專利名稱：使用激光噴霧電離的質(zhì)譜法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文揭示用于使用激光噴霧電離(LSI)的質(zhì)譜法的系統(tǒng)和方法。LSI可在大氣壓下產(chǎn)生多電荷離子以用于分析并且允許分析高分子量分子，包括超過4000道爾頓的分子。所述分析可以是基于溶劑或無溶劑分析。跟蹤LSI的無溶劑分析允許改進(jìn)的空間分辨率，其有利于組織成像和分析溶解度有限的化合物。相關(guān)串請(qǐng)案的交叉引用本申請(qǐng)案主張2009年6月3日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/183，899號(hào)、2009年10月13日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/251，247號(hào)、2009年10月16日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/252，580號(hào)、2010年2月23日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/307，352號(hào)和2010年5月26日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/348，676號(hào)的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)案以全文引用 的方式并入本文中。
背景技術(shù)：
基質(zhì)輔助激光解吸/ 電離(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)是一種用于質(zhì)譜法(MS)中的電離技術(shù)，其允許分析許多(生物)分子。所述(生物)分子的電離是通過激光觸發(fā)，而基質(zhì)是用于保護(hù)(生物)分子免受激光影響。適當(dāng)基質(zhì)材料一般具有低分子量并且常常呈酸性以提供質(zhì)子源，優(yōu)先產(chǎn)生帶正電(生物)分子離子；基本基質(zhì)材料也可用于優(yōu)先提供帶負(fù)電(生物)分子離子?；|(zhì)材料在所用的激光波長(zhǎng)下還具有良好光學(xué)吸收以使得其快速吸收激光照射。在這一過程期間還常常使用溶劑。表面成像可能非常適用于如檢測(cè)癌癥邊界、確定藥物攝取位置和在腦組織中定位信號(hào)傳導(dǎo)分子或合成材料分析(聚合物組合物中的斷裂)等多種領(lǐng)域。已充分建立通過MS進(jìn)行成像，尤其使用次級(jí)離子質(zhì)譜法(secondary ion mass spectrometry, SIMS),但SIMS僅勉強(qiáng)適用于完整生物組織。另一方面，MALDI MS已在用于組織成像方面獲得一定的成功，尤其用于高豐度組分，諸如膜脂、藥物代謝物和蛋白質(zhì)。然而，使用所述基于真空的MALDIMS來進(jìn)行組織成像，尤其對(duì)于純的組織來說存在許多缺點(diǎn)。大氣壓(AP)-MALDI組織成像解決了真空MALDI的許多缺點(diǎn)，但因其在高空間分辨率下的敏感度問題而受限。重要的是，MALDI以作為一種主要產(chǎn)生單電荷離子以用于MS分析的電離方法而著稱。然而，有效的MS儀器通常并不檢測(cè)單電荷離子，因此AP-MALDI可能與高分辨率質(zhì)譜儀不相容。使用溶劑的傳統(tǒng)分析方法還產(chǎn)生許多缺點(diǎn)。舉例來說，雖然目前使用的MALDI技術(shù)可用于分析一些(生物)分子，但對(duì)于通常不溶于常見溶劑中的許多(生物)分子(包括蛋白質(zhì))來說仍存在相當(dāng)大的技術(shù)障礙。舉例來說，諸如膜蛋白等一些蛋白質(zhì)因?yàn)榫哂惺杷远蝗?。另外，錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)具有暴露的疏水性區(qū)域并且可形成不溶性聚集體。許多重組蛋白質(zhì)當(dāng)在異源宿主中過表達(dá)時(shí)，會(huì)因?yàn)殄e(cuò)誤折疊而變得不溶或發(fā)展諸如阿茲海默氏病(Alzheimer, s Disease)等疾病狀況。另外，在基于溶劑的MS樣品制備中，會(huì)出現(xiàn)人為因素，諸如色氨酸和甲硫氨酸殘基的氧化(科恩(Cohen)，分析化學(xué)(Anal. Chem.) 2006 ；78 =4352-4362 ；弗洛里希(Froelich)等人,蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics) 2008 ;8 :1334-1345)。這些人為因素可能在組合樣品和基質(zhì)的溶液的同一時(shí)段內(nèi)產(chǎn)生。因此，基于溶劑的MS可能對(duì)于與了解氧化應(yīng)激有關(guān)的應(yīng)用并非最佳。MS在用于表征材料時(shí)存在這些缺點(diǎn)和其它缺點(diǎn)，這是因?yàn)槠錈o法分析純的、復(fù)雜的、電離延遲或溶解延遲材料。生物材料是一類所述復(fù)雜的材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過質(zhì)譜法(MS)改進(jìn)材料分析和表面成像(包括組織成像)的系統(tǒng)和方法。所述系統(tǒng)和方法利用激光噴霧電離(LSI)方法，其產(chǎn)生更易通過MS儀器檢測(cè)的許多多電荷離子，而非通過常規(guī)基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)產(chǎn)生的主要為單電荷的離子。在透射幾何條件下對(duì)準(zhǔn)的激光改進(jìn)空間分辨率，這對(duì)于表面成像分析尤其重要。跟蹤LSI的MS可以是基于溶劑或無溶劑分析。跟蹤LSI的無溶劑分析避免了上文所述的與基 于溶劑的分析相關(guān)的許多缺點(diǎn)。無溶劑分析還允許改進(jìn)的空間分辨率，其有利于MS表面成像。特定來說，本文所揭示的一實(shí)施例提供一種產(chǎn)生多電荷離子以用于分析材料的方法，其包含將所述材料和基質(zhì)涂覆于表面作為材料/基質(zhì)分析物；在大氣壓或接近大氣壓下用激光燒蝕所述材料/基質(zhì)分析物；和使經(jīng)激光燒蝕的材料/基質(zhì)分析物穿過加熱區(qū)域，隨后材料/基質(zhì)分析物進(jìn)入質(zhì)譜儀的高度真空區(qū)域。所產(chǎn)生的多電荷離子可以是正離子或負(fù)離子。在另一實(shí)施例中，所述基質(zhì)由在激光波長(zhǎng)下吸收能量的小分子構(gòu)成。在另一實(shí)施例中，所述小分子是選自由二羥基苯甲酸和二羥基苯乙酮組成的群組。在另一實(shí)施例中，小分子是選自由以下組成的群組2，5-二羥基苯甲酸(2，5-DHB ;酸性基質(zhì)材料)；2，5_ 二羥基苯乙酮(2，5-DHAP) ;2，6_ 二羥基苯乙酮(2，6_DHAP) ;2，4，6_三羥基苯乙酮(2，4，6-THAP) ; a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA) ;2_氨基苯甲醇(2-ABA ;基本基質(zhì)材料)；和/或具有類似位置官能團(tuán)的其它小芳香族分子。在另一實(shí)施例中,激光在紫外區(qū)中具有輸出功率。在另一實(shí)施例中,激光是氮?dú)饧す?337nm)或三倍頻Nd/YAG激光(355nm)。在另一實(shí)施例中，所述加熱區(qū)域是加熱管。在特定實(shí)施例中，加熱管由不會(huì)放出對(duì)質(zhì)譜儀真空系統(tǒng)有害的蒸氣的耐熱材料構(gòu)成。在另一實(shí)施例中，所述管由金屬或石英構(gòu)成?？芍苯踊蜷g接加熱所述管。在一些實(shí)施例中，其可直接或間接加熱到50-600°C的溫度。在另一實(shí)施例中，所述管可直接或間接加熱到150-450°C的溫度。在另一實(shí)施例中，由材料/基質(zhì)分析物的激光燒蝕點(diǎn)和通向質(zhì)譜儀的真空的離子入口界定的離子源區(qū)域中的電場(chǎng)小于800V。在另一實(shí)施例中，所述離子源區(qū)域中的電場(chǎng)小于100V。在另一實(shí)施例中，離子源區(qū)域中的電場(chǎng)是0V。在另一實(shí)施例中，離子源區(qū)域中的電場(chǎng)小于OV。材料可以是生物材料或非生物材料。在某些實(shí)施例中，材料是生物材料并且可以是(但不限于)蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物或脂質(zhì)。在其它實(shí)施例中，材料是非生物材料并且可以是(但不限于)聚合物或油。本文所揭示的實(shí)施例可包括使用無溶劑或基于溶劑的材料/基質(zhì)分析物制備方法分析材料/基質(zhì)分析物。在一實(shí)施例中，所述分析包括表面成像和/或電荷遠(yuǎn)程斷裂以用于結(jié)構(gòu)表征。在另一實(shí)施例中，質(zhì)譜儀用于分析材料/基質(zhì)中的分析物。所述分析可在正離子或負(fù)離子模式下進(jìn)行。激光燒蝕可在透射或反射幾何條件下完成。透射幾何條件使燒蝕區(qū)域最小(例如組織中的亞細(xì)胞)。所述表面可以是(但不限于)在反射模式下的玻璃、石英、陶瓷、金屬、聚合物，或在透射模式下的玻璃、石英和/或聚合物。


圖I展示用于獲得圖2-14(七種肽、兩種小蛋白質(zhì)和四種脂質(zhì))中所示的圖像的基質(zhì)(2，5_ 二羥基苯甲酸(DHB)/分析物)的照片。圖2描繪P -淀粉樣蛋白(33-42)的無溶劑和基于溶劑的分析。 圖3描繪促脂解素的無溶劑和基于溶劑的分析。圖4描繪加壓素的無溶劑和基于溶劑的分析。圖5描繪強(qiáng)啡肽(dynorphin)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖6描繪P -淀粉樣蛋白(1-11)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖7描繪物質(zhì)P的無溶劑和基于溶劑的分析。圖8描繪蜂毒肽(mellitin)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖9描繪P -淀粉樣蛋白(1-42)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖10描繪牛胰島素的無溶劑和基于溶劑的分析。圖11描繪2-花生四烯?；视?2-AG)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖12描繪N-花生四烯?；鵜氨基丁酸(NAGABA)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖13描繪磷脂酰肌醇(PI)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖14描繪磷脂酰膽堿(PC)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖15描繪根據(jù)形狀的同重分子(具有相同標(biāo)稱質(zhì)量的化合物)的無溶劑分離。圖16展示對(duì)根據(jù)形狀的異構(gòu)分子(元素組成相同但結(jié)構(gòu)不同的化合物)說明的無溶劑分離。圖17提供使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)使質(zhì)譜法成像的方法的示意圖，其展示用于真空或大氣壓(AP)方法(AP-MALDI和激光噴霧電離(LSI))的更均質(zhì)無溶劑基質(zhì)/分析物制備的優(yōu)點(diǎn)。圖18描繪TissueBox的示意圖，其展示在組織切片上制備基質(zhì)。圖19描繪TissueBox的照片。圖20描繪顯示內(nèi)部的TissueBox的適配器組固持器。圖21描繪球磨裝置(TissueLyzer (加利福尼亞州瓦倫西亞的凱杰公司(Qiagen，Valencia, CA)))，其以所需時(shí)間和頻率同時(shí)震蕩兩個(gè)適配器組以使得球狀物通過球磨方法
研磨基質(zhì)。圖22A-B描繪用44微米篩網(wǎng)球磨(DHB基質(zhì)，在25Hz下30秒)后的基質(zhì)晶體尺寸。圖22A展示放大100倍(500 u m比例尺)和放大100倍的插圖(50 u m比例尺)。圖22B展不使用掃描電子顯微術(shù)(Scanning electron microscopy, SEM)放大3000倍的10 u m比例尺。圖23描繪用44微米篩網(wǎng)球磨(DHB基質(zhì)，在25Hz下30秒)后的基質(zhì)晶體尺寸。圖24描繪約10 ii m尺寸的圖25的基質(zhì)晶體的放大圖。圖25描繪使用安裝有不同篩網(wǎng)尺寸和不同不銹鋼珠粒(I. 2mm和4mm)的SurfaceBox且使用25Hz頻率和60秒持續(xù)時(shí)間、使用20 U m篩網(wǎng)轉(zhuǎn)移基質(zhì)的TissueLyzer設(shè)定沉積于空顯微載片上的基質(zhì)的光學(xué)顯微術(shù)圖像。使用DHB基質(zhì)。圖26描繪如圖25中但使用a -氰基-4-羥基-肉桂酸(CHCA)基質(zhì)獲得的基質(zhì) 的光學(xué)顯微術(shù)圖像。圖27描繪使用安裝有不同篩網(wǎng)尺寸和不同不銹鋼珠粒(I. 2mm和4mm)的SurfaceBox且使用25Hz頻率和5分鐘持續(xù)時(shí)間、使用3 ii m篩網(wǎng)轉(zhuǎn)移基質(zhì)的TissueLyzer設(shè)定沉積于空顯微載片上的基質(zhì)的光學(xué)顯微術(shù)圖像。使用CHCA基質(zhì)。圖28展示使用(I)快速無溶劑SurfaceBox基質(zhì)沉積(左)和(2)噴涂(右)和CHCA基質(zhì)時(shí)小鼠腦組織的組織成像(A)用CHCA基質(zhì)覆蓋的組織的照片；(B)質(zhì)譜；(C)各別m/z值的MS圖像對(duì)于無溶劑為(I) 779. 6和(II) 843. 3以及對(duì)于基于溶劑為(1)726.3和(11)804. 3。圖29描繪小鼠腦的無溶劑DHB制備。圖30描繪在布魯克(Bruker)儀器(馬薩諸塞州比爾里卡的布魯克 達(dá)托尼克斯公司(Bruker Datonics, Inc. , Billerica, MA))上使用2, 5-DHB作為基質(zhì)時(shí)小鼠腦的無溶劑 TissueBox 制備。圖31描繪用乙醇洗滌且用溶于50 50 0. 2乙腈(ACN) /水/三氟乙酸(TFA)中的芥子酸基質(zhì)點(diǎn)樣的小鼠腦的MALDI-飛行時(shí)間(Time of Flight，TOF)MS質(zhì)譜。圖32A-B描繪用乙醇洗滌且用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)點(diǎn)樣的小鼠腦的LSI-MS質(zhì)譜。圖33描繪激光燒蝕后用乙醇洗滌且用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)點(diǎn)樣的小鼠腦。圖34描繪使用雙篩網(wǎng)方法產(chǎn)生較細(xì)粒徑的圖。圖35描繪雙篩網(wǎng)TissueBox方法的圖。圖36展示使用如下TissueLyzer條件時(shí)使用(I)鉻珠粒和(2)不銹珠粒預(yù)研磨的基質(zhì)的SEM圖像(A) 15Hz頻率持續(xù)30分鐘和(B) 25Hz頻率持續(xù)5分鐘。圖37展示使用安裝有3iim篩網(wǎng)尺寸和不同不銹鋼珠粒(I.2mm和4mm)的SurfaceBox且使用25Hz頻率和5分鐘持續(xù)時(shí)間的TissueLyzer設(shè)定沉積于小鼠腦組織切片上的DHB基質(zhì)的光學(xué)顯微術(shù)圖像。展示透射光。圖38展示使用SurfaceBox沉積于小鼠腦組織切片上的DHB基質(zhì)的光學(xué)顯微術(shù)圖像，并提供在25Hz/300秒下根據(jù)44X 3 y m篩網(wǎng)的DHB的光學(xué)顯微術(shù)圖像。圖39展示使用安裝有3iim篩網(wǎng)尺寸和不同不銹鋼珠粒(I.2mm和4mm)的SurfaceBox且使用25Hz頻率和5分鐘持續(xù)時(shí)間的TissueLyzer設(shè)定沉積于小鼠腦組織切片上的DHB基質(zhì)的光學(xué)顯微術(shù)圖像。展示反射光。圖40展示與單篩網(wǎng)TissueBox (圖23)相比提供小于< 5 ii m的粒子的顯著增加的雙篩網(wǎng)TissueBox (比例尺在右下角)。
圖41描繪比較常規(guī)RG (上部)與TG (下部)的流程。圖42描繪用于在AP下產(chǎn)生離子的基質(zhì)涂覆和基于激光的源設(shè)計(jì)的示意圖。圖42⑷展示RG且圖42⑶展示TG。圖43展示使用無場(chǎng)透射幾何條件大氣壓(LSI)分析小鼠腦組織的結(jié)果。圖44描繪小鼠腦切片的分析。圖45描繪激光燒蝕后圖44(1)的經(jīng)無溶劑基質(zhì)處理的組織切片。圖46描繪激光燒蝕后圖44 (I)的經(jīng)無溶劑基質(zhì)處理的組織切片；包圍凹坑的其余基質(zhì)指示基質(zhì)有助于組織的燒蝕過程。圖47描繪激光燒蝕后圖44(2)的經(jīng)無溶劑基質(zhì)處理的組織切片。 圖48是兩種不同無溶劑樣品制備方法的圖。圖49描繪使用LSI形成多電荷離子的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖50從正面描繪離子最大源的特寫圖，以最顯著位置展示固持于x、y、z臺(tái)上的聚焦透鏡。圖51描繪極接近于離子入口孔(小孔)的石英板的特寫圖。圖52描繪通過僅以正向和反向移動(dòng)使石英板多次穿過激光束而形成穿過基質(zhì)的線(心形)。圖53描繪溶于2，5_DHB基質(zhì)中的鞘磷脂。圖54展示來自鞘磷脂的全部為單電荷的離子。圖55描繪溶于2，5_DHB中的磷脂酰甘油，展示單電荷離子。圖56描繪溶于2，5-DHB中的磷脂酰肌醇的譜圖，展示單電荷離子。圖57描繪溶于2，5_DHB中的大麻素(anandamide)的譜圖，展示單電荷離子。圖58描繪溶于2，5_DHB中的NAGly的譜圖，展示單電荷離子。圖59描繪亮氨酸腦啡肽(Leu-Enkaphelin)的譜圖，通過LSI展示單電荷離子。圖60描繪緩激肽的譜圖，通過LSI展示雙電荷離子和無單電荷離子。圖61描繪物質(zhì)P的雙電荷離子的譜圖。圖62描繪血管緊張素I的LSI譜圖。圖63描繪血管緊張素I的ESI譜圖。圖64描繪ACTH的譜圖，展示在遞增的分子量下LSI產(chǎn)生較高電荷狀態(tài)。圖65描繪具有電荷狀態(tài)+4的淀粉樣蛋白1-42的譜圖。圖66描繪具有電荷狀態(tài)+5的淀粉樣蛋白1-42的譜圖。圖67描繪具有電荷狀態(tài)+6的淀粉樣蛋白1-42的譜圖。圖68描繪牛胰島素的譜圖，展示電荷狀態(tài)+4和+5。圖69描繪放在載玻片上的基質(zhì)/分析物樣品制備物上的金屬絲網(wǎng)。圖70描繪使用圖69的金屬絲網(wǎng)的結(jié)果。圖71A-C描繪胰蛋白酶牛血清白蛋白(BSA)蛋白質(zhì)消化物的LSI-離子遷移率光譜法-質(zhì)譜法(MS) -MS和MS/MS，其使用基于溶劑的樣品制備條件和2，5-DHAP基質(zhì)，150°C的錐孔溫度和所安裝的脫溶劑化裝置(未加熱)I) IMS-MS (圖71 (A) )、II) Triffave切片的圖71 (B)阱和圖71 (C)轉(zhuǎn)移區(qū)域中的CID斷裂。左邊顯示質(zhì)譜且右邊顯示漂移時(shí)間分離相對(duì)于質(zhì)荷比(m/z)的2D圖。
圖72描繪總無溶劑分析的益處的實(shí)例。 圖73A-B描繪通過粗油樣品的無溶劑樣品制備、隨后LSI-MS-MS采集得到的TSA。圖74A-C描繪TSA質(zhì)譜。圖75描繪使用2，5-DHB和使用400°C的經(jīng)加熱轉(zhuǎn)移毛細(xì)管在LTQ Velos儀器上進(jìn)行碳酸酐酶(平均分子量29029)蛋白質(zhì)的LSI。圖76描繪在LTQ-ETD Velos儀器上進(jìn)行LSI。 圖77描繪OVA肽323-339的不同電荷狀態(tài)的LSI-CID質(zhì)譜。圖78A-F描繪如下比較圖78 (A，D)混合物I的LSI-LTQ-MS分析，和圖78 (B，E)GF (m/z = 612.4)的CID譜圖。圖78(C，F(xiàn))展示血管緊張素I (m/z = 648. 9)，使用DHAP和DHB基質(zhì)。圖79A-B 描繪使用 OVA 肽 323-339 (m/z 444. 554)的 CID 得到的 LSI-MSn 譜圖。圖80A-B描繪血管緊張素-I的MS/MS譜圖。圖81A-B描繪氧化的P -淀粉樣蛋白10-20的MS/MS譜圖，m/z 488 (A)LSI_CID、(B) LSI-ETD，使用 DHB。圖82A-E描繪的照片說明LSI-MS分析的優(yōu)化和益處(I)利用精確和連續(xù)燒蝕，使用SYNAPT G2的XYZ臺(tái)(左欄)，即手動(dòng)成像實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行采集，(A)到(C);封埋有基質(zhì)/分析物樣品的載玻片=(D)基于溶劑到(E)無溶劑樣品制備，使用2，5-DHAP和血管緊張素
