含有生物活性涂層的鎳鈦合金及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有生物活性涂層的鎳鈦合金，首先將鎳鈦合金表面打磨光亮，然后合金浸泡在1～3mg/mL的Tris-鹽酸多巴胺溶液中12～36h，使表面形成聚多巴胺薄膜；再以0.1％～0.5％(v/v)的乙酸為溶劑，配制1～10mg/mL的殼聚糖溶液，用磷酸鹽緩沖溶液配制1～10mg/mL的明膠溶液和100～500ng/mL的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液，將處理后的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中12～36h，再逐層自組裝殼聚糖-明膠-內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-明膠，每個溶液中浸泡5～20min，逐層自組裝共循環(huán)4～10次，最后用氮?dú)獯蹈杉纯桑辉撏繉涌梢杂行Т龠M(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在鎳鈦合金表面粘附和生長，從而滿足鎳鈦合金作為心血管植入材料快速內(nèi)皮化的需求，有效解決鎳鈦合金表面誘發(fā)血栓、產(chǎn)生凝血的問題，擴(kuò)大鎳鈦合金的臨床應(yīng)用范圍。
【專利說明】含有生物活性涂層的鎳鈦合金及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及金屬材料，特別涉及含有生物活性涂層的鎳鈦合金，還涉及該合金的制備方法及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來，鎳鈦合金材料由于其獨(dú)特的形狀記憶效應(yīng)、超彈性性能、高耐腐蝕性和良好的生物相容性，被廣泛用作心血管領(lǐng)域的長期植入器件，如心血管支架和心臟封堵器等。但由于存在材料表面容易誘發(fā)血栓、產(chǎn)生凝血等問題，鎳鈦合金的臨床應(yīng)用仍然受限。
[0003]內(nèi)皮細(xì)胞具有抗血栓的特異性能，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在材料表面的快速生長和包被可以有效減少凝血問題。內(nèi)皮細(xì)胞的微環(huán)境在調(diào)控細(xì)胞生長行為方面發(fā)揮著重要作用。近年來，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過各種方法構(gòu)筑細(xì)胞外微環(huán)境以促進(jìn)心血管植入材料表面快速內(nèi)皮化，如通過化學(xué)或物理方法將細(xì)胞外基質(zhì)中的生物大分子、人工合成的多肽和各種生長因子引入到生物材料表面。然而，由于細(xì)胞天然微環(huán)境體系的復(fù)雜性，現(xiàn)有的僅涉及在植入材料表面引入單一生物活性分子的方法很難模擬內(nèi)皮細(xì)胞外微環(huán)境，因而不能夠滿足材料表面快速內(nèi)皮化的需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種含有生物活性涂層的鎳鈦合金，該合金含有的生物活性涂層具有仿細(xì)胞外微環(huán)境的特點(diǎn)，可以使鎳鈦合金表面快速內(nèi)皮化；同時，本發(fā)明還提供了該含有生物活性涂層的鎳鈦合金的制備方法及該合金在制備醫(yī)用硬組織植入材料中的應(yīng)用。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法，包括以下步驟:
[0007](I)基材預(yù)處理
[0008]將鎳鈦合金打磨至表面光亮，用丙酮超聲清洗，得到潔凈的金屬表面；
[0009](2)沉積聚多巴胺薄膜層
[0010]將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在I?3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液中浸泡12?36小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；所述鹽酸多巴胺溶液用Tris緩沖溶液配制；
[0011](3)逐層自組裝
[0012]將步驟⑵沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在I?10mg/mL明膠溶液中12?36小時,然后依次浸入I?10mg/mL殼聚糖溶液、I?10mg/mL明膠溶液、100?500ng/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和I?10mg/mL明膠溶液，每個溶液中浸泡5?20分鐘，每次浸泡后用超純水清洗；依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環(huán)，共循環(huán)4?10次，最后用氮?dú)獯蹈?，即可；所述殼聚糖溶液?.1%?
