專利名稱：一種動脈粥樣硬化大鼠模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥模型技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于研究動脈粥樣硬化病理機制、藥理學(xué)評價動物模型的制備方法。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)生的危險因素主要為高血壓、高脂血癥、吸煙等，導(dǎo)致血管壁形成大小不一的斑塊，妨礙相應(yīng)組織器官的血流供應(yīng)。建立AS的病理模型可進行病理機制和藥理學(xué)研究。
現(xiàn)有的采用家兔、鵪鶉等建立的食餌性AS模型有一定的局限性。家兔和鵪鶉主動脈斑塊病變處多呈火山口樣改變及大量的泡沫細胞在表面堆積，與人類AS斑塊的病理類型不一致；家兔和鵪鶉冠狀動脈的分支主要發(fā)生于心肌內(nèi)的冠狀動脈中小分支，與人類發(fā)病的部位也不一致。
大鼠具有飼養(yǎng)方便、抵抗力強、食性與人相近等優(yōu)點。用高脂飼料添加膽鹽和抗甲狀腺藥物可使血脂升高。但由于大鼠的抗病能力強，形成AS發(fā)病周期長，且只能形成類似人類早期的AS病變，而不易形成后期的病變。采用大劑量維生素D3一次性腹腔注射后，雖能快速誘導(dǎo)主動脈AS病變。但由于是一次性注射而未給予高脂飼料喂養(yǎng)，故難以形成冠狀動脈等器官性的進一步AS全身性后期病變。
本發(fā)明提供一種制作周期短、成本低、病理狀態(tài)與人體相似的一種誘發(fā)動物全身性動脈硬化病變病理模型的方法。本發(fā)明動物模型制作方法如下1.動物雄性大鼠；2.高脂飼料的成分及配比基礎(chǔ)飼料(參照實驗動物管理委員會規(guī)定大鼠食用配料)70-95％，膽固醇1-6％，豬油3-12％，白糖0-10％，膽酸鈉0.01-5％，丙基硫氧嘧啶或甲基硫氧嘧啶0.01-3％；3.飼料加工方法按上述配比將膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶或甲基硫氧嘧啶、白糖及豬油與基礎(chǔ)飼料攪拌均勻后，壓制成顆粒，烘干成高脂飼料；4.模型的制作按體重給予雄性大鼠注射維生素D320-200萬單位/kg后，喂食上述高脂飼料7-20周，即成動脈粥樣硬化大鼠模型。
取該模型大鼠的主動脈、冠狀動脈進行病理觀察，可觀測到全身性的動脈粥樣硬化病理改變，其病變與人類發(fā)病狀態(tài)類似，因此可用于研究動脈粥樣硬化的病理學(xué)機制及藥理學(xué)評價。
具體實施例方式
實施例1.制作大鼠高脂飼料將3％膽固醇，0.5％膽酸鈉，0.2％丙基硫氧嘧啶，5％白糖，10％豬油(精致豬板油)與81.3％基礎(chǔ)飼料(上海西普爾-必凱公司)攪拌均勻后，壓制成顆粒即成大鼠高脂飼料。
實施例2.制作動脈粥樣硬化大鼠模型雄性Wistar大鼠20只，體重300±10g，購自中科院上海實驗動物中心(合格證號SCXK滬2002-0010)。隨機分成對照組和實驗組2組，每組10只。飼養(yǎng)于清潔級動物房。實驗組大鼠在腹腔注射維生素D360萬單位/kg體重后，喂食本發(fā)明高脂飼料。正常組大鼠腹腔注射同等體積的生理鹽水后，給予普通顆粒飼料(成分同基礎(chǔ)飼料，上海西普爾-必凱公司)喂養(yǎng)。8周后處死大鼠，取主動脈、心臟、肝臟、腦、腎臟進行病理觀測，觀察下列病理學(xué)變化。
1.主動脈病變程度觀測①大體觀察沿主動脈瓣至髂動脈分支處取出主動脈，縱向剪開，在10％福爾馬林溶液中固定，大體觀察，確定斑塊面積及部位。
通過大體觀察，參照《中藥藥理研究方法學(xué)》、《現(xiàn)代藥理實驗方法》，病變按照下述標準評分0級內(nèi)膜表面光滑，無斑塊，評0分；0.5級內(nèi)膜有輕度奶油色變化，但無凸出于表面的斑塊，評0.5分；1級有明顯的凸起奶油色斑塊，面積小于3mm2，評1分；2級斑塊面積大于3mm2，評2分；3級斑塊融合成片，大部分斑塊面積大于3mm2，評3分；4級斑塊幾乎覆蓋整個動脈內(nèi)膜，評4分。
結(jié)果顯示，經(jīng)油紅O大體染色后，對照組未出現(xiàn)陽性斑塊。實驗組大鼠主動脈出現(xiàn)大量斑塊，病變評分達2.5±1.4，斑塊區(qū)域主要分布于主動脈弓、腹主動脈及髂動脈分叉處。
②病理切片觀察取主動脈弓、胸動脈、腹動脈中段縱切面，石蠟包埋，連續(xù)切片，作HE染色及鈣質(zhì)染色。