Io圖83A-B描繪基于溶劑沉積且在透射幾何條件LSI型設(shè)定下通過N2激光燒蝕的2,5-DHB的顯微術(shù)。圖84描繪在MS-MS SYNAPT G2上進(jìn)行源修改以使得能夠脫除在激光燒蝕期間所形成的基質(zhì)/分析物簇的溶劑，從而獲得類似ESI的多電荷離子。圖85描繪脫溶劑化裝置金屬材料的比較研究。利用使用I)血管緊張素1、2)牛胰島素和3)泛素作為樣品的A)銅和B)不銹鋼獲得LSI-MS質(zhì)譜，使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)制備。圖86描繪使用銅脫溶劑化裝置且使用2，5-DHAP作為基質(zhì)時(shí)以下物質(zhì)的LSI-MS質(zhì)譜1)血管緊張素1、2)胰島素、3)泛素和4)溶菌酶，A)不使用熱，和B)施加額外的熱(5V)。圖87描繪泛素的多電荷結(jié)構(gòu)的LSI-MS-MS。圖88描繪LSI-MS-MS。部分(I)展示質(zhì)譜且部分(2)展示以下各物的td相對(duì)于m/z的2D圖A)細(xì)胞色素C、⑶溶菌酶和C)肌紅蛋白，其是使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)制備并且使用銅脫溶劑化裝置在不使用熱的情況下獲得。圖89描繪￠-淀粉樣蛋白(1-42)與(42-1)的異構(gòu)蛋白質(zhì)的LSI-MS-MS，其使用溶于50 50ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)且使用銅脫溶劑化裝置在不使用熱的情況下獲得。圖90描繪使用2JDHAP基質(zhì)時(shí)阿茲海默氏病的非淀粉樣蛋白組分(NAC)的LSI-IMS-MS TSA,其是使用銅脫溶劑化裝置在不施加熱的情況下獲得。圖91A-B描繪來自LTQ-Velos的血管緊張素I的LSI質(zhì)譜。(A)使用飽和DHAP溶液(50 50 ACN/水)且(B)溶液升溫并變得超飽和，從而在各2 ii L斑點(diǎn)中存在更多基質(zhì)。圖92描繪來自ABA溶液(50 50 ACN/水)的單電荷和雙電荷血管緊張素I負(fù)尚子的LSI LTQ質(zhì)譜。圖93描繪雙電荷血管緊張素I正離子和負(fù)離子的LSI-MS-MS漂移時(shí)間分布。圖94A-C描繪通過DHAP使用TSA產(chǎn)生多個(gè)電荷。圖95展示的圖指示由無溶劑制備的各基質(zhì)產(chǎn)生的最高血管緊張素I電荷狀態(tài)(+2到+3)的比率與超過五分鐘的研磨時(shí)間成反比。圖96描繪用DHAP基質(zhì)燒蝕的血管緊張素I的LSI-MS譜圖。圖97描繪通過337nm激光燒蝕的DHB。圖98描繪通過較高通量的355nm激光燒蝕的DHB。圖99描繪通過337nm激光燒蝕的ABA。 圖100描繪通過355nm激光燒蝕的ABA。圖101A-C描繪通過電荷遠(yuǎn)程斷裂進(jìn)行脂肪酸分析。圖102描繪通過電荷遠(yuǎn)程斷裂進(jìn)行脂肪酸分析。圖103描繪用于血管緊張素I的傳統(tǒng)電離方法的總結(jié)。圖104描繪圖103中所示的用于血管緊張素I的傳統(tǒng)電離方法結(jié)合LSI的總結(jié)。圖105描繪LSI-MS示意圖和結(jié)果。圖106展示LSI儀器的照片。圖107A-B描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)時(shí)牛胰島素的LSI-MS-MS。圖108描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)以及使用經(jīng)加熱的熱裝置(這里為對(duì)加熱線施加約5伏特)時(shí)溶菌酶與泛素的較低豐度蛋白質(zhì)混合物的LSI-IMS-MS。圖109描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)以及使用經(jīng)加熱的熱裝置(這里為對(duì)鎳鉻合金加熱線施加約5伏特)時(shí)，在與圖108類似的濃度下泛素的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。圖110描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)以及使用經(jīng)加熱的熱裝置(這里為約5V)時(shí)，在與圖108類似的濃度下溶菌酶的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。圖111描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)以及使用經(jīng)加熱的熱裝置(這里為約5V)時(shí)，在與圖108相同的濃度下泛素和溶菌酶的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。圖112A-B描繪泛素和溶菌酶的MS。圖113描繪使用2，5-DHB在不施加熱的情況下粗油的LSI-MS-MS分析圖114描繪使用2，5-DHB在施加熱的情況下粗油的LSI-MS-MS分析。圖115A-D描繪使用2，5-DHAP和脫溶劑化裝置在不施加熱的情況下分子量遞增的蛋白質(zhì)的LSI-MS-MS。圖116描繪用于分析異構(gòu)蛋白質(zhì)的LSI-MS-MS，所述蛋白質(zhì)由于m/z相同且如這里所示電荷狀態(tài)分布極其相似而未能通過質(zhì)譜法來區(qū)分。圖117描繪P淀粉樣蛋白(1-42)的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。圖118描繪P -淀粉樣蛋白(42-1)的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。圖119描繪用于使用泛素的ESI-MS-MS與LSI-MS-MS比較的條件。圖120描繪以2維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z圖顯示的泛素的LSI-MS-MS結(jié)果。圖121描繪以2維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z圖顯示的泛素的ESI-MS-MS結(jié)果。圖122描繪針對(duì)圖120和121的所有電荷狀態(tài)所選取的漂移時(shí)間分布。圖123描繪用于圖124-127中所示的結(jié)果的條件。
圖124描繪在遞增錐孔電壓下獲得的MS，顯示離子豐度增加和較低電荷狀態(tài)(電荷剝離)。選取針對(duì)電荷狀態(tài)+9、+7、+5的漂移時(shí)間分布。圖125描繪從圖124選取的針對(duì)電荷狀態(tài)+9的漂移時(shí)間。圖126描繪從圖124選取的針對(duì)電荷狀態(tài)+7的漂移時(shí)間。圖127描繪從圖124選取的針對(duì)電荷狀態(tài)+5的漂移時(shí)間。圖128描繪與蛋白質(zhì)(左圖)相比蛋白質(zhì)復(fù)合物(右圖)的LSI-MS-MS漂移時(shí)間分布。圖129描繪牛胰島素的TSA。圖130描繪血管緊張素I的TSA。 圖131描繪對(duì)以I : I摩爾比存在的脂質(zhì)(鞘磷脂，SM)與肽(血管緊張素l，Ang.I)的基于溶劑的分析。圖132描繪對(duì)以I : I摩爾比存在的脂質(zhì)(鞘磷脂，SM)與肽(血管緊張素l，Ang.I)的TSA分析。圖133描繪使用Orbitrap Exactive得到的平坦載玻片上用溶于50 : 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織的LSI-MS完整和插圖質(zhì)譜總和，展示多電荷蛋白質(zhì)離子。圖134A-B2描繪使用LTQ-Velos得到的平坦載玻片上用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織的LSI-MS譜圖。圖135描繪LSI MS，展示使用Orbitrap Exactive從平坦載玻片上用溶于50 50ACN/水中的2，5-DHAP點(diǎn)樣的脫脂老化組織檢測(cè)到的最高質(zhì)量離子的同位素分布。圖136A-B3描繪使用Orbitrap Exactive得到的平坦載玻片上涂有金的載玻片上用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織的LSI MS。圖137描繪LSI MS的插圖。圖138A-B描繪平坦載玻片上用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)(放大100倍)(圖138A)和2，5-DHB (放大5倍)(圖138B)點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織在使用LSI-IMS激光燒蝕后的顯微術(shù)。圖139A-B描繪涂有金的載玻片上用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)(放大100倍)(圖139A)和2，5-DHB (放大10倍)(圖139B)點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織在使用LSI-IMS激光燒蝕后的顯微術(shù)。圖140A-B描繪涂有金的載玻片上用溶于含0. 1% TFA的50 50 ACN 水中的芥子酸(圖140A)和溶于50 50 ACN 水中的2，5_DHAP(圖140B)點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織的MALDIMSo圖141A-B描繪平坦載玻片上用溶于含0. 1% TFA的50 50 ACN :水中的芥子酸(圖141A)和溶于50 50 ACN 水中的2，5_DHAP(圖141B)點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織的MALDIMSo
具體實(shí)施例方式基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)是一種用于質(zhì)譜法(MS)中的電離技術(shù)，其允許分析許多(生物)分子。也已充分建立通過MS進(jìn)行成像，尤其使用次級(jí)離子質(zhì)譜法(SMS)。然而，SMS僅勉強(qiáng)適用于完整生物組織或其它表面。(AP)-MALDI成像因?yàn)槠湓诟呖臻g分辨率下的敏感度問題而同樣受限。常規(guī)AP-MALDI通過激光燒蝕基質(zhì)/分析物主要產(chǎn)生單電荷或低電荷狀態(tài)離子。在AP-MALDI中，對(duì)樣品固持板施加電壓以幫助使低電荷狀態(tài)離子上升并集中到質(zhì)譜儀的離子入口小孔中。商業(yè)AP-MALDI源在對(duì)樣品板施加的約2000V下達(dá)到最大離子豐度并在低于約500V時(shí)產(chǎn)生極少離子。通常，樣品載體安置于電離室內(nèi)以使得所沉積的樣品接近電離室與光譜儀之間界面的進(jìn)入孔，從而使得樣品可在反射幾何條件下由激光束照明。這種樣品載體通常選自包含傳導(dǎo)性材料的群組。如果樣品載體具有傳導(dǎo)性，那么其通常用作電極以提供將電離分析物從靶表面移動(dòng)到界面上的進(jìn)入孔的電場(chǎng)，電離分析物通過所述進(jìn)入孔進(jìn)入光譜儀。在MS期間使用溶劑的傳統(tǒng)分析方法也產(chǎn)生許多缺點(diǎn)。舉例來說，包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的許多(生物)分子通常不溶于常見溶劑中。另外，錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)具有暴露的疏水性區(qū)域并且可形成不溶性聚集體。許多重組蛋白質(zhì)當(dāng)在異源宿主中過表達(dá)時(shí)，會(huì)因?yàn)殄e(cuò)誤折疊而變得不溶或發(fā)展諸如阿茲海默氏病等疾病狀況。 另外，在基于溶劑的MS樣品制備中，會(huì)出現(xiàn)人為因素，諸如色氨酸和甲硫氨酸殘基的氧化(科恩(Cohen)，分析化學(xué)(Anal. Chem.) 2006 ；78 =4352-4362 ；弗洛里希(Froelich)等人,蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics) 2008 ；8 :1334-1345) 這些人為因素可在組合樣品和基質(zhì)的溶液的同一時(shí)段內(nèi)產(chǎn)生。因此，基于溶劑的MS可能對(duì)于與了解氧化應(yīng)激有關(guān)的應(yīng)用并非最佳。本發(fā)明提供通過質(zhì)譜法(MS)改進(jìn)材料分析和表面成像(包括組織成像)的系統(tǒng)和方法。所述系統(tǒng)和方法利用激光噴霧電離(LSI)方法，其產(chǎn)生更易通過MS儀器檢測(cè)的許多多電荷離子，而非通過常規(guī)基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)產(chǎn)生的主要為單電荷的離子。激光可以在反射或透射幾何條件下關(guān)于樣品固持器對(duì)準(zhǔn)，但當(dāng)在透射幾何條件下對(duì)準(zhǔn)時(shí)改進(jìn)空間分辨率，這對(duì)于表面成像分析尤其重要。跟蹤LSI的MS可以是基于溶劑或無溶劑分析。跟蹤LSI的無溶劑分析避免了上文所述的與基于溶劑的分析相關(guān)的許多缺點(diǎn)。無溶劑分析還允許改進(jìn)的空間分辨率，其有利于MS表面成像。本發(fā)明的多電荷離子允許擴(kuò)大高效質(zhì)譜儀的質(zhì)量范圍，其通常限于質(zhì)荷(m/z)比4000。對(duì)于單電荷離子，這使得分子量限于4000道爾頓。帶多個(gè)電荷還可以改進(jìn)斷裂，如使用電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)所證明。本文提供產(chǎn)生多電荷離子的方法，其類似于電噴霧電離(ESI)，在大氣壓或接近大氣壓下，但對(duì)基質(zhì)/分析物使用激光燒蝕而非如ESI中的施加電壓和液體溶液。許多類似ESI的方法，諸如解吸ESI (DESI)和AP-MALDI方法，可產(chǎn)生多電荷離子，但始終存在電場(chǎng)(通常以千伏特計(jì))和使用液體溶劑。本文所揭示的方法允許通過LSI快速分析(每個(gè)樣品約I秒)和精確質(zhì)量測(cè)量(< 5ppm)。這些方法進(jìn)一步允許通過LSI進(jìn)行質(zhì)量特定表面成像(包括組織成像)和任選的無溶劑分析。這些方法還允許LSI與液態(tài)分離聯(lián)用，和通過TSA進(jìn)行相對(duì)定量。諸如(但不限于)寡核苷酸、聚糖和糖蛋白等其它化合物類別可以通過LSI來進(jìn)行分析。通過LSI產(chǎn)生多電荷離子不需要電場(chǎng)并且用于AP-MALDI的高電場(chǎng)可能對(duì)多電荷離子的產(chǎn)生是有害的。在一些實(shí)施例中，經(jīng)激光燒蝕的材料可穿過加熱區(qū)域，隨后進(jìn)入用于質(zhì)量分析的質(zhì)譜儀的高度真空。LSI的優(yōu)點(diǎn)是使用激光，因此具有高空間分辨率，基于溶劑或無溶劑樣品制備(對(duì)于溶解度有限的化合物和對(duì)于用于組織成像的改進(jìn)的空間分辨率為無溶劑)，多電荷離子擴(kuò)大高效質(zhì)譜儀的質(zhì)量范圍并且改進(jìn)斷裂以用于結(jié)構(gòu)分析。LSI還允許在多電荷離子與單電荷離子之間快速轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換無溶劑條件也會(huì)隨意產(chǎn)生單電荷或多電荷離子。期望當(dāng)在大氣壓下和在真空中操作時(shí)，可提高空間分辨率，從而在透射模式下從背面對(duì)準(zhǔn)激光?；|(zhì)可以是在激光波長(zhǎng)下吸收的許多小分子中的任一種，諸如(但不限于)在33711111下為2，5-二羥基苯甲酸(2，5-DHB)、2，5_ 二羥基苯乙酮(2，5_DHAP)和2-氨基苯甲醇(2-ABA)和在355nm下為2，5_DHAP ;和/或具有類似位置官能團(tuán)的其它小芳香族分子。材料/基質(zhì)可用于產(chǎn)生多電荷離子，其具有低蒸氣壓或在室溫下是液體，諸如2-氨基苯甲酸乙酯(N2激光，337nm)或2-羥基苯乙酮(Nd/YAG激光，355nm)。用溶劑潤濕或甚至在溶劑中蒸發(fā)的基質(zhì)材料通常在LSI條件下產(chǎn)生多電荷離子。
用于這些實(shí)驗(yàn)的激光可以是在紫外區(qū)中具有輸出功率的任何激光，但最通常是氮?dú)饧す?337nm)或三倍頻Nd/YAG激光(355nm)。在一些實(shí)施例中，加熱區(qū)域可以是加熱管，經(jīng)激光燒蝕的材料必須瞬間穿過所述加熱管到達(dá)真空。所述管可以是金屬、石英或任何耐熱材料，其不會(huì)放出對(duì)質(zhì)譜儀真空系統(tǒng)有害的蒸氣。在一些實(shí)施例中，所述管可直接或間接加熱到50-600°C，或在一實(shí)施例中加熱到 125-450 0C o由基質(zhì)/分析物的激光燒蝕點(diǎn)和通向質(zhì)譜儀的真空的離子入口界定的離子源區(qū)域中的電場(chǎng)可小于500V。在一些實(shí)施例中，所述電場(chǎng)可小于100V，或是0V，或甚至-100V。激光束可在反射幾何條件下撞擊基質(zhì)分析物表面，其中激光從與燒蝕同一面(朝向MS離子入口小孔燒蝕)撞擊樣品，或通過使激光束透射幾何條件模式穿過激光波長(zhǎng)可透過樣品固持器以在膨脹的基質(zhì)分析物股流朝向離子入口小孔之情況下從相對(duì)于激光燒蝕的基質(zhì)/分析物的另一面撞擊樣品來撞擊樣品。在反射模式下，諸如(但不限于)金屬、玻璃或塑料等金屬或非傳導(dǎo)性表面可用作樣品固持器，且在透射幾何條件下，諸如(但不限于)玻璃、石英和塑料等激光束傳導(dǎo)性材料可用作樣品固持器。如果離子源電壓較低且應(yīng)用加熱轉(zhuǎn)移區(qū)域，那么激光燒蝕添加有基質(zhì)的組織可產(chǎn)生例如蛋白質(zhì)的多電荷離子。這尤其具有價(jià)值，因?yàn)槠湓试S使用高效質(zhì)譜儀進(jìn)行組織成像并在AP條件下使用。使用這種方法，在100，000的質(zhì)量分辨率(相對(duì)于1000-2000的先前分辨率大大增加)和5ppm的質(zhì)量精確度(與25-100ppm的先前質(zhì)量精確度相比)下獲得來自組織的蛋白質(zhì)的譜圖，從而使得蛋白質(zhì)鑒別改進(jìn)了很多。如本文所述進(jìn)行的無溶劑基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)分析顯示可獲得均質(zhì)覆蓋。因此，所得均質(zhì)樣品可由于晶體尺寸無可變性而使用較小激光功率從幾乎每個(gè)激光點(diǎn)產(chǎn)生離子，由此有效地降低化學(xué)非均質(zhì)性(“熱析點(diǎn)”或“熱點(diǎn)”，從而改進(jìn)質(zhì)量測(cè)量的定性和定量方面)、非所需分析物斷裂和化學(xué)背景(基質(zhì)信號(hào))。另外，在基于溶劑的方法中，在蛋白質(zhì)下游處理期間樣品的損失可高達(dá)50%。在無溶劑MALDI方法中，這種局限性可有所降低，在一些情況下顯著降低，因?yàn)樵谑褂弥榱Ｒ詸C(jī)械方式混合分析物與材料/基質(zhì)的步驟期間可有效地從小瓶的壁上回收樣品。圖56和57提供指示傳統(tǒng)MALDI與無溶劑MALDI之間的一般差異的示意圖。本文所揭示的方法也可用于自動(dòng)無溶劑基質(zhì)沉積方法，其允許在約I分鐘內(nèi)使用20 u m篩網(wǎng)制備具有晶體尺寸范圍為< I到12 y m的均質(zhì)基質(zhì)覆蓋的純的組織樣品?？赏ㄟ^在約5分鐘內(nèi)使用3 篩網(wǎng)球磨各別基質(zhì)而使所述尺寸進(jìn)一步減小到尺寸為< I到5 U m的晶體。將這種快速表面涂覆方法應(yīng)用于小鼠腦組織且將結(jié)果與使用MALDI-飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜儀的基于溶劑的噴涂方法(實(shí)例4)進(jìn)行比較。可顯示在MALDI-離子遷移率光譜法-質(zhì)譜法(IMS)-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行的總無溶劑分析(TSA)使用無溶劑氣相分離來分離同重組合物。本發(fā)明的無溶劑MALDI方法的實(shí)例為分析淀粉樣蛋白肽(實(shí)例8)。淀粉樣蛋白肽(1-42)是阿茲海默氏病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，其引起氧化應(yīng)激并且轉(zhuǎn)化為不溶性神經(jīng)毒性
