專利名稱：神經(jīng)突增生做為增強(qiáng)記憶化合物的測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用神經(jīng)突增生(neurite outgrowth)測(cè)定作為增強(qiáng)和改善記憶功能 化合物的篩選法。
背景技術(shù)：
日益增長(zhǎng)的證據(jù)表明成年的大腦中神經(jīng)元仍繼續(xù)增生(Arsenijevic，Y.等，Exp. Neurol. ，170 48-62 (2001) ；Vescovi, A. L ^,Biomed. Pharmacother. ,55 201-205 (2001)； Cameron, H. Α.和 McKay, R. D.，J. Comp. Neurol, 435 406-417 (2001)；以及 Geuna, S 等， Anat. Rec.，265 132-141 (2001))。目前進(jìn)行中的實(shí)驗(yàn)策略是將神經(jīng)元干細(xì)胞移植到成年大 腦中用于多種治療適應(yīng)征(Kurimoto，Y 等，Neurosci. Lett.，306 57-60(2001) ；Singh, G.， Neuropathology, 21 110—114 (2001)禾口 Cameron，H. Α.禾口 McKay，R. D.，Nat. Neurosci.，2 894-897(1999))。對(duì)于發(fā)育胚胎期的神經(jīng)發(fā)生已經(jīng)了解了很多(Saitoe, M.和Tully，T。， "Making Connection between synaptic and behavioralplasticity in Drosophila", In Toward a Theory of Neuroplasticity, J McEachemand C. Shaw, Eds(New York Psychology Press), pp. 193-220 (2000))。神經(jīng)元分化，神經(jīng)軸延伸和初始突觸靶標(biāo)識(shí)別， 看起來(lái)均以活性非依賴性的形式發(fā)生。無(wú)論在成年人還是在年輕人中，起改善學(xué)習(xí)和記憶作用的化合物會(huì)在市場(chǎng)中得到 迅速的接受和使用。本申請(qǐng)?zhí)剿髁嗽鰪?qiáng)神經(jīng)突增生及其對(duì)記憶的作用的化合物的交集。發(fā)明概述長(zhǎng)期記憶可以用刺激CREB途徑活性和增強(qiáng)神經(jīng)突增生的化合物來(lái)進(jìn)行增強(qiáng)。本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及鑒定增強(qiáng)記憶的化合物的方法，包含從文庫(kù)中選擇誘導(dǎo)神經(jīng)突 增生并且也增強(qiáng)CREB途徑功能的候選化合物，其中既促進(jìn)神經(jīng)突增生又增強(qiáng)CREB途徑功 能的化合物被鑒定為增強(qiáng)記憶的化合物。選擇誘導(dǎo)神經(jīng)突增生的候選化合物的步驟包括， 向神經(jīng)突宿主細(xì)胞提供候選化合物或?qū)φ栈衔?；測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)候選化合物和對(duì)照化合 物的反應(yīng)；以及觀察候選化合物和對(duì)照化合物之間的細(xì)胞生長(zhǎng)差異；其中導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)中 的陽(yáng)性變化的候選化合物被鑒定為增強(qiáng)神經(jīng)突增生的化合物。該方法中使用的神經(jīng)突宿主 細(xì)胞可以是Neuroscreen 1細(xì)胞，小鼠海馬神經(jīng)元，或成神經(jīng)細(xì)胞瘤Neuro2a細(xì)胞。該宿主 細(xì)胞可以進(jìn)一步包含CREB報(bào)道構(gòu)建物，并且候選化合物也上調(diào)CREB報(bào)道構(gòu)建物。在實(shí)施方案的一個(gè)方面，選擇增強(qiáng)CREB途徑功能的候選化合物的步驟包含使包 含可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的宿主細(xì)胞與候選化合物進(jìn)行接觸，從而產(chǎn)生測(cè) 試樣品；使該測(cè)試樣品與亞適量的CREB功能刺激劑接觸；確定已經(jīng)與所述測(cè)試化合物和所
4述CREB功能刺激劑接觸的所述宿主細(xì)胞內(nèi)的指示物活性；將該指示物活性和對(duì)照細(xì)胞內(nèi) 的指示物活性進(jìn)行比較，所述對(duì)照細(xì)胞已經(jīng)接觸了所述CREB功能刺激劑而未接觸所述測(cè) 試化合物；如果1)相對(duì)于接觸了所述CREB功能刺激劑而未接觸所述測(cè)試化合物的所述對(duì) 照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性，步驟c)中所確定的指示物活性升高；以及2)相對(duì)于未接觸所述 CREB功能刺激劑和未接觸所述測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞中的指示物活性，未接觸所述CREB 功能刺激劑而接觸了所述測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性沒(méi)有顯著不同，則選擇所 述測(cè)試化合物。在實(shí)施方案的另一個(gè)方面，進(jìn)一步包含使用步驟e)中所選擇的所述測(cè)試化合物 一個(gè)范圍的不同濃度來(lái)重復(fù)步驟a)到e)的步驟；如果1)相對(duì)于已經(jīng)接觸了所述CREB功 能刺激劑而未接觸所述測(cè)試化合物的所述對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性，在該范圍的不同濃度 的所述測(cè)試化合物中的指示物活性升高；和2)相對(duì)于未接觸所述CREB途徑功能刺激劑和 未接觸所述測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性，未接觸所述CREB功能刺激劑而被引 入了所述范圍的不同濃度的所述測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性沒(méi)有顯著不同，則 選擇所述測(cè)試化合物，從而選出候選化合物；使神經(jīng)來(lái)源的細(xì)胞與步驟g)中所選擇的所述 候選化合物以及與亞適量的CREB功能刺激劑進(jìn)行接觸；在接觸了所述候選化合物和所述 CREB功能刺激劑的細(xì)胞內(nèi)對(duì)內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)進(jìn)行評(píng)估；將步驟i)中所評(píng)估的內(nèi) 源CREB依賴性基因表達(dá)與已經(jīng)接觸了所述CREB功能刺激劑而未接觸所述候選化合物的對(duì) 照細(xì)胞中的內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比；如果相對(duì)于已經(jīng)接觸了所述CREB功能 刺激劑而未接觸所述候選化合物的對(duì)照細(xì)胞中的內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)，步驟i)中所 評(píng)估的內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)升高；以及2)相對(duì)于未接觸所述CREB功能刺激劑和未接 觸所述候選化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的CREB依賴性基因表達(dá)，未接觸所述CREB功能刺激劑而 接觸了所述候選化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)沒(méi)有顯著不同，則選擇 所述候選化合物，從而選出經(jīng)確認(rèn)的候選化合物；1)將步驟k)中所選出的所述經(jīng)確認(rèn)的候 選化合物施用于動(dòng)物；在適合于在所述動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生長(zhǎng)期記憶形成的條件下，對(duì)被施用了所 述經(jīng)確認(rèn)的候選化合物的所述動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練；對(duì)步驟m)中訓(xùn)練的所述動(dòng)物體內(nèi)的長(zhǎng)期記 憶形成進(jìn)行評(píng)估；以及將步驟η)中評(píng)估的長(zhǎng)期記憶形成與未施用所述經(jīng)確認(rèn)的候選化合 物的對(duì)照動(dòng)物內(nèi)所產(chǎn)生的長(zhǎng)期記憶形成進(jìn)行對(duì)比。在另一個(gè)方面，宿主細(xì)胞是人成神經(jīng)細(xì) 胞瘤細(xì)胞而所述神經(jīng)來(lái)源的細(xì)胞是神經(jīng)元。神經(jīng)元也可以是原代海馬細(xì)胞。指示基因可以 編碼熒光素酶。在另一個(gè)方面，CREB功能刺激劑是毛喉素，以步驟e)中選擇的所述測(cè)試化 合物的一個(gè)范圍的四種不同濃度來(lái)重復(fù)步驟a)到e)，或動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。


圖IA-C顯示了條柱圖，其表明了以相對(duì)光單位(RLU)測(cè)定的CREB過(guò)表達(dá)以及咯 利普蘭對(duì)CRE-熒光素酶報(bào)道基因的作用。圖2A-B顯示了條柱圖，其表明了 CREB的增強(qiáng)減少了獲得最大長(zhǎng)期記憶所要求的訓(xùn)練。圖3A-C顯示了條柱圖，表明CREB增強(qiáng)劑對(duì)神經(jīng)突長(zhǎng)度的影響。圖4A-B顯示了 HT-2175和新CREB增強(qiáng)劑對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突的增生以及 對(duì)海馬記憶的作用。
