專(zhuān)利名稱(chēng)：一種單加成富勒烯氨基酸衍生物的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單加成富勒烯氨基酸衍生物的固相合成方法，屬于化學(xué)固 相合成領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1963年美國(guó)化學(xué)家Meirifidd創(chuàng)建固相肽合成，標(biāo)志著當(dāng)代固相有機(jī)合 成化學(xué)時(shí)代的開(kāi)始。固相合成是指反應(yīng)時(shí)鍵連在固相載體上的底物結(jié)構(gòu)處 于適當(dāng)?shù)娜軇┲校c外加構(gòu)件分子及試劑分子在固液兩相交界處進(jìn)行有關(guān) 的化學(xué)反應(yīng)，過(guò)濾后經(jīng)適當(dāng)反應(yīng)切斷連接鍵得到目標(biāo)產(chǎn)物。其特點(diǎn)如下 ①操作簡(jiǎn)單過(guò)濾-淋洗-再過(guò)濾；②使用過(guò)量的試劑 一般至少3倍于底物； ③假稀釋效應(yīng)可以避免分子間的成鍵。固相法合成肽的一般合成步驟為 將羧基端的氨基酸鍵連到功能化載體(樹(shù)脂)上，得到負(fù)載氨基酸的樹(shù)脂； 組裝各個(gè)氨基酸，進(jìn)行縮合反應(yīng)；目標(biāo)肽的主鏈序列組裝完全后，使用樹(shù) 脂裂解液脫除側(cè)鏈保護(hù)基以及切除載體，純化后得到產(chǎn)物。裂解時(shí)采用酸 解方式，包括Fmoc策略裂解肽樹(shù)脂方法和Boc策略裂解肽樹(shù)脂方法，F(xiàn)moc策略 裂解肽樹(shù)脂方法采用以三氟乙酸為主要成分的有機(jī)試劑，配合苯甲硫醚等清除 劑對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行酸解。
現(xiàn)有合成富勒烯氨基酸衍生物方法可以分為固相合成和液相合成方 法，其中固相合成純化步驟簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模合成。2001年Federica合成了 可以用于固相肽合成的新型富勒烯谷氨酸衍生物，隨后以富勒烯谷氨酸衍 生物為前體通過(guò)固相合成制備了一系列富勒烯肽衍生物但采用該方法合成 的富勒烯氨基酸種類(lèi)有限，不能得到任意氨基酸側(cè)鏈的單加成富勒烯氨基 酸衍生物。
Romanova將氨基酸或二肽與C6o直接反應(yīng)得到以單加成富勒烯氨基酸 (這些產(chǎn)物的紅外譜圖沒(méi)有C60的特征吸收峰而是顯示兩性離子形式的氨 基酸和肽組分的吸收峰。Kotdnikova等研究了此類(lèi)單加成富勒烯氨基酸 C60-DL-alanine和(:6()-01^^^116-DL-alanine對(duì)不同膜區(qū)的通透性，結(jié)果表 明它們具有很強(qiáng)的膜親和力，可以很好地通過(guò)磷脂雙分子層，且不會(huì)破壞膜的完整性。該方法采用液相合成，純化麻煩，不能保證富勒烯與氨基酸 的單加成。
研究發(fā)現(xiàn)富勒烯及其衍生物具有許多的生物學(xué)活性，包括酶活性抑制、活
性氧清除與產(chǎn)生、DNA切割、光誘導(dǎo)細(xì)胞損傷等，不斷增加的實(shí)驗(yàn)資料提示富 勒烯及其衍生物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景，如作為光動(dòng)力學(xué)治 療中的光敏劑、抗衰老藥物、反義核酸藥物和藥物載體。近年來(lái)，以未修飾的 富勒烯為結(jié)構(gòu)成分的富勒烯納米顆粒與碳納米管等納米生物材料的研究受到了 高度重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種單加成富勒烯氨基酸的固相合成方法，解決 液相合成方法的純化麻煩，不能保證富勒烯與氨基酸的單加成的問(wèn)題。 本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的一種單加成富勒烯氨基酸的固相合成方法具體步驟為 步驟一將負(fù)載氨基酸的固相肽合成樹(shù)脂加入到純度大于99.0%的二氯甲烷 和純度大于99.0%的二甲基酰胺之一，或兩者的混和液中溶脹1~2小時(shí)，抽濾后 得到的負(fù)載氨基酸的固相肽合成樹(shù)脂備用。其中二氯甲烷和二甲基酰胺混合比