淀粉樣蛋白原纖維形式。除關(guān)于與阿茲海默氏病有關(guān)的乙?；土姿峄牡鞍踪|(zhì)修飾變化外，有證據(jù)表明主要涉及His-6、His-13、His-14和Met_35。Met_35的氧化還作為錯(cuò)誤 折疊淀粉樣前驅(qū)蛋白(APP)和阿茲海默氏病的發(fā)作原因來進(jìn)行討論。然而，根據(jù)本發(fā)明，淀粉樣蛋白肽的疏水性組分顯示無溶劑MALDI分析可在不使用MS不相容清潔劑的情況下克服這些氧化人為因素，以及溶解度問題。疏水性肽的電離抑制以及發(fā)射間(shot-to-shot)非再現(xiàn)性也可極大地降低，從而改進(jìn)分析的定量方面。經(jīng)胰蛋白酶消化的淀粉樣蛋白肽(1-42)可使用無溶劑方法得到100%序列覆蓋，然而基于溶劑的MALDI由于溶解度和電離問題而不能檢測(cè)疏水性肽。對(duì)于細(xì)菌視紫紅質(zhì)(一種膜蛋白)的分析可見類似改進(jìn)。根據(jù)本發(fā)明，利用各別樣品固持器(例如微量滴定板)同時(shí)進(jìn)行制備、均質(zhì)化和直接沉積于MALDI板上的無溶劑MALDI方法可提高高通量分析的可能性。用于蛋白質(zhì)/肽分析的無溶劑MALDI方法的當(dāng)前局限性包括相對(duì)于基于溶劑的方法的較高材料需要量和會(huì)增加分析時(shí)間的金屬加合的較大趨勢(shì)。這可通過連接至少一種金屬陽離子(Na+)來克服，這使得使用無溶劑MALDI分析來分析疏水性肽較為可靠。基質(zhì)/分析物的無溶劑或基于溶劑的制備可產(chǎn)生多電荷離子。無溶劑樣品制備可具有關(guān)于組織樣品的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠淇上扇軇┦够衔飻U(kuò)散。其也可適用于不要求溶劑溶解度的情況。本發(fā)明的另一實(shí)施例是SurfaceBox/TissueBox,其可提供將基質(zhì)涂覆于組織以提供高分辨率成像的無溶劑方法。其也可與微量滴定板一起使用以同時(shí)制備多樣品無溶劑樣品并且直接轉(zhuǎn)移到MALDI靶板，所述板可為(但不限于)顯微鏡載玻片。載玻片消除與昂貴金屬樣品板相關(guān)的攜帶和清潔問題。透射幾何條件可允許較高空間分辨率表面成像。組織盒、透射幾何條件和激光噴霧多電荷離子的組合可適用于使較大分子成像。與真空電離相比，大氣壓可使得方法更快和生理學(xué)上更適當(dāng)。使用如本文所述的這些方法，空間分辨率與質(zhì)量分辨率都可能較聞。因此，本文所述的系統(tǒng)和方法提供任選地使用無溶劑基質(zhì)沉積和/或分離的LSI的快速和簡(jiǎn)單方法。所述系統(tǒng)和方法說明MALDI中的多個(gè)電荷可提供更有效的斷裂并且擴(kuò)大適用質(zhì)量范圍。所揭示方法的優(yōu)點(diǎn)包括使超過4，OOODa分子量的蛋白質(zhì)成像的能力，諸如圖65中所示的P淀粉樣蛋白(1-42)。本發(fā)明還展示高壓對(duì)使分子成像的能力的作用，如圖70中所示。本文所述的系統(tǒng)和方法允許類似于ESI而產(chǎn)生多電荷離子。LSI可使用傳統(tǒng)用于真空或AP-MALDI中的基于溶劑的樣品制備方法或使用無溶劑樣品制備來進(jìn)行?；|(zhì)/分析物L(fēng)SI樣品可在透射幾何條件下或在反射幾何條件下用激光(N2激光337nm ；Nd/YAG激光355nm)燒蝕以產(chǎn)生LSI離子。在低電壓或無電壓下在樣品板與離子入口孔之間獲得離子。這允許使用(但不限于)玻璃、塑料或金屬樣品固持器。透明玻璃和塑料(有或無金屬涂層)允許透射幾何條件。低電壓可包括低于500或1000伏的水平。本文所揭示的方法的多電荷離子是通過如下機(jī)制來產(chǎn)生，其中將分析物捕捉于通過基質(zhì)吸收激光能量所產(chǎn)生的多電荷基質(zhì)液滴中。形成氣體噴射，從而將多電荷液滴向離子入口孔推進(jìn)。這一過程的動(dòng)量允許在無電場(chǎng)的情況下帶電荷液滴達(dá)到離子入口孔。脫除這些多電荷液滴的溶劑以產(chǎn)生多電荷離子。因此，在離表面經(jīng)測(cè)量以毫米而非微米計(jì)的一定距離處產(chǎn)生多電荷離子。使用某些基質(zhì)，脫溶劑化能力可小于其它基質(zhì)，但所有基質(zhì)都將優(yōu)選地使用加熱產(chǎn)生基質(zhì)蒸發(fā)(脫溶劑化)，從而產(chǎn)生多電荷分析物離子。因此，脫溶劑化區(qū)域用于產(chǎn)生激光噴霧離子，但一般不用于產(chǎn)生MALDI離子。使用加熱管(由不同金屬構(gòu)成，諸如(但不限于)銅或不銹鋼；不同直徑和長(zhǎng)度；并且除圓錐體加熱外應(yīng)用和不應(yīng)用加熱)，在所述加熱管中將離子從大氣壓轉(zhuǎn)移到作為脫溶劑化區(qū)域的真空。這具有如下優(yōu)點(diǎn)離子可在層流中產(chǎn)生，從而減少壁上的損失并允許集中在較低壓力下離開毛細(xì)管的離子，使用所述構(gòu)件作為在較低壓力區(qū)域中操作的離子漏斗。在電場(chǎng)不存在下形成多電荷液滴(或簇)的另一優(yōu)點(diǎn)是使離子入口孔處從AP到真空區(qū)域的損失(“邊緣損失”)減到最少。 本文所揭示的系統(tǒng)和方法的實(shí)例可用于分析(但不限于)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、表面和組織和/或使其成像。然而，所述系統(tǒng)和方法并不限于用于蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)，也可直接用于諸如組織等復(fù)雜表面。聚合物和塑料是適合于如本文所揭示的分析的非限制性示范性材料。也可以分析寡核苷酸。本文所揭示的系統(tǒng)和方法也適合于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)領(lǐng)域中的分析。激光可以是紅外(IR)或紫外(UV)激光。激光噴霧電離(LSI)可與無場(chǎng)透射幾何條件AP-MALDI互換使用。方法描述中對(duì)參考文獻(xiàn)的引用中有關(guān)參考方法的教示內(nèi)容以引用的方式并入本文中。I.實(shí)例 I這一實(shí)例描述使用激光噴霧電離在AP下和在高空間分辨率和超高質(zhì)量分辨率下直接從組織分析蛋白質(zhì)。這一實(shí)例中所述的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明LSI-MS可組合分析速度、高空間分辨率、和使用ESI的軟電離、帶多個(gè)電荷、斷裂和橫截面分析的MALDI的成像能力。A.引言通過MS進(jìn)行組織成像證實(shí)適用于諸如檢測(cè)腫瘤邊緣、確定高藥物攝取部位和在腦組織中定位信號(hào)傳導(dǎo)分子等領(lǐng)域。已充分建立使用次級(jí)離子質(zhì)譜法(SIMS)進(jìn)行成像，但其僅勉強(qiáng)適用于生物組織和其它表面的完整分子質(zhì)量測(cè)量。在真空條件下操作的MALDI MS已成功地用于組織成像，尤其用于高豐度組分，諸如膜脂、藥物代謝物和蛋白質(zhì)。已實(shí)現(xiàn)約20 ii m的空間分辨率且MALDI-MS方法已試圖用于闡明帕金森氏癥(Parkinson' s)、肌肉萎縮癥、肥胖和癌癥疾病。用純?nèi)軇?、用水稀釋的溶劑或與有機(jī)溶劑混合的溶劑進(jìn)行組織固定或洗滌可提高肽和蛋白質(zhì)的信號(hào)質(zhì)量，以及延長(zhǎng)組織壽命，隨后進(jìn)行基質(zhì)應(yīng)用。施瓦茲(Schwartz)等人開發(fā)了一組關(guān)于以下的實(shí)踐指南組織切片(組織儲(chǔ)藏、切片和封片)的適當(dāng)處理，肽和蛋白質(zhì)分析，和基質(zhì)的選擇和濃度，溶劑組成，基質(zhì)沉積策略，和使用MALDI采集最佳質(zhì)譜數(shù)據(jù)的儀器參數(shù)。(施瓦茲(Schwartz)等人,質(zhì)譜學(xué)雜志(J. Mass Spectrom) 2003 ；38 699-708)。組織厚度也會(huì)影響總體峰值強(qiáng)度和對(duì)于肽和蛋白質(zhì)所觀察到的峰的總數(shù)。另外，基質(zhì)的選擇和其沉積于組織上對(duì)于確定從組織提取和檢測(cè)的蛋白質(zhì)的亞群很重要。令人遺憾的是，使用基于真空的MS進(jìn)行與分析純的組織有關(guān)的組織成像存在缺點(diǎn)。這些研究中所用的質(zhì)譜儀通常還具有不足質(zhì)量分辨率和質(zhì)量精確度。因?yàn)檎婵针婋x方法產(chǎn)生單電荷離子，所以質(zhì)量選擇性斷裂方法僅提供有限信息，尤其關(guān)于肽和蛋白質(zhì)的信 息。另外，無高級(jí)斷裂，諸如電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)可用于確信的蛋白質(zhì)鑒別。AP-MALDI組織成像可與高分辨率質(zhì)譜儀聯(lián)合，但在高空間分辨率下存在敏感度問題。AP-MALDI也主要產(chǎn)生單電荷離子。因此，在這些質(zhì)譜儀上由于其固有質(zhì)量范圍局限性(通常質(zhì)荷比(m/z) < 4000)而不可能使用AP-MALDI進(jìn)行完整蛋白質(zhì)的質(zhì)量和橫截面分析。LSI，一種在AP下操作的類似MALDI的新方法，相對(duì)于其它用于蛋白質(zhì)組織成像的基于MS的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)，包括分析速度、改進(jìn)的空間分辨率、更適當(dāng)AP條件、通過帶多個(gè)電荷擴(kuò)大質(zhì)量范圍和改進(jìn)斷裂、和在適當(dāng)儀器上獲得橫截面數(shù)據(jù)的能力。已證明在高效AP電離質(zhì)譜儀(Orbitrap Exactive, SYNAPT G2)上LSI對(duì)于高質(zhì)量化合物之適用性,從而產(chǎn)生類似ESI的多質(zhì)子化離子。通過ETD使用LSI方法展示序列分析的第一實(shí)驗(yàn)已成功地在賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)LTQ-ETD質(zhì)譜儀上進(jìn)行。對(duì)于泛素(一種重要的調(diào)節(jié)蛋白)獲得幾乎完整序列覆蓋。將ETD斷裂應(yīng)用于LSI-MS分析可提供一種研究生物過程的新方法，包括從完整蛋白質(zhì)和直接從組織定位磷酸化、糖基化和泛素化位點(diǎn)。此外，不同于ESI和相關(guān)基于ESI的方法(諸如解吸-ESI)，LSI方法允許高空間分辨率成像，如對(duì)于脂質(zhì)所示(約10到約SOil m)。與AP-MALDI相同開發(fā)階段的報(bào)導(dǎo)相比，LSI的靈敏度大一個(gè)數(shù)量級(jí)以上并且能夠在高分辨率質(zhì)譜儀上分析蛋白質(zhì)，如通過在將僅17飛摩爾(femtomole)牛胰臟胰島素涂覆于顯微鏡載玻片上后獲得完整采集質(zhì)譜所證明。LSI方法的速度已通過在8秒內(nèi)獲得五個(gè)樣品的質(zhì)譜來展示，并且預(yù)計(jì)所述方法可在不到I秒內(nèi)在機(jī)械移動(dòng)下分析樣品。在MS中未呈現(xiàn)的是，使用Orbitrap質(zhì)譜儀裝置，在100，000質(zhì)量分辨率和聚焦燒蝕約300 y m3空間體積的氮?dú)饧す庀伦C明直接從小鼠腦組織進(jìn)行完整蛋白質(zhì)分析的效用。B.實(shí)驗(yàn)程序I.材料基質(zhì)，2，5-二羥基苯甲酸(2，5-DHB)98%、2，5-二羥基苯乙酮(2，5-DHAP)99. 5 %和芥子酸(SA) 99%購自密蘇里州圣路易斯的西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich, Inc.,St. Louis, MO)。溶劑，ACN、三氟乙酸(TFA)和EtOH購自賓夕法尼亞州匹茲堡的飛世爾科技公司(Fisher Scientific Inc. , Pittsburgh, PA)。使用純水(馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司(Millipore' s Corporate, Billerica, MA))。平坦的顯微載玻片(尺寸為76.2X25.4X1_)是獲自新罕布什爾州樸次茅斯的金密封產(chǎn)品公司(Gold SealProducts, Portsmouth, NH)。用于成像實(shí)驗(yàn)的涂有ITO的傳導(dǎo)性載玻片是布魯克公司(Bruker)(馬薩諸塞州比爾里卡(Billerica, MA))的贈(zèng)品。2.小鼠腦組織用C02氣體對(duì)20周齡的C57B1/6小鼠施以安樂死并且用冰冷的I X磷酸鹽緩沖生理鹽水(150mM NaClUOOmM NaH2P04，pH 7.4)經(jīng)賁門灌注5分鐘以去除紅細(xì)胞。將腦冷凍在_22°C下且使用萊卡(Leica) CM1850冷凍切片機(jī)(伊利諾斯州班諾克本的萊卡微系統(tǒng)公司(Leica Microsystems Inc. , Bannockburn, IL))依次切割成 10 U m 切片。將組織切片放在預(yù)冷卻的顯微載玻片(平坦的或涂有金)上，簡(jiǎn)單地用手指從背面加溫以使得切片松弛并附著。小心避免因在含有干燥劑的氣密盒中儲(chǔ)藏(在_20°C下)和運(yùn)輸(在干冰下)封埋有組織的載玻片直到使用而引起的水冷凝。
3.老化和新鮮組織樣品的分析這一研究中所用的小鼠腦組織切片在干冰中運(yùn)輸，隨后脫脂(delipified)，接著在干冰中徹夜運(yùn)輸。在_5°C下儲(chǔ)藏老化脫脂組織樣品約兩個(gè)月。起初對(duì)老化組織樣品進(jìn)行脫脂并通過MALDI-T0F-MS分析檢驗(yàn)。使用最佳脫脂條件進(jìn)行進(jìn)一步研究，比較從MALDI和LSI-MS分析獲得的結(jié)果。切下第二組小鼠腦組織，冷凍并立即徹夜運(yùn)輸。各平坦且涂有金的顯微載玻片封埋有四到五片組織切片。一收到冷凍樣品后，就如下文所述對(duì)載玻片上的組織進(jìn)行脫脂并再次立即冷凍和徹夜運(yùn)輸以在Orbitrap Exactive (賽默飛世爾科技公司(Thermo FisherScientific))質(zhì)譜儀上進(jìn)行即時(shí)LSI-MS分析。再次冷凍這些樣品并徹夜運(yùn)輸以用于顯微術(shù)和后續(xù)MALDI-MS和LSI-LTQ Velos分析。4.組織的脫脂根據(jù)公開程序去除組織切片中的脂質(zhì)。簡(jiǎn)單來說，在干燥器中干燥封埋有組織的載玻片，隨后用乙醇洗滌兩次。在第一次洗滌時(shí)，將封埋有組織的載玻片浸沒于填充有70%EtOH的玻璃皮氏培養(yǎng)皿(Petri dish)中，旋動(dòng)30秒，并小心地移出。接著傾斜載玻片以去除溶劑并持續(xù)約10秒，立即在另一皮氏培養(yǎng)皿中用95% EtOH再洗滌30秒。第二次洗滌后，使載玻片在干燥器中干燥20分鐘，隨后進(jìn)行分析，或儲(chǔ)藏于約-20°C下直到使用為止或在干冰下運(yùn)輸。5.小鼠腦組織的激光噴霧電離(LSI)質(zhì)譜法(MS)在Orbitrap Exactive或LTQ-Velos質(zhì)譜儀上進(jìn)行LSI涉及去除離子最大源和強(qiáng)制聯(lián)鎖或去除前窗和側(cè)窗以允許激光和樣品接近離子入口孔。簡(jiǎn)單來說，將激光束(337nm，新港公司(Newport Corporation)VSL-337ND-S)與質(zhì)譜儀的離子入口孔對(duì)準(zhǔn)。通過將許多0. 2uL液滴放在組織材料上來用溶解于50 50 ACN :水中的LSI基質(zhì)(2，5-DHB或2，5-DHAP)制備封埋有小鼠腦組織的顯微鏡載玻片。溶劑蒸發(fā)后，將含有LSI基質(zhì)涂覆于小鼠腦組織的載玻片接近地(I到3_)放在質(zhì)譜儀離子遷移管入口(孔)前并且手動(dòng)移動(dòng)穿過關(guān)于離子入口孔180度對(duì)準(zhǔn)(透射幾何條件)的激光束。將AP到真空離子遷移毛細(xì)管加熱到375°C (對(duì)于2，5-DHB)和300°C (對(duì)于2，5_DHAP)并且每次脈沖的激光通量為約0. 5-1J cm-2。在電場(chǎng)不存在下在離子源區(qū)域中觀察到多電荷離子。所述布置允許手動(dòng)粗組織研究以觀察多電荷離子。使用平坦且涂有金的載玻片。6.小鼠腦組織的MALDI MS使用裝備有氮?dú)饧す?337nm)的MALDI-T0F布魯克(Bruker)UltrafIex質(zhì)譜儀(德國不來梅的布魯克公司(Bruker, Bremen, Germany))來監(jiān)測(cè)組織脫脂的成效并與LSI結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)公開研究進(jìn)行MALDI樣品制備。洗滌組織并在干燥器中干燥后，用0. 2u L溶解于含0. 1% TFA的50 50 ACN 水中的SA基質(zhì)或溶解于50 50 ACN 水中的2，5-DHAP點(diǎn)樣組織。使用線性正離子模式，在20. 16kV的加速電壓、18. 48kV的提取電壓、7. 06kV的透鏡電壓和360ns的脈沖離子提取下獲得質(zhì)譜。優(yōu)化延時(shí)提取參數(shù)以具有用于12kDa質(zhì)量范圍的最佳分辨率和敏感度。使用30次激光發(fā)射的增量，且將發(fā)射安置在單基質(zhì)點(diǎn)內(nèi)并在其中移動(dòng)以獲得具有總共120次激光發(fā)射的質(zhì)譜。加工質(zhì)譜并使用弗雷克斯(Flex)分析軟件進(jìn)行基線校正。使用平坦且涂有金的顯微載片；預(yù)期僅涂有金的顯微載片提供正確的質(zhì)量校準(zhǔn)。
7.顯微術(shù)和空間體積測(cè)量進(jìn)行光學(xué)顯微術(shù)(尼康(Nikon)，ECLIPSE, LV 100)以通過在LSI-Orbitrap分析(并運(yùn)輸?shù)絎SU)后測(cè)量組織上的燒蝕區(qū)域來獲得關(guān)于空間分辨率的定性信息。使用各種放大倍數(shù)條件，范圍為5倍到100倍，從而提供降低到< Iym分辨率的詳圖。獲得老化和新鮮組織樣品的顯微術(shù)數(shù)據(jù)。在10 厚的組織切片上以<3 寬度X < IOym長(zhǎng)度空間分辨率提供< 300 y m3的界限分明的、高空間體積測(cè)定的典型實(shí)例，如對(duì)于老化組織切片所觀察的。新鮮組織切片提供略微較好的分辨率。C.結(jié)果I.對(duì)老化組織樣品評(píng)估實(shí)驗(yàn)條件在質(zhì)譜組織分析之前這一研究中用于提取脂質(zhì)的溶劑是基于先前報(bào)導(dǎo)的研究以及根據(jù)我們從MALDI-MS分析獲得的結(jié)果來選擇。使用兩種溶劑對(duì)老化組織切片進(jìn)行脫脂，但與使用SA作為基質(zhì)的異丙醇洗滌相比，乙醇洗滌產(chǎn)生較高強(qiáng)度蛋白質(zhì)MALDI-MS信號(hào)。在來自封埋于平坦的顯微載玻片上的同一小鼠腦的不同組織切片上的大致同一位置進(jìn)行質(zhì)譜采集以用于兩個(gè)脫脂程序。圖31展示用乙醇洗滌且用溶于50 50 0.2 ACN/水/TFA中的芥子酸基質(zhì)點(diǎn)樣的小鼠腦的MALDI-TOF MS質(zhì)譜。如圖31中所示，所檢測(cè)的肽和蛋白質(zhì)信號(hào)的m/z在約5，000到19，000的范圍內(nèi)(圖31)，其在西雷(Seeley)等人所提供的m/z范圍內(nèi)(西雷(Seeley)等人，美國質(zhì)譜學(xué)會(huì)雜志(J. Am. Soc. Mass Spectrom) 2008 ；19 1069-1077);預(yù)期質(zhì)量校準(zhǔn)略微不精確，這是因?yàn)槭褂脽o傳導(dǎo)性涂層的平坦的顯微載玻片。僅幾種所檢測(cè)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生相當(dāng)大的信號(hào)強(qiáng)度并且推測(cè)其來自組織中的最豐富蛋白質(zhì)種類。在質(zhì)量范圍m/z設(shè)定為< 2200的Orbitrap Exactive儀器上使用LSI方法顯示與主要電離蛋白質(zhì)的2，5-DHAP相比，2，5-DHB對(duì)于電離脂質(zhì)的極大偏好。類似于先前報(bào)導(dǎo)，使用LSI，使用2，5-DHB作為基質(zhì)，僅觀察到脂質(zhì)信號(hào)，甚至在脫脂組織中也是如此，但在充分洗滌的組織中脂質(zhì)信號(hào)以較低豐度存在。另一方面，如圖32A中所示，用乙醇洗滌且用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)點(diǎn)樣的小鼠腦的完整質(zhì)譜主要顯示多電荷離子。由于質(zhì)譜分辨率提供13C同位素分離，因此單電荷狀態(tài)分布是以高精確度測(cè)定蛋白質(zhì)分子量唯一所必需的。因此，甚至恰好在雜波上方觀察到的離子(無法可靠地鑒別其單同位素峰值)也提供與線性MALDI-TOF值類似的平均質(zhì)量數(shù)據(jù)。圖32B展示來自圖32A的插圖區(qū)域，其質(zhì)量范圍設(shè)定為m/z 650至1000。多電荷離子在+3到+8的范圍內(nèi)，表示離子的分子量為約650到5000Da。對(duì)于這個(gè)數(shù)據(jù)集，大多數(shù)離子是來自低于IOkDa的化合物，并且很可能是小蛋白質(zhì)。圖135展示在平坦的載玻片上從用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP點(diǎn)樣的脫脂老化組織檢測(cè)到的最高質(zhì)量離子的同位素分布為約13kDa化合物(圖135)。由于老化樣品的儲(chǔ)藏時(shí)間較長(zhǎng)，有可能一些所觀察到的蛋白質(zhì)是來自死后的酶促消化。激光燒蝕后，獲得顯微術(shù)數(shù)據(jù)以檢查L(zhǎng)SI燒蝕組織區(qū)域的空間分辨率。使用類似源幾何條件的先前組織分析研究使用作為基質(zhì)的2，5-DHB的無溶劑應(yīng)用產(chǎn)生平均約80 y m的空間分辨率，并且使用基于溶劑的基質(zhì)沉積于未洗滌的組織切片上產(chǎn)生顯著較大的燒蝕區(qū)域。如圖33的光學(xué)顯微術(shù)圖像中所示，在改進(jìn)的激光聚焦和使用2，5-DHAP作為基質(zhì)的情況下，燒蝕區(qū)域的寬度在< 3到IOiim的范圍內(nèi)。燒蝕區(qū)域的長(zhǎng)形特點(diǎn)(長(zhǎng)度為約8到