圖5A-C顯示了條柱圖，表明Gprl2 siRNA對(duì)神經(jīng)突增生和記憶的作用。圖6A-D顯示了線圖和條柱圖，表明GalR3受體拮抗劑HT-2157對(duì)神經(jīng)突增生和情 景記憶(contextual memory)的作用。圖7A-B顯示了條柱圖，表示出GABA-受體(HT-1974)和單胺氧化酶B (HT-1060) 抑制劑對(duì)NSl細(xì)胞中神經(jīng)突增生的作用發(fā)明詳述本發(fā)明涉及基于細(xì)胞的篩選測(cè)定法，其用于鑒定在正常和記憶受損個(gè)體中增強(qiáng)記 憶的化合物。分子研究已經(jīng)開(kāi)始解釋生化記憶。記憶通?？梢苑譃殚L(zhǎng)期記憶(LTM)或鞏固 記憶(consolidated memory)和短期記憶(STM)或工作記憶。該兩種類型記憶間的一個(gè)顯 著表型差異是LTM涉及新蛋白的合成。因而，長(zhǎng)期記憶的產(chǎn)生涉及與STM中所利用的那些 不同的生化途徑。本發(fā)明使用多步驟的篩選方法快速鑒定具有針對(duì)LTM獲取中所涉及的生化途徑 的活性的化合物。通過(guò)這些篩選方法所鑒定的化合物能夠增強(qiáng)正常個(gè)體、記憶受損個(gè)體或 兩者的記憶。本文描述的方法利用了在增強(qiáng)的記憶、環(huán)腺苷酸(cAMP)應(yīng)答元件結(jié)合(CREB)系 統(tǒng)以及神經(jīng)突增生之間所觀察到的相互關(guān)聯(lián)。激活CREB途徑和誘導(dǎo)神經(jīng)突增生的化合物 被設(shè)想具有增強(qiáng)記憶，尤其是LTM的效用。CREB涂徑測(cè)定所述篩選方法的一個(gè)步驟涉及使用環(huán)腺苷酸(CAMP)應(yīng)答元件結(jié)合(CREB)篩選系 統(tǒng)。任何能夠監(jiān)測(cè)或報(bào)告CREB途徑活性升高的系統(tǒng)都可以用于所公開(kāi)的方法。示例性的 系統(tǒng)在U. S.專利申請(qǐng)No. 10/527，950名稱為“認(rèn)知增強(qiáng)劑篩選方法”的申請(qǐng)中有描述，通 過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。在該方法中，將包含可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的宿主細(xì)胞與測(cè)試化 合物進(jìn)行接觸，從而產(chǎn)生測(cè)試樣品。該測(cè)試樣品接著與亞適量的CREB功能刺激劑進(jìn)行接 觸，并通過(guò)將宿主細(xì)胞中的指示物活性與對(duì)照細(xì)胞中的指示物活性進(jìn)行比較來(lái)確定宿主細(xì) 胞中指示物的活性。本文所述的方法可以用于鑒定或篩選增強(qiáng)CREB途徑和促進(jìn)神經(jīng)突增生的化合 物，其在本文中被稱作記憶增強(qiáng)劑。所述的方法提供了基于細(xì)胞的高通量方法(測(cè)定法)， 以用于鑒定或篩選通過(guò)提高CREB途徑功能而起作用的記憶增強(qiáng)劑。記憶增強(qiáng)劑可以通過(guò)各種機(jī)制提高、增強(qiáng)或改善CREB途徑功能。例如，記憶增強(qiáng) 劑可以影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其引起CREB-依賴性基因表達(dá)的誘導(dǎo)。CREB-依賴性基因表達(dá) 的誘導(dǎo)可以通過(guò)例如上調(diào)CREB功能的正效應(yīng)物和/或下調(diào)CREB功能的負(fù)效應(yīng)物而實(shí)現(xiàn)。 CREB功能的正效應(yīng)物包括腺苷酸環(huán)化酶和CREB激活劑。CREB功能的負(fù)效應(yīng)物包括cAMP 磷酸二酯酶(cAMP PDE)和CREB阻抑物。記憶增強(qiáng)劑可以通過(guò)直接作用于CREB蛋白的激活劑或阻抑物形式和/或包含 CREB蛋白的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，或者生化作用于上述的上游，來(lái)提高、增強(qiáng)或改善CREB途徑功能。 例如，CREB途徑功能可以通過(guò)以下方式而受到影響通過(guò)轉(zhuǎn)錄提高，轉(zhuǎn)錄后提高或既轉(zhuǎn)錄 提高又轉(zhuǎn)錄后提高CREB蛋白水平；通過(guò)改變CREB蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其它必要組分如 CREB-結(jié)合蛋白(CBP蛋白)的親和力；通過(guò)改變包含CREB蛋白的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體對(duì)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)DNA CREB應(yīng)答元件的親和力，或通過(guò)誘導(dǎo)針對(duì)CREB蛋白同種型的被動(dòng)或主動(dòng)免疫。記憶增 強(qiáng)劑提高、增強(qiáng)或改善CREB途徑功能的特定機(jī)制對(duì)于實(shí)施本公開(kāi)的方法并不是決定性的?！疤岣逤REB途徑功能”或“增強(qiáng)CREB途徑功能”意思是提高、增強(qiáng)或改善CREB-依 賴性基因表達(dá)的能力?！罢{(diào)節(jié)CREB途徑功能”意思是調(diào)節(jié)CREB-依賴性基因表達(dá)的能 力。CREB-依賴性基因表達(dá)可以通過(guò)提高內(nèi)源CREB產(chǎn)量而提高、增強(qiáng)或改善，例如通 過(guò)直接或間接刺激內(nèi)源基因而產(chǎn)生升高的量的CREB，或者通過(guò)提高功能性的(生物活 性的)CREB。參見(jiàn)，例如，U. S. Pat. No. 5，929，223 ；U. S. Pat. No. 6，051559 ；和國(guó)際公開(kāi) No.W096/11270(1996年4月18號(hào)公開(kāi))，通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文?！疤岣吖δ苄?的(生物活性的)CREB”意思是包括提高DNA結(jié)合能力、磷酸化狀態(tài)、蛋白穩(wěn)定性，亞細(xì)胞定 位等的能力。CREB-依賴性基因表達(dá)可以通過(guò)提高或降低內(nèi)源CREB的產(chǎn)生來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，例 如通過(guò)直接或間接刺激內(nèi)源基因以產(chǎn)生升高的或降低的量的CREB，或通過(guò)提高或降低功能 性的(生物活性的)CREB。在用于鑒定或篩選記憶增強(qiáng)劑的優(yōu)選方法中包含基于細(xì)胞的方法，其用于鑒定作 為記憶增強(qiáng)劑的候選化合物。此種篩選的一個(gè)實(shí)例包含(a)使包含可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的 宿主細(xì)胞，與測(cè)試化合物以及與亞適量的刺激劑進(jìn)行接觸，所述刺激劑將信號(hào)途徑活化至 CREB上；(b)對(duì)接觸了所述測(cè)試化合物和刺激劑的宿主細(xì)胞中的指示物活性進(jìn)行確定；(c) 將步驟(b)中確定的指示物活性與接觸了刺激劑而未接觸測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞(只接觸 了刺激劑的對(duì)照細(xì)胞)內(nèi)的指示物活性進(jìn)行比較；(d)如果(1)相對(duì)于步驟(c)中對(duì)照細(xì) 胞內(nèi)的指示物活性，步驟(b)中確定的指示物活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著升高；和(2)相對(duì)于既未 接觸刺激劑也未接觸測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞(未接觸任何試劑的對(duì)照細(xì)胞)內(nèi)的指示物活 性，未接觸刺激劑而接觸了測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞(只接觸測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞)內(nèi)的 指示物活性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，則選擇該測(cè)試化合物；(e)用步驟(d)中選擇的測(cè)試 化合物以一個(gè)范圍的不同濃度重復(fù)步驟(a)到(d)；以及(f)如果(1)相對(duì)于只接觸刺激 劑的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性，所述測(cè)試化合物的該范圍的不同濃度中的指示物活性成比 例地在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著升高；和(2)相對(duì)于既未接觸刺激劑也未接觸測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞 內(nèi)的指示物活性，只引入一個(gè)范圍的不同濃度的測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性沒(méi) 有顯著差異，則選擇該測(cè)試化合物，其中該測(cè)試化合物被鑒定為候選化合物。在特定的實(shí)施 方案中，如果(1)在測(cè)試化合物不同濃度的線性范圍內(nèi)，指示物活性成比例地顯著升高；和 (2)相對(duì)于既未接觸刺激劑也未接觸測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性，只引入所述 范圍的不同濃度測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性沒(méi)有顯著不同，則在步驟(f)中選 擇該測(cè)試化合物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在接觸刺激劑之前與測(cè)試化合物接觸。