4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記的方法。本發(fā)明提供檢測(cè)糖代謝標(biāo)記的方法和提供更為接近天然產(chǎn)物的標(biāo)簽，并在標(biāo)簽不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)簽的直接檢測(cè)。在無(wú)需有毒催化劑等的條件下，運(yùn)用納米金表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特殊拉曼信號(hào)標(biāo)簽標(biāo)記的細(xì)胞表面糖檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)糖生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物正交反應(yīng)在化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域有非常廣泛的運(yùn)用，是一種兩步化學(xué)標(biāo)記法。在糖生物學(xué)領(lǐng)域，第一步，通過(guò)有機(jī)合成方法在天然單糖分子上修飾生物正交基團(tuán)(例如:疊氮或端炔，最為常用)，而后通過(guò)生物體自身代謝被整合到生物糖鏈中；第二步，通過(guò)上一步的整合后，天然糖鏈中帶有了一個(gè)化學(xué)報(bào)告基團(tuán)，用一個(gè)攜帶生物正交互補(bǔ)的基團(tuán)的分子，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)的方式對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)、成像和分離。雖然這種兩步化學(xué)標(biāo)記法在生物分子的檢測(cè)、成像和分離方面，尤其是生物分子動(dòng)態(tài)變化方面，取得了重要的進(jìn)展；然而，此方法仍存在一系列的問(wèn)題需要研究者們解決。一，合成修飾上的正交基團(tuán)對(duì)分子單體本身的理化性質(zhì)有一定的改變；二，后續(xù)的化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)體系的生物相容性問(wèn)題；三，活體動(dòng)態(tài)標(biāo)記很受限制。
[0003]針對(duì)這些問(wèn)題，研究者們的解決思路集中在改善化學(xué)反應(yīng)的生物相容性方面；以Ac4ManNAz生物代謝標(biāo)記為例，其方略為:
[0004]以銅催化疊氮與炔[3+2]環(huán)加成反應(yīng)為例。此反應(yīng)催化用的的Cu (I)的細(xì)胞毒性非常強(qiáng)，研究者們把重心一方面放在開發(fā)配體來(lái)降低其毒性，并提高反應(yīng)速率上(以BTTAA最為常用)，另一方面放在活化炔上(以環(huán)辛炔及其衍生物最為成功)。配體的方法雖然能夠很大程度地加快反應(yīng)速率，但Cu (I)的毒性只能得到一定程度的降低；而活化炔的方法不使用Cu (I)催化劑，僅通`過(guò)環(huán)張力和共軛的方式來(lái)降低環(huán)加成反應(yīng)的活化能，實(shí)現(xiàn)提高反應(yīng)速率的目的。活化炔的方法最大的缺點(diǎn)就是炔的活化很復(fù)雜，合成成本高、吸附背景高、相對(duì)于催化反應(yīng)速率慢、而且生物相溶性問(wèn)題也未得到很好的解決。
[0005]拉曼(Raman)是一種非化學(xué)標(biāo)記的成像和檢測(cè)方法,可以對(duì)特定的具有Raman信號(hào)的基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)和成像。在細(xì)胞的Raman成像中，存在一段Raman信號(hào)沉默的區(qū)域(1800-2800^1),即此區(qū)域內(nèi)沒有細(xì)胞的任何信號(hào)。所以，使用Raman信號(hào)在此沉默區(qū)域的目標(biāo)基團(tuán)作為天然糖衍生物的修飾基團(tuán)(例如，炔基的Raman信號(hào)在2100CHT1左右)進(jìn)行細(xì)胞甚至活體切片的Raman檢測(cè)和成像。然而，Raman信號(hào)相對(duì)于熒光信號(hào)來(lái)說(shuō)非常弱，其對(duì)于細(xì)胞膜上富含的磷脂的檢測(cè)和成像都顯得有些困難(需要使用功率較強(qiáng)的激光器)，那么對(duì)于細(xì)胞膜表面的少量的含Raman信號(hào)基團(tuán)的非天然糖的檢測(cè)和成像更是不可實(shí)現(xiàn)。
[0006]表面增強(qiáng)拉曼(SERS)是Au、Ag等金屬表面對(duì)于Raman信號(hào)的一種增強(qiáng)現(xiàn)象,一般可以實(shí)現(xiàn)IO6-1O12的增強(qiáng)效果。這一增強(qiáng)很可能就使得細(xì)胞膜表面的少量的含Raman信號(hào)基團(tuán)的非天然糖的檢測(cè)和成像成為可能。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提供4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記的方法，在標(biāo)簽不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)簽的直接檢測(cè)。
[0008]具體地，本發(fā)明提供一種4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子，其通過(guò)下述方法制備:
[0009]I)將HAuCl4 (氯金酸)水溶液加熱至回流，在攪拌下加入檸檬酸鈉溶液；
[0010]2)室溫冷卻，獲得金納米粒子晶種；
[0011]3)將獲得的金納米粒子晶種加入超純水中，在攪拌下加入檸檬酸鈉、HAuCl4和鹽酸羥胺溶液，室溫?cái)嚢瑁@得金納米粒子；
[0012]4)向獲得的金納米粒子中加入4-巰基苯硼酸的乙醇溶液，室溫?cái)嚢?-24小時(shí)，即得所述4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子。
[0013]優(yōu)選地，步驟I)所述HAuCl4水溶液的質(zhì)量濃度為0.01%，檸檬酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為1%。
[0014]優(yōu)選地，步驟3)中檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為1%、HAuCl4的質(zhì)量濃度為1%，的鹽酸羥胺溶液的濃度為10mM。
[0015]所述的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子可以用于檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記。
[0016]本發(fā)明還提供一種檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記的方法，其包含以下步驟:
[0017]I)使用含非天然單糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；