15u m)可通過將所封埋的組織連續(xù)移動(dòng)穿過所聚焦的激光束來解釋。當(dāng)在燒蝕區(qū)域附近沉積時(shí)見到基質(zhì)表不LSI基質(zhì)在組織材料的解吸/電尚中的功能。 2.對(duì)新鮮組織樣品比較LSI-MS、顯微術(shù)和MALDI-MS分析對(duì)于老化組織樣品成功獲得的結(jié)果促使檢查除將組織封埋到載玻片所需的短時(shí)間外維持在_20°C或低于_20°C下的新鮮組織切片，脫脂，質(zhì)譜分析和顯微術(shù)。圖133顯示平坦的載玻片上使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)時(shí)新鮮脫脂樣品的完整和插圖MS總和，顯示m/z 917. 50 (MW 1833.0)時(shí)存在豐富的雙電荷LSI離子和較高m/z值時(shí)主要存在多電荷離子。觀察到至少兩種電荷狀態(tài)分布的最高質(zhì)量蛋白質(zhì)的分子量為17，882Da，盡管對(duì)于分子量為約19，665Da的離子觀察到單一低豐度同位素分布。在新鮮樣品中也觀察到在老化組織樣品(圖32B)中觀察到的一些較低分子量蛋白質(zhì)，但其豐度較低，而較高質(zhì)量蛋白質(zhì)明顯更豐富。圖136A-B3展示在單次激光發(fā)射中觀察到最豐富蛋白質(zhì)。圖136A展示通過將組織移動(dòng)穿過激光束并進(jìn)入離子入口孔3_所獲得的總離子流。在IHz下操作激光且每秒獲得一次質(zhì)譜采集。圖136B1展示完整采集的總和，圖136B2展示單次發(fā)射采集且圖136B3展示表示約7次激光發(fā)射的7次連續(xù)質(zhì)譜采集的總和。未觀察到涂有金的載玻片(圖136)與平坦的載玻片(圖133)之間的顯著差異。圖137展示三種同位素分布，各對(duì)應(yīng)于分子量為9908、11788和12369Da(單同位素質(zhì)量)的蛋白質(zhì)。圖137中所示的蛋白質(zhì)的同位素分布是使用設(shè)定為100，000質(zhì)量分辨率的Orbitrap Exactive從涂有金的載玻片上用溶于50 50 ACN :水中的2，5-DHAP基質(zhì)點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織得到。將來自同一只小鼠的新鮮組織切片脫脂且立即在LTQ Velos儀器上測(cè)量質(zhì)量。觀察到大部分上述多電荷離子。然而，未觀察到具有分子量1830的肽且這種肽可能在脫脂期間已被去除。圖134B1顯示單次0. I秒采集，展示具有MW 11,788的蛋白質(zhì)的多電荷狀態(tài)分布。圖134B2顯示小鼠腦組織的另一區(qū)域的單次采集且展示MW 11,788的蛋白質(zhì)的豐度低于麗17882的第二種蛋白質(zhì)。多次掃描的質(zhì)譜總和提供于圖134A中。在圖134A-B2中m/z 760附近觀察到的離子是來自脂質(zhì)。這些結(jié)果證明這種方法用于高空間分辨率組織成像的可能性。此外，不添加LSI基質(zhì)的LSI-MS分析不會(huì)提供任何有用的分析結(jié)果。在沉積LSI基質(zhì)后使用涂有金且平坦的顯微載片可提供脫脂組織的類似豐度質(zhì)譜。正如所料，在使用傳導(dǎo)性或非傳導(dǎo)性載玻片的AP LSI結(jié)果中未觀察到質(zhì)量位移。正如同老化組織一樣，2，5-DHB優(yōu)先檢測(cè)脂質(zhì)組分和2，5-DHAP蛋白質(zhì)組分。圖138A展示封埋于平坦的玻璃顯微載片上且用2，5_DHAP處理的新鮮脫脂組織在使用LSI-MS進(jìn)行激光燒蝕后的放大100倍的顯微術(shù)，展示寬度< 3-8μπι且長(zhǎng)度< 5-25 μ m的空間分辨率。與圖138A中所見相比，圖139A的使用涂有金的載玻片的新鮮脫脂組織在使用LSI-IMS進(jìn)行激光燒蝕后的放大100倍的顯微術(shù)提供略微更好的空間燒蝕。圖138B描繪位于圖138A的同一載玻片上且使用大致相同的激光聚焦、但使用2，5_DHB基質(zhì)、使用10倍放大倍數(shù)的另一脫脂切片。圖138B的顯微術(shù)展示約200 μ m的空間分辨率。類似地，圖139B描繪位于圖139A的同一涂有金的載玻片上、使用大致相同的激光聚焦、但使用2，5-DHB基質(zhì)、使用10倍放大倍數(shù)的另一脫脂切片。圖138B的顯微術(shù)展示約100 μ m的空間分辨率。顯然，使用2，5-DHB，明顯更難以獲得較高空間分辨率和體積分析。不同實(shí)驗(yàn)條件的空間分辨率展現(xiàn)以下一般趨勢(shì)2，5-DHB(涂有金且平坦的載玻片)>> 2，5-DHAP(涂有金且平坦的載玻片)>無基質(zhì)(涂有金且平坦的載玻片)。
出于比較目的，使用封埋于涂有金且平坦的載玻片上的來自小鼠腦的依序組織切片進(jìn)行真空MALDI-MS分析。用2，5-DHAP涂布各脫脂組織切片的一半且用SA涂布另一半，涂覆若干O. 2 μ I基質(zhì)溶液。有趣的是，在使用2，5-DHAP的LSI與使用2，5-DHAP或SA的MALDI之間未見多電荷離子的相同分子量。使用2，5-DHAP基質(zhì)的MALDI產(chǎn)生不良結(jié)果，其可有助于解釋真空MALDI與LSI之間的差異。圖140A和141A分別描繪涂有金的載玻片和平坦的載玻片上用溶于含0.1% TFA的50 50 ACN :水中的芥子酸點(diǎn)樣的脫脂新鮮組織的MALDI-MS。圖140B和141B分別描繪涂有金的載玻片和平坦的載玻片上用溶于50 50ACN :水中的2，5-DHAP涂布的脫脂新鮮組織的MALDI MS。D.討論使用設(shè)定為100，000質(zhì)量分辨率和< 5ppm外部質(zhì)量精確度的Orbitrap Exactive質(zhì)譜儀，從單次I秒采集(表示單次激光發(fā)射)，觀察小鼠腦組織的質(zhì)譜。圖133中所示的質(zhì)譜需要對(duì)表示大部分O. 2 μ L基質(zhì)點(diǎn)的燒蝕的約15秒數(shù)據(jù)求平均值。如上述圖134Α-Β2中所示，使用LTQ Velos質(zhì)譜儀獲得類似結(jié)果，但無質(zhì)量分辨率。燒蝕區(qū)域的深度是在反射幾何條件MALDI測(cè)量中難以獲得的值，但卻是組織重構(gòu)所必需的信息。通過反射幾何條件MALDI應(yīng)用進(jìn)行成像已顯示燒蝕約50 μ m深度，以及大的深度和形狀可變性；標(biāo)準(zhǔn)橫向燒蝕為約ΙΟΟμπι?？勺冃钥赡苁羌す鉀_擊角和聚焦不良的激光束，尤其是樣品制備條件所致的結(jié)果，從而引入各分析的空間分辨率的測(cè)定不確定性。另一方面，SMS僅燒蝕上層(精確深度仍處于討論中)；50μπι橫向分辨率在商業(yè)上可用。然而，SMS使得許多生物分子產(chǎn)生明顯斷裂，并且離子產(chǎn)率隨著m/z增加而快速降低，從而使得組織切片的分析極其困難。最新研究引入一種新的基于激光的成像技術(shù)，即激光燒蝕電噴霧電離MS,其提供活組織的具有350 μ m橫向分辨率和50 μ m深度分辨率的深度分布。這些研究提供如下某種指示在反射幾何條件布置下通過激光沖擊燒蝕多少材料。大的燒蝕區(qū)域(體積)提供不良空間分辨率。燒蝕區(qū)域的可變性也可能是MALDI的不良定量性能的原因。據(jù)報(bào)導(dǎo)，使用真空MALDI，以聚焦透鏡遠(yuǎn)離購得的肽和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物的燒蝕區(qū)域約12mm來實(shí)現(xiàn)5 μ m橫向分辨率。離MALDI樣品的所述短距離僅能通過在透射幾何條件下使用激光束來實(shí)現(xiàn)。我們所測(cè)量的燒蝕值和已知的10 μ m組織切片厚度證明可實(shí)現(xiàn)< 300 μ m3的界限分明的空間體積。本發(fā)明研究中所用的點(diǎn)樣基質(zhì)的干液滴方法不適合于組織成像研究，因?yàn)轭A(yù)期提取到ACN:H20溶劑中的可溶性蛋白質(zhì)在暴露于所涂覆的基于溶劑的基質(zhì)的大部分區(qū)域內(nèi)擴(kuò)散。為減輕這個(gè)問題，我們使用無溶劑基質(zhì)制備方法。在使用透射幾何條件的LSI中燒蝕整個(gè)組織厚度的事實(shí)可以解釋對(duì)于LSI和MALDI-MS所獲得的不同質(zhì)譜結(jié)果，其中后者僅燒蝕組織切片的表面區(qū)域。此外，根據(jù)從LSI-MS獲得的燒蝕區(qū)域，溶劑/基質(zhì)對(duì)組織的傷害和激光對(duì)組織的燒蝕的程度似乎在使用2，5-DHAP(相對(duì)于2，5-DHB)和使用脫脂組織(相對(duì)于未洗滌的組織)的情況下顯著較小。需要解決的另一困難是激光束未穿透組織的激光燒蝕區(qū)域。這種情況似乎與不均勻的組織厚度和基質(zhì)涂覆有關(guān)。未來的進(jìn)展將需要改進(jìn)的敏感度、使得每次激光發(fā)射穿透組織的條件和有效使所產(chǎn)生的氣相離子的復(fù)雜性簡(jiǎn)單化的無溶劑氣相分離即使使用TOF分析儀的當(dāng)前成像質(zhì)譜儀可提供超過10，000的質(zhì)量分辨率和優(yōu)于20ppm的質(zhì)量精確度，這種質(zhì)譜儀也不足以鑒別或甚至驗(yàn)證蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。此外，由于蛋白質(zhì) 離子的低電荷狀態(tài)，通過諸如ETD等先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行斷裂并不適用。使用LSI方法，可實(shí)現(xiàn)MALDI的空間優(yōu)點(diǎn)，以及API質(zhì)譜儀的質(zhì)量分辨率和精確度，和由于可產(chǎn)生類似ESI的多電荷離子而應(yīng)用ETD和橫截面分析的潛在能力。E.結(jié)論已報(bào)導(dǎo)在同時(shí)存在高空間和質(zhì)量分辨率下直接從產(chǎn)生多電荷離子的組織觀察到的肽和蛋白質(zhì)的第一實(shí)例。實(shí)現(xiàn)單次激光發(fā)射采集和< 300 μ Hi3的燒蝕空間體積。多電荷離子的產(chǎn)生允許使用高效API質(zhì)譜儀進(jìn)行高質(zhì)量分析，從而提供同位素分辨率和精確質(zhì)量測(cè)量。多電荷離子可允許電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)斷裂用于改進(jìn)的蛋白質(zhì)鑒別。使用激光直接從組織進(jìn)行電離允許高空間分辨率用于質(zhì)量特定組織成像。這種新方法存在與在組織成像中定位蛋白質(zhì)有關(guān)的多種潛在應(yīng)用。需要改進(jìn)的敏感度、樣品制備和激光聚焦來使這種技術(shù)發(fā)展到單細(xì)胞分析。II.實(shí)例 2這一實(shí)例描述使用兩種脫溶劑化裝置和其使2，5-DHAP基質(zhì)脫除溶劑的能力進(jìn)行的研究。使用由銅和不銹鋼構(gòu)成的脫溶劑化裝置進(jìn)行比較研究。這一實(shí)例中涵蓋的其它研究描述通過應(yīng)用脫溶劑化裝置所獲得的結(jié)果。Α.概述激光噴霧電離(LSI)是一種通過激光燒蝕基質(zhì)/分析物混合物來產(chǎn)生多電荷離子的方法。在商業(yè)離子遷移率光譜法質(zhì)譜法SYNAPT G2儀器上通過引入有效脫溶劑化條件來實(shí)現(xiàn)LSI。B.引言近來，在賽默飛世爾科技公司(ThermoFisher Scientific) Orb i trap Exactive (馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默科技公司(Thermo Scientific, Waltham,MA))上引入激光噴霧電離(LSI)-質(zhì)譜法(MS)。這種電離方法的原理是通過使用在大氣壓(AP)下操作的激光來燒蝕分析物/基質(zhì)樣品并且隨后在脫溶劑化過程期間由多電荷基質(zhì)/分析物簇形成離子。電荷狀態(tài)選擇的自由選擇證明LSI對(duì)于使用類似于使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)獲得的離子的單電荷離子和類似于通過電噴霧電離(ESI)產(chǎn)生的離子的多電荷離子分析復(fù)雜混合物的效用。后一種離子尤其有利于提供通過激光燒蝕諸如蛋白質(zhì)和合成聚合物等較大分子進(jìn)行電離且隨后在高效但質(zhì)量范圍有限的儀器(諸如OrbitrapExactive)上分析多電荷離子的能力。在這一研究中，在商業(yè)離子遷移率光譜法(MS)SYNAPT G2儀器上展示LSI以使用如圖84中所示的國產(chǎn)脫溶劑化裝置分析蛋白質(zhì)。與甚至高分辨率質(zhì)譜儀相比，IMS-MS由于其擴(kuò)大動(dòng)態(tài)范圍和分離異構(gòu)組合物的能力而具有許多優(yōu)點(diǎn)。IMS尺寸根據(jù)電荷和橫截面(尺寸和形狀)來分離離子。IMS具有無溶劑氣相分離的益處并且使用無溶劑樣品制備可完全消除電離、分離和質(zhì)量分析與使用任何溶劑之間的關(guān)系，從而通過MS進(jìn)行總無溶劑分析。C.方法 I.制造脫溶劑化裝置使用1/8英寸外徑、1/16英寸內(nèi)徑、3/4英寸長(zhǎng)的銅和不銹鋼管作為脫溶劑化室。所述管卷繞有24號(hào)鎳鉻合金線(科學(xué)試劑盒與北方實(shí)驗(yàn)室(Science Kit and BorealLaboratories),美國紐約州托納旺達(dá)的科學(xué)試劑盒公司的分公司(Science Kit, Inc.,Tonawanda, NY, USA))和薩偉真(Saureisen)Pl 膠粘劑(Inso-lute 膠粘粉 Pl 號(hào))以在所述線下方和上方施加絕緣和穩(wěn)定性。所述管的出口端位置緊靠沃特斯(Waters)Z噴霧源的離子入口分離器。使用透射幾何條件的氮?dú)饧す?光譜物理公司(Spectra Physics)VSL337 ND S)燒蝕基質(zhì)/分析物樣品，使用“干液滴”方法沉積于顯微鏡載玻片上。2.材料2，5-二羥基苯乙酮(DHAP)基質(zhì)(98%純度)、胰島素(牛胰臟)、泛素(牛紅細(xì)胞)、溶菌酶(雞蛋清)、細(xì)胞色素C(馬心臟)和肌紅蛋白(馬心臟)是購自美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich, Inc. , St. Louis, MO, USA),且血管緊張素1(人類)是來自美國多肽公司(American peptide)。乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、三氟乙酸(TFA)和乙酸溶劑是獲自美國賓夕法尼亞州匹茲堡的飛世爾科技公司(FisherScientific Inc. , Pittsburgh, PA, USA)。使用純水(美國馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司(Millipore Corp.，Billerica，MA，USA))。顯微載片(尺寸為I X 3英寸)是獲自美國新罕布什爾州樸次茅斯的金密封產(chǎn)品公司(Gold Seal Products,Portsmouth,NH,USA)。3.樣品制備血管緊張素、泛素、溶菌酶、細(xì)胞色素C和肌紅蛋白的儲(chǔ)備溶液個(gè)別地用純水制備且胰島素是用50 50 MeOH :水制備。使用基于溶劑的樣品制備方案，使用用50 50ACN :水制備的2，5-DHAP基質(zhì)，在載玻片上使用I μ L制備LSI樣品，接著吹干到完成。將干LSI樣品放在脫溶劑化裝置的前面約I到3mm的距離處。對(duì)于ESI與LSI之間的比較，用49 : 49 : 2 ACN/水/乙酸制備泛素。E.結(jié)果展示使用所制造的脫溶劑化裝置的基于激光的新穎電離方法。脫溶劑化裝置的示意圖可見于圖84中。圖84描繪在MS-MS SYNAPT G2上進(jìn)行源修改以使得能夠脫除在激光燒蝕期間所形成的基質(zhì)/分析物簇的溶劑，從而獲得類似ESI的多電荷離子。脫溶劑化裝置可使用例如自耦變壓器(Variac)來加熱。對(duì)脫溶劑化裝置施加熱并非最終必需的。通過降低基質(zhì)的熱需求，也可以使脫溶劑化更有效地提高電離效率。2，5-二羥基苯乙酮(2，5-DHAP)可顯示這種情況。可顯示產(chǎn)生多電荷離子的基質(zhì)的其它實(shí)例是2-氨基苯甲酰醇(ABA)和一些DHB異構(gòu)體。也可使用揮發(fā)性基質(zhì)和液體基質(zhì)。研究?jī)煞N脫溶劑化裝置脫除2，5-DHAP基質(zhì)的溶劑的能力。圖85Α-Β展示從銅和不銹鋼脫溶劑化裝置獲得的MS并且低質(zhì)量蛋白質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度不存在差異。圖85(A)展示來自銅脫溶劑化裝置的MS且圖85 (B)展示來自不銹鋼脫溶劑化裝置的MS，其使用樣品(I)血管緊張素(MW 1295)、(2)牛胰島素(MW 5731)和(3)泛素(MW 8561)。使用溶于50 50ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)制備樣品。圖85A3展示銅使得較高質(zhì)量蛋白質(zhì)產(chǎn)生較高信號(hào)強(qiáng)度。圖86描繪使用銅脫溶劑化裝置且使用2，5_DHAP作為基質(zhì)時(shí)以下物質(zhì)的LSI-MS質(zhì)譜1)血管緊張素I (MW 1295)、2)胰島素(Mff 5731)、3)泛素(MW 8561)和4)溶菌酶(MW14300)，部分(A)中顯示不使用熱且部分(B)中顯示施加額外的熱(5V)。源溫度為150°C。圖86㈧(2)的質(zhì)譜展示在不對(duì)脫溶劑化裝置施加熱(如圖86⑶⑵中所見)的情況下蛋白質(zhì)具有較高信噪比和較好質(zhì)譜。