在一個(gè)可作替代的實(shí)施方案中，篩選包括(a)使宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物以及與 亞適量的刺激劑接觸，所述刺激劑將信號(hào)途徑活化至CREB上；(b)評(píng)估已經(jīng)接觸了測(cè)試化 合物和刺激劑的宿主細(xì)胞中內(nèi)源的CREB-依賴性基因表達(dá)；(c)將步驟(b)中評(píng)估的內(nèi)源 CREB-依賴性基因表達(dá)與接觸了刺激劑而未接觸測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞(只接觸了刺激劑 的對(duì)照細(xì)胞)中的內(nèi)源CREB-依賴性基因表達(dá)進(jìn)行比較；(d)如果(1)相對(duì)于步驟(c)中 的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源CREB-依賴性基因表達(dá)，步驟(b)中確定的內(nèi)源CREB-依賴性基因表 達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地升高；和(2)相對(duì)于既未接觸刺激劑也未接觸測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞(未接觸任何試劑的對(duì)照細(xì)胞)內(nèi)的CREB-依賴性基因表達(dá)，未接觸刺激劑而接觸了測(cè)試 化合物的對(duì)照細(xì)胞(只接觸了測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞)內(nèi)的CREB-依賴性基因表達(dá)沒(méi)有統(tǒng) 計(jì)學(xué)上的顯著差異，則選擇該測(cè)試化合物；(e)用步驟(d)中選擇的測(cè)試化合物以一個(gè)范圍 的不同濃度重復(fù)步驟(a)到(d)；以及(f)如果⑴相對(duì)于只接觸了刺激劑的對(duì)照細(xì)胞內(nèi) 的CREB-依賴性基因表達(dá)，一個(gè)范圍的不同濃度的所述測(cè)試化合物的CREB-依賴性基因表 達(dá)成比例地在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著升高；和(2)相對(duì)于既未接觸刺激劑也未接觸測(cè)試化合物的對(duì) 照細(xì)胞內(nèi)的CREB-依賴性基因表達(dá)，只引入了所述范圍的不同濃度的測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì) 胞內(nèi)的CREB-依賴性基因表達(dá)沒(méi)有顯著地差異，則選擇該測(cè)試化合物，其中該測(cè)試化合物 被鑒定為候選化合物。在特定的實(shí)施方案中，如果(I)CREB-依賴性基因表達(dá)在測(cè)試化合物 不同濃度的線性范圍成比例地顯著升高；和(2)相對(duì)于既未接觸刺激劑也未接觸測(cè)試化合 物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的CREB-依賴性基因表達(dá)，只引入所述范圍的不同濃度的測(cè)試化合物的對(duì) 照細(xì)胞內(nèi)的CREB-依賴性基因表達(dá)沒(méi)有顯著差異，則在步驟(f)中選擇該測(cè)試化合物。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在接觸刺激劑之前與測(cè)試化合物接觸。優(yōu)選地，在初級(jí)篩選中使用的“將信號(hào)途徑活化至CREB上的刺激劑”是CREB功能 刺激劑。CREB功能刺激劑是能夠刺激CREB途徑功能的試劑?！按碳REB途徑功能”意思 是通過(guò)刺激內(nèi)源CREB的產(chǎn)生而對(duì)CREB-依賴性基因表達(dá)進(jìn)行刺激的能力，例如通過(guò)直接或 間接刺激內(nèi)源基因產(chǎn)生升高的量的CREB，或通過(guò)提高功能性的(生物活性的)CREB。參見(jiàn)， 例如，U. S. Pat. NO. 5，929，223 ；U. S. Pat. No. 6，051559 ；和國(guó)際公開(kāi) No. W096/11270 (1996 年4月18日公開(kāi))，通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文?！癈REB功能刺激劑”包括藥物，化合 物，離子化合物，有機(jī)化合物，有機(jī)配體，包括輔因子，糖類，重組和合成肽，蛋白，擬肽，核酸 序列，包括基因，核酸產(chǎn)物，和其它分子以及組合物。CREB功能刺激劑可以是腺甘酸環(huán)化酶 1 (ACl)的激活劑(例如，毛喉素)；細(xì)胞透膜體cAWP類似物(例如，8-溴cAW)；影響G-蛋 白偶聯(lián)受體的試劑(神經(jīng)遞質(zhì))，例如但不限于腎上腺素能受體和阿片樣物質(zhì)受體及其配 體(例如，異丙腎上腺素，苯乙胺類)；細(xì)胞內(nèi)鈣濃度調(diào)節(jié)劑(例如，氯化鉀，毒胡蘿卜內(nèi)酯， N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體激動(dòng)劑)；負(fù)責(zé)cAMP分解的磷酸二酯酶的抑制劑(拮抗 劑)(例如，咯利普蘭(其抑制磷酸二酯酶4)，異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)(其抑制磷酸二酯 酶1和2)。蛋白激酶和蛋白磷酸酶的調(diào)節(jié)劑(激動(dòng)劑)，其介導(dǎo)CREB蛋白活化和CREB-依 賴性基因表達(dá)。CREB功能刺激劑也可以是能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中增強(qiáng)CREB功能的 化合物。這樣的化合物包括但不限于，影響膜穩(wěn)定性和流動(dòng)性以及特異的免疫刺激的化合 物?；罨罜REB上的信號(hào)途徑包括促細(xì)胞分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)途徑和蛋 白激酶A (PKA)。因而，將信號(hào)途徑活化至CREB上的刺激劑包括MAPK/Erk激酶(MEK)的抑 制劑。其它將信號(hào)途徑活化至CREB上的刺激劑是已知的，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易 獲得的。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，CREB途徑篩選可以由使用果蠅的篩選方法代替，其中所 述的篩選方法包括(a)將測(cè)試化合物施用于具有可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因 的果蠅；(b)評(píng)估已經(jīng)被施用了測(cè)試化合物的果蠅體內(nèi)的指示物活性；以及(C)將步驟(b) 中評(píng)估的指示物活性和沒(méi)有被施用測(cè)試化合物的對(duì)照果蠅體內(nèi)的指示物活性進(jìn)行對(duì)比。相 比于未被施用測(cè)試化合物的對(duì)照果蠅體內(nèi)的指示物活性，步驟(b)中的指示物活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異，則將該測(cè)試化合物鑒定為候選化合物。包含可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的宿主細(xì)胞，可以通過(guò)將包含可操 縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的DNA構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞而進(jìn)行制備。DNA構(gòu)建物可以 依照本領(lǐng)域已知的方法導(dǎo)入細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)化，直接攝取，磷酸鈣沉淀，電穿孔，粒子轟擊 法，使用脂質(zhì)體)。這些方法在,例如，Sambrook等的Molecular Cloning =A Laboratory Manual,第 2 版(NewYork :Cold Spring Harbor University Press) (1989)禾口 Ausubel 等 的 CurrentProtocols in Molecular Biology (New York : John Wiley&Sons) (1998)中有更 詳細(xì)的描述。如本文中所用的細(xì)胞指的是動(dòng)物細(xì)胞。該細(xì)胞可以是干細(xì)胞或體細(xì)胞。合適的動(dòng) 物細(xì)胞是，例如，哺乳動(dòng)物來(lái)源的。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子包括人(例如HeLa細(xì)胞)，牛，羊， 豬，嚙齒動(dòng)物(例如大鼠，鼠(例如胚胎干細(xì)胞)，兔等)和猴(例如COSl細(xì)胞)細(xì)胞。優(yōu)選 的，所述細(xì)胞是神經(jīng)來(lái)源的(例如成神經(jīng)細(xì)胞瘤，神經(jīng)元，神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等)。 所述細(xì)胞也可以是胚胎細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞或其它祖細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞是體細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞可以 是，例如，上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，血細(xì)胞(包括造血細(xì)胞，紅細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì) 胞等)，腫瘤細(xì)胞，心肌細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或星形 膠質(zhì)細(xì)胞)或經(jīng)病原體感染的細(xì)胞(例如，感染了細(xì)菌，病毒，擬病毒，寄生蟲(chóng)或朊病毒的那 些)。所述細(xì)胞可以由商業(yè)獲得或來(lái)自保藏機(jī)構(gòu)或直接從動(dòng)物獲得，例如活檢。包含可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的果蠅可以如Belvin等在Neuron， 22(4) 777-787(1999)中描述的那樣產(chǎn)生。