經(jīng)石蠟包埋切片后，HE染色光鏡下觀察，對照組血管細胞排列整齊而完整；實驗組病變部位內(nèi)膜明顯增厚，血管內(nèi)皮細胞排列不完整，平滑肌細胞在內(nèi)膜增生顯著，與大量堆積的泡沫細胞形成典型的動脈粥樣硬化斑塊。經(jīng)鈣質(zhì)染色后斑塊內(nèi)顯示明顯鈣化灶。結(jié)果顯示，實驗組大鼠8周后主動脈出現(xiàn)典型的動脈粥樣硬化病變。
2.心臟病理觀測①冠狀動脈病變心臟在冠狀溝下方和距心尖0.5cm處橫斷，取其間組織塊，石蠟包埋，連續(xù)切片，作HE染色。另外，每組3只在心臟相同部位作冰凍切片，進行油紅O染色。
參照《中藥藥理研究方法學(xué)》、《現(xiàn)代藥理實驗方法》，每只動物觀察10個動脈斷面，冠狀動脈病變程度分級按照以下標準評分0級動脈內(nèi)膜無脂質(zhì)浸潤，評0分；0.5級內(nèi)膜有輕度脂質(zhì)浸潤，評0.5分；1級內(nèi)膜斑塊占血管腔面積的1/4，評1分；2級內(nèi)膜斑塊占血管腔面積的1/2，評2分；3級內(nèi)膜斑塊占血管腔面積的1/2以上，評3分；4級斑塊幾乎堵塞整個管腔，評4分。
對照組大鼠心臟冠狀動脈經(jīng)油紅O染色后未發(fā)現(xiàn)陽性斑塊區(qū)域。實驗組大鼠出現(xiàn)典型的冠狀血管AS病變，病變程度評分為1.9±0.8。病變的冠狀血管主要分布于分支比中等大小的分支。病變過程、分布與人類相似、AS病變區(qū)主要為內(nèi)膜增厚，管腔嚴重狹窄；內(nèi)皮和平滑肌層細胞排列紊亂，平滑肌增生明顯。經(jīng)冰凍切片、油紅O染色后，AS病變區(qū)血管壁染色陽性，血管內(nèi)膜堆積大量泡沫細胞。結(jié)果顯示，實驗組大鼠8周后冠狀動脈出現(xiàn)典型的動脈粥樣硬化病變。
②心肌病變經(jīng)油紅O染色，實驗組大鼠心肌陽性區(qū)域呈片狀，病變區(qū)心肌細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒。結(jié)果顯示，實驗組大鼠8周后心肌存在脂肪沉積。
3.其它組織病理觀測取肝臟、腦、腎臟橫斷面，進行病理觀測。
將大鼠解剖后大體觀察，實驗組大鼠肝臟呈現(xiàn)乳黃色。冰凍切片經(jīng)油紅O進行脂肪染色呈強陽性。肝細胞特別是肝血竇周圍細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量的紅染脂質(zhì)顆粒，證明肝臟存在脂質(zhì)沉積。腦動脈和腎臟動脈均出現(xiàn)不同程度的粥樣硬化病變。
表1.實驗組大鼠動脈粥樣硬化病變統(tǒng)計表。
主動脈 冠狀動脈編號心肌脂質(zhì)沉積肝臟脂質(zhì)沉積 腎動脈 腦動脈病變評分病變評分1 1 1 + ++ -2 4 2 + ++ +3 3 2 + ++ +4 3 2 + ++ +5 3 2 + ++ +6 0 0.5+ ++ -7 4 3 + ++ +8 4 3 + ++ +9 1 1 + ++ -10 2 2 + ++ -+存在病變；-未檢測到病變。
病理結(jié)果顯示，本發(fā)明制備方法能使大鼠主動脈和冠狀動脈血管壁均出現(xiàn)大量粥樣斑塊，心肌、肝臟組織均存在脂肪沉積，腦動脈和腎臟動脈均出現(xiàn)不同程度的粥樣硬化病變。結(jié)果表明，本發(fā)明可用于制備更接近于人類發(fā)病狀態(tài)的全身性動脈粥樣硬化大鼠模型，且方法快速簡便，為進一步研究動脈粥樣硬化的病理機制及藥理研究提供了穩(wěn)定、可靠的動物模型。
權(quán)利要求
1.一種動脈粥樣硬化大鼠模型的制備方法，按如下操作給雄性大鼠按體重注射維生素D3 20-200萬單位/kg后，喂食高脂飼料7-20周，即成動脈粥樣硬化大鼠模型；所說的高脂飼料配方與配比如下基礎(chǔ)飼料70-95％膽固醇1-6％豬油3-12％白糖0-10％膽酸鈉0.01-5％丙基硫氧嘧啶或甲基硫氧嘧啶0.01-3％按上述配比將各成分攪拌均勻后，壓制成顆粒并烘干，即成高脂飼料。
2.權(quán)利要求所述方法制備的動脈粥樣硬化大鼠模型在研究動脈粥樣硬化病理機制、藥理學(xué)評價中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥模型技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于研究動脈粥樣硬化病理機制、藥理學(xué)評價的動物模型。本發(fā)明選用雄性大鼠，先注射維生素D
文檔編號G09B23/36GK1542704SQ2003101083
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月4日
發(fā)明者楊鵬遠, 芮耀誠 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)