圖87展示通過以下方法得到的泛素的MS-MS數(shù)據(jù)A)通過LSI和B)通過ESI。部分(I)描繪質(zhì)譜，部分(2)描繪漂移時(shí)間相對(duì)于m/z的2D圖，并且部分(3)描繪使用以下獲得的不同電荷狀態(tài)的漂移時(shí)間分布A)結(jié)合溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)的LSI;和B)使用49 49 2 ACN/水/乙酸的ESI。對(duì)于LSI，使用2，5-DHAP作為基質(zhì)并且使用銅脫溶劑化裝置在不施加熱但使用設(shè)定為150°C的離子源溫度的情況下獲得數(shù)據(jù)。在5μ 7π η的流速和150°C的源溫度下獲得ESI。圖87 (A) (I)和87 (B) (I)中的質(zhì)譜電荷狀態(tài)類似并且87 (A) (3)和87 (B) (3)中的漂移時(shí)間幾乎一致，說明通過兩種電離方法得到類似的氣相離子結(jié)構(gòu)。圖88描繪的部分(I)描繪以下高質(zhì)量蛋白質(zhì)的質(zhì)譜并且部分(2)描繪以下高質(zhì)量蛋白質(zhì)的td相對(duì)于m/z的2D圖(A)細(xì)胞色素C (MW 12310)、⑶溶菌酶(MW 14300)和(C)肌紅蛋白(MW 16952)，其是使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)制備并且使用銅脫溶劑化裝置在不使用熱的情況下獲得。源溫度為150°C。這些較高質(zhì)量蛋白質(zhì)顯示LSI對(duì)于使用銅脫溶劑化裝置在不施加熱但使用150°C源溫度的情況下獲得MS-MS數(shù)據(jù)(圖88 (2))的適用性。所述方法還用于分析β (1-42)與(42-1)的異構(gòu)蛋白質(zhì)混合物。圖89描繪使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基質(zhì)的β-淀粉樣蛋白(1_42)與(42_1)的異構(gòu)蛋白質(zhì)混合物的LSI-IMS-MS，其使用銅脫溶劑化裝置在不使用熱的情況下獲得。質(zhì)譜，即部分(A)不區(qū)分兩種化合物的存在，但td相對(duì)于m/z漂移范圍瞬象的二維圖，即部分(B)顯然展示兩種組分。部分⑶中的插圖展示+4電荷狀態(tài)的接近基線分離。與圖117和118中分別分析的純樣品相比，二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z展示根據(jù)兩種蛋白質(zhì)的電荷數(shù)和橫截面以及重疊位置的分離。如所選取的電荷狀態(tài)+4的漂移時(shí)間分布(右下角)所示，蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)呈基線分離狀態(tài)。β_淀粉樣蛋白(1-42)因其低溶解度和高聚集趨勢(shì)而眾所周知并且在阿茲海默氏病的神經(jīng)毒性空斑形成中起重要作用。由此可見，異構(gòu)肽可使用LSI-MS-MS進(jìn)行電離和分離；(1-42)具有更致密的結(jié)構(gòu)，因?yàn)橛^察到其具有較快漂移時(shí)間。所述分析是使用2，5-DHAP作為基質(zhì)來進(jìn)行且除150°C離子源外不對(duì)熱裝置施加額外熱。并且所述方法還用于分析阿茲海默氏病的非淀粉樣蛋白組分(NAC)的總無溶劑分析。圖90描繪使用2 JDHAP基質(zhì)時(shí)阿茲海默氏病的非淀粉樣蛋白組分(NAC)的LSI-IMS-MS總無溶劑分析，其是使用銅脫溶劑化裝置在不施加熱的情況下獲得。部分(A)描繪質(zhì)譜且部分(B)描繪2D時(shí)間漂移相對(duì)于m/z。漂移范圍圖說明在大氣壓下有效地直接從表面產(chǎn)生大的多電荷肽離子。較高電荷狀態(tài)顯示陽離子添加以及質(zhì)子添加，類似于真空MALDI中的觀察結(jié)果。較低電荷狀態(tài)顯示兩種不同形狀。F.結(jié)論制造簡(jiǎn)單脫溶劑化裝置，其將通過激光燒蝕基質(zhì)/蛋白質(zhì)混合物所形成的多電荷基質(zhì)/分析物簇轉(zhuǎn)化為多電荷離子以用于具有低熱和/或熱能力的儀器，諸如沃特斯(Waters) IMS-MS儀器。在AP條件下使用這種制造的脫溶劑化裝置產(chǎn)生多電荷LSI離子的成功證明了所提出的電離機(jī)制，即所述LSI類似于ESI。所述方法對(duì)于蛋白質(zhì)混合物的無溶劑分散(分離)和使用MS-MS技術(shù)的總無溶劑分析的適用性對(duì)于組織成像應(yīng)用極有前途。III.實(shí)例 3這一實(shí)例研究通過激光噴霧電離產(chǎn)生多電荷正離子和負(fù)離子以用于總無溶劑分 析的基質(zhì)和基質(zhì)制備方法。A.引言先前研究?jī)H顯示由基于溶劑的干液滴樣品制備產(chǎn)生多電荷LSI離子。努力了解與在LSI中通過激光燒蝕MALDI MS中常用的基質(zhì)所產(chǎn)生的類似ESI的多電荷離子的形成和電荷減少有關(guān)的過程。了解分析物并入基質(zhì)中如何可主要產(chǎn)生多電荷離子和非并入產(chǎn)生所有單電荷離子，以及這是否適用于除2，5_ 二羥基苯甲酸外的基質(zhì)，對(duì)于了解MALDI機(jī)制和開發(fā)新的改進(jìn)的MS應(yīng)用具有基本重要性。預(yù)期在涉及許多常見基質(zhì)材料的這些研究中所得到的理解，以及產(chǎn)生多電荷正離子和負(fù)離子以用于TSA的發(fā)現(xiàn)將提供使用基于激光的AP電離儀器產(chǎn)生多電荷離子的改進(jìn)。使用LSI研究無溶劑制備。B.方法研究常見MALDI基質(zhì)2，5_ 二羥基苯甲酸(DHB)和2，5_ 二羥基苯乙酮(DHAP)，以及先前未使用LSI方法測(cè)試的基質(zhì)，即2-氨基苯甲醇(ABA)、氨茴酸(AA)和2-羥基苯乙酮(HAP)0在基于溶劑的應(yīng)用中，通過以7.7nmol μ L—1的濃度將分析物粉末(購自美國多肽公司(American Peptide Company Inc.))溶解于50 : 50 ACN :水中來制備血管緊張素I分析物。通過以90pmol μ L-1的濃度將牛胰島素粉末(購自西格瑪奧德里奇公司(SigmaAldrich))溶解于50 : 50水MeOH中來制備蛋白質(zhì)分析物。在載玻片(購自金密封公司(Gold Seal))上點(diǎn)樣2 μ L分析物溶液，接著在上面點(diǎn)樣2 μ L飽和基質(zhì)溶液，混合并干燥。對(duì)于無溶劑制備，將10 μ L分析物(用50 : 50水MeOH溶液制備)傾倒于不銹鋼珠粒上并在35°C下蒸發(fā)3小時(shí)以去除溶劑。接著使用TissueLyzer方法將固體分析物/基質(zhì)混合物放在載玻片上。通過使用TissueLyzer直接混合血管緊張素I粉末與基質(zhì)來制備包括ABA的樣品。通過在載玻片上混合2 μ L分析物溶液與2 μ L基質(zhì)來制備包括HAP的樣品(在25°C下是液體)。所有樣品都在透射幾何條件下使用光譜物理公司(Spectra Physics) VSL337ND-S氮?dú)饧す鉄g到用于離子遷移率光譜法(MS)-MS分析的改進(jìn)的沃特斯(Waters)SYNAPT G2質(zhì)譜儀或賽默公司(Thermo) LTQ-Velos質(zhì)譜儀中。355nm Nd: YAG激光也用于顯微術(shù)研究和HAP樣品。所有基質(zhì)都是購自西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich)。C.結(jié)果展示在LSI中用于改進(jìn)的多電荷離子形成的條件。圖91A-B描繪來自LTQ-Velos的血管緊張素I的LSI質(zhì)譜。在圖91(A)中，飽和DHAP溶液(50 : 50水ACN)產(chǎn)生的+1離子多于+3離子。在圖91(B)中，溶液升溫且變得超飽和，從而在各2yL斑點(diǎn)中存在更多基質(zhì)。這種方法產(chǎn)生具有與飽和溶液相比較高+3離子比率和較高總體離子強(qiáng)度的譜圖。圖92描繪來自ABA溶液(50 : 50水ACN)的單電荷和雙電荷血管緊張素I負(fù)離子的LSILTQ質(zhì)譜。放大的譜圖展示對(duì)應(yīng)于電荷的同位素分布。在堿性氨基酸取代基情況下，顯示LSI可產(chǎn)生多電荷負(fù)離子。無氨基的基質(zhì)僅產(chǎn)生單電荷負(fù)離子。對(duì)雙電荷血管緊張素I正離子和負(fù)離子的漂移時(shí)間分布的觀察結(jié)果揭露，在不考慮是什么基質(zhì)產(chǎn)生所述離子的情況下，負(fù)尚子具有較慢漂移時(shí)間且正尚子具有相同漂移時(shí)間。圖93揭露-2尚子比+2尚子移動(dòng)得略慢并且在不考慮使用什么基質(zhì)的情況下+2離子顯示相同漂移時(shí)間。展示多電荷離子的豐富產(chǎn)生，其中30Hz的研磨頻率對(duì)于分析物并入基質(zhì)中為最佳。圖94A-C描繪通過DHAP使用TSA產(chǎn)生多個(gè)電荷。圖94(A)描繪在25Hz下研磨10分鐘僅產(chǎn)生+2電荷。圖94⑶描繪在30Hz下研磨10分鐘產(chǎn)生+2與+3電荷，其中+3具有最高相對(duì)豐度。圖94 (C)描繪30Hz研磨能夠?qū)⑴Ｒ葝u素并入DHAP晶體中以使得在強(qiáng)的2維漂移時(shí)間圖中實(shí)現(xiàn)高達(dá)+7的電荷狀態(tài)。 也通過使用有機(jī)液體基質(zhì)將分析物溶解于基質(zhì)自身中來產(chǎn)生多電荷，但如圖96中所示，用HAP基質(zhì)(在25°C下是液體)燒蝕的血管緊張素I的譜圖顯示僅使用355nm波長(zhǎng)的Nd/YAG激光實(shí)現(xiàn)結(jié)果。圖95所展示的圖指示由無溶劑制備的各基質(zhì)產(chǎn)生的最高血管緊張素I電荷狀態(tài)(+2到+3)的比率與超過五分鐘的研磨時(shí)間成反比。當(dāng)制備無溶劑樣品時(shí)，顯示當(dāng)研磨10分鐘而非5分鐘時(shí)，各基質(zhì)混合物產(chǎn)生較小高電荷比。最后，定性顯微術(shù)研究揭露當(dāng)如圖98中所示以較高通量使用355nm Nd: YAG激光時(shí)，形成熔融DHB/分析物液滴，這與如圖97中所示的來自337nm氮?dú)饧す獾臉O少熔融材料相反。通過337nm激光燒蝕的DHB的無溶劑LSI實(shí)驗(yàn)僅產(chǎn)生單電荷。通過355nm激光燒蝕的DHB的無溶劑LSI實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生多電荷離子。另外，顯示在使用氮?dú)饧す獾幕谌軇┑腁BA實(shí)驗(yàn)中無熔融燒蝕并且與使用355nm Nd/YAG激光形成的大量熔融材料形成對(duì)比。圖99描繪通過337nm激光燒蝕的ΑΒΑ。這種激光在破壞ABA的晶體結(jié)構(gòu)方面有困難，因此所產(chǎn)生的用于基于溶劑的LSI實(shí)驗(yàn)的信號(hào)低得多。圖100描繪通過355nm激光燒蝕的ΑΒΑ。與基于溶劑的LSI實(shí)驗(yàn)中的337nm相比，這種激光產(chǎn)生好得多的多電荷信號(hào)，因?yàn)檩^高激光通量允許形成熔融基質(zhì)/分析物液滴。D.結(jié)論了解哪些LSI條件使得產(chǎn)生豐富的多電荷離子對(duì)于改進(jìn)MS應(yīng)用極其重要。無溶劑多電荷產(chǎn)生可使LSI斷裂技術(shù)擴(kuò)展到溶解度有限的分析物，并且負(fù)離子的形成可改進(jìn)更加傾向于脫質(zhì)子化而非質(zhì)子化的分子的分析。IV.實(shí)例 4這一實(shí)例描述使用TissueBox/SurfaceBox裝置將無溶劑MALDI基質(zhì)沉積于表面所產(chǎn)生的樣品的無溶劑MALDI研究和結(jié)果。A.通用方法對(duì)于球磨，不銹鋼珠粒(I. 2mm)和鉻珠粒(I. 3mm)是購自俄克拉何馬州巴特爾斯維爾的比奧斯派斯制品公司(BioSpec Products, Inc. Bartlesville, OK)。3 μ m和 20 μ m 目的材料A是購自明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的工業(yè)網(wǎng)織品公司(Industrial Netting, Inc.,Minneapo I is, MN)，并且20 μ m的材料B是購自馬里蘭州哥倫比亞的霍琴托格拉股份有限公司(Hogentogler & Co, Inc. Colombia, MD)。基質(zhì)，即 α -氛基-4-輕基-肉桂酸(CHCA)和2，5_ 二羥基苯甲酸98% (DHB)是購自密蘇里州圣路易斯的西格瑪奧德里奇公司(SigmaAldrich, Inc.，St. Louis，MO)。溶劑，即乙腈(ACN)和三氟乙酸(TFA)是購自賓夕法尼亞州匹茲堡的飛世爾科技公司(Fisher Scientific Inc.，Pittsburgh, PA)。使用純水(馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司(Millipore’s Corporate,Billerica,MA))。平坦的顯微載片(尺寸為I英寸X3英寸)是購自新罕布什爾州樸次茅斯的金密封產(chǎn)品公司(Gold SealProducts, Portsmouth, NH)。使用用于成像的涂有ITO的傳導(dǎo)性載片(馬薩諸塞州比爾里卡的布魯克公司(Bruker, Billerica, MA))。噴槍(1/5馬力、100PSI壓縮機(jī)和噴槍套件)是獲自加利福尼亞州卡馬里奧的中心氣動(dòng)專業(yè)公司(Central Pneumatic Professional,Camarillo, CA)。使用塑料真空密封食物容器在不干擾組織/基質(zhì)組合物的情況下進(jìn)行樣品運(yùn)輸和解凍，這種容器是購自伊利諾斯州斯科基的ZeVRO公司(ZeVRO，Skokie, IL)。I.小鼠腦組織 使18周齡的C57 B1/6小鼠麻醉并且用冰冷的I X磷酸鹽緩沖生理鹽水(150mMNaCl、IOOmM NaH2PO4, pH = 7. 4)經(jīng)賁門灌注5分鐘以去除紅細(xì)胞。將腦冷凍在-20°C下且使用萊卡CM1850冷凍切片機(jī)(伊利諾斯州班諾克本的萊卡微系統(tǒng)公司(LeicaMicrosystems Inc. , Bannockburn, IL))依次切割成 10 μ m 切片。在各別 MALDI-TOF-MS 和MALDI-IMS-MS研究中，使用來自同一小鼠的切片，但在用于分析的兩種不同類型的質(zhì)譜儀之間動(dòng)物是不同的。將切片放在預(yù)冷卻的載片上。簡(jiǎn)單地用手指從背面使載玻片加溫以使得切片松弛并附著。小心避免水冷凝。將載片在_20°C下儲(chǔ)藏于含有干燥劑的氣密盒中直到使用為止。2.用于快速無溶劑基質(zhì)沉積應(yīng)用的SurfaceBox :設(shè)計(jì)和制造設(shè)計(jì)并制造用于無溶劑MALDI基質(zhì)沉積于表面的裝置。圖18展示這種裝置的設(shè)計(jì)原理，其由緊密地固定但具有足夠距離(約Icm)以使得通過球磨裝置(TissueLyzer)能夠?qū)崿F(xiàn)珠粒的用力移動(dòng)和篩網(wǎng)的可能彎曲不會(huì)傷害組織切片的兩個(gè)隔室組成。上隔室是以篩網(wǎng)(20μηι或3μηι)面向下隔室的形式安裝。將各別基質(zhì)材料和珠粒添加到SurfaceBox的上隔室中。所述珠粒以及所需基質(zhì)材料保留在SurfaceBox的上部部分中。將固持面向上隔室的組織切片的顯微載片以足夠距離放在下隔室中并且通過在SurfaceBox的側(cè)壁中開槽或簡(jiǎn)單地通過在顯微載片的底部使用雙面膠帶而固定于下隔室。SurfaceBox被設(shè)計(jì)成防止顯微載片外的基質(zhì)污染。通過用力移動(dòng)SurfaceBox,使用不需勞力且靈活的TissueLyzer裝置來進(jìn)行各別基質(zhì)材料的涂覆。B.小鼠腦組織的MS分析I.無溶劑 MALDI 分析MALDI_T0F 儀器將粘著于ITO載玻片(馬薩諸塞州比爾里卡的布魯克·達(dá)托尼克斯公司(BrukerDatonics, Inc. , Billerica, MA))的冷凍小鼠腦組織切片放入干燥氮?dú)馐抑?0分鐘,此時(shí)組織解凍。在2400dpi的分辨率下使用愛普生(Epson)掃描儀(愛普生(Epson)Perfection4490 Photo)得到組織的數(shù)字圖像。將組織放入Autoflex III MALDI TOF儀器(馬薩諸塞州比爾里卡的布魯克·達(dá)托尼克斯公司(Bruker Datonics, Inc.，Billerica, MA))中，并且在FlexImaging 2. I軟件(馬薩諸塞州比爾里卡的布魯克·達(dá)托尼克斯公司(BrukerDatonics, Inc. , Billerica, MA))中使用三個(gè)教示點(diǎn)記錄樣品臺(tái)的xy位置。在測(cè)量500Da到2000Da的質(zhì)量范圍的正離子、反射模式下操作儀器。所有固態(tài)智慧式(smartbeam)激光都在200Hz的重復(fù)頻率下操作，并且激光束直徑調(diào)整到50 μ m。成像光柵分辨率也設(shè)定為50 μ m以提供高空間分辨分子圖像。手動(dòng)確定小鼠腦的一部分(2mmX5mm)以用于成像實(shí)驗(yàn)，采集到超過3600個(gè)譜圖。從每一像素總和總共200次激光發(fā)射。完成分析后，使用FlexImaging通過基于疑問信號(hào)的檢測(cè)和強(qiáng)度以顏色梯度呈現(xiàn)各體素的分子詳情來處理結(jié)果O2.將SurfaceBox應(yīng)用于使用TissueLyzer的快速無溶劑基質(zhì)沉積。使用TissueLyzer (加利福尼亞州瓦倫西亞的凱杰公司(QIAGEN, Valencia, CA))和設(shè)定頻率(在本文中為15Hz和25Hz)在含有珠粒材料的5mL玻璃小瓶中預(yù)研磨大量?jī)?chǔ)備基質(zhì)材料(約Ig)并持續(xù)固定時(shí)間(在本文中為5分鐘和30分鐘)。在一組實(shí)驗(yàn)中，使用30-50個(gè)鉻珠粒(I. 3mm)。在第二組中，使用20-30個(gè)不銹鋼珠粒(I. 2mm)以及3個(gè)4mm珠粒。3基質(zhì)轉(zhuǎn)移條件的評(píng)估將預(yù)研磨的基質(zhì)(CHCA、DHB)以及3個(gè)大(4mm)不銹鋼珠粒和10到20個(gè)小(I. 2mm)不銹鋼珠粒放在SurfaceBox的上隔室中。將封埋有小鼠腦切片的顯微載片放在下隔室中。接著將組裝的SurfaceBox裝置放在TissueLyzer樣品固持器中并固定于TissueLyzer臂上。在25Hz的設(shè)定頻率下組織切片的基質(zhì)厚度由時(shí)間(30秒到5分鐘)控制。對(duì)于具有20 μ m孔隙的篩網(wǎng)材料，在60秒內(nèi)獲得DHB和CHCA基質(zhì)材料的均勻覆蓋。對(duì)于具有3μπι孔隙的篩網(wǎng)材料，球磨時(shí)間增加到5分鐘(DHB、CHCA基質(zhì))。兩種不同基質(zhì)材料(DHB、CHCA)也涂覆于位于一個(gè)顯微載片上的兩個(gè)不同組織切片上。簡(jiǎn)單地通過僅在基質(zhì)涂覆范圍內(nèi)移動(dòng)各別切片來進(jìn)行兩個(gè)后續(xù)基質(zhì)涂覆循環(huán)?？赏ㄟ^將兩個(gè)SurfaceBox放在TissueLyzer固持器中來實(shí)現(xiàn)多路復(fù)用(multiplexing)(可在補(bǔ)充信息(SupplementalInformation)中得到照片)。
4.用于基于溶劑的基質(zhì)沉積的噴涂根據(jù)先前報(bào)導(dǎo)的程序(加勒特(Garrett)等人，國際質(zhì)譜學(xué)雜志(Int. J. MassSpectrom) 2007，260，166-176)，使用噴槍將基于溶劑的基質(zhì)涂覆于組織切片上，所述文獻(xiàn)中有關(guān)所述程序的教示以引用的方式并入本文中。簡(jiǎn)單來說，將基質(zhì)(CHCA)溶解于含0. 1% TFA的50 50 ACN/水溶液中并且以12cm到15cm的距離使用噴槍噴灑于封埋于載玻片上的組織切片上。將總共20個(gè)基質(zhì)溶液涂層涂覆于各組織切片上?；谌軇┑幕|(zhì)涂覆方案對(duì)于所有樣品都保持不變，因此并非對(duì)于所有樣品都是最佳的。5.顯微術(shù)使用光學(xué)顯微術(shù)(尼康(Nikon)，ECLIPSE, LV)提供對(duì)沉積于載玻片上的基質(zhì)和基質(zhì)覆蓋的組織，以及純組織和不同篩網(wǎng)的定性了解。使用各種放大倍數(shù)條件(5倍到100倍)，從而提供降低到約1-10 μ m的詳圖。在日立(Hitachi) S-2400掃描電子顯微鏡上進(jìn)行掃描電子顯微術(shù)(SEM)分析。對(duì)于SEM研究，將碳帶放在基質(zhì)覆蓋的組織上以獲得SEM樣品。將SEM樣品放在SEM樣品固持器中并在各種放大倍數(shù)下進(jìn)行分析。6.樣品的制備和儲(chǔ)藏