包含可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的DNA構(gòu)建物可以如，例如，Ausubel 等在 Current Protocols in Molecular Biology (New York : JohnWiley&Sons) (1998)禾口 Sambrook 等的 Molecular Cloning :A LaboratoryManual,第 2 版(New York : Co Id Spring Harbor University Press)中描述的那樣制備。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指的是通常在結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)上游(5’ )的DNA 序列，其通過(guò)為RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄起始可能需要的其它因子提供識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)來(lái)控制編 碼區(qū)的表達(dá)。CRE啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“指示基因”，指的是其產(chǎn)物易于測(cè)定的核酸序列，例如，通 過(guò)比色法作為酶反應(yīng)的產(chǎn)物如編碼熒光素酶的基因。廣泛使用的指示基因的其它例子包 括編碼酶的那些，例如β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酸酶和β-葡糖苷酶；發(fā)光分子，例如 綠色熒光蛋白和螢火蟲(chóng)熒光素酶；以及營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記，例如，His3p和Ura3p。參見(jiàn)，例如， Ausubel 等，CurrentProtocols in Molecular Biology(New York :John Wiley&Sons),第 九章(1998)。接觸測(cè)試化合物和/或CREB功能刺激劑的細(xì)胞(例如，宿主細(xì)胞，神經(jīng)來(lái)源的細(xì) 胞，等)將攝取所述測(cè)試化合物和/或CREB功能刺激劑。"CREB功能刺激劑的亞適量”的意思是將CREB途徑功能刺激(誘導(dǎo))到內(nèi)源(基 態(tài))水平以上所需的CREB功能刺激劑的量或劑量，從而可以測(cè)定由記憶增強(qiáng)劑誘導(dǎo)的CREB 途徑功能進(jìn)一步在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著升高，并且該測(cè)定并不歸因于天然細(xì)胞波動(dòng)或作為天然 細(xì)胞波動(dòng)結(jié)果的變異。CREB功能刺激劑的亞適量是這樣的劑量或濃度，其中效應(yīng)量(指示 物活性，CREB-依賴性基因表達(dá))與該劑量或濃度成比例，并且當(dāng)該劑量或濃度變化時(shí)，效應(yīng)量不變。CREB功能刺激劑的亞適量憑經(jīng)驗(yàn)確定并根據(jù)多種因素發(fā)生變化，包括特定CREB 功能刺激劑的藥物動(dòng)力學(xué)特征以及所要接觸的特定細(xì)胞。例如，確定CREB功能刺激劑的亞 適量可以通過(guò)(a)使包含可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的宿主細(xì)胞的不同樣品與 不同濃度的CREB功能刺激劑進(jìn)行接觸；以及(b)通過(guò)評(píng)估宿主細(xì)胞樣品中的指示物活性來(lái) 確定影響指示物活性從基態(tài)到最大反應(yīng)所需的CREB功能刺激劑的濃度范圍。CREB功能刺 激劑的亞適量可以是產(chǎn)生(1)指示物最大活性的50%或更少和(2)天然細(xì)胞波動(dòng)以上的 指示物活性的任何濃度。對(duì)CREB功能刺激劑的亞適量的確定是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力 范圍內(nèi)的?！皩⑿盘?hào)途徑活化至CREB上的刺激劑亞適量”意思是刺激(誘導(dǎo))信號(hào)途徑至 CREB上所需的刺激劑的量或劑量?！皽y(cè)試化合物的不同濃度的范圍”意思是測(cè)試化合物的2個(gè)或更多(S卩，2、3、4、 5等)不同濃度。選擇的濃度范圍通常在初步篩選步驟(a)中的測(cè)試化合物濃度的兩側(cè)。 “(不同)濃度的線性范圍”意思是這樣的濃度，其中在效應(yīng)不再隨濃度變化而變化之前，其 效應(yīng)(指示物活性，CREB-依賴的基因表達(dá))隨濃度而升高。選擇濃度范圍在本領(lǐng)域技術(shù) 人員的能力范圍內(nèi)?！肮δ苄缘?生物活性的)CREB”意思是包括蛋白的DNA結(jié)合能力、磷酸化狀態(tài)、蛋 白穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位等。“CREB-依賴性基因表達(dá)”在本文中也指“CRE-介導(dǎo)的基因表達(dá)”。CREB-依賴 性基因表達(dá)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法(例如，RNA印跡，蛋白質(zhì)印跡)來(lái)確定。這樣的 方法在，例如，Ausubel 等，Current Protocols InMolecular Biology (New York :John Wiley&Sons)(1998)禾口 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,% 2 版 (New York : Co Id SpringHarbor University Press (1989)中有詳細(xì)描述。“內(nèi)源CRE-介導(dǎo)的基因”在本文中也指“內(nèi)源的CREB-依賴性基因”。這樣 的基因在本領(lǐng)域是已知的，并包括，例如，c-fos，前強(qiáng)啡肽，tPA和腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (BDNF) (Barco, A.等，Cell, 108(5) :689_703 (2002))。CRE-介導(dǎo)的基因也可以由本領(lǐng) 域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的和容易獲得的方法進(jìn)行鑒定(參見(jiàn)，例如，Ausubel等， Current Protocols In MolecularBiology(New York John Wiley&Sons) (1998)禾口 Sambrook 等，MolecularCloning :A Laboratory Manual，第 2 片反(New York :CoId Spring HarborUniversity Press (1989))。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括使用附加的或次級(jí)篩選，例如使用神經(jīng)來(lái)源的宿主細(xì)胞 與CREB途徑篩選中鑒定的候選化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，CREB途徑篩選中的宿主細(xì)胞 是正在增生的細(xì)胞，例如成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞，而次級(jí)篩選中的細(xì)胞是非增殖，已分化的神經(jīng) 來(lái)源細(xì)胞(如神經(jīng)元(例如，原代海馬細(xì)胞)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。在特定的實(shí)施方案中，初 級(jí)篩選中的CRE-介導(dǎo)的基因是CRE-介導(dǎo)的指示基因(CRE-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因)，而次級(jí)篩選中 的CRE-介導(dǎo)的基因是內(nèi)源的CRE-介導(dǎo)基因。在含有報(bào)道系統(tǒng)的宿主細(xì)胞內(nèi)觀察到的激活CREB途徑的化合物被稱為“經(jīng)確認(rèn) 的活性化合物”或“候選化合物”。候選化合物對(duì)內(nèi)源的，CRE-介導(dǎo)的基因表達(dá)(內(nèi)源的 CREB-依賴性基因表達(dá))的作用可以通過(guò)例如以下方法來(lái)進(jìn)行評(píng)估或評(píng)價(jià)(a)使神經(jīng)元 (特別是海馬細(xì)胞)與經(jīng)確認(rèn)的活性化合物(或候選化合物)進(jìn)行接觸，從而產(chǎn)生樣品；(b) 使所述樣品與亞適量的CREB功能刺激劑接觸；(c)對(duì)接觸了經(jīng)確認(rèn)的活性化合物(或候選化合物)以及CREB功能刺激劑的神經(jīng)元中內(nèi)源CREB-依賴性基因表達(dá)進(jìn)行評(píng)估；和(d)將 步驟(c)中評(píng)估的內(nèi)源CREB-依賴性基因表達(dá)與接觸了 CREB功能刺激劑而未接觸經(jīng)確認(rèn) 的活性化合物(或候選化合物)的對(duì)照神經(jīng)元中的內(nèi)源CREB-依賴性基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比。 與對(duì)照細(xì)胞中的CREB-依賴性基因表達(dá)相比，步驟(c)中評(píng)估的CREB-依賴性基因表達(dá)在 統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異將經(jīng)確認(rèn)的活性化合物(或候選化合物)鑒定為是對(duì)CREB-依賴性基 因表達(dá)有影響的，并將其鑒定為確認(rèn)的候選化合物。優(yōu)選地，相對(duì)于既未接觸CREB功能刺 激劑也未接觸經(jīng)確認(rèn)的活性化合物(候選化合物)的對(duì)照細(xì)胞(未接觸任何試劑的對(duì)照細(xì) 胞)中的CREB-依賴性基因表達(dá)，未接觸CREB功能刺激劑而接觸了經(jīng)確認(rèn)的活性化合物 (或候選化合物)的對(duì)照細(xì)胞(只接觸了經(jīng)確認(rèn)的活性化合物(或候選化合物)的對(duì)照細(xì) 胞)中CREB-依賴性基因表達(dá)沒(méi)有獲得顯著差異。