0.5% (v/v)的乙酸配制，所述明膠溶液和的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液用磷酸鹽緩沖溶液配制。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟(2)為:將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液中浸泡24小時，鹽酸多巴胺溶液用lOmM，pH值為8.5的Tris緩沖溶液配制。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟(3)中，將步驟(2)制得的沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金在5mg/mL明膠溶液中浸泡24小時，然后依次浸入5mg/mL殼聚糖溶液、5mg/mL明膠溶液、200ng/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和5mg/mL明膠溶液中，每個溶液浸泡10分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環(huán)，共循環(huán)5次，最后用氮?dú)獯蹈?，即可?br> [0015]根據(jù)上述方法制備得到含有生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0016]將上述方法制得的含有生物活性涂層的鎳鈦合金作為心血管植入材料。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明通過逐層自組裝在鎳鈦合金表面構(gòu)筑仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層，該涂層由聚多巴胺-明膠-殼聚糖-明膠-內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-明膠構(gòu)成，其中殼聚糖-明膠-內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-明膠至少有四層。該涂層可以有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在鎳鈦合金表面粘附和生長，從而滿足鎳鈦合金作為心血管植入材料快速內(nèi)皮化的需求，有效解決鎳鈦合金表面誘發(fā)血栓、產(chǎn)生凝血的問題，擴(kuò)大鎳鈦合金的臨床應(yīng)用范圍，增加臨床應(yīng)用的長期有效性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0019]圖1未涂層的鎳鈦合金的掃描電鏡圖；
[0020]圖2表面形成仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金的掃描電鏡圖；
[0021]圖3未涂層的鎳鈦合金的原子力顯微鏡圖；
[0022]圖4表面形成仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金的原子力顯微鏡圖；
[0023]圖5表面接觸角對比圖；
[0024]圖6內(nèi)皮細(xì)胞在合金表面生長的細(xì)胞活性圖；
[0025]圖7內(nèi)皮細(xì)胞在合金表面生長的NO釋放圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0027]實(shí)施例1
[0028]取鎳鈦合金片，按以下操作步驟構(gòu)筑仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層:
[0029](I)基材預(yù)處理
[0030]將鎳鈦合金片依次用100目、300目和2000目的砂紙打磨至表面光亮，用丙酮超聲清洗5分鐘，得到潔凈的金屬表面；
[0031](2)沉積聚多巴胺薄膜層
[0032]用lOmM，pH值為8.5的Tris緩沖溶液配制2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在該溶液中浸泡24小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；
[0033](3)逐層自組裝
[0034]以0.3% (v/v)的乙酸為溶劑,配制5mg/mL的殼聚糖溶液；以pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制5mg/mL的明膠溶液和200ng/mL的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液；將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中24小時，然后依次浸入殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液，每個溶液中浸泡10分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；
[0035]依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環(huán)，共循環(huán)5次，最后用氮?dú)獯蹈?，得到表面形成仿?xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0036]實(shí)施例2
[0037]本實(shí)施例步驟(2)用20mM，pH值為7.2的Tris緩沖溶液配制lmg/mL的鹽酸多巴胺溶液，將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在該溶液中浸泡12小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；
[0038]本實(shí)施例步驟(3)以0.5% (v/v)的乙酸為溶劑，配制lmg/mL的殼聚糖溶液；以PH值為8的磷酸鹽緩沖溶液配制lmg/mL的明膠溶液和100ng/mL的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液；將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中36小時，然后依次浸入殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液，每個溶液中浸泡20分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；
[0039]依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環(huán)，共循環(huán)4次，最后用氮?dú)獯蹈?，得到表面形成仿?xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0040]其它與實(shí)施例1相同。
[0041]實(shí)施例3
[0042]本實(shí)施例步驟⑵用20mM，pH值為9的Tris緩沖溶液配制3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在該溶液中浸泡36小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；
[0043]本實(shí)施例步驟(3)本實(shí)施例步驟(3)以0.5% (v/v)的乙酸為溶劑,配制10mg/mL的殼聚糖溶液；以pH值為6的磷酸鹽緩沖溶液配制10mg/mL的明膠溶液和500ng/mL的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液；將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中12小時，然后依次浸入殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液，每個溶液中浸泡5分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；
[0044]依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環(huán)，共循環(huán)10次，最后用氮?dú)獯蹈桑玫奖砻嫘纬煞录?xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0045]其它與實(shí)施例1相同。
[0046]實(shí)施例4
[0047]本實(shí)施例步驟⑵用20mM，pH值為8.5的Tris緩沖溶液配制3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在該溶液中浸泡24小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；
