝的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種農(nóng)藥降解酶劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥殘留導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境惡化，威脅食品安全，一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的問題。農(nóng)藥殘留的生物降解是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，利用基因工程手段構(gòu)建農(nóng)藥解毒酶基因工程菌，發(fā)酵并表達(dá)農(nóng)藥降解酶是是目前解決農(nóng)藥殘留問題的有效技術(shù)手段，具有安全、高效、無二次污染等特點(diǎn)。農(nóng)藥降解酶的制備工藝直接關(guān)系到酶活力的高低，利用基因工程菌制備農(nóng)藥降解 酶的工藝包括種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、菌體收集、菌體破碎和粗酶提取等步驟。在種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程中要保持一定的抗生素壓力以保持工程菌中的質(zhì)粒不丟失。在發(fā)酵前期要加入誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)酶蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)物一般為異丙基硫代半乳糖苷。酶蛋白通常存在于細(xì)胞內(nèi)部，所以發(fā)酵結(jié)束后首先要收集菌體，離心法簡(jiǎn)單易行且回收率高，是工業(yè)化生產(chǎn)首選的收集方法。菌體破碎是粗酶提取的關(guān)鍵工藝，直接關(guān)系到酶活性高低和酶液的品質(zhì)。菌體破碎方法有超聲波破碎、真空負(fù)壓破碎、機(jī)械攪拌破碎、低溫凍融破碎等方法，其中超聲波破碎方法簡(jiǎn)單且效率較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種農(nóng)藥降解酶劑及其制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種農(nóng)藥降解酶劑，所述農(nóng)藥降解酶劑為，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)=CGMCC No. 1529的基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體破碎的上清液。農(nóng)藥降解酶劑為在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的基因工程菌菌液再經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液；即將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)10-15小時(shí)，而后按體積比1% -5%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)2-4小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到22°C -25°C，誘導(dǎo)表達(dá)18-22個(gè)小時(shí)后菌體經(jīng)過破碎并回溶于原發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液，離心得到的上清液即為降解酶劑。農(nóng)藥降解酶劑的制備方法，將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中370C，溶氧量20-30 %，培養(yǎng)10-15小時(shí)，而后按體積比I % _5%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，37 °C，溶氧量20-30 %，培養(yǎng)2-4小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到22°C _25°C，誘導(dǎo)表達(dá)18-22個(gè)小時(shí)后菌體經(jīng)過破碎并回溶于原發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液，離心得到的上清液即為降解酶劑。
將上述所得發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入發(fā)酵液體積1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶菌體，而后以5000rpm離心10分鐘收集菌體，將收集的菌體中加入液氮破碎菌體，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體冷凍干燥，將凍干后的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，再以10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。所述發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計(jì)，蛋白胨2% -3 %、酵母粉2% -3 %、甘油2% -3%, K2HPO4 O. 25%, KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。所述LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計(jì)，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體真空冷凍干燥，其真空度30pa，凍干溫度-50°C，凍干時(shí)間8-12h。所述降解酶劑用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)為1.本發(fā)明制備的農(nóng)藥降解酶劑能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，可以去除水果、蔬菜表面農(nóng)藥殘留，保障食品安全。2.本發(fā)明制備的農(nóng)藥降解酶劑酶活力高，作用迅速。3.本發(fā)明制備的農(nóng)藥降解酶劑酶活力穩(wěn)定。不易失活。4.本發(fā)明制備的農(nóng)藥降解酶劑安全高效，無毒副作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)=CGMCCNo. 1529的基因工程菌株接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，溶氧量20%，培養(yǎng)時(shí)間10個(gè)小時(shí)。LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計(jì)，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50 μ g的氨芐青霉素。所述基因工程菌株，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No. 1529，另參見申請(qǐng)?zhí)?00510086957. 3中的相關(guān)記載。而后按體積比1%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，在370C，溶氧量20%，培養(yǎng)2小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到25°C，誘導(dǎo)表達(dá)20個(gè)小時(shí)后將發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液(稱取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計(jì)加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高于菌體表面0. 5cm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體置于真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，其中真空冷凍干燥真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時(shí)間12h，將凍干后的菌體用0. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計(jì)，蛋白胨2%、酵母粉2%、甘油2%、K2HPO4 O. 25%,KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50 μ g的氨芐青霉素。檢測(cè)上述制備所得農(nóng)藥降解酶的酶活力吸取980 μ I O. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩沖液，10 μ I 10mg/mL的對(duì)硫磷溶液(稱取對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混勻，加入10 μ I上述農(nóng)藥降解酶劑，30°C反應(yīng)I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應(yīng)，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸緩沖液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計(jì)加以校正。)充分混勻，于410nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活力。酶活力單位(U)定義為在30°C，pH 7. O的條件下，I分鐘降解I μ g甲基對(duì)硫磷所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。測(cè)定上述制備的農(nóng)藥降解酶酶活力為10546U/mL，能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。 實(shí)施例2將基因工程菌接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，溶氧量20%，培養(yǎng)時(shí)間10個(gè)小時(shí)。LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計(jì)，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化鈉1%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50的氨芐青霉素。而后按體積比1%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，在370C，溶氧量25%，培養(yǎng)3小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到25°C，誘導(dǎo)表達(dá)22個(gè)小時(shí)后將發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液(稱取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計(jì)加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高于菌體表面0. 