如本文所述，來(lái)自幾種化學(xué)品類別的經(jīng)確認(rèn)的候選化合物和記憶增強(qiáng)劑通過(guò)記憶 形成的體內(nèi)模型進(jìn)行了改進(jìn)。要對(duì)其增強(qiáng)CREB途徑功能的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)或評(píng)估的化合物，例如藥用制劑，藥 物，化合物，離子化合物，有機(jī)化合物，有機(jī)配體，包括輔因子，糖類，重組和合成肽，蛋白，擬 肽，核酸序列，包括基因，核酸產(chǎn)物和其它的分子和組合物，可以依照本文的方法對(duì)其增強(qiáng) CREB途徑功能的能力進(jìn)行單獨(dú)篩選，或者一個(gè)或多個(gè)化合物可以同時(shí)進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)測(cè)試化 合物的混合物時(shí)，通過(guò)所述方法選擇的化合物可以通過(guò)合適的方法(例如，色譜法，測(cè)序， PCR)進(jìn)行分離(視情況而定)和鑒定。也可以按照這些方法來(lái)確定在測(cè)試樣品中存在具有 增強(qiáng)CREB途徑功能能力的一個(gè)或多個(gè)化合物。要對(duì)其增強(qiáng)CREB途徑功能能力進(jìn)行篩選的 化合物的通常濃度為從約10_9M到約10_3M。通過(guò)組合化學(xué)合成或其它方法產(chǎn)生的化合物(例如，有機(jī)化合物，重組和合成肽， 類肽，核酸)的大規(guī)模組合文庫(kù)可以被測(cè)試(參見(jiàn)例如，Zuckerman, R. N.等，J. Med. Chem, 37 :2678-2685(1994)，和其中引用的參考文獻(xiàn)；也參見(jiàn)，Ohlmeyer, M. H. J.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 10922-10926 (1993)和 De Witt, S. H.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 6909-6913(1993)，涉及經(jīng)標(biāo)簽標(biāo)記的化合物；Rutter, W. J.等，U. S. Pat. No. 5,010, 175 ； Huebner, V. D.等，U. S. Pat. No. 5，182，366 和 Geysen，H. Μ. U. S. Pat. No. 4，833，092)。這些 文獻(xiàn)通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。當(dāng)從組合文庫(kù)中篩選的化合物攜帶特定標(biāo)簽時(shí)，通 過(guò)色譜方法鑒定個(gè)別化合物是可能的。依照本文的方法，也可以對(duì)化學(xué)品文庫(kù)，微生物培養(yǎng)基和噬菌體展示文庫(kù)來(lái)進(jìn)行 測(cè)試(篩選)其中能夠增強(qiáng)CREB途徑功能的一個(gè)或多個(gè)化合物的存在。也對(duì)經(jīng)確認(rèn)的候選化合物進(jìn)行評(píng)估以評(píng)價(jià)神經(jīng)突增生。神經(jīng)突增生測(cè)定篩選過(guò)程的另一個(gè)步驟涉及對(duì)經(jīng)確認(rèn)活性或候選化合物能力的確定，所述能力顯 示CREB途徑活性以誘導(dǎo)神經(jīng)突增生。多種神經(jīng)突增生測(cè)定是本領(lǐng)域已知的，其測(cè)定神經(jīng) 突細(xì)胞突起所增加的長(zhǎng)度。例如，U. S. PatentNo. 7，282340和7，452，863，通過(guò)引用將其全 部?jī)?nèi)容并入本文，描述了神經(jīng)突增生測(cè)定。多種不同的細(xì)胞類型可以在所述測(cè)定中使用，例 如，源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的PC12細(xì)胞。PC12細(xì)胞已知為用作神經(jīng)元分化的模型 系統(tǒng)。神經(jīng)突增生測(cè)定的一個(gè)實(shí)施方案使用成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞，已知當(dāng)其暴露于特定化合 物如NGF時(shí)，發(fā)展出長(zhǎng)軸突-樣突起。
長(zhǎng)期記憶形成鑒定為提高CREB途徑活性和誘導(dǎo)神經(jīng)突增生的化合物繼而被測(cè)試其影響長(zhǎng)期記 憶形成的能力。情景恐懼條件作用是評(píng)估LTM的方法的一個(gè)例子。典型地來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)期記憶形 成測(cè)試使用動(dòng)物模型進(jìn)行，包括(a)將上文討論的測(cè)定中鑒定的有效量的經(jīng)確認(rèn)的候選 化合物施用給動(dòng)物(例如，人類，其它哺乳動(dòng)物，脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物)；(b)在適合在動(dòng) 物內(nèi)產(chǎn)生長(zhǎng)期記憶形成的條件下，對(duì)施用了經(jīng)確認(rèn)的候選化合物的動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練；(C)評(píng) 估步驟(b)中訓(xùn)練的動(dòng)物內(nèi)的長(zhǎng)期記憶形成；和(d)將步驟(c)中評(píng)估的長(zhǎng)期記憶形成與 未被施用經(jīng)確認(rèn)的候選化合物的對(duì)照動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生的長(zhǎng)期記憶形成進(jìn)行對(duì)比。如果相對(duì)于對(duì) 照動(dòng)物內(nèi)所評(píng)估的長(zhǎng)期記憶形成，用經(jīng)確認(rèn)的候選化合物處理的動(dòng)物內(nèi)所評(píng)估的長(zhǎng)期記憶 形成的增強(qiáng)是顯著的，則該經(jīng)確認(rèn)的候選化合物被鑒定為記憶增強(qiáng)劑。使用用于其它認(rèn)知 功能障礙的行為方法(模型)，用類似方法進(jìn)行長(zhǎng)期記憶篩選是可行的。這些測(cè)定的組合使得可以鑒定出既刺激神經(jīng)突增生也影響CREB途徑的化合物。 能夠影響這兩個(gè)系統(tǒng)的化合物將會(huì)改善正常個(gè)體和患有各種記憶不足的個(gè)體的記憶。提供下面的實(shí)施例用以說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例1CREB 測(cè)定構(gòu)建了 CREB活性測(cè)定。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，用CREB表達(dá)或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染 Neuro2A細(xì)胞。在存在或不存在毛喉素(PKA激活劑)的情況下，監(jiān)測(cè)CRE-熒光素酶活性。 本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)在圖IA中顯示。CREB過(guò)表達(dá)導(dǎo)致CRE-報(bào)道構(gòu)建物活化的升高(每組η = 3，*表明ρ <0.05)。CRE-熒光素酶報(bào)道分子因而測(cè)定了 CREB途徑的活化。在圖IB中， 顯示了咯利普蘭對(duì)CREB-活化的作用。用PDE4抑制劑咯利普蘭處理Neuro2A細(xì)胞，并通過(guò) CRE-熒光素酶活化來(lái)監(jiān)測(cè)CREB的活化?？├仗m激活CREB-依賴性轉(zhuǎn)錄，將其鑒定為CREB 增強(qiáng)劑(每組η = 8，p < 0. 001)。在0.5μΜ毛喉素存在的情況下，測(cè)定了咯利普蘭對(duì)CREB-活化的作用。用PDE4 抑制劑咯利普蘭處理Neuro2A細(xì)胞，并在在0. 5 μ M毛喉素存在的情況下，通過(guò)CRE-熒光素 酶活化監(jiān)測(cè)CREB的活化。再次，以及與CREB過(guò)表達(dá)類似(圖1Α)，咯利普蘭激活CREB-依 賴性轉(zhuǎn)錄(載體液(vehicle) η = 7，咯利普蘭η = 8,ρ < 0. 001)。這些數(shù)據(jù)將咯利普蘭鑒 定為CREB增強(qiáng)劑。實(shí)施例2CREB增強(qiáng)和長(zhǎng)期記憶檢測(cè)了施用CREB增強(qiáng)化合物對(duì)長(zhǎng)期記憶(LTM)的作用。將成年的年輕(10-12周大)C57BL/6雄性小鼠(Taconic, NY)用于生化和行為 實(shí)驗(yàn)。到達(dá)時(shí)，將小鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室籠中分組居住(5只小鼠)，并維持12 12小時(shí)的光 照-黑暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)總是在該循環(huán)的光照階段進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的前一天，將小鼠在個(gè)別的 籠子中單獨(dú)居住并維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。除了訓(xùn)練和測(cè)試時(shí)間外，小鼠隨意進(jìn)食水。為評(píng)估情景記憶，使用了經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的情景恐懼條件作用的任務(wù)(Bourtchuladze 等，Cell 79(1) =59-68(1994)) 0在訓(xùn)練日，開(kāi)始非條件刺激(US)即持續(xù)2秒鐘的0. 5mA 足電擊之前，小鼠被置于條件作用室(MedAssociates，Inc. , VA)中2分鐘。在電擊之間以 具有1分鐘的試驗(yàn)間隔的方式重復(fù)US。最后的訓(xùn)練試驗(yàn)后，使小鼠在條件作用室中另外停
