微生物復(fù)合肥料及其生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)中的肥料，涉及一種新型的微生物復(fù)合肥料及其生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]現(xiàn)有的生物肥料大多是單一性的生物肥料。如:固氮菌肥，主要由具有固氮作用的細(xì)菌和真菌組成；又如:磷細(xì)菌，其功能是分解土壤中的有機(jī)磷，使之變?yōu)橐子诒恢参镂盏牧姿?；再?細(xì)菌，其功能是分解土壤中的鉀化合物，使之成為能被植物吸收利用的速效鉀。這些肥料在單獨(dú)使用時(shí)均能發(fā)揮各自作用，部分滿足植物對(duì)氮，磷，鉀三要素的需要。它們不會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)期使用化肥所造成的土壤板結(jié)現(xiàn)象。但其不足在于:單獨(dú)使用上述三類(lèi)生物肥料只能解決植物所需營(yíng)養(yǎng)的一個(gè)方面，且成本較高，用量大。同時(shí)，將三者配合使用，又因難于做到比例適當(dāng)而造成施肥量的不足或浪費(fèi)。長(zhǎng)期使用單一的或復(fù)合的生物肥料的實(shí)踐證明，它們只能替代化肥的30%以下。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0003]本發(fā)明的目的是提供一種能針對(duì)我國(guó)土壤肥力的基本情況，開(kāi)發(fā)一種微生物復(fù)合肥料及其生產(chǎn)方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
[0005]一種微生物復(fù)合肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、枯草芽孢桿菌菌劑組成。微生物復(fù)合肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物20— 50份、枯草芽孢桿菌菌劑20-35份；
[0006]一種生產(chǎn)微生物復(fù)合肥料的方法，將特選的黑曲霉培養(yǎng)物、枯草芽孢桿菌分別進(jìn)行培養(yǎng)、發(fā)酵，然后將發(fā)酵產(chǎn)物按比例組合為微生物復(fù)合肥料。
[0007]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，采用常見(jiàn)固體發(fā)酵培養(yǎng)方法:孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26— 33 °C培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0008]有益效果:
[0009]實(shí)驗(yàn)表明，使用本品可提高糧食產(chǎn)量8 — 30%，提高蔬菜產(chǎn)量10 — 40%，還可改善蔬菜、糧食的品質(zhì)和風(fēng)味。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為60-100克，是目前國(guó)內(nèi)外使用量較少的微生物復(fù)合肥料之一。
[0010]每畝使用量為80— 200克。在本發(fā)明微生物復(fù)合肥料中加入120倍的自來(lái)水和6倍的尿素，在22°C以上45°C以下的水溫中活化28小時(shí)，然后連同化肥(按照上年使用量的50% )灑入土壤中。最好作基肥，每年使用1-3次。
【具體實(shí)施方式】
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[0011 ] 下面的實(shí)施例可以使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。1、囷劑培養(yǎng)制備:
[0012]枯草芽孢桿菌劑培養(yǎng)制備:枯草芽孢桿菌菌劑制備:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級(jí)擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵完畢后離心分離獲得濕菌體和發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的40— 50%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5—0.7:1，載體組成為:CaC0320— 40份，糊精10—20份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0013]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26— 35 °C培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物；
[0014]本發(fā)明提供的產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)L1-2013—02。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)06110:，地址為:中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7926。
[0015]所述菌株特點(diǎn)如下:
[0016]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運(yùn)動(dòng)性的好氧菌。鏡檢為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V— P實(shí)驗(yàn)成陽(yáng)性。
[0017]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus sub tilis)L1-2013一02由一株保藏于本實(shí)驗(yàn)室的產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0018](I)菌懸液的制備
[0019]將在平板劃線分離后長(zhǎng)出的L1-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，10r / min，40°C培養(yǎng)12h后,取ImL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸與9mL生理鹽水中。
[0020](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0021]將菌懸液置于無(wú)菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經(jīng)過(guò)照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置40°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過(guò)的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0022](3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0023]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌L1-2013 — 01，L1-2013— 02，L1-2013—03
[0024](4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0025]將獲得的三株菌L1-2013 — 01，L1-2013— 02，L1-2013— 03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V / V), 40 °C UOOr / min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
[0026](5)酶活測(cè)定
[0027]酶活單位的定義:ImL粗酶液,于105°C、pH4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個(gè)酶活力單位，以U / mL表示。
[0028]經(jīng)測(cè)定，菌株L1-2013— 02，為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達(dá)到30000U / mL,比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0029]所述氯化鋰平板:淀粉I %，蛋白胨 I %，(NH) 2S040.4 %，K2HPO40.8%, CaCl20.2%,氯化鋰0.9%,瓊脂2%。
[0030]所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5 %，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0031]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉5%?15%，豆餅粉4%?10%，(NH) 2S040.4 %,K2HP040.8%, CaC120.2%?
[0032]所述的搖瓶培養(yǎng)條件:該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10%(V / V)，10r / min、40°C 發(fā)酵培養(yǎng) 72h。
[0033]由菌株L1-2013— 02發(fā)酵獲得了一種耐高溫的α -淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0034](I)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在105—115°C之間，且在110°C以下保存的溫度穩(wěn)定性較好，而115°C以上保存長(zhǎng)時(shí)間溫度穩(wěn)定性較差。
[0035](2)該酶最適反應(yīng)pH值為4.2。在pH值3.0_7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定。
[0036](3)酶活性:由本發(fā)明所提供的突變株L1-2013— 02，制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為 30000— 35000U / ml。
[0037]1、本發(fā)明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013— 02，該菌株具有強(qiáng)耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點(diǎn)。
[0038]2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫α -淀粉酶酶活力高達(dá)30000—35000u / ml,;適用溫度范圍為25—115°C，最適反應(yīng)溫度110°C，在110°C酶活完全穩(wěn)定；適用反應(yīng)pH值范圍為3.0—7.0，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為4.2，比現(xiàn)有的耐高溫α -淀粉酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
[0039]本發(fā)明提供的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013一03是由實(shí)驗(yàn)室保藏的一株產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)的黑曲霉Aspergillus niger L1-2010經(jīng)多輪亞硝基胍誘變，然后對(duì)突變株逐級(jí)篩選淘汰，最后對(duì)優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測(cè)試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013—03。
[0040]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉AspergillusnigerL1-2013一03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為:中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編100101)，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7927。
[0041]產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0042]I)斜面培養(yǎng):將原始黑曲霉菌株Aspergillus niger Li_2010劃線接種斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2?3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色孢子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下:12。Brix 麥芽汁 100mL, pH 值自然，121°C滅菌 20min ；
[0043]2)孢子懸液制備(以下步驟均在無(wú)菌條件下操作):向試管斜面加入15mL無(wú)菌水，把孢子刮下，用濾紙過(guò)濾，將濾過(guò)液倒入已滅菌、并加有5—10粒無(wú)菌玻璃珠的150mL三角瓶中，將三角瓶放入搖床振蕩10 — 15min，使孢子分散。
[0044]3)亞硝基胍(