例任意，且每lg樹(shù)脂加入0,25mL以上的二氯甲烷和二甲基酰胺之一，或兩者 的混和液。
步驟二將富勒烯溶于純度大于99.0%的甲苯，加入上述抽濾后的負(fù)載氨基 酸的固相肽合成樹(shù)脂，攪拌反應(yīng)20h 50h，得到負(fù)載富勒烯氨基酸的樹(shù)脂，過(guò)濾。 其中每100mL的甲苯加入150~260mg的富勒烯。
步驟三將過(guò)濾后負(fù)載富勒烯氨基酸的樹(shù)脂在20 70'C下用純度大于99.0% 的甲苯抽濾洗滌樹(shù)脂2次以上，再以純度大于99.0%的二氯甲垸洗滌3次以上。 其中每次洗滌時(shí)，每lg樹(shù)脂加入0.5mL以上的甲苯，每lg樹(shù)脂加入0.5mL以 上的二氯甲垸。
步驟四在室溫下將洗滌后所得負(fù)載富勒烯氨基酸的樹(shù)脂與樹(shù)脂裂解液反 應(yīng)1.5 2.5h，過(guò)濾裂解液后備用；再用洗滌液洗滌樹(shù)脂2次以上，過(guò)濾洗滌液備 用。其中裂解液為含40%以上純度大于99.0%的三氟乙酸，1%~30%的清除劑， 其余為純度大于99.0%的二氯甲烷或純度大于99.0%二甲基酰胺。其中清除劑是苯甲硫醚、硫代甲基醚、二巰基乙醚中的一種或幾種。洗滌液為含純度大于99.0% 的三氟乙酸的所有有機(jī)溶劑。每lg樹(shù)脂加入0.25mL以上的裂解液，每lg樹(shù)脂 加入0.5mL以上的洗滌液。
步驟五:收集上述所有裂解液和洗滌液混合，在(TC以下加入純度大于99.0% 的甲基叔丁基醚，放于低于0°。的溫度10h以上，離心，得到含雜質(zhì)的目標(biāo)產(chǎn)物， 其中甲基叔丁基醚、裂解液和洗滌液的之間的體積比1: 1: 1~30: 1: 2。在本 步驟中在加入甲基叔丁基醚之前也可以通入氬氣，以使目標(biāo)產(chǎn)物更快的從液體 中析出。
步驟六在-20"C (TC的溫度下用純度大于99.0%的甲基叔丁基醚洗滌3 次以上，干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物，其中每次洗滌時(shí)，每lg樹(shù)脂加入lmL以上的甲 基叔丁基醚。
有益效果
本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單，特別是在純化步驟只需過(guò)濾，簡(jiǎn)化了分離過(guò)程。 另外，氨基酸的種類(lèi)任意，可以合成相同結(jié)構(gòu)的各種氨基酸富勒烯衍生物。該 方法適于組合化學(xué)大規(guī)模合成篩選。
具體實(shí)施例
實(shí)施例一
1. 將0.55mmol/g的H-Cys(Trt)-2Cl-Trt樹(shù)脂0.6g加入純度為99.0%的二氯甲 垸溶脹2h，抽濾備用。
2. 在35'C下將240mgC6o溶于100ml純度為99.0%的甲苯攪拌超聲溶解后， 加入上述抽濾后的樹(shù)脂50"C攪拌反應(yīng)40h。
3. 用砂芯漏斗將樹(shù)脂從反應(yīng)液中分離，在5(TC下用純度為99.0。/。的甲苯抽 濾洗滌樹(shù)脂，再以二氯甲垸洗滌6次，每次2min，抽濾得到固體樹(shù)脂。
4. 將所得樹(shù)脂與5ml裂解液室溫反應(yīng)2h，用砂芯漏斗過(guò)濾裂解液后備用， 再用純度為99.0%的三氟乙酸洗滌樹(shù)脂兩次，用砂芯漏斗過(guò)濾洗漆液備用，該裂 解液為純度均為99.0%的二巰基乙醚、苯甲硫醚、三氟乙酸、二氯甲烷，體積比 為10/0、 5%、 44%、 50%。 o
5. 收集上述裂解液和洗滌液并混合，向其中通氬氣15min后加入15mL純度為99.0%的甲基叔丁基醚，放于-20'C的冰箱15h，離心后所得固體沉淀在-20'C 下用純度為99.0%的甲基叔丁基醚洗滌4次后過(guò)濾出沉淀，干燥后得目標(biāo)產(chǎn)物 C60(H)NHCH(COOH)CH2SH，產(chǎn)率為10%。 實(shí)施例二