12留30秒，并繼而被放置回它們?cè)瓉?lái)的籠子。在訓(xùn)練后一天或四天測(cè)試記憶的保持。兩個(gè) 時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果相同。將小鼠置于同樣的訓(xùn)練室內(nèi)，并通過(guò)定義為運(yùn)動(dòng)完全缺失的木僵行為 (freezing behavior)評(píng)分來(lái)對(duì)條件作用進(jìn)行評(píng)價(jià)?？倻y(cè)試時(shí)間持續(xù)3分鐘。拍攝了每個(gè) 實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象之后，實(shí)驗(yàn)儀器用75%乙醇，水徹底清洗，干燥，和通風(fēng)。小鼠用一個(gè)，兩個(gè)，五個(gè)或十個(gè)情景條件作用的試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行訓(xùn)練。4天之后，通過(guò)木 僵行為評(píng)分測(cè)試情景記憶。數(shù)據(jù)在圖2A中顯示。當(dāng)與單獨(dú)試驗(yàn)后的記憶相比時(shí)，具有多重 試驗(yàn)的訓(xùn)練顯著促進(jìn)了情景記憶。5次訓(xùn)練試驗(yàn)獲得最大的記憶。接著，小鼠接受弱訓(xùn)練 (兩次試驗(yàn))來(lái)誘導(dǎo)次最大記憶，或強(qiáng)訓(xùn)練(5次試驗(yàn))來(lái)誘導(dǎo)最大記憶。CREB增強(qiáng)劑咯利 普蘭或載體液在訓(xùn)練后立即被注射到海馬內(nèi)。訓(xùn)練之后4天通過(guò)木僵行為評(píng)分測(cè)試情景記 憶。CREB-增強(qiáng)劑咯利普蘭劑量依賴性地促進(jìn)弱訓(xùn)練之后的次最大化情景記憶，但對(duì)強(qiáng)訓(xùn)練 后的最大記憶沒(méi)有影響。因而，CREB增強(qiáng)足以促進(jìn)亞適度訓(xùn)練后的記憶形成，但不影響最 大化記憶。實(shí)施例3CREB增強(qiáng)劑和神經(jīng)突增牛測(cè)定了 CREB增強(qiáng)劑在NSl細(xì)胞內(nèi)對(duì)神經(jīng)突贈(zèng)生的作用。 On-targetsiRNA(Dharmacon Inc. Lafayette, USA)用于體外測(cè)試(NSl 細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)突增 生)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用Dharmafect 3轉(zhuǎn)染Neuroscreen 1 (NSl)細(xì)胞(Cellomics Inc.) ο將Neuroscreen 1 (NSl)細(xì)胞在增濕的，37°C ,5% C02的培養(yǎng)箱內(nèi)由I型膠原包被 的75cm2塑料燒瓶(Biocoat，Becton Dickinson)中進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞在添加了 10%熱失 活馬血清(Invitrogen)、5%熱失活胎牛血清(Cellgro)和2mM L-谷氨酰胺(Cambrex)的 RPIM完全細(xì)胞培養(yǎng)基(Cambrex)中進(jìn)行培養(yǎng)。為擴(kuò)增，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并在80%融 合時(shí)分瓶。每2到3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。如同其正被傳代一樣來(lái)收獲NSl細(xì)胞，并接著使用庫(kù)耳特計(jì)數(shù)器(Becton Dickinson Coulter Zl)計(jì)數(shù)。將細(xì)胞以200 μ 1體積的每孔2000個(gè)細(xì)胞的密度接種到由 I型膠原包被的96孔板中。RPMI培養(yǎng)基添加了 200ng/ml的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGFβ ,Sigma)。 NSl細(xì)胞被溫育72小時(shí)以允許分化為神經(jīng)元表型。NGF^接著被稀釋到50ng/ml，并且將細(xì) 胞分別用指示劑量的siRNA或化合物處理。使用Cellomics ArrayScan II Vti HCS掃描器對(duì)神經(jīng)突增生進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)說(shuō) 明書(shū)，細(xì)胞使用HitKit HCS反應(yīng)物試劑盒(Cellomics)染色。該測(cè)定基于免疫熒光，使用 已經(jīng)驗(yàn)證特異地標(biāo)記神經(jīng)突和神經(jīng)元細(xì)胞體的抗體。簡(jiǎn)短地，細(xì)胞在3. 7%的甲醛中固定， 并且細(xì)胞核用煙酸己可堿染料染色。細(xì)胞接著在神經(jīng)突增生緩沖液中清洗，并且神經(jīng)突由 用于神經(jīng)突增生高含量篩選的Cellomics'專用初級(jí)抗體進(jìn)行染色。與該初級(jí)抗體溫育1 小時(shí)后，細(xì)胞再次被清洗，接著與熒光標(biāo)記的二抗溶液溫育1小時(shí)?？贵w染色的96孔板在 黑暗中儲(chǔ)存于4°C直至掃描。使用Cellomics ArrayScan II Vti HCS掃描器掃描平板。該 神經(jīng)突增生測(cè)定使用兩個(gè)通道進(jìn)行掃描。通道1探測(cè)煙酸己可堿染料并通過(guò)軟件鑒定細(xì)胞 以及用于自動(dòng)聚焦來(lái)進(jìn)行使用。通道2探測(cè)二抗的FITC熒光并通過(guò)軟件來(lái)計(jì)算關(guān)于神經(jīng) 突所產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)而進(jìn)行使用。在第一組實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了針對(duì)PDE4d(咯利普蘭靶標(biāo))的siRNA對(duì)于NSl細(xì)胞中神經(jīng)突增生的作用。NSl細(xì)胞用單獨(dú)載體液(Dharmafect 3)、非靶向?qū)φ誷iRNA、或PDE4d siRNA來(lái)進(jìn)行處理，并在48小時(shí)后測(cè)定神經(jīng)突長(zhǎng)度。這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)在圖3A中顯示。相較 于單獨(dú)載體液，用PDE4dsiRNA處理的NSl細(xì)胞具有顯著更長(zhǎng)的神經(jīng)突。相反，非靶向?qū)φ?siRNA對(duì)神經(jīng)突增生沒(méi)有影響。這些發(fā)現(xiàn)表明擊倒PDE4d(CREB增強(qiáng)劑咯利普蘭的靶標(biāo))， 促進(jìn)了神經(jīng)突的增生。下一組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了 CREB增強(qiáng)劑咯利普蘭在NS細(xì)胞中對(duì)神經(jīng)突增生的作用。在 5 μ M毛喉素存在情況下，NSl細(xì)胞用載體液或增量的咯利普蘭處理。結(jié)果在圖3Β中顯示。 咯利普蘭劑量依賴性地提高神經(jīng)突增生，其通過(guò)NSl細(xì)胞中神經(jīng)突的長(zhǎng)度增加來(lái)測(cè)量。CREB增強(qiáng)劑咯利普蘭在NS細(xì)胞中對(duì)神經(jīng)突增生的作用。在5 μ M毛喉素存在的情 況下，NSl細(xì)胞用載體液或增量的咯利普蘭進(jìn)行處理?？├仗m劑量依賴性地提高神經(jīng)突 增生，其通過(guò)NSl細(xì)胞中神經(jīng)突分支點(diǎn)的增加來(lái)測(cè)量。所有的實(shí)驗(yàn)都顯示8個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔 (每個(gè)測(cè)量至少100個(gè)NSl細(xì)胞的神經(jīng)突長(zhǎng)度)的MEAN+/-SEM。實(shí)施例4CREB增強(qiáng)劑對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元中神經(jīng)突增牛以及對(duì)海馬記憶的作用為了海馬體內(nèi)咯利普蘭注射或Cprl2siRNA處理，小鼠用20mg/kg的三溴乙醇麻 醉并用33- 口徑(gauge)的引導(dǎo)插管(guide cannula)雙側(cè)植入背側(cè)海馬體(坐標(biāo)A =-1. 8mm, L = +/-1. 5mm 至 1. 2mm 的深度)(Franklin 和 Paxinos, 1997)。手術(shù)恢復(fù)后 5 到 9天，動(dòng)物被注射藥物或載體液對(duì)照。使用通過(guò)聚乙烯管連接于微型注射器的輸注插管，將 2 μ 1藥物或載體液注射入每個(gè)海馬體。整個(gè)輸注流程耗時(shí)約2分鐘，并且輕柔地處理動(dòng)物 以使應(yīng)激最小化。將ΗΤ2175溶解于載體液并在訓(xùn)練前20分鐘以指示的劑量腹腔內(nèi)施用(I. P.)。對(duì) 照動(dòng)物只接受載體液。對(duì)于每個(gè)訓(xùn)練和藥物注射過(guò)程，使用未接受實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物組。對(duì)于海 馬體內(nèi)咯利普蘭的注射，將Ιμ 1指示劑量的咯利普蘭(溶于0.DMSO的PBS中)在行為 訓(xùn)練之后立即注射。為評(píng)估情景記憶，使用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的情景恐懼條件作用任務(wù)(Bourtchuladze等， Cell 79(1) :59-68(1994)。在訓(xùn)練日，在進(jìn)行非條件刺激(US)即持續(xù)2秒鐘的0. 5mA足電 擊之前，小鼠被置于條件作用室中(Med Associates Inc.，VA)2分鐘。電擊之間以具有1 分鐘的實(shí)驗(yàn)間隔的方式重復(fù)US。在最后的訓(xùn)練試驗(yàn)后，使小鼠在條件作用室中另外停留30 秒，并繼而被放置回它們?cè)瓉?lái)的籠子。