將MALDI基質(zhì)制備的組織樣品牢固地放在塑料真空密封食物容器中并略微排氣以去除空氣中所含的水分。將樣品容器在_80°C下保持一個(gè)夜晚并放在干冰上。在使用之前，從干冰上移出容器并使容器升溫到室溫，隨后釋放少量真空密封。一天(對(duì)于MALDI-T0F)和六天(對(duì)于MALDI-MS-T0F)后獲得質(zhì)量測(cè)量結(jié)果。C.小鼠腦組織的MS分析I.無溶劑 MALDI 分析MALDI_T0F 儀器將粘著于ITO載玻片(馬薩諸塞州比爾里卡的布魯克·達(dá)托尼克斯公司(BrukerDatonics, Inc. , Billerica, MA))的冷凍小鼠腦組織切片放入干燥氮?dú)馐抑?0分鐘,此時(shí)組織解凍。在2400dpi的分辨率下使用愛普生(Epson)掃描儀(愛普生(Epson)Perfection4490 Photo)得到組織的數(shù)字圖像。將組織放入Autoflex III MALDI TOF儀器(馬薩諸塞州比爾里卡的布魯克·達(dá)托尼克斯公司(Bruker Datonics, Inc.，Billerica, MA))中，并且在FlexImaging 2. I軟件(馬薩諸塞州比爾里卡的布魯克·達(dá)托尼克斯公司(BrukerDatonics, Inc. , Billerica, MA))中使用三個(gè)教示點(diǎn)記錄樣品臺(tái)的xy位置。在測(cè)量500Da 到2000Da的質(zhì)量范圍的正離子、反射模式下操作儀器。所有固態(tài)智慧式激光都在200Hz的重復(fù)頻率下操作，并且激光束直徑調(diào)整到50 μ m。成像光柵分辨率也設(shè)定為50 μ m以提供高空間分辨分子圖像。手動(dòng)確定小鼠腦的一部分(2_X5mm)以用于成像實(shí)驗(yàn)，采集到超過3600個(gè)譜圖。從每一像素對(duì)總共200次激光發(fā)射求和。完成分析后，使用FlexImaging通過基于疑問信號(hào)的檢測(cè)和強(qiáng)度以顏色梯度呈現(xiàn)各體素的分子詳情來處理結(jié)果。2.總無溶劑分析(TSA) MALDI-IMS-MS 儀器在成像實(shí)驗(yàn)之前使用CanoScan 4400F掃描儀(英國賴蓋特的佳能公司(Canon,Reigate, U. K.))獲得組織切片的數(shù)字掃描并且輸入MALDI成像圖案制作軟件(英國曼徹斯特的沃特斯公司(Waters Corporation, Manchester, U. K.))中，選擇其中待成像的區(qū)域。使用以IMS模式操作的MALDI SYNAPT HDMS (英國曼徹斯特的沃特斯公司(WatersCorporation, Manchester, U. K.))獲得MALDI-IMS-MS分析。使用聚乙二醇的標(biāo)準(zhǔn)混合物(英國格林厄姆的西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich, Gillingham, U. K.))進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，范圍在m/z 100與1000之間。在以超出100-1000的m/z范圍的HDMS模式操作的MALDISYNAPT HDMS上，使用200Hz Nd: YAG激光獲得組織成像數(shù)據(jù)。選擇150 μ m的空間分辯率，并且每個(gè)像素獲得400次激光發(fā)射。用于離子遷移率分離的氣體是氮?dú)猓淞魉僭O(shè)定為22mLmin—1。MS裝置中的壓力為5· 07 Χ10—1毫巴。MS波速設(shè)定為300ms—1，其中能夠?qū)崿F(xiàn)可變波高。波高設(shè)定為6V到14V。采集后，使用MALDI成像轉(zhuǎn)換器(英國曼徹斯特的沃特斯公司(Waters Corporation,Manchester, U. K.))將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為分析文件格式以使用BioMap (瑞士巴塞爾的諾華公司(Novartis,Basel,CH))進(jìn)行圖像分析。也可使用DriftScope 2.1(英國曼徹斯特的沃特斯公司(Waters Corporation, Manchester, U. K.))評(píng)估數(shù)據(jù),其中可觀察m/z相對(duì)于漂移時(shí)間的2-D圖。在本文中，應(yīng)用“峰值檢測(cè)”算法以產(chǎn)生峰值列表，可將其載入Excel中，在其中報(bào)導(dǎo)m/z、強(qiáng)度和漂移時(shí)間。因此，可鑒別具有類似m/z (同重元素)和不同漂移時(shí)間(遷移率)的種類，如對(duì)于m/z 863. 5的一組低豐度同重種類所示?？蓮腄riftScope 2. I選擇和選取個(gè)別離子種類,用其X和Y坐標(biāo)保留特定m/z和漂移時(shí)間。接著可轉(zhuǎn)換所選取的原始數(shù)據(jù)以用于BioMap。輸出僅呈現(xiàn)所關(guān)注離子的離子圖像。使用TissuLyzer制備多種無溶劑樣品。分析那些樣品并將結(jié)果展示于圖1_14中。圖I展示用于獲得圖2-14(七種肽、兩種小蛋白質(zhì)和四種脂質(zhì))中所示的圖像的基質(zhì)(2，5-DHB)/分析物混合物的照片。使用TissueLyzer (10分鐘，頻率為20Hz)制備無溶劑樣品以進(jìn)行均質(zhì)化并將粉末直接轉(zhuǎn)移到MALDI板(左邊)。為確保滿足兩種不同電離方法之間相同的基質(zhì)/分析物條件，將無溶劑制備的基質(zhì)/分析物樣品留在容器小瓶中的一部分溶解于50/50乙腈/水中并且點(diǎn)樣于MALDI靶板上，隨后蒸發(fā)溶劑，得到基于溶劑制備的樣品(右邊)。這種確定的模型混合物覆蓋各種不同化合物類別(肽、小蛋白質(zhì)和脂質(zhì))、分子量(378. 6到5733. 5Da)、溶解度/疏水性[例如牛胰島素(可溶)相對(duì)于β -淀粉樣蛋白(1-42)(不溶)；β -淀粉樣蛋白(1-11)(親水性)相對(duì)于β -淀粉樣蛋白(33-42)(疏水性)];和電離[例如2-AG相對(duì)于NAGABA ；ΡΙ相對(duì)于PC]以示范活組織中存在的簡(jiǎn)單挑戰(zhàn)。也使用其它基質(zhì)(例如α -氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA))。使用MALDI-T0F/T0F儀器(布魯克公司(Bruker))使兩種不同制備樣品(使用和不使用溶劑)成像。對(duì)于無溶劑制備，所得成像通過離子豐度測(cè)量展示基質(zhì)中的均質(zhì)樣品分布，這與基于溶劑的制備相反。左側(cè)圖像是無溶劑且右側(cè)圖像是基于溶劑，如對(duì)于確定的模型混合物中的肽、小蛋白質(zhì)和脂質(zhì)所說明各種不同化合物類別(肽、小蛋白質(zhì)和脂質(zhì))、分子量(378. 6到5733. 5Da)、溶解度/疏水性[例如牛胰島素相對(duì)于β _淀粉樣蛋白 (1-42) ;β-淀粉樣蛋白(1-11)相對(duì)于β-淀粉樣蛋白(33-42)];和電離[例如2-AG相對(duì)于NAGABA ；ΡΙ相對(duì)于PC]。甚至類似的化合物和分子量[例如圖2 (m/z 915. 2)到11 (m/z2846.5)中按漸增分子量排序的肽]使用基于溶劑的電離方法(右)也只產(chǎn)生低再現(xiàn)性結(jié)果，然而無溶劑方法在整個(gè)樣品中產(chǎn)生類似離子豐度(左)。使用利用具有各種性質(zhì)的各種化合物的無溶劑樣品制備(左側(cè)圖像)，分析物的離子信號(hào)在整個(gè)樣品中相當(dāng)恒定，然而使用基于溶劑的方法(右側(cè)圖像)，離子信號(hào)極不均勻。圖2-14展示使用無溶劑和基于溶劑的分析來分析若干種蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)。圖2描繪β_淀粉樣蛋白(33-42 ;MW 915.2)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖3描繪促脂解素(MW 951. I)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖4描繪加壓素(MW 1084.3)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖5描繪強(qiáng)啡肽(MW 1137.4)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖6描繪β -淀粉樣蛋白(1-11 ;MW 1325.3)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖7描繪物質(zhì)P (MW1347. 8)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖8描繪蜂毒肽(MW 2846.5)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖9描繪淀粉樣蛋白(1-42 ;麗4511)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖10描繪牛胰島素(MW5733. 5)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖11描繪2-花生四烯?；视?2_AG) (MW 378. 6)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖12描繪N-花生四烯酰基Y氨基丁酸(NAGABA) (MW 389. 6)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖13描繪磷脂酰肌醇(PI) (MW 909. I)的無溶劑和基于溶劑的分析。圖14描繪磷脂酰膽堿(PC) (MW 760. I)的無溶劑和基于溶劑的分析。V.實(shí)例 5這一實(shí)例描述旨在實(shí)現(xiàn)欲用于SurfaceBox中以改進(jìn)組織切片的覆蓋的基質(zhì)晶體的尺寸的均勻減小的研究。A.基質(zhì)涂覆圖18描繪適合用于使用MALDI的成像質(zhì)譜法的TissueBox的示意圖。所述TissueBox可通過在同一固持器中添加更多組織切片或更多盒，接著可使用不同基質(zhì)來實(shí)現(xiàn)多路復(fù)用。所示部分包括固持基質(zhì)材料、篩網(wǎng)和金屬珠粒的SurfaceBox上隔室；和包括組織切片和載玻片的下隔室。TissueBox包括具有基質(zhì)和珠粒和孔隙為約44 μ m的篩網(wǎng)底部的可套盒。固持盒可包括位于載玻片上的組織樣品。各組件以緊密配合套在一起，從而使得具有足以保持篩網(wǎng)分隔的間距。球磨機(jī)允許為內(nèi)含物的用力移動(dòng)選擇頻率和持續(xù)時(shí)間，如本文中使用所制造的SurfaceBox的情況。這轉(zhuǎn)而又提供改變推過篩孔的材料的量(由此對(duì)應(yīng)于組織切片表面上的基質(zhì)厚度)的極其容易且簡(jiǎn)單的方法。所述方法較快，操作者干預(yù)極小且產(chǎn)生晶體尺寸介于< I μ m與30 μ m之間的均勻覆蓋的經(jīng)歷視所用篩網(wǎng)而定(使用44 μ m篩孔的來自組織的SEM數(shù)據(jù))。圖22A-B描繪用44微米篩網(wǎng)球磨(DHB基質(zhì)，在25Hz下30秒)后的基質(zhì)晶體尺寸。圖22A展示放大100倍(500 μ m比例尺)和放大100倍的插圖(50 μ m比例尺)。圖22B展示使用掃描電子顯微術(shù)(SEM)放大3000倍的10 μ m比例尺。研究實(shí)現(xiàn)欲用于SurfaceBox中的基質(zhì)晶體的均勻減小的條件。圖36涉及適當(dāng)晶粒尺寸的重要性。圖36展示放大6000倍、使用5μηι比例尺、使用以下TissueLyzer條件時(shí)使用(I)鉻珠粒和(2)不銹珠粒的顯微術(shù)掃描(A) 15Hz頻率持續(xù)30分鐘和(B) 25Hz頻率持續(xù)5分鐘。含有I. 3_鉻珠粒的小瓶中的預(yù)研磨基質(zhì)的光學(xué)顯微術(shù)結(jié)果顯示與不銹鋼 珠粒相比，實(shí)現(xiàn)晶體尺寸的有效和均勻減小。如圖36(1) (A)中所示，基于所獲得的最小和均質(zhì)晶體尺寸(尺寸< I μ m到5 μ m的絨毛狀非結(jié)晶材料)，使用較重鉻金屬珠粒持續(xù)較長(zhǎng)研磨時(shí)間可產(chǎn)生最好的結(jié)果。為實(shí)現(xiàn)均一晶體覆蓋，評(píng)估減小將用于SurfaceBox裝置中的篩孔(20 μ m和3 μ m)的條件。為使得基質(zhì)層的個(gè)別晶體尺寸更明顯，在空顯微載玻片上且使用較短研磨時(shí)間進(jìn)行比較以避免妨礙評(píng)估的較厚基質(zhì)層。圖24-27展示DHB或CHCA的光學(xué)顯微術(shù)圖像。圖24和25提供在25Hz/60秒下根據(jù)20 μ m篩網(wǎng)的DHB的光學(xué)顯微術(shù)圖像，提供IOym的放大比例尺。圖26提供在25Hz/60秒下根據(jù)20 μ m篩網(wǎng)的DHB的光學(xué)顯微術(shù)圖像，提供10 μ m的放大比例尺。圖27展示使用安裝有不同篩網(wǎng)尺寸和不同不銹鋼珠粒(1.2_和4_)的混合物的SurfaceBox且使用25Hz頻率和5分鐘持續(xù)時(shí)間、使用3 μ m篩網(wǎng)轉(zhuǎn)移基質(zhì)的TissueLyzer設(shè)定沉積于空顯微載片上的CHCA基質(zhì)的光學(xué)顯微術(shù)圖像。使用圖36(1) (A)中測(cè)定的減小且更均質(zhì)的晶體尺寸以及安裝有20 μ m篩網(wǎng)材料(材料A)的SurfaceBox提供< I μ m到12 μ m的DHB晶體尺寸和介于約I μ m與12 μ m之間的CHCA。差異似乎是DHB具有大量約I μ m和更小的晶體，以及顯著較大(3-12 μ m)的第二尺寸晶體。在CHCA的情況下，小晶體和大晶體的可變性較不顯著，其中晶體范圍主要為約I μ m到3 μ m，僅少數(shù)達(dá)到12 μ m。基質(zhì)涂覆方法的簡(jiǎn)單性預(yù)示使用具有甚至更小孔隙的篩網(wǎng)制備樣品。在最后一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，研究3μπι篩孔的適用性。3 μ m材料的構(gòu)造類似于20 μ m材料Α。為改進(jìn)組織切片的覆蓋，使用TissueLyzer用力振動(dòng)SurfaceBox的持續(xù)時(shí)間在25Hz的頻率下增加到5分鐘。這些條件產(chǎn)生如圖27中所示范的均質(zhì)尺寸晶體的極均一覆蓋。觀察到介于< Iym與5 μ m之間的CHCA晶體。圖37-39展示使用SurfaceBox沉積于小鼠腦組織切片上的DHB基質(zhì)的光學(xué)顯微術(shù)圖像并提供在25Hz/300秒下根據(jù)44X 3 μ m篩網(wǎng)的DHB的光學(xué)顯微術(shù)圖像。使用不同不銹鋼珠粒(I. 2mm和4mm)的混合物。圖37展示使用透射光和200 μ m的放大比例尺的光學(xué)顯微術(shù)圖像。圖38展示使用反射光和IOOym比例尺的光學(xué)顯微術(shù)圖像。圖39展示使用反射光和10 μ m比例尺的光學(xué)顯微術(shù)圖像。圖40展示在25Hz/300秒下根據(jù)44X3 μ m篩網(wǎng)的DHB的SEM圖像，提供5μπι的放大比例尺。與單篩網(wǎng)TissueBox(圖23)相比，雙篩網(wǎng)TissueBox提供小于< 5um的粒子的顯著增加(比例尺在右下角)。對(duì)于沉積于組織上的基質(zhì)(這里為DHB)所獲得的結(jié)果顯示于圖37和圖40中。由使用透射光顯微術(shù)(200μπι比例尺)的圖37可見，使用3μπι篩網(wǎng)的組織覆蓋總體均勻；在反射光情況下，基質(zhì)呈現(xiàn)為暗點(diǎn)。使用放大圖(圖40，5μπι比例尺)的反射光指示先前對(duì)于空載玻片所觀察到的類似均勻性(圖27，CHCA)。數(shù)據(jù)表明基質(zhì)包括于組織表面上，其可能是通過用力移動(dòng)TissueLyzer臂而可能實(shí)現(xiàn)的速度的結(jié)果。在本文所用的條件下，與基于溶劑的基質(zhì)涂覆相比，均勻性得到改進(jìn)。因此，實(shí)現(xiàn)小鼠腦組織切片的均勻基質(zhì)覆蓋(DHB)。對(duì)于圖28A-C中所示的組織MS成像研究使用20 μ m材料A。圖28A-C比較使用(I)快速無溶劑SurfaceBox基質(zhì)沉積(左側(cè)圖像)和⑵噴涂(右側(cè)圖像)和CHCA基質(zhì)時(shí)小鼠腦組織的組織成像。圖28A展示用CHCA基質(zhì)覆蓋的組織，圖28B展示質(zhì)譜，且圖28C展示各別m/z值對(duì)于無溶劑為(I) 779. 6和(II) 843. 3且對(duì)于基于溶劑為(1)726.3和(11)804.3。將使用快速無溶劑基質(zhì)(這里是CHCA)涂覆于小鼠腦切片所獲得的MS組織成像結(jié)果與噴涂方法作比較。(加勒特(Garrett)等人，國際質(zhì)譜學(xué)雜志(Int. J. Mass Spectrom) 2007，260，166-176)。使用這一程序，當(dāng)以細(xì)霧形式涂覆飽和CHCA溶液時(shí)，基于溶劑的涂覆產(chǎn)生約5-50 μ m的晶體尺寸。使用MALDI-T0F儀器采集到的數(shù)據(jù)對(duì)于使用50 μ m橫向分辨率和剛好高于基質(zhì)臨界值的激光功率的兩個(gè)組織切片來說保持一致。在圖28中，(A)中展示各小鼠腦切片的成像區(qū)域以及(B)中展示典型質(zhì)譜，且(C)中展示分別由各方法獲得的重疊離子圖像。較豐富離子的m/z (圖28B)對(duì)應(yīng)于含鉀磷脂酰膽堿，例如m/z 772(32:0)和 m/z 798(34:1)。顯示m/z值以及擊中次數(shù)的重疊離子圖像，其提供諸如m/z 779. 6和726. 3以及m/z843. 3和804. 3的互補(bǔ)圖像。使用基于溶劑和無溶劑樣品制備來檢測(cè)不同離子并非出乎意料。所述方法與無溶劑樣品制備互補(bǔ)，其較好地電離疏水性和溶解度有限的化合物。從組織變化獲得脂質(zhì)信號(hào)視基質(zhì)選擇、溶劑系統(tǒng)和極性而定(施瓦茲(Schwartz)等人，質(zhì)譜學(xué)雜志(J. Mass Spectrom) 2003, 38,699-708)。脂質(zhì)概況和信號(hào)強(qiáng)度在兩種樣品制備之間不同。選擇具有足夠離子強(qiáng)度的個(gè)別離子來提供可見分子圖像，并在同一樣品制備中形成互補(bǔ)對(duì)。在這一實(shí)例和圖28A-C中重要的是均勻反應(yīng)而非m/z值或離子信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)離子圖像進(jìn)行彩色編碼以說明構(gòu)成整個(gè)圖像的各質(zhì)譜中的離子強(qiáng)度。離子圖像中針對(duì)相同m/z值的相同顏色的均勻分布指示具有幾乎相同離子強(qiáng)度的質(zhì)量信號(hào)。如例如通過具有相同顏色的大片區(qū)域(圖28、1、C)可見，使用無溶劑MALDI分析獲得均勻離子信號(hào)反應(yīng)?；谌軇┑腗ALDI分析(圖28、2C)展示信號(hào)強(qiáng)度變化的隨機(jī)變化，例如在主要是綠色(中等豐度)的一片中的紅色(高豐度)和藍(lán)色(低豐度)像素。離子信號(hào)強(qiáng)度變化可歸因于MALDI分析中通常發(fā)生并且限制MALDI組織成像應(yīng)用的熱析點(diǎn)(sweet spot)。這一比較指示高分辨率圖像可使用SurfaceBox進(jìn)行快速基質(zhì)涂覆和高分辨率圖像分析來獲得。使用MALDI-T0F-MS儀器進(jìn)行組織成像的先前無溶劑涂覆使用100 μ m橫向分辨率。(波利泰瓦爾(Puolitaival)等人，美國質(zhì)譜學(xué)會(huì)雜志(J. Am. Soc. Mass Spectrom) 2008,19,882-886)。VI.實(shí)例 6
這一實(shí)例描述使用FF-TG-AP MALDI分析小鼠腦組織。還描述無溶劑和基于溶劑的基質(zhì)涂覆的比較。A.小鼠腦的組織質(zhì)量分析 圖43A-B展示使用無場(chǎng)透射幾何條件大氣壓(FF_TG_AP) MALDI源進(jìn)行小鼠腦的組織質(zhì)量分析，所述小鼠腦是通過將基質(zhì)放在組織與載玻片之間來制備。圖43(A)展示通過對(duì)純的組織斑點(diǎn)取樣所獲得的總離子流并且圖43 (B)展示質(zhì)譜。插圖指示使用高質(zhì)量分辨率儀器(50000質(zhì)量分辨率，< 5ppm質(zhì)量精確度)描述的同重組合物。這種FF設(shè)計(jì)能夠用TG-AP源燒蝕組織與基質(zhì)層。組織與基質(zhì)厚度都可以準(zhǔn)確地測(cè)定和優(yōu) 化。如下文詳細(xì)討論，圖44展示具有通過噴灑干材料且隨后進(jìn)行激光燒蝕而用DHB覆蓋的腦切片的顯微載片的照片。圖44展示具有如下腦切片的顯微載片(I)通過直接從容器中噴灑干材料且隨后進(jìn)行激光燒蝕而用DHB覆蓋；和(2)基于溶劑攙入四滴DHB基質(zhì)。圖45和46展示激光燒蝕后圖44的經(jīng)無溶劑基質(zhì)處理的組織切片的光學(xué)顯微術(shù)圖像；在圖45 (放大比例尺為50 μ m)中，凹坑的形狀指示成功地激光燒蝕穿過組織；在圖46 (放大比例尺為ΙΟμπι)中，包圍凹坑的其余基質(zhì)指示基質(zhì)有助于組織的燒蝕。圖47描繪激光燒蝕后圖44(2)的經(jīng)無溶劑基質(zhì)處理的組織切片；暴露于O. 2μ L基質(zhì)的區(qū)域呈現(xiàn)黑色。在發(fā)射激光產(chǎn)生離子后，通過光學(xué)顯微術(shù)檢查組織切片上的基于溶劑和無溶劑基質(zhì)涂覆。用DHB基質(zhì)覆蓋組織切片以使得激光束穿過組織，隨后達(dá)到基質(zhì)。所述基質(zhì)證明在這種布置中組織材料電離，但程度比使用組織與顯微鏡載片之間的基質(zhì)要小。組織上的激光沖擊是肉眼看不到的。光學(xué)顯微術(shù)檢查揭露組織廣泛沖擊事件。圖45和46中展示兩種區(qū)域。圖45展示圖44的經(jīng)無溶劑基質(zhì)處理的組織切片且可將這些切片與圖47中所示的基于溶劑的涂覆的結(jié)果作比較。圖45中的較大沖擊區(qū)域指示燒蝕組織區(qū)域(約80 μ m)的形狀。如通過燒蝕組織的周圍隆起可見，觀察到組織損傷。圖46中所示的兩個(gè)燒蝕區(qū)域中的較小者指示基質(zhì)的可能作用。僅當(dāng)基質(zhì)充分接近組織時(shí)，基質(zhì)才會(huì)有助于組織分子的解吸/電離?？赡艿臋C(jī)制是在第一次發(fā)射后，熱量使基質(zhì)熔化到組織上。這將解釋具有一部分基質(zhì)晶體的燒蝕組織區(qū)域仍存在于凹坑的每一側(cè)上。當(dāng)基質(zhì)位于組織下方時(shí)，實(shí)現(xiàn)顯著較好的離子流；然而，經(jīng)激光燒蝕的組織區(qū)域顯著較大。用FF-TG-AP方法產(chǎn)生的離子豐度表明使用改進(jìn)的激光束聚焦可觀察到足夠信號(hào)。VII.實(shí)例 7這一實(shí)例展示血管緊張素I的無溶劑MS分析。對(duì)于MALDI樣品制備，按照干液滴方法(卡拉斯(Karas)等人，分析化學(xué)(AnalChem) 1998 ;60 :2299)。使用曲姆賓(Trimpin)等人，質(zhì)譜學(xué)快訊(Rapid Commun MassSpec) 2001 ；15 :1364中所述的方案制備將樣品直接沉積于載玻片上的無溶劑樣品制備物。肽、蛋白質(zhì)、DHB異構(gòu)體和溶劑是獲自西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich)(密蘇里州圣路易斯(St. Louis, MO)) ο圖62展示通過LSI使用2，5-DHB所獲得的血管緊張素I的質(zhì)譜。插圖展示如所指示的擴(kuò)大區(qū)域。圖63展示通過電噴霧電離(ESI)使用50/50CAN/水所獲得的血管緊張素I的質(zhì)譜。結(jié)果顯示對(duì)于諸如血管緊張素I等小系統(tǒng)，在ESI與使用2，5-DHB和基于溶劑的樣品制備條件的FF-TGAP-MALDI之間觀察到相同電荷狀態(tài)分布和豐度。VIII.實(shí)例 8這一實(shí)例展示經(jīng)電離的淀粉樣蛋白肽(1-42)的AP-MALDI。淀粉樣蛋白肽(1-42)在阿茲海默氏病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。作為疾病過程的一部分，其是轉(zhuǎn)化成不溶性神經(jīng)毒性β_淀粉樣蛋白原纖維形式(文德林(Wunderlin)等人，妝-歐洲研討會(huì)(Peptides-European Symposium) 1999 ;25 ;330_331)。對(duì)于這一實(shí)例，對(duì)淀粉樣蛋白(1-42)進(jìn)行AP穿過階段MALDI。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子量超過標(biāo)準(zhǔn)MS范圍,所以蛋白質(zhì)被電離。圖65-67展不電荷+4、+5和+6的質(zhì)譜。這一實(shí)例展不電離較大分子量蛋白質(zhì)(超過約4，OOOmw)可允許使用AP穿過階段MALDI對(duì)其進(jìn)行分析。IX.實(shí)例 9這一實(shí)例展示牛胰島素的制備和MS分析。