1. 將0.55mmol/g的H-Cys(Trt)-2Cl-Trt樹(shù)脂0.6g加入純度為99.0%的二氯甲 垸溶脹2h，抽濾備用。
2. 在35。C下將240mgQo溶于100ml純度為99.0%的甲苯攪拌超聲溶解后， 加入上述抽濾后的樹(shù)脂5(TC攪拌反應(yīng)20h。
3. 用砂芯漏斗將樹(shù)脂從反應(yīng)液中分離，在5(TC下用純度為99.0。/。的甲苯抽 濾洗滌樹(shù)脂，再以純度為99.0%的二氯甲烷洗滌6次，每次2min，抽濾得到固 體樹(shù)脂。
4. 將所得樹(shù)脂與5ml裂解液室溫反應(yīng)2h，用砂芯漏斗過(guò)濾裂解液后備用， 再用純度為99.0%三氟乙酸洗滌樹(shù)脂兩次，用砂芯漏斗過(guò)濾洗滌液備用，該裂解 液為純度均為99.0%的二巰基乙醚、苯甲硫醚、三氟乙酸、二氯甲烷，體積比為 1%、 5%、 44%、 50%。。
5. 收集上述裂解液和洗滌液并混合，向其中通氬氣15min后加入15mL純度 為99.0%的甲基叔丁基醚，混勻后放于-20'C的冰箱15h，離心后所得固體沉淀在 -20'C下用純度為99.0%的甲基叔丁基醚洗滌4次后過(guò)濾出沉淀，干燥后得目標(biāo) 產(chǎn)物C6o(H)NHCH(COOH)CH2SH，產(chǎn)率為5%。
實(shí)施例三-
1. 將0.6mmol/g的H-Lys(Boc)-Wang樹(shù)脂0.5g,加入純度為99.0%的二氯 甲烷和純度為99.0%的二甲基酰胺(1: 9，體積比)溶脹lh，抽濾備用。
2. 在35'C下將240mg (36()溶于100ml純度為99.0%甲苯攪拌超聲溶解后， 加入上述抽濾后的樹(shù)脂5(TC攪拌反應(yīng)30h。
3. 用砂芯漏斗將樹(shù)脂從反應(yīng)液中分離，在50'C下用純度為99.0。/。的甲苯洗 滌樹(shù)脂。再以純度為99.0%的二氯甲烷洗滌6次每次1分鐘，抽濾得到固體樹(shù)脂。
4. 將所得樹(shù)脂與4ml裂解液室溫反應(yīng)2h，用砂芯漏斗過(guò)濾裂解液后備用， 用純度為99.0%三氟乙酸洗滌樹(shù)脂兩次，用砂芯漏斗過(guò)濾洗滌液備用，該裂解液 為純度均為99.0%的三氟乙酸、苯甲硫醚、二氯甲烷，體積比為95%、 2.5%、2.5%混合。。
5.收集上述裂解液和洗滌液并混合，在-20'C下向其中加入20mL純度為 99.0%的甲基叔丁基醚置于冰箱20h，離心后所得固體沉淀在-2(TC下用甲基叔 丁基醚洗滌5次后再過(guò)濾出沉淀，干燥后得目標(biāo)產(chǎn)物 C60(H)NHCH(COOH)(CH2)4NH2，產(chǎn)率為7%。
實(shí)施例四
1.0.6mmol/gH-Lys(Boc)-Rink樹(shù)脂0.5g，加二氯甲垸和二甲基酰胺(1: 9， 體積比)溶脹lh,抽濾備用。
2. 在35。C下將240mgC6o溶于100ml純度為99.0%的甲苯攪拌超聲溶解后， 加入上述抽濾后的樹(shù)脂50'C攪拌反應(yīng)30h。
3. 用砂芯漏斗將樹(shù)脂從反應(yīng)液中分離，在5(TC下用純度為99.0。/。的甲苯洗 滌樹(shù)脂。再以純度為99.0%的二氯甲垸洗滌6次每次1分鐘，抽濾得到固體樹(shù)脂。
4. 將所得樹(shù)脂與4ml裂解液室溫反應(yīng)2h,用砂芯漏斗過(guò)濾裂解液后備用， 用純度為99.0°/。的三氟乙酸洗滌樹(shù)脂兩次，用砂芯漏斗過(guò)濾洗滌液備用，該裂解 液為純度均為99.0%的三氟乙酸、苯甲硫醚、二氯甲烷按體積比95°/。、 2.5%、 2.5%混合。。
5. 收集上述裂解液和洗滌液并混合，在-2(TC下向其中加入為15mL純度為 99.0%的甲基叔丁基醚置于冰箱20h，離心后所得固體沉淀在-2(TC下用純度為 99.0%的甲基叔丁基醚洗滌5次后再過(guò)濾出沉淀，干燥后得目標(biāo)產(chǎn)物 C60(H)NHCH(COOH)(CH2)4NH2，產(chǎn)率為12%。
權(quán)利要求