在訓(xùn)練后一天或四天測(cè)試記憶的保持。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn) 的結(jié)果相同。將小鼠置于同樣的訓(xùn)練室內(nèi)，并通過(guò)定義為運(yùn)動(dòng)完全缺失的木僵行為評(píng)分來(lái) 對(duì)條件作用進(jìn)行評(píng)價(jià)?？倻y(cè)試時(shí)間持續(xù)3分鐘。拍攝了每個(gè)試驗(yàn)的進(jìn)程。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象 之后，實(shí)驗(yàn)儀器用75%乙醇，水徹底清洗，干燥，和通風(fēng)。所有的行為實(shí)驗(yàn)都以平衡形式設(shè)計(jì)和實(shí)施，意思是⑴對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)條件(例如， 特定的劑量-效應(yīng))，我們使用相同數(shù)目的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照小鼠；(ii)每種實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)幾次， 并且重復(fù)的日子相加以產(chǎn)生受試個(gè)體的最終數(shù)目。每個(gè)工作時(shí)段的過(guò)程都被拍攝下來(lái)。在 每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者不知道(盲的)訓(xùn)練和測(cè)試過(guò)程中對(duì)個(gè)體的處理方式。使用軟件包 (StatView 5. 0. 1 ；SAS Institute, Inc)通過(guò) Student，s 非配對(duì) t 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。生化數(shù) 據(jù)通過(guò)ANOVA進(jìn)行分析。除非另有指明，文本和附圖中的所有值都表示為MEAN+SEM。圖4A-B顯示了 HT-2175和一種新的CREB增強(qiáng)劑對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元中神經(jīng)突增生
14長(zhǎng)以及對(duì)海馬記憶的作用。圖A顯示了咯利普蘭和HT-2175對(duì)海馬神經(jīng)元中的神經(jīng)突增生 的作用。小鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)3天，并繼而用HT-2175或咯利普蘭處理24小時(shí)。HT-2175 和咯利普蘭促進(jìn)神經(jīng)突增生，其通過(guò)每個(gè)神經(jīng)突的分支點(diǎn)的顯著增加來(lái)測(cè)量。顯示了 8個(gè) 實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔(每個(gè)測(cè)量至少100個(gè)神經(jīng)元的神經(jīng)突長(zhǎng)度)的MEAN+/-SEM。圖4B顯示了 HT-2175對(duì)弱行為訓(xùn)練(兩次試驗(yàn))誘導(dǎo)的情景記憶的作用。小鼠用HT-2175或載體液處 理，并繼而在情景條件作用中進(jìn)行訓(xùn)練。如通過(guò)其對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元中神經(jīng)突增生的作用 所預(yù)期的那樣，HT-2175劑量依賴性地促進(jìn)情景記憶。實(shí)施例5Gpr 12 siRNA對(duì)神經(jīng)突增牛和記憶的作用體內(nèi)SiRNA注射用于研究Gpr 12 siRNA對(duì)神經(jīng)突增生和記憶的作用。體內(nèi)等級(jí) 的 siSTABLE siRNA(Dharmacon Inc.，Lafayette, USA)被用于評(píng)估 Gprl2 在小鼠 CNS 中 的功能。siRNA’ s被化學(xué)修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性。21聚體的siSTABLE非靶向siRNA被用作 對(duì)照。開(kāi)始的測(cè)試使用bDNA測(cè)定(QuantiGene bDNAassay試劑盒，Bayer)，幾個(gè)未修飾的 (siGENOME)針對(duì)Gprl2的siRNA，在體外利用Neuro2a細(xì)胞進(jìn)行。siRNA使用多組分合理設(shè) 計(jì)算法(Reynolds等，2004)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過(guò)BLAST檢索控制其針對(duì)Gprl2的特異性。下 面的siRNA被選擇出來(lái)用于進(jìn)一步在體內(nèi)鑒別Grp 12 siRNA2 有義鏈 GAGGCACGCCCAUCAGAUAUU (SEQ IDNO 1)Grp 12 siRNA2 反義鏈 UAUCUGAUGGGCGUGCCUCUU (SEQ IDNO 2)非靴向siRNA 正義鏈 UAGCGACUAAACACAUCAAUU(SEQ IDNO 3)禾口非靴向siRNA 反義鏈 UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU (SEQ IDNO 4)針對(duì)Gprl2的siSTABLE siRNA和非靶向?qū)φ誷iRNA在5 %葡萄糖中被稀釋到 0. 5 μ g/μ 1，并與6當(dāng)量22kDa的線性聚乙烯亞胺(Fermentas)混合。在室溫溫育10分 鐘后，使用通過(guò)聚乙烯管連接于微型注射器的輸注插管，將2μ 1注射入每個(gè)海馬體。整個(gè) 輸注過(guò)程耗時(shí)約2分鐘，并且輕柔處理動(dòng)物以使應(yīng)激最小化。在3天的時(shí)間內(nèi)總共提供了 siRNA的3次輸注(每個(gè)海馬體每天1 μ g siRNA)。NSl細(xì)胞用Gprl2 siRNA或非靶向?qū)φ誷iRNA處理48小時(shí)。將神經(jīng)突長(zhǎng)度與 經(jīng)載體液?jiǎn)为?dú)處理的細(xì)胞和未處理細(xì)胞進(jìn)行比較。當(dāng)以增加的神經(jīng)突長(zhǎng)度來(lái)測(cè)量時(shí)， Grpl2siRNA顯著增強(qiáng)了神經(jīng)突增生。非靶向?qū)φ誷iRNA或單獨(dú)的載體液對(duì)神經(jīng)突長(zhǎng)度沒(méi) 有影響。該結(jié)果在圖5A中顯示。顯示了 8個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔(每個(gè)測(cè)量至少100個(gè)NSl細(xì)胞 的神經(jīng)突長(zhǎng)度)的MEAN+/-SEM。圖5B顯示了 Gprl2siRNA對(duì)分支點(diǎn)的作用。NSl細(xì)胞用 Gprl2siRNA或非靶向?qū)φ誷iRNA處理48小時(shí)。將神經(jīng)突長(zhǎng)度與載體液?jiǎn)为?dú)處理的細(xì)胞以 及未處理細(xì)胞進(jìn)行比較。當(dāng)以增加的分支點(diǎn)數(shù)目來(lái)測(cè)量時(shí)，Gprl2siRNA顯著增強(qiáng)了神經(jīng)突 增生。非靶向?qū)φ誷iRNA或單獨(dú)的載體液對(duì)分支點(diǎn)沒(méi)有影響。顯示了 8個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔(每 個(gè)測(cè)量至少100個(gè)NSl細(xì)胞的神經(jīng)突長(zhǎng)度)的MEAN+/-SEM。圖5C顯示了 Gprl2siRNA對(duì)記 憶的作用。小鼠被重復(fù)注射Gprl2siRNA(n = 20)或?qū)φ誷iRNA (η = 19)到海馬體內(nèi)，接著 使用弱訓(xùn)練樣式(兩次試驗(yàn))在情景恐懼條件作用中進(jìn)行訓(xùn)練。24小時(shí)后通過(guò)木僵行為評(píng) 分來(lái)評(píng)估記憶。正如從其對(duì)神經(jīng)突增生的作用所預(yù)期的那樣，Gprl2siRNA促進(jìn)情景記憶。實(shí)施例6GalR3受體拮抗劑HT-2157對(duì)神經(jīng)突增生以及情景記憶的作用
顯示了每個(gè)藥物劑量的8個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔和每個(gè)載體液的16個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)的 MEAN+/-sem0對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，測(cè)量了最少100個(gè)細(xì)胞中的神經(jīng)突增生。圖6A顯示了定量化 HT-2157對(duì)NSl細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)軸增生作用的數(shù)據(jù)。與CREB增強(qiáng)劑咯利普蘭相似，HT-2157促 進(jìn)神經(jīng)突增生，其由每個(gè)細(xì)胞總神經(jīng)突長(zhǎng)度的增加來(lái)表明。圖6B顯示了定量化HT-2157對(duì) NSl細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)軸增生作用的數(shù)據(jù)。HT-2157促進(jìn)神經(jīng)突增生，其由每個(gè)樹(shù)突的分支點(diǎn)數(shù)目 的增加來(lái)表明。圖6C顯示了定量化HT-2157對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元中神經(jīng)突增生作用的數(shù)據(jù)， HT-2157劑量依賴性地促進(jìn)神經(jīng)突增生，其由分支點(diǎn)數(shù)目的增加來(lái)表明。圖6D顯示了關(guān)于 HT-2157對(duì)情景記憶的作用的數(shù)據(jù)。小鼠用指定劑量的HT-2157或用對(duì)照載體液處理，并在 情景恐懼條件作用中以兩次試驗(yàn)進(jìn)行訓(xùn)練。