[0048]本實(shí)施例步驟(3)本實(shí)施例步驟(3)以0.1 % (v/v)的乙酸為溶劑,配制8mg/mL的殼聚糖溶液；以PH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制8mg/mL的明膠溶液和300ng/mL的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液；將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中20小時，然后依次浸入殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液，每個溶液中浸泡15分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；
[0049]依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環(huán)，共循環(huán)7次，最后用氮?dú)獯蹈?，得到表面形成仿?xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0050]其它與實(shí)施例1相同。
[0051]用本發(fā)明得到的表面形成仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
[0052]1、采用掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡觀察鎳鈦合金表面形貌的變化:
[0053]選取未經(jīng)處理的鎳鈦合金和含有生物活性涂層的鎳鈦合金，采用FEI Nova 400型場發(fā)射掃描電鏡(Philips公司)和WET-SPM-9500J3型原子力顯微鏡(Shimadzu公司)在室溫下進(jìn)行表面形貌表征。
[0054]鎳鈦合金表面形貌變化如圖1?4所示，可見，未涂層的鎳鈦合金表面呈現(xiàn)很多打磨過程中形成的明顯劃痕，而經(jīng)過逐層自組裝后，劃痕明顯減少，并且出現(xiàn)許多顆粒狀沉積物，形成粗糙表面，更有利于細(xì)胞的黏附和生長。
[0055]2、對涂層表面的親疏水性采用接觸角測量儀進(jìn)行測試:
[0056]選取未經(jīng)處理的鎳鈦合金和含有生物活性涂層的鎳鈦合金，采用接觸角測量儀(臺灣翰光高科技股份有限公司)進(jìn)行表面親疏水性能表征。
[0057]結(jié)果見圖5，鎳鈦合金表面形成仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層后表面的接觸角為43°，比未涂層鎳鈦合金表面的接觸角降低了 47°，表明沉積殼聚糖、明膠和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子后鎳鈦合金表面呈現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性。
[0058]3、采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過MTT法對得到的含仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金進(jìn)行細(xì)胞相容性測試:
[0059]選取未經(jīng)處理的鎳鈦合金和含有生物活性涂層的鎳鈦合金，分別在其表面接種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，接種密度為I X 14個/孔，用含10%血清和I %雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別培養(yǎng)I天和3天，MTT法測定細(xì)胞活性，酶標(biāo)儀于波長490nm處測定吸光度。結(jié)果見圖6。
[0060]從圖6中可知，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在含仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金表面培養(yǎng)I天和3天后，其細(xì)胞活性均高于未涂層鎳鈦合金，并且培養(yǎng)3天后，與未涂層鎳鈦合金相比，結(jié)果呈現(xiàn)出顯著性差異，表明本發(fā)明形成的仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層可以有效地提高鎳鈦合金的細(xì)胞相容性。
[0061]4、采用NO檢測試劑盒測定含仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金表面人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的NO釋放量:
[0062]選取未經(jīng)處理的鎳鈦合金和含有生物活性涂層的鎳鈦合金，分別在其表面接種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，接種密度為I X 14個/孔，用含10%血清、I %雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別培養(yǎng)I天和3天，收集各孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,離心并收集上清液,用NO試劑盒進(jìn)行NO表達(dá)水平檢測，酶標(biāo)儀于波長540nm處測定吸光度。結(jié)果見圖7。
[0063]測試結(jié)果見圖7。由圖7可見，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在本發(fā)明得到的含有仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金表面培養(yǎng)I天和3天的NO釋放量均高于未涂層的鎳鈦合金，而且兩者相比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著性差異。NO具有促進(jìn)血管新生的作用，內(nèi)皮細(xì)胞來源的NO能促進(jìn)胚胎細(xì)胞參與血管的形成。因此，NO測定結(jié)果表明本發(fā)明得到的含有仿細(xì)胞外微環(huán)境生物活性涂層的鎳鈦合金可以促進(jìn)血管新生。
[0064]最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)基材預(yù)處理 將鎳鈦合金打磨至表面光亮，用丙酮超聲清洗，得到潔凈的金屬表面； (2)沉積聚多巴胺薄膜層 將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在I?3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液中浸泡12?36小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；所述鹽酸多巴胺溶液用Tris緩沖溶液配制； (3)逐層自組裝 將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在I?10mg/mL明膠溶液中12?36小時，然后依次浸入I?10mg/mL殼聚糖溶液、I?10mg/mL明膠溶液、100?500ng/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和I?10mg/mL明膠溶液，每種溶液中浸泡5?20分鐘，每次浸泡后用超純水清洗；依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環(huán)，共循環(huán)4?10次，最后用氮?dú)獯蹈桑纯?；所述殼聚糖溶液?.1%?0.5% (v/v)的乙酸配制，所述明膠溶液和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液用磷酸鹽緩沖溶液配制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法，其特征在于，所述步驟(2)為:將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液中浸泡24小時，鹽酸多巴胺溶液用10mM，pH值為8.5的Tris緩沖溶液配制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，將步驟(2)制得的沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金在5mg/mL明膠溶液中浸泡24小時，然后依次浸入5mg/mL殼聚糖溶液、5mg/mL明膠溶液、200ng/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和5mg/mL明膠溶液中，每種溶液浸泡10分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環(huán)，共循環(huán)5次，最后用氮?dú)獯蹈?，即可?br> 4.由權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法制得的含有生物活性涂層的鎳鈦合金。
5.權(quán)利要求4所述含有生物活性涂層的鎳鈦合金作為心血管植入材料的應(yīng)用。
【文檔編號】C23C26/00GK104129113SQ201410359270
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】劉鵬, 趙永春 申請人:重慶大學(xué)