1.一種單加成富勒烯氨基酸的固相合成方法，其特征在于具體制備步驟如下步驟一將負(fù)載氨基酸的固相肽合成樹(shù)脂加入到純度大于99.0％的二氯甲烷和純度大于99.0％的二甲基酰胺之一，或兩者的混和液中溶脹1～2小時(shí)，抽濾后得到的負(fù)載氨基酸的固相肽合成樹(shù)脂備用；步驟二將富勒烯溶于純度大于99.0％的甲苯，加入上述抽濾后的負(fù)載氨基酸的固相肽合成樹(shù)脂，攪拌反應(yīng)20h～50h，得到負(fù)載富勒烯氨基酸的樹(shù)脂，過(guò)濾；步驟三將過(guò)濾后負(fù)載富勒烯氨基酸的樹(shù)脂在20～70℃下用純度大于99.0％的甲苯抽濾洗滌樹(shù)脂2次以上，再以純度大于99.0％的二氯甲烷洗滌3次以上；步驟四在室溫下將洗滌后所得負(fù)載富勒烯氨基酸的樹(shù)脂與樹(shù)脂裂解液反應(yīng)1.5～2.5h，過(guò)濾裂解液后備用；再用洗滌液洗滌樹(shù)脂2次以上，過(guò)濾洗滌液備用；步驟五收集上述所有裂解液和洗滌液混合，在0℃以下加入純度大于99.0％的甲基叔丁基醚，放于低于0℃的溫度10h以上，離心，得到含雜質(zhì)的目標(biāo)產(chǎn)物；步驟六在-20℃～0℃的溫度下用純度大于99.0％的甲基叔丁基醚洗滌3次以上，干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物。
2. 如權(quán)利要求1所述的步驟一，其特征在于二氯甲烷和二甲基酰胺混合比例任意，且每lg樹(shù)脂加入0.25mL以上的二氯甲垸和二甲基酰胺之一，或兩者 的混和液。
3. 如權(quán)利要求1所述的步驟二，其特征在于每100mL的甲苯加入150 260mg 的富勒烯。
4. 如權(quán)利要求1所述的步驟三，其特征在于每次洗滌時(shí)，每lg樹(shù)脂加入0.5mL 以上的甲苯，每lg樹(shù)脂加入0.5mL以上的二氯甲垸。
5. 如權(quán)利要求1所述的步驟四，其特征在于:裂解液為含40%以上純度大于99.0% 的三氟乙酸，1%~30%的清除劑，其余為純度大于99.0°/。的二氯甲烷或純度大 于99.0%二甲基酰胺；其中清除劑是苯甲硫醚、硫代甲基醚、二巰基乙醚中的 一種或幾種；洗滌液為含純度大于99.0%的三氟乙酸的所有有機(jī)溶劑；每lg 樹(shù)脂加入0.25mL以上的裂解液，每lg樹(shù)脂加入0.5mL以上的洗滌液。
6. 如權(quán)利要求1所述的步驟五，其特征在于甲基叔丁基醚、裂解液和洗滌液的之間的體積比l: 1: 1~30: 1: 2。
7. 如權(quán)利要求1所述的步驟五，其特征在于在加入甲基叔丁基醚之前通入氬 氣。
8. 如權(quán)利要求1所述的步驟六，其特征在于每次洗滌時(shí)，每lg樹(shù)脂加入lmL 以上的甲基叔丁基醚。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單加成富勒烯氨基酸衍生物的固相合成方法，屬于化學(xué)固相合成領(lǐng)域。該方法包括以下步驟將負(fù)載氨基酸的樹(shù)脂與C₆₀甲苯溶液反應(yīng)，過(guò)濾C₆₀甲苯，在樹(shù)脂中加入裂解液反應(yīng)，過(guò)濾樹(shù)脂、洗滌、收集裂解液和洗滌液干燥后得到單加成富勒烯氨基酸。本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單，特別是在純化步驟只需過(guò)濾，簡(jiǎn)化了分離過(guò)程。另外，氨基酸的種類(lèi)任意，可以合成相同結(jié)構(gòu)的各種單加成富勒烯氨基酸衍生物。該方法適于組合化學(xué)大規(guī)模合成篩選。采用該方法合成的化合物具有許多的特性，如熒光性質(zhì)，生物學(xué)活性。此類(lèi)化合物還可以制備成納米材料，有作為靶向藥物載體的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C01B31/00GK101302008SQ20081011592
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者楊新林, 馨 解 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)