5cm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體置于真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，其真空冷凍干燥真空度30pa，凍干溫度-50°C，凍干時(shí)間10h，將凍干后的菌體用0. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計(jì)，蛋白胨2.5%、酵母粉2.5%、甘油2.5%、K2HPO40. 25%,KH2PO4 0. 016%,NaCl 0. 05%、MgSO4 ·H2O 0. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50 μ g的氨芐青霉素。檢測(cè)上述制備所得農(nóng)藥降解酶的酶活力吸取980 μ I 0. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩沖液，10 μ I 10mg/mL的對(duì)硫磷溶液(稱取對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混勻，加入10 μ I上述農(nóng)藥降解酶劑，30°C反應(yīng)I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應(yīng)，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸緩沖液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計(jì)加以校正。)，充分混勻，于410nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活力。酶活力單位(U)定義為在30°C，pH 7. O的條件下，I分鐘降解I μ g甲基對(duì)硫磷所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。測(cè)定上述制備的農(nóng)藥降解酶酶活力為11250U/mL,能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。實(shí)施例3將基因工程菌菌接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，溶氧量20%，培養(yǎng)時(shí)間10個(gè)小時(shí)。LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計(jì)，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50的氨芐青霉素。而后按體積比2%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，在370C，溶氧量30%，培養(yǎng)3小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到22°C，誘導(dǎo)表達(dá)20個(gè)小時(shí)后將發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/20發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液(稱取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計(jì)加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制 容器中，菌體厚度O. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高于菌體表面1cm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體置于真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，其中真空冷凍干燥真空度30pa，凍干溫度-50°C，凍干時(shí)間12h)，將凍干后的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計(jì)，蛋白胨3%、酵母粉2%、甘油2. 5%、K2HP04 0. 25%,KH2PO4 0. 016%, NaCl 0. 05%, MgSO4 · H2O 0. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加75 μ g的氨芐青霉素。檢測(cè)上述制備所得農(nóng)藥降解酶的酶活力吸取980 μ I 0. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩沖液，10 μ I 10mg/mL的對(duì)硫磷溶液(稱取對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混勻，加入10 μ I上述農(nóng)藥降解酶劑，30°C反應(yīng)I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應(yīng)，吸取0. 5ml加入4. 5mL0. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸緩沖液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計(jì)加以校正。)，充分混勻，于410nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活力。酶活力單位(U)定義為在30°C，pH 7. O的條件下，I分鐘降解I μ g甲基對(duì)硫磷所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。測(cè)定上述制備的農(nóng)藥降解酶酶活力為11532U/mL，能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)藥降解酶劑，其特征在于所述農(nóng)藥降解酶劑為，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)=CGMCC No. 1529的基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體破碎的上清液。
2.按權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥降解酶劑，其特征在于農(nóng)藥降解酶劑為在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的基因工程菌菌液再經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液；即將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)10-15小時(shí)，而后按體積比1% _5%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，37 °C，溶氧量20-30 %，培養(yǎng)2-4小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到22°C _25°C，誘導(dǎo)表達(dá)18-22個(gè)小時(shí)后菌體經(jīng)過破碎并回溶于原發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩沖液，離心得到的上清液即為降解酶劑。
3.—種權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥降解酶劑的制備方法，其特征在于將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 °C，溶氧量20-30 %，培養(yǎng)I O-15小時(shí)，而后按體積比1% -5%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)2-4小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到220C -25°C，誘導(dǎo)表達(dá)18-22個(gè)小時(shí)后菌體經(jīng)過破碎并回溶于原發(fā)酵液體積的O. lmol/LpH7. O的磷酸鹽緩沖液，離心得到的上清液即為降解酶劑。
4.按權(quán)利要求4所述的農(nóng)藥降解酶劑的制備方法，其特征在于將上述所得發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入發(fā)酵液體積1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶菌體，而后以5000rpm離心10分鐘收集菌體，將收集的菌體中加入液氮破碎菌體，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體冷凍干燥，將凍干后的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，再以10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。
5.按權(quán)利要求4所述的農(nóng)藥降解酶劑的制備方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計(jì)，蛋白胨2% -3%、酵母粉2% -3%、甘油2% -3%、K2HPO4 O. 25%, KH2PO4O.016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。
6.按權(quán)利要求4所述的農(nóng)藥降解酶劑的制備方法，其特征在于所述LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計(jì)，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。
7.按權(quán)利要求4所述的農(nóng)藥降解酶劑的制備方法，其特征在于所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體真空冷凍干燥，其真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時(shí)間8-12h。
8.按權(quán)利要求4所述的農(nóng)藥降解酶劑的制備方法，其特征在于所述降解酶劑用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶劑制備工藝的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種農(nóng)藥降解酶劑及其制備方法。所述所述農(nóng)藥降解酶劑為保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No.1529的基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體破碎的上清液。本發(fā)明制備的農(nóng)藥降解酶劑能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，可以去除水果、蔬菜表面農(nóng)藥殘留，保障食品安全。
文檔編號(hào)A62D101/26GK102994462SQ20111043107
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者謝建飛, 石元亮, 盧宗云, 張惠文, 李鵬程, 邢云鵬, 李敏 申請(qǐng)人:遼寧中科生物工程有限公司