使用2，5-DHB和MALDI基于溶劑的基質(zhì)/分析物制備方法，產(chǎn)生牛胰島素的質(zhì)譜。(卡拉斯(Karas)等人，分析化學(xué)(Anal. Chem.) 1988 ；60 :2299)。MALDI 質(zhì)譜(圖 68)類似于胰島素的ESI譜圖。圖10展示牛胰島素的無溶劑和基于溶劑的制備。X.實(shí)例10.其它數(shù)據(jù)和揭示內(nèi)容以下各圖呈現(xiàn)與旨在通過質(zhì)譜法(MS)改進(jìn)材料分析和組織成像的研究和實(shí)驗(yàn)有關(guān)的其它數(shù)據(jù)和揭示內(nèi)容。圖15描繪根據(jù)形狀的同重分子的無溶劑分離。MS-MS根據(jù)電荷數(shù)和橫截面(尺寸和形狀)來分離分子；半乳糖和阿司匹林(aspirin)具有基本上相同的分子量(基本上相同的尺寸)并且通過添加一個(gè)陽離子(相同的電荷數(shù))來電離。圖15展示使用半乳糖(C6H1206 ;精確分子量為180. 063Da)相對(duì)于阿司匹林(C9H804 ;精確分子量為180. 042Da)的ESI-MS-MS(SYNAPT G2，沃特斯公司(Waters Company))的漂移時(shí)間譜圖(無溶劑分離，尚子遷移率輸出)。圖16描繪根據(jù)形狀的異構(gòu)分子的無溶劑分離。IMS-MS根據(jù)電荷數(shù)和橫截面(尺寸和形狀)來分離分子；N-AEA(大麻素；藥理學(xué)相關(guān)化合物，一種內(nèi)源性大麻素樣物；與腦功能和健康(幸福)有關(guān)；花生四烯酸和乙醇胺通過胺官能團(tuán)連接在一起得到酰胺鍵)和0-ΑΕΑ(大麻素；可能藥理學(xué)無關(guān)化合物；花生四烯酸和乙醇胺通過醇官能團(tuán)連接在一起得到酯鍵)具有相同分子量(相同大小)并且通過添加一個(gè)陽離子(相同電荷數(shù))來電離。圖16 展示使用 O-AEA相對(duì)于 N-AEA 的 ESI-MS-MS (SYNAPT G2，沃特斯公司(Waters Company))的漂移時(shí)間譜圖(無溶劑分離，離子遷移率數(shù)據(jù))。插圖譜圖是N-AEA和O-AEA的質(zhì)譜(MS輸出)，提供[M+H] +質(zhì)荷比(m/z)為348. 28的豐富離子。由于其分子量和電荷相同，因此這些離子無法以MS尺寸來區(qū)分(僅根據(jù)m/z分離)。圖17提供樣品制備和反射幾何條件(RG)MALDI的流程，其展示與組織材料的分析尤其有關(guān)的問題。將組織放在樣品固持器上并涂覆基質(zhì)。將激光引導(dǎo)到基質(zhì)和樣品上，從而引起組織分子的解吸和電離。圖17特別展示其不適宜用于未完全囊封組織樣品的基質(zhì)材料。RG MALDI是目前銷售的真空和大氣壓MALDI質(zhì)譜儀中僅用的源幾何條件。最左邊的圖像展示表面(通常是涂有金的載玻片、金屬板或可固持載玻片的金屬板)上的組織材料。為使轉(zhuǎn)移到氣相中的分子完整并附著電荷，對(duì)于較大分子尤為關(guān)鍵的是，必須使用輔助分析物的解吸和電離的基質(zhì)。上部中間的圖像顯示理想情況并且下部中間的圖像顯示當(dāng)使用基于溶劑的涂覆方法涂覆基質(zhì)時(shí)的實(shí)驗(yàn)事實(shí)；打亂和攪亂各種化合物在組織切片中的定位以使得其丟失其原始且天然的環(huán)境和位置。上部右邊的圖像展示在氣相下產(chǎn)生完整分子離子的RG MALDL· UV激光(通常為355nm[N2激光]、355nm[Nd:YAG激光])從‘正面’并以一定角度激發(fā)基質(zhì)(在橫向和深度尺寸上限制對(duì)燒蝕區(qū)域的控制)。通過施加電壓來使產(chǎn)生的離子從表面上升以使其加速離開并到達(dá)通常根據(jù)m/z分離分子的分析器中。圖19描繪TissueBox的一個(gè)圖的照片。展示用于組裝圖18中所描繪的TissueBox的已制造部分。左側(cè)圖像展示在底部固持篩網(wǎng)(通常是金屬或塑料，具有各種‘孔’尺寸，>44到Ιμπι)的上隔室。這一上隔室在組裝時(shí)用基質(zhì)和珠粒(通常是不銹鋼、玻璃、鉻且典型尺寸范圍為0.5_到5_)填充。右側(cè)圖像展示在底部固持載玻片(封埋有兩個(gè)組織切片)的下隔室，且當(dāng)與上隔室組裝時(shí)，所述隔室被設(shè)計(jì)和制造成使得組織與篩網(wǎng)之間存在足夠間距，從而使得在后續(xù)TissueLyzer應(yīng)用期間即使用力移動(dòng)珠粒其也不會(huì)接觸(可調(diào)整時(shí)間和頻率以得到所需基質(zhì)(例如2，5-DHB和CHCA)的最佳均勻覆蓋)。 圖20描繪顯示內(nèi)部的TissueBox的適配器組固持器。圖21描繪TissueLyzer裝置，其以所需時(shí)間和頻率同時(shí)震蕩兩個(gè)適配器組以使得球狀物通過球磨方法研磨基質(zhì)。如果如圖18中所示放置篩子，那么基質(zhì)會(huì)沉積于組織切片上。在無篩子的情況下，基質(zhì)/分析物無溶劑制備可如圖1-14中所示來進(jìn)行。圖29描繪在布魯克(Bruker) T0F/T0F儀器上使用2，5-DHB作為基質(zhì)進(jìn)行小鼠腦的無溶劑TissueBox制備。上部圖像展示組織成像和依質(zhì)量選擇斑點(diǎn)并且在下部圖像中展示質(zhì)譜，據(jù)此選擇質(zhì)量來獲得m/z 772. 5處信號(hào)的MS/MS斷裂。結(jié)果展示于圖30中，其為使用TissueBox制備方法進(jìn)行組織成像的一個(gè)實(shí)例。圖30展示來自小鼠腦組織的m/z 772. 5Da的無溶劑MALDI T0F/T0F。在86，058m/z、183，991m/z、551，288m/z、713, 371m/z和772，501m/z處可見峰。選擇組織斑點(diǎn)的斷裂的質(zhì)譜并從組織材料依質(zhì)量選擇離子m/z 772. 5 (參見圖29)。圖34描繪對(duì)于甚至更細(xì)粒徑使用雙篩網(wǎng)方法的組織盒圖。所述設(shè)計(jì)類似于圖18，即單篩網(wǎng)TissueBox，除了使用兩個(gè)篩網(wǎng)。雙篩網(wǎng)方法通常使用兩個(gè)不同尺寸的篩網(wǎng)；具有較小‘？L’孔隙的篩網(wǎng)位于可保留珠粒的具有較大孔隙的篩網(wǎng)下方。這種中間隔室使晶粒尺寸細(xì)化到甚至更小的粒子，從而覆蓋下方的表面(本文中說明的是封埋有組織切片的載玻片)。圖35描繪雙篩網(wǎng)TissueBox方法和具有組織的載玻片的圖。圖35展示用于組裝圖34中所描繪的雙篩網(wǎng)TissueBox的已制造部分。左邊展示具有兩種不同‘孔’尺寸的所安裝篩網(wǎng)(在這里20μπι的是組裝于上部且3μπι的是組裝于中間)。其次，右邊展示下隔室。最右邊展示載玻片(封埋有兩個(gè)組織切片)，其將會(huì)組裝于下隔室的下方?？捎秒p篩網(wǎng)方法消除預(yù)研磨。圖41描繪比較常規(guī)RG(上部)與TG(下部)的流程。對(duì)于較高動(dòng)量粒子來說，TG中的向前動(dòng)量消除了對(duì)在樣品板與質(zhì)譜儀的離子入口之間施加電壓的需要。圖42描繪用于在AP下產(chǎn)生離子的基質(zhì)涂覆和基于激光的源設(shè)計(jì)的示意圖。圖42⑷展示RG且圖42⑶展示TG。
圖48是兩種不同無溶劑樣品制備方法的圖。流程的上部部分展示無溶劑使用TissueBox方法將基質(zhì)涂覆于組織上，其通常將與RG MALDI 一起使用。下半部分展示首先使用TissueBox無溶劑方法用基質(zhì)涂布顯微鏡載玻片，接著涂覆于組織上。這種方法針對(duì)透射幾何條件具有優(yōu)點(diǎn)。在兩種情況下，激光能量都是被基質(zhì)而非組織吸收。圖49-52提供用于進(jìn)行無溶劑MALDI的設(shè)備的照片。圖49描繪使用LSI形成多電荷離子的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。展示已使用干液滴方法涂覆基質(zhì)/分析物的石英板的固持器。氮?dú)饧す馐呛谏凶硬⑶艺梦挥谄淝胺降氖琴惸w世爾科技公司(Thermo FisherScientific)離子最大源(Ion Max source)。圖50從正面描繪離子最大源的特寫圖，以最顯著位置展示固持于x、y、z臺(tái)上的聚焦透鏡。通過透鏡聚焦激光束以撞擊固持于接近質(zhì)譜儀離子入口小孔的石英板上的基質(zhì)/分析物樣品。激光束與離子入口毛細(xì)管(180度)串聯(lián)并撞擊固持于距離MS離子入口小孔O. 2mm到20mm處的樣品。圖51還展示石英玻璃上的孔和樣品。圖52展示通過僅以正向和反向移動(dòng)使石英板多次穿過激光束而形成穿過基質(zhì)的線(心形)。圖53-61展示使用LSI獲得的結(jié)果。圖53和54展示使用LSI獲得的關(guān)于鞘磷脂 的結(jié)果。圖55展示關(guān)于2，5-DHB中的磷脂酰甘油(一種脂質(zhì))的結(jié)果，其在LSI中再次展示單電荷離子，正如ESI中一樣。圖56展示使用LSI獲得的關(guān)于磷脂酰肌醇的結(jié)果。圖57展示使用LSI獲得的關(guān)于大麻素(anadamide)的結(jié)果。圖58展示使用LSI獲得的關(guān)于NAGly的結(jié)果。圖59展示使用LSI獲得的關(guān)于亮氨酸腦啡肽(leu_enkaphalin)的結(jié)果。圖60展示使用LSI獲得的關(guān)于緩激肽的結(jié)果。圖61展示使用LSI獲得的關(guān)于物質(zhì)P的結(jié)果O圖64-67展示使用LSI獲得的其它結(jié)果。圖64展示關(guān)于ACTH的結(jié)果，其電荷狀態(tài)為+2和+3。圖65-67展示關(guān)于淀粉樣蛋白(1-42)的結(jié)果，其電荷狀態(tài)分別為+4、+5和
+6 ο圖69提供用于在電壓下進(jìn)行無溶劑MALDI的設(shè)備的照片。圖70提供在電壓下使用AP穿過階段MALDI獲得的關(guān)于血管緊張素I的結(jié)果。與在缺少電壓的情況下可見電荷狀態(tài)+2和+3的圖62相比，電荷狀態(tài)為+1和+2。圖71-80提供本文所揭示的方法的益處的其它證據(jù)。如圖71B-C中所示，片段離子提供BSA的胰蛋白酶肽的必需序列信息。具體來說，圖71A-C描繪胰蛋白酶牛血清白蛋白(BSA)蛋白質(zhì)消化物的LSI-IMS-MS和MS/MS，其使用基于溶劑的樣品制備條件和2，5-DHAP基質(zhì)，150°C的錐孔溫度和所安裝的脫溶劑化裝置(未加熱)I) IMS-MS (圖71A)、IDTriWave切片的圖71 (B)阱和圖71 (C)轉(zhuǎn)移區(qū)域中的CID斷裂。左邊顯示質(zhì)譜且右邊顯示漂移時(shí)間分離相對(duì)于質(zhì)荷比(m/z)的2D圖。圖72A-B描繪總無溶劑分析的益處的實(shí)例。由肽和脂質(zhì)(50/50摩爾比)制備模型混合物并通過以下進(jìn)行分析1)使用LSI的總無溶劑分析；11)使用無溶劑樣品制備的IMS-MS ;僅II檢測(cè)出兩種組分。部分㈧描繪2D IMS-MS圖，且部分⑶描繪質(zhì)譜。圖73A-B描繪通過粗油樣品的無溶劑樣品制備、隨后LSI-MS-MS采集進(jìn)行的TSA。圖73(A)描繪質(zhì)譜且圖73(B)描繪在無溶劑條件下在加熱(超過200°C )下溶于2，5-DHB中的純粗油的漂移時(shí)間(td)相對(duì)于m/z的二維圖。圖74A-C描繪TSA質(zhì)譜和漂移時(shí)間(td)相對(duì)于m/z的二維圖圖74A展示在無溶劑條件下在30Hz持續(xù)5分鐘的研磨模式下制備的溶于2，5-DHAP中的粗油，添加其它基質(zhì)并在30Hz下重復(fù)研磨5分鐘；圖74B展示與圖74A相同制備的純植物油；且圖74C展示在30Hz持續(xù)5分鐘的研磨模式下溶于2，5-DHAP中的機(jī)油。對(duì)于圖74A-C，使用2 μ L分析物且在無溶劑條件下制備。向所有三種樣品施加熱且根據(jù)離子遷移率尺寸的形狀分離產(chǎn)生的離子。這一信息顯示不存在如傳統(tǒng)MALDI分析中常見的激光誘導(dǎo)的聚集體。這些LSI結(jié)果還指示與基質(zhì)有關(guān)的化學(xué)背景并不明顯。雖然純植物油和機(jī)油中存在很多低質(zhì)量種類，但與粗油樣品有關(guān)的復(fù)雜性可在2D圖中觀察到。此外，2D圖還指示適用于使用瞬象方法比較分析漂移時(shí)間相對(duì)于m/z的2D圖形顯示。圖75描繪使用2，5-DHB和使用400°C的經(jīng)加熱轉(zhuǎn)移毛細(xì)管在LTQ Velos儀器上進(jìn)行碳酸酐酶(平均分子量29029)蛋白質(zhì)的LSI。圖76描繪在LTQ-ETD Velos儀器上進(jìn)行LSI。在無停機(jī)時(shí)間(真空聯(lián)鎖)或交叉污染的情況下快速采集多個(gè)樣品。圖77A-B描繪OVA肽323-339的不同電荷狀態(tài)的LSI-CID質(zhì)譜。圖77 (A)m/z =887 ;圖 77 (B) m/z = 444，使用 DHB 基質(zhì)。 圖78A-F 描繪圖 78 (A，D)混合物 I 的 LSI-LTQ-MS 分析和圖 78 (B，E) GF (m/z =612.4)的CID譜圖的比較。圖78(C，F(xiàn))展示Ang I (m/z = 648. 9)，使用DHAP和DHB基質(zhì)。圖78 (D) DHB產(chǎn)生的電荷狀態(tài)高于DHAP (圖78A)。圖78 (B, C，E，F(xiàn))顯示對(duì)于兩種基質(zhì)觀察到通過CID斷裂獲得的類似序列信息。圖79A-B 描繪使用 OVA 肽 323-339 (m/z 444. 554)的 CID 的 LSI-MSn (η = 2 和 3)譜圖。圖79 (A)展示LSI-MS2，且圖79 (B)展示LSI-MS3，使用DHB。圖80Α-Β描繪含有血管緊張素I (Ang. I)、OVA肽323-339 (0VA)、β-淀粉樣蛋白10-20 (BA (10-20))、髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白139-151 (MPP)和生長(zhǎng)因子102-111 (GF)的混合物中Ang. I (m/z 433)的MS/MS譜圖。圖80 (A)展示LSI-CID，且圖80 (B)展示LSI-ETD,使用DHB基質(zhì)。圖81A-B描繪經(jīng)氧化的β -淀粉樣蛋白10-20 (BA)的MS/MS譜圖，m/z 488 (A)LSI-CID、(B)LSI-ETD，使用DHB。與LSI-CID相比，使用LSI-ETD觀察到改進(jìn)的序列覆蓋。圖82A-E說明LSI-MS分析的優(yōu)化和益處⑴利用精確和連續(xù)燒蝕，使用SYNAPTG2的XYZ臺(tái)(左欄)，即手動(dòng)成像實(shí)驗(yàn)設(shè)定進(jìn)行采集，(A)到(C);封埋有基質(zhì)/分析物樣品的載玻片(D)基于溶劑到(E)無溶劑樣品制備，使用2，5-DHAP和血管緊張素I。圖83A-B描繪基于溶劑沉積且在透射幾何條件LSI型設(shè)定下通過N2激光燒蝕的
2,5-DHB的顯微術(shù)；將第二顯微載玻片放在距離約2mm處而非質(zhì)譜儀入口孔以收集經(jīng)燒蝕的股流左邊(a)顯示母載片上的燒蝕區(qū)域且右邊(b)顯示收集的股流。實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示在激光燒蝕過程中形成“簇”或“液滴”。圖101A-C描繪通過電荷遠(yuǎn)程斷裂進(jìn)行脂肪酸分析。所述圖展示在SYNAPT HD質(zhì)譜儀上使用真空MALDI獲得的油酸的TSA。圖IOlA描繪質(zhì)譜，圖IOlB描繪二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z，且圖IOlC描繪針對(duì)兩種同重元素m/z 295. 123到295. 179和m/z295. 260到295. 322所選取的漂移時(shí)間。圖102描繪通過電荷遠(yuǎn)程斷裂進(jìn)行脂肪酸分析。圖101A-C的油酸MS/MS :部分(A)展示總MS且部分(B)展示觀察到三種遷移率。最低遷移率顯示電荷遠(yuǎn)程斷裂且因此提供如部分(C. 3)中所見的結(jié)構(gòu)信息(C-9雙鍵位置)。圖103描繪用于血管緊張素1(肽)的傳統(tǒng)電離方法的總結(jié)。左圖展示來自真空MALDI的結(jié)果并且右圖展示AP ESI。圖104描繪圖103中所示的用于血管緊張素I (肽)的傳統(tǒng)電離方法結(jié)合LSI (下部)的總結(jié)。LSI展示使用含有痕量肽的固體基質(zhì)(2，5_ 二羥基苯甲酸[2，5-DHB])的激光燒蝕的類似ESI的多電荷離子質(zhì)譜。圖105描繪LSI-MS示意圖和結(jié)果。上部部分展示LSI方法的示意圖，展示激光燒蝕產(chǎn)生多電荷簇或液滴，其進(jìn)入脫溶劑化區(qū)域以蒸發(fā)基質(zhì)，從而釋放多電荷離子。左下部分展示相對(duì)于似乎通過常規(guī)MALDI機(jī)制(APCI方法)產(chǎn)生的單電荷離子，多電荷離子增加脫溶劑化區(qū)域(右上所示)的溫度的反應(yīng)。右下部分展示收集于與含有基質(zhì)2，5-DHB的母顯微鏡載玻片保持3mm距離的顯微鏡載片上的經(jīng)激光燒蝕的液滴。條件類似于LSI激光燒蝕條件并顯示液滴通過在AP下進(jìn)行激光燒蝕而由固體基質(zhì)產(chǎn)生。圖106展示LSI儀器的照片。上部部分展示MS-MS SYNAPT G2。已去除雙噴針電噴霧離子源(Iockspray)的馬達(dá)以提供將激光(右上)直接與質(zhì)譜儀的孔對(duì)準(zhǔn)的能力。激光與孔之間的聚焦透鏡允許激光束直接聚焦于放在載玻片上且封埋于孔前I到3mm處的基 質(zhì)/分析物樣品上。右下部分展示源修改的內(nèi)部視圖。樣品面向熱裝置(白色)，激光從背面(這里是右側(cè))擊中；使用納米電噴霧源的xyz臺(tái)移動(dòng)(光柵)基質(zhì)/分析物樣品穿過聚焦的激光束。前面的電線可接通例如自耦變壓器裝置(Variac device)，也可以提供熱，這視所用的基質(zhì)而定。左下部分展示載有約3打LSI樣品的顯微載玻片。圖107A-B描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)時(shí)牛胰島素的LSI-MS-MS。圖107A描繪當(dāng)施加熱并使樣品移動(dòng)穿過聚焦的激光束時(shí)，總離子流提供有效離子產(chǎn)生的指示。采集約80秒后，關(guān)閉溫度，觀察到一大滴離子流。圖107B描繪來自總離子流的多次采集的質(zhì)譜。如電荷狀態(tài)+4的插圖譜圖所示，在高分辨率下展示使用ESI通常觀察到的豐富信號(hào)和電荷狀態(tài)。圖108描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)以及使用經(jīng)加熱的熱裝置(這里為約5V)時(shí)溶菌酶與泛素的較低豐度蛋白質(zhì)混合物的LSI-IMS-MS。由于這兩種蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)褶合而觀察到擁擠的總質(zhì)譜。圖109描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)以及使用經(jīng)加熱的熱裝置(這里為約5V)時(shí)，在與圖108類似的濃度下泛素的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。如關(guān)于ESI離子的情況，根據(jù)電荷數(shù)和橫截面(尺寸和形狀)分離LSI離子。圖110描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)以及使用經(jīng)加熱的熱裝置(這里為約5V)時(shí)，在與圖108類似的濃度下溶菌酶的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。如關(guān)于ESI離子的情況，根據(jù)電荷數(shù)和橫截面(尺寸和形狀)分離LSI離子。圖111描繪使用2，5-DHB作為基質(zhì)以及使用經(jīng)加熱的熱裝置(這里為約5V)時(shí)，在與圖108相同的濃度下泛素和溶菌酶的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。如關(guān)于ESI離子的情況，根據(jù)電荷數(shù)和橫截面(尺寸和形狀)分離兩種蛋白質(zhì)的LSI離子。數(shù)據(jù)的二維性和圖形顯示允許指定兩種蛋白質(zhì)和電荷狀態(tài)的各特點(diǎn)的身份。如圖112中關(guān)于溶菌酶所示，可清楚地選取各蛋白質(zhì)的質(zhì)譜。圖112A-B描繪泛素和溶菌酶的MS。圖112A描繪如圖108中所示的泛素和溶菌酶的總MS。圖112B描繪從圖111中所示的2維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z圖選取的溶菌酶的質(zhì)
