【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及一種用于骨組織修復(fù)與再生、蛋白及藥物遞送以及基因治療的大孔生物活性玻璃納米簇的制備技術(shù)，具體涉及一種以樹枝狀聚乙烯亞胺為模板劑和催化劑制備大孔生物活性玻璃納米簇的方法。

背景技術(shù)：

生物活性玻璃是一種以三維硅氧四面體形成的玻璃網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，摻入ca，p和na等其他元素作為改性劑的硅酸鹽玻璃。由于生物活性玻璃具有良好的生物活性，生物相容性及成骨基因激活能力，能與骨組織和軟組織形成化學(xué)鍵合并且促進，因此在骨缺損及皮膚組織的修復(fù)與重建等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

微納米生物活性玻璃因為具有相對較小的尺寸以及多樣的結(jié)構(gòu)，有著更加優(yōu)越的性能。而傳統(tǒng)方法制備的生物活性玻璃大多形狀不規(guī)則、粒度不均勻，由于孔徑和孔容過小，藥物和基因運輸?shù)男蔬^低，從而限制了微納米生物活性玻璃的廣泛應(yīng)用。因此，近年來逐漸發(fā)展出各種具有特定形貌、尺寸均勻且分散性能良好的微納米生物活性玻璃材料，旨在通過調(diào)整微納米生物活性玻璃特殊的形貌來提高生物活性玻璃的骨、齒缺損修復(fù)效率、基因和生長因子裝載效率等性能。

高分子模板技術(shù)是合成生物活性玻璃的一種常見方法。主要是利用某些兩親表面活性劑大分子，嵌段共聚物或生物大分子在反應(yīng)體系中通過自組裝形成特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，作為納米顆粒形成的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑或者形態(tài)模板劑。目前已有使用高分子模板劑吐溫-80合成納米線組成的生物活性玻璃納米簇，聚乙二醇作為模板劑合成的生物活性玻璃微球等技術(shù)，其所使用的模板劑多為線性高分子。但還未有人嘗試利用聚乙烯亞胺這種樹枝狀的高分子作為模板劑來調(diào)控生物活性玻璃的形貌和尺寸。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種以樹枝狀聚乙烯亞胺為模板劑和催化劑制備大孔生物活性玻璃納米簇的方法，該方法初次使用樹枝狀的高分子作為模板劑與催化劑調(diào)控生物活性玻璃的形貌和尺寸，操作簡單，反應(yīng)條件溫和，可制備不同尺寸的生物活性玻璃納米團簇。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種以樹枝狀聚乙烯亞胺為模板劑和催化劑制備大孔生物活性玻璃納米簇的方法，包括以下步驟：

1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺溶于醇水溶液中，醇與水的體積比為3:1，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；

2)硅烷的水解與縮合：將硅烷在攪拌下逐滴加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，開始水解與縮合反應(yīng)；

3)加入鈣源和磷源：將磷酸三乙酯和四水合硝酸鈣在攪拌下加入上述反應(yīng)體系中，反應(yīng)完全得到乳白色生物活性玻璃溶膠-凝膠；

4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠進行洗滌，干燥和煅燒，得到生物活性玻璃納米團簇。

進一步，所述步驟1)中樹枝狀的聚乙烯亞胺為分子量mw為25000的氨基封端的樹枝狀聚乙烯亞胺。

進一步，所述步驟2)中加入的硅烷，使聚乙烯亞胺的摩爾量為硅烷摩爾量的10％～30％。

進一步，所述步驟1)中聚乙烯亞胺的溶解溫度為40℃，在磁轉(zhuǎn)子的攪拌下溶解。

進一步，所述步驟2)中所用硅烷為正硅酸乙酯。

進一步，所述步驟1)中醇水溶液為乙醇水溶液，步驟2)中硅烷按照硅烷與乙醇的體積比為1:(40～80)的量加入。

進一步，所述步驟3)中待步驟2)加入硅烷反應(yīng)30分鐘后，在磁轉(zhuǎn)子攪拌下加入磷酸三乙酯，反應(yīng)30分鐘后將四水合硝酸鈣溶于微量去離子水中、并在磁轉(zhuǎn)子攪拌下加入反應(yīng)體系中，40℃反應(yīng)3小時得到乳白色生物活性玻璃溶膠-凝膠。

進一步，所述步驟3)中加入的磷酸三乙酯和四水合硝酸鈣的投料比按si：ca：p原子數(shù)比80：16：4或si：ca：p原子數(shù)比60：36：4。

進一步，所述步驟4)中得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠使用無水乙醇和去離子水各洗滌3次；然后將生物活性玻璃在-80℃的冷凍干燥機中干燥過夜。

進一步，所述步驟4)中生物活性玻璃煅燒的具體過程是將生物活性玻璃置于馬弗爐中，以2℃/min的速度從室溫升溫到350℃，并在350℃下煅燒3小時后，再由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果及優(yōu)點：