[0018]2)將培養(yǎng)的細(xì)胞與權(quán)利要求1制備的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子的溶液共孵育，使4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子結(jié)合到細(xì)胞表面的唾液酸上；
[0019]3)使用拉曼光譜儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面的拉曼標(biāo)簽信號(hào)，根據(jù)采集的信號(hào)判斷細(xì)胞表面是否存在所述非天然單糖。
[0020]優(yōu)選地，所述非天然單糖為含疊氮、炔基或氘代甲基的非天然單糖。更優(yōu)選地，所述非天然單糖為Ac4ManNAz或d3-Ac4ManNAz。
[0021]優(yōu)選地，所述細(xì)胞為HeLa和/或CHO細(xì)胞。所述Ac4ManNAz的濃度范圍為0.01 μ M至 100 μ Μ。
[0022]更優(yōu)選地50 μ M的Ac4ManNAl培養(yǎng)CHO細(xì)胞時(shí)，孵育時(shí)間最少為34小時(shí)。
[0023]本發(fā)明提供4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記的方法，檢測(cè)糖代謝標(biāo)記，并提供了更為接近天然產(chǎn)物的標(biāo)簽，在標(biāo)簽不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)簽的直接檢測(cè)。在無(wú)需有毒催化劑等的條件下，運(yùn)用納米金表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特殊拉曼信號(hào)標(biāo)簽標(biāo)記的細(xì)胞表面糖檢測(cè)的方法。這種方法在無(wú)需有毒催化劑等的條件下，運(yùn)用納米金表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特殊拉曼信號(hào)標(biāo)簽標(biāo)記的細(xì)胞表面糖檢測(cè)的方法。這種方法實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的檢測(cè)。而且該方法適用于各種細(xì)胞表面非天然糖的檢測(cè)。
[0024]為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是使用納米金表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特殊拉曼信號(hào)標(biāo)簽標(biāo)記的細(xì)胞表面糖檢測(cè)的示意圖。[0026]圖2是Raman光譜儀的暗場(chǎng)成像，圖中的亮點(diǎn)(箭頭所示)表示金納米粒子。
[0027]圖3和圖4分別是CHO和HeLa細(xì)胞中檢測(cè)細(xì)胞膜表面的疊氮和炔基的Raman信號(hào)。
[0028]圖5和圖6分別是CHO和HeLa細(xì)胞中檢測(cè)氘代甲基的Raman信號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]請(qǐng)參照?qǐng)D1，其是使用納米金表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特殊拉曼信號(hào)標(biāo)簽標(biāo)記的細(xì)胞表面糖檢測(cè)的示意圖，非天然的單糖(以式I的Ac4ManNAz為例)被代謝到細(xì)胞表面后變?yōu)榉翘烊坏耐僖核?式II的NeuNAz)，4-巰基苯硼酸(MPBA)修飾的金納米粒子(AuMPBA)與唾液酸8，9-位上兩個(gè)羥基反應(yīng)生成如圖所示的產(chǎn)物。通過(guò)金納米粒子(AuNPs)的表面增強(qiáng)拉曼就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)非天然Raman標(biāo)簽的檢測(cè)。
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子，其特征在于，其通過(guò)下述方法制備: 1)將HAuCl4水溶液加熱至回流，在攪拌下加入檸檬酸鈉溶液； 2)室溫冷卻，獲得金納米粒子晶種； 3)將獲得的金納米粒子晶種加入超純水中，在攪拌下加入檸檬酸鈉、HAuCl4和鹽酸羥胺溶液，室溫?cái)嚢?，獲得金納米粒子； 4)向獲得的金納米粒子中加入4-巰基苯硼酸的乙醇溶液，室溫?cái)嚢?-24小時(shí)，即得所述4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子，其特征在于，步驟I)所述HAuCl4水溶液的質(zhì)量濃度為0.01%，檸檬酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子，其特征在于，步驟3)中檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為1%、HAuCl4的質(zhì)量濃度為1%，的鹽酸羥胺溶液的濃度為10mM。
4.權(quán)利要求1所述的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子在檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記中的應(yīng)用。
5.一種檢測(cè)細(xì)胞表面糖標(biāo)記的方法，其特征在于，包含以下步驟: O使用含非天然單糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞； 2)將培養(yǎng)的細(xì)胞與權(quán)利要求1制備的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子的溶液共孵育，使4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子結(jié)合到細(xì)胞表面的唾液酸上； 3)使用拉曼光譜儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面的拉曼標(biāo)簽信號(hào)，根據(jù)采集的信號(hào)判斷細(xì)胞表面是否存在所述非天然單糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述非天然單糖為含疊氮、炔基或氘代甲基的非天然單糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述非天然單糖為Ac4ManNAz或d3-Ac4ManNAz。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為HeLa和/或CHO細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述Ac4ManNAz的濃度范圍為0.01 μ M至100 μ Μ。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，50μ M的Ac4ManNAl培養(yǎng)CHO細(xì)胞時(shí)，孵育時(shí)間最少為34小時(shí)。
【文檔編號(hào)】B22F9/24GK103674925SQ201210342478
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】陳興, 田中群, 田向東, 林亮, 洪森煉 申請(qǐng)人:北京大學(xué)