-i'TfeP曰。
圖113描繪使用2，5-DHB在不施加熱的情況下粗油的LSI-MS-MS分析。圖114描繪使用2，5-DHB在施加熱的情況下粗油的LSI-MS-MS分析。當(dāng)認(rèn)為‘不對(duì)脫溶劑化裝置施加熱’時(shí)，其仍連接于150°C的離子源分離器。因此，金屬脫溶劑化裝置接近150°C。當(dāng)對(duì)脫溶劑化裝置施加熱時(shí)，其加熱到超過150°C。當(dāng)施加熱時(shí)，觀察到更豐富且更高分子量的離子。在氣相下分離離子。未觀察到由高激光功率引起的聚集，這在使用激光解吸/電離時(shí)通常觀察到或在使用ESI時(shí)觀察到較高濃度。這些復(fù)雜系統(tǒng)的圖形瞬象可具有足夠特殊性以進(jìn)行快速區(qū)分，只要使用相同樣品和采集方案即可。圖115A-D描繪使用2，5-DHAP和脫溶劑化裝置在不施加熱的情況下分子量遞增的蛋白質(zhì)的LSI-IMS-MS。圖115A展示關(guān)于牛胰島素的結(jié)果，圖115B展示關(guān)于泛素的結(jié)果，圖115C展示關(guān)于細(xì)胞色素C的結(jié)果，且圖IlOT展示關(guān)于溶菌酶的結(jié)果。圖116描繪用于分析異構(gòu)蛋白質(zhì)混合物的LSI-MS-MS，所述混合物由于m/z相同且如這里所示電荷狀態(tài)分布極其相似而不可能僅通過質(zhì)譜法來區(qū)分。β淀粉樣蛋白(1-42)的總質(zhì)譜展示于部分(A)中且淀粉樣蛋白(42-1)展示于部分(B)中。使用2，5_DHAP 作為基質(zhì)進(jìn)行分析并且不對(duì)脫溶劑化裝置施加熱。圖117描繪β淀粉樣蛋白(1-42)的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z展示根據(jù)電荷數(shù)和橫截面進(jìn)行分離。使用2，5-DHAP作為基質(zhì)進(jìn)行分析并且不對(duì)熱裝置施加熱。圖118描繪淀粉樣蛋白(42-1)的二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z。二維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z展示根據(jù)電荷數(shù)和橫截面進(jìn)行分離。使用2，5-DHAP作為基質(zhì)進(jìn)行分析并且不對(duì)熱裝置施加熱。本文所揭示的方法展示分析物/基質(zhì)簇的脫溶劑化可通過增加溫度(2，5-DBH,約4000C )和通過降低基質(zhì)的熱要求(2，5-DHB，約300°C )來實(shí)現(xiàn)。本文所揭示的方法還展示異構(gòu)蛋白質(zhì)混合物的電荷狀態(tài)家族是以MS尺寸來進(jìn)行基線分離。圖119-122描繪與通過ESI在SYNAPT G2上使用相同納米電噴霧電離源獲得的結(jié)果相比，基于通過LSI獲得的漂移時(shí)間結(jié)果的泛素結(jié)構(gòu)。圖119描繪用于使用泛素比較ESI-IMS-MS與LSI-MS-MS的條件。圖120描繪以2維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z圖顯示的泛素的LSI-MS-MS結(jié)果。圖121描繪以2維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z圖顯示的泛素的ESI-MS-MS結(jié)果。LSI和ESI的電荷狀態(tài)極相似，ESI離子的離子豐度較高。圖122描繪針對(duì)圖120和121的所有電荷狀態(tài)所選取的漂移時(shí)間分布。左邊顯示LSI離子且右邊顯示ESI離子。LSI和ESI離子顯示基本上相同的漂移時(shí)間。與電荷狀態(tài)無關(guān)，與各別ESI離子相比，LSI離子具有較窄漂移時(shí)間。此外，與ESI離子+12相比，具有電荷狀態(tài)+12的LSI離子顯示分辨率更高的漂移時(shí)間分布。因此，LSI提供大分子的軟電離并保留結(jié)構(gòu)信息。圖123-127描繪基于通過LSI獲得的漂移時(shí)間結(jié)果的泛素結(jié)構(gòu)。圖123描繪用于圖124-127中所示的結(jié)果的條件。LSI條件與圖199中的相同，然而，錐孔電壓從OV(傳統(tǒng)LSI條件)系統(tǒng)地變成100V (典型ESI值)。圖124描繪在遞增錐孔電壓下獲得的MS，顯示離子豐度增加和較低電荷狀態(tài)(電荷剝離)。選取針對(duì)電荷狀態(tài)+9、+7、+5的漂移時(shí)間分布。圖125描繪從圖124選取的針對(duì)電荷狀態(tài)+9的漂移時(shí)間。電荷狀態(tài)+9顯示窄的漂移時(shí)間分布。在100V錐孔電壓下，也觀察到較長(zhǎng)漂移時(shí)間(大致為80漂移時(shí)間箱(drifttime bin))，表示一些蛋白質(zhì)離子通過打開變成更長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)而損失其結(jié)構(gòu)。圖126描繪從圖124選取的針對(duì)電荷狀態(tài)+7的漂移時(shí)間。電荷狀態(tài)+7顯示多個(gè)漂移時(shí)間(大致< 95箱)，表示在OV錐孔電壓下的多種緊密結(jié)構(gòu)。在電壓遞增的情況下，這些漂移時(shí)間消失且僅觀察到一個(gè)豐富的漂移時(shí)間。圖127描繪從圖124選取的針對(duì)電荷狀態(tài)+5的漂移時(shí)間。電荷狀態(tài)+5顯示廣泛的漂移時(shí)間分布。在電壓遞增的情況下，分布的豐度變得更充分。這些結(jié)果顯示在OV錐孔電壓下，應(yīng)用在遞增電壓下?lián)p失的多種結(jié)構(gòu)。因此，LSI是保持泛素結(jié)構(gòu)完整性的軟電離方法。圖128描繪與蛋白質(zhì)(左圖)相比蛋白質(zhì)復(fù)合物(右圖)的LSI-MS-MS漂移時(shí)間分布。對(duì)于所有電荷狀態(tài)都觀察到較長(zhǎng)漂移時(shí)間，電荷狀態(tài)+7最顯著。這一觀察結(jié)果與蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的較大橫截面一致。本文所揭示的方法顯示使用相同納米ESI-MS-MS儀器，LSI與ESI對(duì)于所有電荷狀態(tài)都顯示類似漂移時(shí)間，其中LSI顯示較少構(gòu)象。本文所揭示的方法關(guān)于LSI和錐孔電 壓還顯示，電壓增加較低電荷狀態(tài)離子(電荷剝離)的豐度，電壓引入背景且在電壓遞增的情況下觀察到較少構(gòu)象。 圖129描繪牛胰島素的TSA。使用2，5-DHAP基質(zhì)/牛胰島素的TissueLyzer均質(zhì)化/轉(zhuǎn)移和脫溶劑化裝置在不施加熱的情況下進(jìn)行分析。形成多電荷離子并且在氣相下分離，如在2維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z圖中所觀察到的。圖130描繪血管緊張素I的TSA。使用不同基質(zhì)/血管緊張素I的TissueLyzer均質(zhì)化/轉(zhuǎn)移和脫溶劑化裝置在不施加熱的情況下進(jìn)行分析。形成多電荷離子并且在氣相下分離，如所選取的漂移時(shí)間分布中所示。展示漂移時(shí)間的上部展示在負(fù)離子模式下測(cè)量的2-氨基苯甲醇，展示漂移時(shí)間的中間部分展示在正離子模式下測(cè)量的2-氨基苯甲醇并且展示漂移時(shí)間的下部展示在正離子模式下測(cè)量的2，5-DHAP。結(jié)果顯示在負(fù)離子和正離子模式下TSA可使用各種不同基質(zhì)。與經(jīng)質(zhì)子化的離子相比，相同電荷狀態(tài)的負(fù)離子(雙電荷)具有較快漂移時(shí)間。由兩種不同基質(zhì)產(chǎn)生的雙正電荷離子具有基本上相同的漂移時(shí)間，表示基質(zhì)對(duì)離子的漂移時(shí)間(因此對(duì)結(jié)構(gòu))具有極小影響。應(yīng)注意，ABA的基于溶劑的樣品制備不允許產(chǎn)生雙負(fù)電荷離子；當(dāng)使用Nd/YAG激光(355nm)時(shí)，觀察到雙負(fù)電荷離子。圖131-132展示脂質(zhì)(鞘磷脂，SM)與肽(血管緊張素l，Ang. I)以I : I摩爾比存在的確定混合物的分析。圖131描繪脂質(zhì)(鞘磷脂，SM)與肽(血管緊張素l，Ang. I)以II摩爾比存在的確定混合物的基于溶劑的分析。圖132描繪脂質(zhì)(鞘磷脂，SM)與肽(血管緊張素l，Ang. I)以I : I摩爾比存在的確定混合物的TSA分析。圖131僅觀察到肽，而圖132觀察到混合物的兩種組分，即SM和Ang. I。這些結(jié)果顯示分析的定性和相對(duì)定量改進(jìn)。使用2，5-DHAP基質(zhì)/分析物混合物的TissueLyzer均質(zhì)化/轉(zhuǎn)移和脫溶劑化裝置在不施加熱的情況下進(jìn)行所述分析。形成多電荷離子并且在氣相下分離，如在2維漂移時(shí)間相對(duì)于m/z圖中所觀察到的。除非另有指示，否則說明書和權(quán)利要求書中所用的表示成分的數(shù)量、諸如分子量等性質(zhì)、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字在所有情況下都應(yīng)理解為由術(shù)語“約”修飾。因此，除非與此相反地指出，否則說明書和隨附權(quán)利要求書中所述的數(shù)值參數(shù)為近似值，其可視本發(fā)明設(shè)法獲得的所需性質(zhì)而變化。最低限度地且不試圖限制將同等原則應(yīng)用于權(quán)利要求書的范圍，各數(shù)值參數(shù)應(yīng)至少根據(jù)所報(bào)導(dǎo)的有效位的數(shù)字并藉由應(yīng)用一般舍入技術(shù)來理解。盡管闡述本發(fā)明的寬廣范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)為近似值，但特定實(shí)例中所述的數(shù)值應(yīng)盡可能精確地報(bào)導(dǎo)。然而，任何數(shù)值都固有地含有由其各別測(cè)試測(cè)量結(jié)果中所發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差必然產(chǎn)生的某些誤差。除非本文中另有指示或明顯同上下文矛盾，否則在描述本發(fā)明的情況下(尤其在以下權(quán)利要求書的情況下)所用的術(shù)語“一”、“所述”和類似指示物應(yīng)理解為涵蓋單數(shù)與復(fù)數(shù)。本文中對(duì)數(shù)值范圍的敘述僅打算用作個(gè)別地提及屬于所述范圍內(nèi)的各個(gè)值的簡(jiǎn)寫方法。除非本文中另有指示，否則各個(gè)值并入說明書中，就如同其個(gè)別地在本文中敘述一樣。除非本文中另有指示或者明顯同上下文矛盾，否則本文所述的所有方法都可以任何合適的次序進(jìn)行。本文所提供的任何和所有實(shí)例或示 范性語言(例如“諸如”)的使用僅打算較好地闡明本發(fā)明且不對(duì)另外主張的本發(fā)明的范圍施加限制。說明書中的措辭不應(yīng)理解為指示對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐為必需的任何未主張的要素。本文所揭示的本發(fā)明的替代性要素或?qū)嵤├娜航M不應(yīng)理解為具有限制。各群組成員可個(gè)別地或以與群組的其它成員或本文所見的其它要素的任何組合形式提及和主張。預(yù)期出于便利性和/或?qū)＠缘脑颍航M的一個(gè)或一個(gè)以上成員可包括在群組內(nèi)或從群組內(nèi)刪去。當(dāng)存在任何所述包括或刪去時(shí)，認(rèn)為說明書含有經(jīng)修改的群組，由此滿足隨附權(quán)利要求書中所用的所有庫西群組(Markush group)的書面描述。本文描述本發(fā)明的某些實(shí)施例，包括發(fā)明者已知用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳方式。當(dāng)然，這些所述實(shí)施例的變化對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀以上描述后將變得顯而易見。本發(fā)明者預(yù)期所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員視情況使用所述變化，并且本發(fā)明者打算以除本文具體所述外的方式實(shí)踐本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括如適用法律所允許的隨附權(quán)利要求書中所述的標(biāo)的物的所有修改和同等物。另外，除非本文中另有指示或者明顯同上下文矛盾，否則本發(fā)明涵蓋呈所有可能變化形式的上述要素的任何組合。本文所揭示的特定實(shí)施例可進(jìn)一步使用由……組成或和基本上由……組成的措辭在權(quán)利要求書中加以限制。當(dāng)用于權(quán)利要求書中時(shí)，無論如所申請(qǐng)或根據(jù)修正添加的，過渡術(shù)語“由……組成”不包括權(quán)利要求書中未規(guī)定的任何要素、步驟或成分。過渡術(shù)語“基本上由……組成”對(duì)指定物質(zhì)或步驟和不顯著影響基本和新穎特征的那些物質(zhì)限制權(quán)利要求的范圍。本文中自然地或明確地描述如此主張的本發(fā)明的實(shí)施例并進(jìn)行實(shí)施。最后，應(yīng)了解本文所揭示的本發(fā)明的實(shí)施例說明本發(fā)明的原理?？墒褂玫钠渌薷囊苍诒景l(fā)明的范圍內(nèi)。因此，舉例來說(但不限于)，可根據(jù)本文中的教示使用本發(fā)明的替代性配置。因此，本發(fā)明并不限于如圖明確所示和所述的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生多電荷離子以用于分析材料的方法,其包含 a.將所述材料和基質(zhì)涂覆于表面作為材料/基質(zhì)分析物； b.在大氣壓或接近大氣壓下用激光燒蝕所述材料/基質(zhì)分析物；和 c.使所述經(jīng)激光燒蝕的材料/基質(zhì)分析物穿過加熱區(qū)域,隨后所述材料/基質(zhì)分析物進(jìn)入質(zhì)譜儀的高度真空區(qū)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述基質(zhì)由在所述激光的波長(zhǎng)下吸收能量的小分子構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述小分子是選自由以下組成的群組二羥基苯甲酸、2，5_ 二羥基苯甲酸(2，5-DHB) ; 二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮(2，5-DHAP)、2，6-二羥基苯乙酮(2，6-DHAP)、2，4，6-三羥基苯乙酮(2，4，6-THAP)、a -氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、2-氨基苯甲醇(2-ABA)和其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述激光在紫外區(qū)中具有輸出。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述激光是氮?dú)饧す?337nm)或三倍頻Nd/YAG激光(355nm)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述加熱區(qū)域是加熱管。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述管由不會(huì)放出對(duì)所述質(zhì)譜儀真空系統(tǒng)有害的蒸氣的耐熱材料構(gòu)成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述管由金屬或石英構(gòu)成。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述管加熱到介于50°C到600°C之間的溫度。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述管加熱到介于150°C到450°C之間的溫度。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中由所述材料/基質(zhì)分析物的激光燒蝕點(diǎn)和通向所述質(zhì)譜儀的真空的離子入口界定的離子源區(qū)域中的電場(chǎng)小于800V。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述離子源區(qū)域中的所述電場(chǎng)小于100V。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述離子源區(qū)域中的所述電場(chǎng)是OV或小于0V。
14.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述材料是生物材料或非生物材料。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述材料是選自由蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物和脂質(zhì)組成的群組的生物材料。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述材料是選自由聚合物和油組成的群組的非生物材料。
17.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其進(jìn)一步包含使用無溶劑材料/基質(zhì)分析物制備方法分析所述材料/基質(zhì)分析物。
18.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分析包括表面成像和/或電荷遠(yuǎn)程斷裂以用于結(jié)構(gòu)表征。
19.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中使用質(zhì)譜儀用于分析所述材料/基質(zhì)分析物。
20.一種用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法的系統(tǒng)。
全文摘要
本文揭示用于使用激光噴霧電離(laserspray ionization，LSI)的質(zhì)譜法的系統(tǒng)和方法。LSI可在大氣壓下產(chǎn)生多電荷離子以用于分析并且允許分析高分子量分子，包括超過4000道爾頓(Dalton)的分子。所述分析可以是基于溶劑或無溶劑分析。在LSI之后進(jìn)行無溶劑分析允許改進(jìn)的空間分辨率，其有利于表面和/或組織成像。
文檔編號(hào)H01J27/24GK102741965SQ201080024695
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者薩拉·特林平 申請(qǐng)人:韋恩州立大學(xué)