1)本發(fā)明首次利用樹枝狀的聚乙烯亞胺高分子作為模板劑和催化劑，調(diào)控生物活性玻璃的形貌和尺寸，聚乙烯亞胺特殊的樹枝狀結(jié)構(gòu)使生物活性玻璃形成了特殊的類似于枝狀的納米團簇，可廣泛應(yīng)用于藥物、蛋白或基因的運輸；本發(fā)明中聚乙烯亞胺的投料比在一定范圍內(nèi)越小，將導(dǎo)致生物活性玻璃納米團簇的尺寸越小，因此通過控制聚乙烯亞胺的投料比可制備出不同尺寸的生物活性玻璃納米團簇以滿足實際應(yīng)用中的需求；

2)本發(fā)明中生物活性玻璃納米團簇的制備技術(shù)簡單易行，反應(yīng)條件溫和，制備的生物活性玻璃具有良好的生物活性和生物相容性；

3)本發(fā)明中生物活性玻璃納米團簇的大孔結(jié)構(gòu)使其孔徑遠遠大于傳統(tǒng)的小孔和介孔微納米生物活性玻璃，大的孔徑使其具有良好的基因負載能力，并且能保護基因不受酶的降解作用，從而將基因安全送到靶向細胞或組織，使基因能有效的發(fā)揮作用，是非常有潛力的非病毒基因載體，可用于組織的修復(fù)與重建及癌癥治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

【附圖說明】

圖1為本發(fā)明制備的生物活性玻璃納米團簇的透射電子顯微鏡照片，其中，圖1(a)為聚乙烯亞胺摩爾量為正硅酸乙酯摩爾量的10％時制備的生物活性玻璃，命名為10％bgnc，同理，圖1(b)為20％bgnc，圖1(c)為30％bgnc。

圖2為本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇在模擬體液(sbf)中進行礦化實驗后的透射電子顯微鏡照片，其中，圖2(a)為10％bgnc礦化1天，圖2(b)為20％bgnc礦化1天，圖2(c)為30％bgnc礦化1天。

圖3為本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇對骨髓基質(zhì)干細胞(bmscs)細胞毒性的測定。

圖4為本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇作為基因載體用于細胞基因轉(zhuǎn)染結(jié)果。

【具體實施方式】

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細描述：

本發(fā)明致力于以樹枝狀聚乙烯亞胺高分子作為模板劑和催化劑，制備一種大孔生物活性玻璃納米團簇。一方面，聚乙烯亞胺作為催化劑，可有效的催化硅烷的水解縮合反應(yīng)，從而形成硅氧網(wǎng)絡(luò)，促進反應(yīng)的進行。另一方面，聚乙烯亞胺樹枝狀大分子作為模板劑，發(fā)揮了結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的重要作用，其特有的樹枝狀結(jié)構(gòu)使生物活性玻璃形成了類似于枝狀的納米團簇結(jié)構(gòu)，并且聚乙烯亞胺可以組裝入納米生物活性玻璃團簇的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中從而產(chǎn)生介孔和大孔結(jié)構(gòu)。生物活性玻璃納米團簇特有的大孔結(jié)構(gòu)使其具有優(yōu)異的基因負載能力，在組織工程和基因治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。

實施例1

1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的10％；

2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:40；

3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到生物活性玻璃納米團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例2

(1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的20％；

(2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:40；

(3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

(4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到納米生物活性玻璃團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例3

(1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的30％；

(2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:40；

(3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

(4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到納米生物活性玻璃團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例4

1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的10％；

2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:40；

3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到生物活性玻璃納米團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例5

(1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的20％；

(2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:40；

(3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

(4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到納米生物活性玻璃團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例6

(1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的30％；

(2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:40；

(3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

(4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到納米生物活性玻璃團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例7

1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的10％；

2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:80；

3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到生物活性玻璃納米團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例8

(1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的20％；

(2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:80；

(3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

(4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到納米生物活性玻璃團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例9

(1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的30％；

(2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:80；

(3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

(4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到納米生物活性玻璃團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例10

1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的10％；

2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:80；

3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到生物活性玻璃納米團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例11

(1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的20％；

(2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:80；

(3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

(4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到納米生物活性玻璃團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

實施例12

(1)聚乙烯亞胺醇水溶液的制備：將樹枝狀的聚乙烯亞胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亞胺醇水溶液；其中，醇與水的體積比為3:1，分子量(mw)為25000的聚乙烯亞胺在磁轉(zhuǎn)子攪拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亞胺的摩爾量為反應(yīng)中硅烷摩爾量的30％；

(2)硅烷的水解與縮合：正硅酸乙酯在磁轉(zhuǎn)子攪拌下逐滴緩慢地加入聚乙烯亞胺醇水溶液中，在40℃下開始水解和縮合反應(yīng)，其中，硅烷與無水乙醇的體積比為1:80；

(3)加入鈣源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分鐘后，緩慢加入作為磷源的磷酸三乙酯反應(yīng)30分鐘后，加入作為鈣源的四水合硝酸鈣，反應(yīng)3個小時，得到乳白色的生物活性玻璃溶膠-凝膠溶液；其中，四水合硝酸鈣先溶于微量去離子水中再加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