如從神經(jīng)突增生測(cè)定中所預(yù)期的那樣，HT-2157 劑量依賴性地促進(jìn)情景記憶。實(shí)施例7GABA-等體和單胺氧,化_ B抑制劑對(duì)NSl細(xì)胞,中神經(jīng)突 曾牛的作用冷凍保存的NSl神經(jīng)元購(gòu)自O(shè)ttawa大學(xué)。神經(jīng)元在由多聚_D_賴氨酸包被的96 孔板中，于添加了 2% B27, 500 μ M L-谷氨酰胺和ImM丙酮酸鹽的無(wú)血清Neurobasal培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。鋪板密度為每孔20，000個(gè)神經(jīng)元。為了神經(jīng)突增生測(cè)定，將神經(jīng)元培養(yǎng)2-3天， 并繼而用咯利普蘭，ΗΤ-2175或ΗΤ-2157分別處理24小時(shí)。圖7Α顯示了特異性針對(duì)GABA受體α 5亞單元的反激動(dòng)劑ΗΤ-1974對(duì)NSl細(xì)胞中 的神經(jīng)突長(zhǎng)度的作用的定量化。ΗΤ-1974促進(jìn)神經(jīng)突增生，其由0. 03 μ m ΗΤ-1974的濃度下 神經(jīng)突長(zhǎng)度的增加來(lái)表明。圖7Β顯示了單胺氧化酶抑制劑ΗΤ-1060對(duì)NSl細(xì)胞中神經(jīng)突 長(zhǎng)度的作用的定量化。ΗΤ-1060促進(jìn)神經(jīng)突增生，其由神經(jīng)突長(zhǎng)度的增加來(lái)表明。顯示了每 個(gè)藥物劑量和的2個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)以及載體液(0.2% DMS0)的MEAN+/-sem。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)重 復(fù)，最少對(duì)250個(gè)細(xì)胞中的神經(jīng)突增生進(jìn)行測(cè)量。
權(quán)利要求
一種鑒定增強(qiáng)記憶的化合物的方法，包含從文庫(kù)中選擇誘導(dǎo)神經(jīng)突增生并且也增強(qiáng)CREB途徑功能的候選化合物，從而將既誘導(dǎo)神經(jīng)突增生又增強(qiáng)CREB途徑功能的化合物鑒定為增強(qiáng)記憶的化合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中選擇誘導(dǎo)神經(jīng)突增生的候選化合物的步驟包含a)將候選化合物或者對(duì)照化合物提供給神經(jīng)突宿主細(xì)胞；b)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)候選化合物和對(duì)照化合物的反應(yīng)；以及c)觀察候選化合物和對(duì)照化合物之間細(xì)胞生長(zhǎng)的差異；從而將在細(xì)胞生長(zhǎng)中導(dǎo)致陽(yáng) 性變化的候選化合物鑒定為增強(qiáng)神經(jīng)突增生的化合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述神經(jīng)突宿主細(xì)胞是Neuroscreen1細(xì)胞。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述神經(jīng)突宿主細(xì)胞是小鼠海馬神經(jīng)元。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述神經(jīng)突宿主細(xì)胞是成神經(jīng)細(xì)胞瘤NeUr02a細(xì)胞。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含CREB報(bào)道構(gòu)建物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述候選化合物也上調(diào)CREB報(bào)道構(gòu)建物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中選擇增強(qiáng)CREB途徑功能的候選化合物的步驟包含a)使包含可操縱地連接于CRE啟動(dòng)子的指示基因的宿主細(xì)胞與候選化合物接觸，從而 產(chǎn)生測(cè)試樣品；b)使該測(cè)試樣品與亞適量的CREB功能刺激劑接觸；c)確定已經(jīng)接觸了所述測(cè)試化合物和所述CREB功能刺激劑的所述宿主細(xì)胞中的指示 物活性；d)將上述指示物活性和已經(jīng)接觸了所述CREB功能刺激劑而未接觸所述測(cè)試化合物的 對(duì)照細(xì)胞中的指示物活性進(jìn)行比較；以及e)如果1)相對(duì)于接觸了所述CREB功能刺激劑而未接觸所述測(cè)試化合物的所述對(duì)照 細(xì)胞內(nèi)的指示物活性，步驟c)中確定的指示物活性升高；以及2)相對(duì)于未接觸所述CREB 功能刺激劑和未接觸所述測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞中的指示物活性，未接觸所述CREB功能 刺激劑而接觸了所述測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性沒(méi)有顯著不同，則選擇所述測(cè) 試化合物。
9.權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包含步驟使用步驟e)中選擇的所述測(cè)試化合物的一個(gè)范圍的不同濃度來(lái)重復(fù)步驟a)到e)的 步驟；g)如果1)相對(duì)于已經(jīng)接觸了所述CREB功能刺激劑而未接觸所述測(cè)試化合物的所述 對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性，所述范圍的不同濃度的所述測(cè)試化合物的指示物活性升高；以 及2)相對(duì)于未接觸所述CREB途徑功能刺激劑和未接觸所述測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的 指示物活性，未接觸所述CREB功能刺激劑而引入了所述范圍的不同濃度的所述測(cè)試化合 物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的指示物活性沒(méi)有顯著不同，則選擇所述測(cè)試化合物，從而選擇候選化合 物；h)使神經(jīng)來(lái)源的細(xì)胞與步驟g)中選擇的所述候選化合物以及與亞適量的CREB功能刺 激劑進(jìn)行接觸；i)評(píng)估與所述候選化合物和所述CREB功能刺激劑接觸的細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源CREB依賴性基 因表達(dá)；j)將步驟i)中評(píng)估的內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)與已經(jīng)接觸了所述CREB功能刺激劑 而未接觸所述候選化合物的對(duì)照細(xì)胞中的內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)進(jìn)行比較； k)如果1)相對(duì)于已經(jīng)接觸了所述CREB功能刺激劑而未接觸所述候選化合物的對(duì)照 細(xì)胞中的內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)，步驟i)中評(píng)估的內(nèi)源CREB依賴性基因表達(dá)升高；和 2)相對(duì)于未接觸所述CREB功能刺激劑和未接觸所述候選化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的CREB依 賴性基因表達(dá)，未接觸所述CREB功能刺激劑而接觸了所述候選化合物的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的內(nèi) 源CREB依賴性基因表達(dá)沒(méi)有顯著不同，則選擇所述候選化合物，從而選出經(jīng)確認(rèn)的候選化 合物；1)將步驟k)中選出的經(jīng)確認(rèn)候選化合物施用給動(dòng)物；m)在適合于在所述動(dòng)物中產(chǎn)生長(zhǎng)期記憶形成的條件下，對(duì)施用了所述經(jīng)確認(rèn)的候選化 合物的所述動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練；η)評(píng)估步驟m)中訓(xùn)練的所述動(dòng)物中的長(zhǎng)期記憶形成；和ο)將步驟η)中評(píng)估的長(zhǎng)期記憶形成與未被施用所述經(jīng)確認(rèn)的候選化合物的對(duì)照動(dòng)物 中所產(chǎn)生的長(zhǎng)期記憶形成進(jìn)行對(duì)比。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述宿主細(xì)胞是人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞以及所述神經(jīng)來(lái)源 的細(xì)胞是神經(jīng)元。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述神經(jīng)元是原代海馬細(xì)胞。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述指示基因編碼螢光素酶。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述CREB功能刺激劑是毛喉素。
14.權(quán)利要求13的方法，其中以步驟e)中選擇的所述測(cè)試化合物的一個(gè)范圍的4種不 同濃度來(lái)重復(fù)步驟a)到e)。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于細(xì)胞的篩選試驗(yàn)，其用于鑒定增強(qiáng)正常個(gè)體和記憶受損個(gè)體的記憶的化合物。
文檔編號(hào)C40B30/06GK101970729SQ200880127196
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者M·彼得斯, R·E··斯科特, T·P·圖利 申請(qǐng)人:海利空醫(yī)療公司