(4)純化和燒結(jié)：將得到的生物活性玻璃溶膠-凝膠在9500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，去掉上清液后分別用無水乙醇和去離子水將得到的生物活性玻璃白色固體洗滌3次，隨后在-80℃的條件下冷凍干燥過夜，最終將得到的生物活性玻璃白色粉體在馬弗爐中進行燒結(jié)以去除模板劑，得到納米生物活性玻璃團簇的白色粉體；其中，燒結(jié)條件為：將溫度由常溫以2℃/min的升溫速度升到在350℃，在下350℃的條件下煅燒3小時后，將溫度由350℃以1℃/min的升溫速度升到650℃，煅燒3小時。

本發(fā)明制備過程中得到的生物活性玻璃經(jīng)過煅燒后為白色粉體。

本發(fā)明制得的生物活性玻璃納米團簇的形貌和尺寸對聚乙烯亞胺的投料量具有依賴性。圖一為生物活性玻璃納米團簇的透射電子顯微鏡照片，生物活性玻璃之所以是團簇狀，這與模板劑聚乙烯亞胺的枝狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。當(dāng)聚乙烯亞胺加入反應(yīng)體系中的摩爾量為正硅酸乙酯摩爾量的10％時，生物活性玻璃納米團簇的尺寸為100nm左右，見圖1(a)，當(dāng)聚乙烯亞胺加入反應(yīng)體系中的摩爾量為正硅酸乙酯摩爾量的20％時，生物活性玻璃納米團簇的尺寸約為200-300nm，見圖1(b)，當(dāng)聚乙烯亞胺加入反應(yīng)體系中的摩爾量為正硅酸乙酯摩爾量的30％時，生物活性玻璃納米團簇的尺寸約為500nm，見圖1(c)。因此，在一定范圍內(nèi)，隨著聚乙烯亞胺的投料量的增加，所制備的生物活性玻璃納米團簇的尺寸越來越大。這說明可以通過調(diào)控聚乙烯亞胺的投料比來調(diào)控生物活性玻璃納米團簇的尺寸大小。

圖2是本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇在模擬體液(sbf)中進行礦化實驗后的透射電子顯微鏡照片，將生物活性玻璃納米團簇以1.5mg/ml的濃度分散到sbf中后在37℃的環(huán)境中靜置1天，隨后將生物活性玻璃納米團簇在sbf中的分散液進行離心，并用去離子水清洗3次，樣品在-80℃的環(huán)境下干燥過夜。圖2(a)為10％bgnc礦化1天，圖2(b)為20％bgnc礦化1天，圖2(c)為30％bgnc礦化1天的透射電子顯微鏡照片，從礦化后的生物活性玻璃納米團簇的透射電鏡照片中可以看出，所有的生物活性玻璃納米團簇的表面都形成了明顯的羥基磷灰石的層狀結(jié)晶，這說明本發(fā)明中制備的生物活性玻璃納米團簇具有良好的生物活性。

圖3是本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇對骨髓基質(zhì)干細胞(bmscs)細胞毒性的測定結(jié)果。將濃度為40μg/ml，80μg/ml和160μg/ml的10％bgnc與bmscs共同培養(yǎng)1天，3天和5天后測試細胞的毒性發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇對細胞的生長沒有任何抑制作用，具有良好的細胞相容性。

圖4是本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇作為基因運輸載體，負載mirna后進行細胞轉(zhuǎn)染后細胞攝取的結(jié)果。與本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇具有相同化學(xué)成分的一般的球狀生物活性納米玻璃微球以及常見的商業(yè)化基因載體lipofectamine^tm3000(lipo)作為對照，從結(jié)果可以看出本發(fā)明所制備的生物活性玻璃納米團簇表現(xiàn)出了優(yōu)于傳統(tǒng)生物活性玻璃微球及l(fā)ipo的基因負載效率，因此，有望成為一種新型的基因運輸工具應(yīng)用于組織工程和基因治療中。

本發(fā)明中的生物活性玻璃的制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和；制得的生物活性玻璃具有團簇狀的結(jié)構(gòu)，且制備的生物活性玻璃納米團簇的尺寸在一定范圍內(nèi)隨著模板劑聚乙烯亞胺的投料質(zhì)量的增加而增加，因此可通過調(diào)控模板劑聚乙烯亞胺的投料比來控制生物活性玻璃納米團簇的尺寸，同時，聚乙烯亞胺可作為一種新型的模板劑用于納米合成技術(shù)中；本發(fā)明制備的生物活性玻璃納米團簇具有良好的生物活性和生物相容性，并表現(xiàn)出優(yōu)異的基因負載能力，可廣泛應(yīng)用于骨組織修復(fù)與重建，藥物遞送及蛋白和基因的運輸?shù)壬镝t(yī)學(xué)領(lǐng)域。

以上內(nèi)容僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明權(quán)利要求書的保護范圍之內(nèi)。